Cultivo celular

Cultivo celular2013

Cultivo celularUniversidad Autnoma de Chihuahua Facultad de Medicina Ingeniera biomdicaLesly Pamela Bejarano Hernndez.

Elcultivo celulares el proceso mediante el que clulas, ya seanclulas procariotasoeucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la prctica el trmino "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas de eucariotaspluricelulares, especialmenteclula animal. El desarrollo histrico y metodolgico del cultivo celular est ntimamente ligado a los pptidos cultivares delcultivo de tejidosy elcultivo de rganos.

Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran nmero de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenmeno celular. Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej. transcripcin de DNA, sntesis de protenas, metabolismo energtico... Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y seales asociadas a los diferentes procesos fisiolgicos, como por ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: ncleo-citoplasma, movimiento de protenas,... Ecologa celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciacin..., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformacin celular (inducidas por virus o agentes qumicos), cintica de la poblacin celular,... Interacciones celulares. Procesos de induccin embrionaria, cooperacin metablica, inhibicin por contacto o por adhesin, interacciones clula-clula. Virologa: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas antivirales. Investigacin del Cncer Inmunologa. Gracias especialmente a la introduccin de las tcnicas de fusin celular en la produccin de anticuerpos monoclonales, as como en el anlisis de la gentica de la clula somtica. Ingeniera de protenas. Por la produccin de protenas en lneas celulares: interfern, insulina, hormona de crecimiento.

Biologa celular en un cultivo

Formarn el cultivo aquellas clulas que sean capaces de superar el proceso de disgregacin, y capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensin.

El crecimiento en monocapa significa que las clulas se adherirn al sustrato y en esa forma inician la proliferacin. El crecimiento en suspensin es propio de aquellas clulas capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje, y es propio de las clulas hematopoyticas, algunas lneas celulares transformadas y de clulas procedentes de tumores. En todo tejido existe una fraccin o tipo celular que es capaz de crecer en suspensin. A pesar de que su origen no est claro se cree que se trata de clulas cepa ("stem cells") indiferenciadas.Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva seleccin: aumentan en nmero aquellas clulas que tienen una mayor tasa de crecimiento. As pues, hay que considerar al cultivo como un ente dinmico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos que lo forman varan en el tiempo en funcin de la presin selectiva a la que estn sometidos. En general, se alcanza la confluencia de las clulas, stas detienen su crecimiento, aunque pueden existir tipos celulares neoplsicos que sigan duplicndose hasta desplazar a los otros tipos celulares del cultivo.El crecimiento de las clulas en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases caractersticos de cada tipo celular y condiciones de cultivo. As los hepatocitos de adultos no se establecen ms que como cultivo primario mientras que las clulas endoteliales de cordn umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases, y los fibroblastos drmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo al final todas ellas entran en una fase de senescencia, con acumulacin de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc... que conducen a la muerte del cultivo. Tipos de cultivo celular Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el Mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus propiedades Fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Se distinguen varios tipos de cultivos celulares.

Cultivos primarios Se denominan as a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u rgano. Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos las clulas estn vivas, conservan sus caractersticas originales y su proliferacin es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios. (Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor).

Explantes primarios Se coloca un fragmento de tejido o de rgano en la interface slido-lquido de un soporte de vidrio o de plstico. Las clulas se adhieren a la superficie y las clulas de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.

Lnea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u rgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproduccin de las clulas en el cultivo. Existen diferencias muy importantes entre una lnea celular continua y una lnea primaria o un cultivo primario. En la tabla siguiente se recogen las propiedades diferenciales de las lneas finitas y continuas.

Lnea celular continua. Cultivo que se establece a partir de un tejido u rgano, en muchos casos de un tumor, y que se mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de clulas inmortales. Cultivos secundarios En estas condiciones las clulas suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una clula de espesor). Como consecuencia del contacto entre las clulas se detiene temporalmente su proliferacin, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco. As, podrn subcultivarse durante semanas o meses. En este estado, las clulas frecuentemente mostrarn distintas propiedades segn su origen. Por ejemplo, los fibroblastos secretarn colgeno, las clulas derivadas de tejido muscular esqueltico se fusionarn para generar fibras musculares con capacidad contrctil espontnea, las clulas nerviosas extendern prolongaciones (axones) elctricamente excitables que podrn conectarse (establecer sinapsis) con otras clulas nerviosas, las clulas epiteliales formarn largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto Gracias a que estos fenmenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologas, a veces no aplicables a tejidos intactos.

Cultivos continuos o lneas celulares La mayora de las clulas de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado nmero de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular En estas clulas, la capacidad limitada de proliferacin es el resultado de un acortamiento progresivo de los telmeros (porcin de ADN que se encuentra en los extremos de los cromosomas). En las clulas somticas (todas las clulas que no son clulas sexuales) se encuentra apagado el gen que codifica para la enzima telomerasa, como consecuencia, los telmeros se acortan en cada divisin celular. A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa; as, pueden propagarse como una lnea celular inmortalizada. no todas las clulas humanas se inmortalizan de la misma manera. Los hibridomas es posible fusionar dos clulas formando un heterocarionte una clula con dos ncleos separados pero con los contenidos citoplasmticos compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensin de clulas con compuestos que inducen la fusin de membranas (fusgenos), tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus. Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una clula hbrida en la cual las envolturas de ambos ncleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un nico gran ncleo. Tales clulas hbridas pueden clonarse estableciendo una lnea celular, pero se sabe que en muchos casos la lnea resultante es inestable genticamente, y tiende a perder parte del material gentico.

El medio de cultivo El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones fsico-qumicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estar formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las clulas, las condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas del medio, la naturaleza y composicin de la fase gaseosa y las condiciones de incubacin, especialmente la humedad y la temperatura.

El sustrato de cultivo. La mayor parte de las lneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte ms o menos slido.

La mayor parte de las clulas que se mantienen en cultivo proceden de disgregacin tisular o de tumores formados por clulas adheridas y mantienen esa caracterstica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse.

Los cultivos en suspensin suelen coincidir con los de aquellas clulas que in vivo son circulantes, en general clulas sanguneas.

El cultivo de clulas en suspensin tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulacin y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separacin del sustrato mediante.

Algunas desventajas: son cultivos homogneos en los que se pierden las interacciones.

Los tipos de sustrato ms empleados en la actualidad son los siguientes:

Vidrio.- tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilizacin. Plstico desechable.- empleado como material desechable estril por irradiacin. El plstico ms empleado es el poliestireno, de buena calidad ptica. uso de membranas plsticas porosas.- especialmente para el cultivo de clulas epiteliales polarizadas. Microsoportes ("microcarriers").- Estas bolas con las clulas adheridas se mantienen en suspensin. Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las clulas en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colgeno o fibronectina liberada por las clulas, o bien sobre superficies recubiertas de protenas de matriz extracelular "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus caractersticas diferenciadas precisan de suplementos especficos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las clulas penetran, estableciendo una distribucin tridimensional: geles de colgeno, esponja de celulosa sola, o recubierta de colgeno. Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesin celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel. Interfases lquido-gel o lquido-lquido. Se han observado en algunas situaciones proliferacin celular y adhesin a las interfases lquido-lquido o lquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos. placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaos: 3,5, 6,0 y 10 cm de dimetro son las ms empleadas cuando se trata de crecer las clulas para usar directamente en experimentos. La fase gaseosa. Los componentes ms significativos de la fase gaseosa son el oxgeno y el dixido de carbono. Propiedades fsicas. Las caractersticas del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensin superficial. 1. PH y capacidad tamponadora.2. Osmolaridad.3. Temperatura.4. Viscosidad.5. Tencin superficial. Condiciones fisiolgicas. Hacen referencia a la composicin del medio.

Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa. Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso ms corriente, contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adicin de suero (10%). RPMI 1640. Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas en suspensin. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentracin de aminocidos y vitaminas que el BME. Se usa para la seleccin de hibridomas suplementado con HAT o HT. Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy til para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. McCoy 5A. Medio diseado para el crecimiento para el crecimiento de lneas celulares diploides tanto de rata como humanas. Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus.

Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas, debe ser suplementado con protenas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es til para el cultivo de clulas amniticas. Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares son suplementos protenicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero. Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de cromosomopatas.

Todo medio de cultivo est formado por los siguientes elementos:

Soluciones salinas equilibradas (BSS). Aminocidos. Vitaminas Glucosa. Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular. Hormonas y factores de crecimiento (suero). Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibiticos y antifngicos).

Las contaminaciones. Uno de los problemas ms frecuentes en el cultivo de tejidos en general es el de las contaminaciones. Las clulas eucariotas en cultivo crecen lentamente, con tiempos de duplicacin superiores en muchos casos a las 24 h. Sin embargo, tanto las bacterias como las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. Si se da el caso de una contaminacin por estos organismos pueden provocar la muerte del cultivo en poco tiempo. Para evitarlo se utilizan una serie de tcnicas de trabajo que suponen la mxima asepsia, as como la esterilizacin del material y el trabajo en ambientes estriles (cabina de flujo laminar). Asimismo se utilizan ccteles de sustancias antimicrobianas y antifngicas en el medio aunque en multitud de ocasiones no es posible usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparicin de microorganismos.

Contaminacin bacteriana y por levaduras. Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el crecimiento de los contaminantes microbianos, y los procedimientos habituales de manipulacin (abertura de recipientes, pipeteado,...) son susceptibles de provocar contaminacin por bacterias.

La fuente ms frecuente de contaminacin es la atmsfera. Las precauciones a tomar sern: trabajo en ambiente estril, en una cabina de flujo laminar o en el rea de influencia de un mechero bunsen. usar pipeteadores automticos y pipetas automticas. Si no se dispone de estos nunca pipetear directamente con la boca sino mediante un tubo de goma y intercalando algodn en la boca de la pipeta. mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible. todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un bao deben secarse cuidadosamente antes de usarlas. ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es posible. si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su anlisis conviene hacerlo en ambiente estril y despus limpiar cuidadosamente el rea de trabajo y conectar la iluminacin UV.

Contaminacin por micoplasmas. Los micoplasmas son clulas procariotas pequeas (0,3 a 0,5 m de dimetro) que pueden formar pequeas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumona bovina. No poseen pared celular y por ello slo son capaces de crecer en ciertos medios. Los contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale (humano), M.hyorhinis (cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y tambin de roedores).

Contaminacin por virus. La contaminacin viral es un problema grave pues su prevencin y eliminacin es realmente difcil. Desde que se descubri que el suero bovino poda ser una fuente importante de contaminacin por diferentes virus (herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es limitada. Por ello la nica alternativa es el uso de medios libres de suero.

Tcnicas de contaje celular El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia elctrica que se producen cuando una partcula no conductora en suspensin en un electrolito atraviesa un pequeo orificio. Una pequea abertura entre los electrodos es la zona sensible a travs de la que pasan las partculas que se encuentran en suspensin. Cuando una partcula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partcula. Controlando la cantidad de la suspensin que circula a travs del orificio es posible contar y medir el tamao de las partculas. Es posible contar y medir varios miles de partculas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0,25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0,1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0,1 milmetro cbico, es decir 0,1 microlitro. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es el de tincin con azul tripn. El azul tripn es un coloide que se introduce en el interior de las clulas que presentan roturas en la membrana. As pues las clulas que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Mtodos de disgregacin de clulas en placa La disociacin tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que es necesario separar las clulas entre s y de un sustrato manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo es necesario romper la malla de protenas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las molculas proteicas de la matriz extracelularGeneralmente los mtodos empleados se pueden clasificar en tres categoras: Mecnicos.- En cultivos celulares se emplean los mtodos de rascado de la placa para arrancar las clulas adheridas. Qumicos. se trata de la adicin de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. Enzimticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activa.

El laboratorio de cultivo celular.

El rea de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vas de paso y a ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de clulas. La solucin ideal es disponer de una habitacin aislada.

En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho se encuentran los siguientes tipos de instrumentos:

Las cabinas de flujo laminar. Su funcin es la de mantener un rea libre de partculas, especialmente de posibles contaminantes que puedan acceder al cultivo. Incubadores. Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los laboratorios de biologa. Incubador de CO2. El mantenimiento de la temperatura en una atmsfera con una tensin controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2. Incubadores tipo "roller". Se trata de un incubador o estufa, en el interior del cual se ha instalado un "rotor" de baja velocidad. Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas. Instrumentos pticos de observacin: microscopio de contraste de fases invertido. El control morfolgico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. Congeladores e instalacin de criogenia (depsito de N2 lquido). Es recomendable que los congeladores y la instalacin de criogenia estn en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio. Equipo de esterilizacin: autoclave y equipo de filtracin. La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no slo al medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios lquidos o slidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con ste en algn momento de su manipulacin.

Referencias.1. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, y Peter Walter. Molecular Biology of the Cell, Editorial Garland, 4ta. Edicin (2002).

2. Cultek, cultivos celulares.3. http://www.ehu.es/biofisica/juanma/mbb/pdf/cultivo_celular.pdf4. Arshad Chaudry (Agosto 2004). The Science Creative Quarterly. Consultado el 8 de marzo de 2010 16Lesly Pamela Bejarano Hernandez.