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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACY T-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN- INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN
ENFERMEDADES GENÉTICAS Y METABÓLICAS –INVEGEM-
INFORME FINAL
CUANTIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL DE LOS DISTINTOS TRANSCRITOS DE BCR-ABL Y SU UTILIZACIÓN PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN LEUCEMIA LINFÓBLASTICA AGUDA Y LEUCEMIA MIELOIDE
CRÓNICA
PROYECTO FODECYT No. 24-2010
Dra. Claudia Carranza Investigador Principal
GUATEMALA, NOVIEMBRE DEL 2012
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaria Nacional de
Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –
CONCYT- .
RESUMEN El objetivo general del proyecto Fodecyt No. 24-2010 es cuantificar y evaluar la
presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 quiméricos del gen BCR-ABL y su
utilidad para el estudio de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y
leucemia mieloide crónica.
En el presente estudio se incluyeron 30 pacientes con leucemia mieloide crónica y que
reciben tratamiento con imatinib o nilotinib; a los cuales se les realizaron 4 monitoreos
trimestralmente; haciendo un total de 120 determinaciones. Para ello se obtuvieron los
glóbulos blancos y/o blastos de médula ósea y/o sangre periférica, mediante lisis de
amonio. Se realizó extracción de ARN y retrotranscripción. Posteriormente se
cuantificaron las copias del gen quimérico BCR-ABL y del gen control ABL, mediante
PCR en Tiempo Real. Cada monitoreo se reportó en el sistema internacional.
Del total de pacientes analizados, el 39% presentó una respuesta óptima, un 25% presentó
una respuesta sub-optima al tratamiento y un 36% tiene un fallo a la terapia.
Un 64% alcanzaron una respuesta citogenética completa (<1%IS), un 43% tienen una
respuesta molecular mayor (<0.1%) y por último el 36% que presentó fallo a terapia no
alcanzó la respuesta citogenética completa (>1%).
Los resultados obtenidos en la cuantificación del gen BCR-ABL, son comparables con los
reportados en la mayoría de estudios similares.
En cuando a la edad, cabe destacar que se puede observar que los pacientes con leucemia
mieloide crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la
reportada en el resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre
50-60 años.
En el recuento de plaquetas se puede observar que el grupo que no alcanzó una respuesta
citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000 a 1,332,000
plaquetas/ml. En este grupo se encontró que un 62% presenta alteraciones hematológicas
como trombocitopenia, trombosis y leucopenia.
ABSTRACT The project goal is to quantify and evaluate the presence of different transcripts b2: a2, b3:
a3, e1: a2 from the chimeric BCR-ABL gene and its usefulness for the study of minimal
residual disease in leukemia acute lymphoblastic and chronic myeloid leukemia.
In the present study included 30 patients with chronic myeloid leukemia receiving imatinib
or nilotinib, to which were performed four quarterly monitoring, making a total of 120
determinations.
White blood cells or Blasts were obtained from bone marrow or peripheral blood by
ammonium lysis. RNA extraction and retrotranscription were performed. The BCR-ABL
and ABL gene copies were quantified by Real-Time PCR. Each monitoring was reported in
the international system.
Of the patients studied, 39% had an optimal response, 25% had a suboptimal response to
treatment and 36% has to therapy failure.
64% achieved a complete cytogenetic response (<1% IS), 43% have a major molecular
response (<0.1%) and finally the 36% that showed failure therapy did not achieve complete
cytogenetic response (> 1%).
The results obtained in the quantification of BCR-ABL, are comparable with those reported
in most similar studies.
As for the age, it is noteworthy that patients with chronic myeloid leukemia in Guatemala,
have a median age (<39 years) less than that reported in other countries, where the median
is between 50-60 years.
The platelet count shows that the group did not achieve a complete cytogenetic response
has more range of variation that goes from 89.000 to 1,332,000 platelets / ml. In this group
found that 62% have blood disorders including thrombocytopenia, thrombosis and
leukopenia.
OTROS AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al:
• Apoyo financiero y académico del Instituto de Investigación en
Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM-.
• Apoyo financiero de la Fundación Rozas-Botrán.
• Cooperación de la Unidad de Oncología Pediátrica –UNOP-
• Cooperación del Dr. Mauricio Villegas, Dr. Cáceres y Dra. Silvana Torselli.
BIBLIOGRAFÍA BREVE ACADÉMICA DE AUTORES .
1. Dra. Claudia Carranza PhD.
En el año 2004 se gradúo de Química Bióloga en la Universidad de San Carlos,
Posteriormente en el período 2005-2007 cursó un programa de Doctorado en Biología
Molecular y Celular, especializado en el área de Genética, en el Centro de Investigación
Médica Aplicada –CIMA- , Universidad de Navarra, Pamplona España. En el año 2008, se
incorpora en el Instituto de Investigación en enfermedades Genéticas y Métabolicas –
INVEGEM-, Guatemala; y también se incorpora como catedrática titular del curso de
Bioquímica Humana en la Facultad de Medicina, Universidad Francisco Marroquín. Su
línea de investigación se ha centrado en Genética humana, Biología Molecular del Cáncer,
Genética de neoplasias hematológicas. Actualmente se encuentra cursando un Máster en
Bioética en la Universidad del Istmo, Guatemala ( 2011-2012).
2. Licda. Swuanny Villagrán
Pensum cerrado de la carrera de Química biológica, de la Facultad de Farmacia,
Universidad San Carlos de Guatemala. Actualmente se encuentra laborando como
investigadora en el Instituto de Investigación de Enfermedades Genéticas y Metabólicas –
INVEGEM- .
TABLA DE CONTENIDOS :
PARTE I: I.1 INTRODUCCIÓN ………………………………………………............... 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL TEMA ……………………………………….. 3 I.2.1 Antecedentes en Guatemala………………………………………………. 3 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación…………………………............. 4 I.3 OBJETIVOS ……………………………………………………….. 6 I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General……………………………………………………. 6 I.3.1.2 Específicos………………………………………………… 6 I.3.2 Hipótesis……………………………………………………………. 8 I.4 METODOLOGÍA ………………………………………………………….. 9 I.4.1 Población…………………………………………………………………... 9 1.4.2 Indicadores………………………………………………………………… 9 I.4.3 Estrategia Metodológica…………………………………………………… 9 I.4.4 El Método………………………………………………………………….. 11 I.4.5 La técnica Estadística……………………………………………………… 19 1.4.6 Los instrumentos a utilizar………………………………………………… 19 PARTE II MARCO TEÓRICO ( CONCEPTUAL )……………………………………… 23 PARTE III III. RESULTADOS …………………………………………………………….. 44 III.1 Discusión de Resultados……………………………………………. 80 PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES………………………………………………………... 85 IV.2 RECOMENDACIONES ………………………………………………… 87 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………. 88 IV.4 ANEXOS…………………………………………………………………... 96 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO ……………………………………………….. 166
LISTA DE FIGURAS PAG. Figura No.1: Células mieloides inmaduras de un paciente con leucemia
mieloide crónica……………………………………………………………………. 26
Figura No. 2: Linfoblastos en un frote de médula ósea de un paciente
con leucemia linfoblástica aguda…………………………………………………… 28
Figura No. 3: Alteraciones genéticas encontradas en leucemia
linfoblástica aguda infantil (a) y adultos (b)………………………………………... 33
Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR…. 34
Figura No. 5: Translocación t(9;22)(q34:q11) en LMC……………………………. 36
Figura No. 6: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR……. 37
Figura No. 7: Probabilidad de sobrevivencia libre de eventos, según el riesgo……. 41
Figura No. 8: Gráfica de seguimiento de paciente 13-LMC……………………….. 53
Figura No. 9: Gráfica de seguimiento de paciente 15-LMC. ……………………… 54
Figura No. 10: Gráfica de seguimiento de paciente 41-LMC……………………… 55
Figura No. 11: Gráfica de seguimiento de paciente 46-LMC……………………… 56
Figura No. 12: Gráfica de seguimiento de paciente 12-LMC……………………… 57
Figura No. 13: Gráfica de seguimiento de paciente 17-LMC……………………… 58
Figura No. 14: Gráfica de seguimiento de paciente 24-LMC……………………… 59
Figura No. 15: Gráfica de seguimiento de paciente 36-LMC……………………… 60
Figura No. 16: Gráfica de seguimiento de paciente 37-LMC……………………… 61
Figura No. 17: Gráfica de seguimiento de paciente 48-LMC……………………… 62
Figura No. 18: Gráfica de seguimiento de paciente 61-LMC……………………… 63
Figura No. 19: Gráfica de seguimiento de paciente 62-LMC……………………… 64
Figura No. 20: Gráfica de seguimiento de paciente 19-LMC……………………… 65
Figura No. 21: Gráfica de seguimiento de paciente 38-LMC……………………… 66
Figura No. 22: Gráfica de seguimiento de paciente 40-LMC……………………… 67
Figura No.23: Gráfica de seguimiento de paciente 43-LMC………………………. 68
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 24: Gráfica de seguimiento de paciente 47-LMC…………………….. 69
Figura No. 25: Gráfica de seguimiento de paciente 60-LMC…………………….. 70
Figura No. 26: Gráfica de seguimiento de paciente 39-LMC…………………….. 71
Figura No. 27: Gráfica de seguimiento de paciente 16-LMC…………………….. 72
Figura No. 28: Gráfica de seguimiento de paciente 18-LMC…………………….. 73
Figura No. 29: Gráfica de seguimiento de paciente 20-LMC…………………….. 74
Figura No. 30: Gráfica de seguimiento de paciente 42-LMC…………………….. 75
Figura No. 31: Gráfica de seguimiento de paciente 44-LMC…………………….. 76
Figura No. 32: Gráfica de seguimiento de paciente 45-LMC…………………….. 77
Figura No. 33: Gráfica de seguimiento de paciente 49-LMC…………………….. 78
Figura No. 34: Gráfica de seguimiento de paciente 50-LMC……………………. 79
Figura No. 35: Bandas comparando extracción de ARN con trizol y con kit……. 96
Figura No. 36: Almacenamiento de muestras de sangre periférica en RNAlater… 97
Figura No. 37: Trizol, reactivo que se utilizará para la extracción de ARN…….. 97
Figura No. 38: El reactivo trizol es agregado a las muestras…………………….. 98
Figura No. 39: El trizol de color rosa sobre la muestra de pacientes. …………… 98
Figura No. 40: Lisis con trizol de la muestra……………………………………… 99
Figura No. 41: Dispensación de cloroformo para la separación
de fases del ARN obtenido……………………………………………………….. 99
Figura No. 42: Tubo mezclado con cloroformo y trizol, listo para centrifugación... 100
Figura No. 43: Centrifugación de muestras para separación de fases……………... 100
Figura No. 44: Separación de fases; la fase superior lofórmica contiene el
ARNde interés……………………………………………………………………… 101
Figura No. 45: Dispensación de etanol para precipitación del ARN……………..... 101
Figura No. 46: Preparación de muestras y reactivos para QRT-PCR………………. 102
Figura No. 47: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL, primera evaluación del kit. 103
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 48: Amplificación de los estándares de BCR-ABL
Normalizada de la primera evaluación del kit……………………………. 103
Figura No. 49: Amplificación de los estándares de BCR-ABL, de la primera
evaluación del kit………………………………………………………………... 104
Figura No. 50: Amplificación normalizada de los estándares de ABL de la
primera evaluación del kit………………………………………………………. 104
Figura No. 51: Amplificación de los estándares de ABL, de la primera
evaluación del kit. ………………………………………………………………. 105
Figura No. 52: Amplificación del gen ABL de los controles positivos,
de la primera evaluación del kit…………………………………………………. 105
Figura No. 53: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
normalizada, de la primera evaluación del kit…………………………………… 106
Figura No. 54: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
de la primera evaluación del kit…………………………………………………. 106
Figura No. 55: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL de la segunda
evaluación del kit. ……………………………………………………………….. 108
Figura No. 56: Amplificación de los estándares de ABL de la segunda
evaluación del kit……………………………………………………………….... 108
Figura No. 57: Amplificación de los estándares de ABL normalizada
de la segunda evaluación del kit. ………………………………………………… 109
Figura No. 58: Amplificación de los estándares de BCR-ABL de la segunda
evaluación del kit………………………………………………………………… 109
Figura No. 59: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada
de la segunda evaluación del kit……………………………………………….… 110
Figura No. 60: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
normalizada de la segunda evaluación del kit…………………………………… 110
Figura No. 61: Amplificación de los controles positivos del gen ABL
normalizada de la segunda evaluación del kit…………………………………… 111
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 62: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL de la evaluación
del segundo kit. ………………………………………………………………. 113
Figura No. 63: Amplificación de los estándares de ABL normalizada
de la evaluación del segundo kit………………………………………………. 113
Figura No. 64: Amplificación de los estándares de ABL de la evaluación
del segundo kit………………………………………………………………… 114
Figura No. 65: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada
de la evaluación del segundo kit……………………………………………………… 114
Figura No. 66: Amplificación de los estándares de BCR-ABLde la
evaluación del segundo kit…………………………………………………….. 115
Figura No. 67: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
normalizada de la evaluación del segundo kit…………………………………. 115
Figura No. 68: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
de la evaluación del segundo kit……………………………………………….. 116
Figura No. 69: Amplificación del gen ABL y BCR-ABL del primer
monitoreo de pacientes ………………………………………………………… 118
Figura No. 70: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL del primer
monitoreo de pacientes. ………………………………………………………... 119
Figura No.71: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada
del primer monitoreo de pacientes……………………………………………… 119
Figura No. 72: Amplificación de los estándares de ABL normalizada del
primer monitoreo de pacientes………………………………………………….. 120
Figura No. 73: Amplificación de los controles positivos del gen ABL
normalizada del primer monitoreo de pacientes………………………………… 120
Figura No. 74: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL
del primer monitoreo de pacientes………………………………………………. 121
Figura No. 75: Amplificación de muestras de pacientes de no. 1-11
del primer monitoreo……………………………………………………………. 121
Figura no. 76: Amplificación de muestras de pacientes de no. 1-11 normalizada
del primer monitoreo…………………………………………………………….. 122
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 77: Curva estándar de BCR-ABL de la segunda corrida del
Primer monitoreo de pacientes …………………………………………..….. 125
Figura No. 78: Curva estándar de ABL de la segunda corrida del
primer monitoreo de pacientes……………………………………………….. 125
Figura No. 79: Amplificación de cada una de las muestras, de la segunda
corrida del primer monitoreo de pacientes…………………………………… 126
Figura No. 80: Amplificación de los estándares de ABL normalizada de la
segunda corrida del primer monitoreo de pacientes………………………….. 126
Figura No. 81: Amplificación de los estándares de BCR-ABL
normalizada de la segunda corrida del primer monitoreo…………………….. 127
Figura No. 82: Amplificación de los controles del gen ABL de la segunda
corrida del primer monitoreo de pacientes…………………………………………. 127
Figura No. 83: Amplificación de los controles del gen BCR-ABL normalizada
de la segunda corrida del primer monitoreo……………………………………. 128
Figura No. 84: Amplificación de las muestras del gen BCR-ABL normalizada
de la segunda corrida del primer monitoreo……………………………………. 128
Figura No. 85: Amplificación de las muestras del gen ABL de la segunda
corrida del primer monitoreo…………………………………………………… 129
Figura No. 86: Curva estándar del gen ABL de la tercera corrida del
primer monitoreo de pacientes………………………………………………….. 130
Figura No. 87: Curva estándar del gen BCR-ABL de la tercera
corrida del primer monitoreo de pacientes……………………………………… 131
Figura No. 88: Amplificación de todas las muestras, de la tercera
corrida del primer monitoreo……………………………………………………. 131
Figura No. 89: Amplificación de los estándares del gen control ABL
normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo……………………….. 132
Figura No. 90: Amplificación de los estándares del gen control BCR-ABL
normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo.……………………… 132
Figura No. 91: Amplificación de las muestras del gen ABL
normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo……………………….. 133
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 92: Amplificación del gen control BCR-ABL normalizada
de la tercera corrida del primer monitoreo……………………………………. 133
Figura No. 93: Amplificación de los cuatro estándares del gen control ABL
normalizada para la cuarta corrida del segunda jornada……………………… 135
Figura No. 94: Amplificación de los estándares del gen ABL de la cuarta
corrida del segunda jornada………………………………………………………….. 136
Figura No. 95: Amplificación del transcrito BCR-ABL de la cuarta corrida
del segunda jornada……………………………………………………………. 136
Figura No. 96: Amplificación del gen BCR-ABL de la cuarta corrida del
segunda jornada………………………………………………………………… 137
Figura No. 97: Curva estándar del gen control ABL de la cuarta corrida
del segunda jornada…………………………………………………………….. 137
Figura No. 98: Curva estándar del gen BCR-ABL de la cuarta corrida
del segunda jornada…………………………………………………………….. 138
Figura No. 99: Se observa la amplificación de los controles alto, mediano
y negativo del gen BCR-ABL………………………………………………… 138
Figura No. 100: Se observa la amplificación del gen control ABL en
las muestras de pacientes no. 11-25…………………………………………….. 139
Figura No. 101: Amplificación del gen ABL en muestras de pacientes de
la cuarta corrida segunda jornada………………………………………………. 139
Figura No. 102: Amplificación del gen control BCR-ABL en las muestras
de pacientes no. 11-35………………………………………………………….. 140
Figura No. 103: Se observa la amplificación del gen control BCR-ABL
en la muestras de paciente no. 11-25. …………………………………………. 140
Figura No. 104: Amplificación del gen BCR-ABL de muestras de pacientes
segundo monitoreo……………………………………………………………… 143
Figura No. 105: Amplificación del gen control ABLen muestras de pacientes
en el segundo monitoreo………………………………………………………… 144
Figura No. 106: Amplificación del gen BCR-ABL en el segundo monitoreo….. 144
Figura No. 107: Amplificación del gen BCR-ABL en el segundo monitoreo…. 145
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 108: Amplificación del gen control ABL normalizada en el
segundo monitoreo…………………………………………………………. 145
Figura No. 109: Amplificación de curva estándar del gen ABL en el
segundo monitoreo………………………………………………………….. 146
Figura No.110 : Amplificación de estándares y 10 pacientes,
del segundo monitoreo……………………………………………………… 146
Figura No. 111: Amplificación de muestras de pacientes del gen BCR-ABL
en la segunda jornada del segundo monitoreo…………………………….. 147
Figura No. 112: Amplificación del gen control ABL de los pacientes
analizados en la segunda jornada del segundo monitoreo…………………. 147
Figura No. 113: Amplificación de muestras y estándares de la segunda
jornada del segundo monitoreo……………………………………………... 148
Figura No. 114: Curva de estándares del gen control ABL de la segunda
jornada del segundo monitoreo……………………………………………… 148
Figura No. 115: Amplificación de muestras de 15 pacientes y curva estándar
de la tercera jornada del segundo monitoreo………………………………… 149
Figura No. 116: Amplificación de muestras de pacientes de la tercera jornada
del segundo monitoreo………………………………………………………. 149
Figura No. 117: Amplificación de gen control ABL de la tercera jornada
de la segunda monitoreo……………………………………………………… 150
Figura No. 118: Amplificación de curva estándar del gen BCR-ABL de la
tercera jornada del segundo monitoreo………………………………………. 150
Figura No. 119: Amplificación del gen ABLen muestras de pacientes de la
tercera jornada del segundo monitoreo………………………………………. 151
Figura No. 120: Amplificación del gen BCR-ABL de muestras de pacientes
del tercer monitoreo…………………………………………………………... 153
Figura No. 121: Amplificación del gen control ABL en muestras de
pacientes del tercer monitoreo……………………………………………….. 153
Figura No. 122: Amplificación del gen BCR-ABL del tercer monitoreo……. 154
LISTA DE FIGURAS PAG.
Figura No. 123: Amplificación de curva estándar del gen ABL del
tercer monitoreo………………………………………………………………. 154
Figura No.124 : Amplificación de estándares y pacientes, del tercer monitoreo
Figura No. 125: Curva estándar del gen control ABL del tercer monitoreo…… 155
Figura No. 126: Curva estándar del gen BCR-ABL del tercer monitoreo……. 155
Figura No. 127: Amplificación de muestras de 15 pacientes y curva
estándar de la segunda jornada del tercer monitoreo…………………………… 158
Figura No. 128: Amplificación de gen control ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo…………………………………………………….. 159
Figura No. 129: Amplificación de estándares del gen ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo…………………………………………………….. 159
Figura No. 130: Amplificación de estándares del gen BCR-ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo……………………………………………………. 160
Figura No. 131: Amplificación del gen BCR-ABL de los pacientes analizados
de la segunda jornada del tercer monitoreo…………………………………….. 160
Figura No. 132: Gráfica de estándares de BCR-ABL de la segunda
jornada del tercer monitoreo……………………………………………………. 161
Figura No. 133: Curva estándar del gen ABL de la segunda jornada del
tercer monitoreo………………………………………………………………… 161
Figura No. 134: Amplificación de muestras y calibradores del cuarto monitoreo. 163
Figura No. 135: Amplificación de estándares del gen BCR-ABL del
cuarto monitoreo………………………………………………………………… 163
Figura No. 136: Amplificación de muestras del cuarto monitoreo…………….. 164
Figura No. 137: Amplificación de estándares del gen ABL del cuarto monitoreo 164
Figura No. 138: Curva estándar del gen control ABL del cuarto monitoreo….. 165
Figura No. 139: Curva estándar del gen BCR-ABL del cuarto monitoreo……. 165
LISTA DE TABLAS PAG.
Tabla No. 1: Peso molecular de transcritos…………………………. 18
Tabla No. 2 Clasificación citomorfológica de leucemias agudas
linfoblásticas (lal) de acuerdo al grupo cooperativo franco americano
- británico (fab)……………………………………………………… 30
Tabla No.3: Resultados de los cuatro monitoreos de los
pacientes analizados………………………………………………….. 45
Tabla No 4: Evaluación de la respuesta al tratamiento imatinib……. 48
Tabla No. 5 : Respuesta al imatinib del total de pacientes analizados. 49
Tabla No. 6: Pacientes y las respuestas alcanzadas………………….. 50
Tabla No 7: Respuesta al imatinib alcanzada durante el monitoreo
molecular……………………………………………………………… 50
Tabla No. 8: Datos clínicos y hematológicos…………………………. 52
Tabla No. 9: Resultado de MCGR, CCGR y MMR en distintos estudios 82
Tabla No. 10: Parámetros evaluados durante la primera corrida……… 107
Tabla No. 11: Parámetros evaluados durante la primera corrida. …….. 112
Tabla No. 12: Parámetros evaluados durante corrida………………….. 117
Tabla No. 13: Parámetros evaluados…………………………………... 123
Tabla No.14: Resultados de pacientes primera corrida………………… 124
Tabla No. 15: Resultados de pacientes de segunda corrida……………. 129
Tabla No. 16: Resultados de tercera corrida de pacientes……………… 134
Tabla No. 17: Resultados globales de los 10 pacientes ………………… 134
Tabla No. 18 : Resultados obtenidos de la corrida de pcr en tiempo real de
los pacientes 11-25……………………………………………………… 141
Tabla No. 19: Resultados e interpretación de los pacientes……………. 142
Tabla No. 20 resultados de validación de corridas del tercer monitoreo 152
Tabla No. 21: Resultados en numero de copias de BCR-ABL……….. 157
Tabla No. 22: Resultados de validación de corridas…………………... 157
RESUMEN El objetivo general del proyecto Fodecyt No. 24-2010 es cuantificar y evaluar la
presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 quiméricos del gen BCR-ABL y su
utilidad para el estudio de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y
leucemia mieloide crónica.
En el presente estudio se incluyeron 30 pacientes con leucemia mieloide crónica y que
reciben tratamiento con imatinib o nilotinib; a los cuales se les realizaron 4 monitoreos
trimestralmente; haciendo un total de 120 determinaciones. Para ello se obtuvieron los
glóbulos blancos y/o blastos de médula ósea y/o sangre periférica, mediante lisis de
amonio. Se realizó extracción de ARN y retrotranscripción. Posteriormente se
cuantificaron las copias del gen quimérico BCR-ABL y del gen control ABL, mediante
PCR en Tiempo Real. Cada monitoreo se reportó en el sistema internacional.
Del total de pacientes analizados, el 39% presentó una respuesta óptima, un 25% presentó
una respuesta sub-optima al tratamiento y un 36% tiene un fallo a la terapia.
Un 64% alcanzaron una respuesta citogenética completa (<1%IS), un 43% tienen una
respuesta molecular mayor (<0.1%) y por último el 36% que presentó fallo a terapia no
alcanzó la respuesta citogenética completa (>1%).
Los resultados obtenidos en la cuantificación del gen BCR-ABL, son comparables con los
reportados en la mayoría de estudios similares.
En cuando a la edad, cabe destacar que se puede observar que los pacientes con leucemia
mieloide crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la
reportada en el resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre
50-60 años.
En el recuento de plaquetas se puede observar que el grupo que no alcanzó una respuesta
citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000 a 1,332,000
plaquetas/ml. En este grupo se encontró que un 62% presenta alteraciones hematológicas
como trombocitopenia, trombosis y leucopenia.
ABSTRACT The project goal is to quantify and evaluate the presence of different transcripts b2: a2, b3:
a3, e1: a2 from the chimeric BCR-ABL gene and its usefulness for the study of minimal
residual disease in leukemia acute lymphoblastic and chronic myeloid leukemia.
In the present study included 30 patients with chronic myeloid leukemia receiving imatinib
or nilotinib, to which were performed four quarterly monitoring, making a total of 120
determinations.
White blood cells or Blasts were obtained from bone marrow or peripheral blood by
ammonium lysis. RNA extraction and retrotranscription were performed.
The BCR-ABL and ABL gene copies were quantified by Real-Time PCR. Each monitoring
was reported in the international system.
Of the patients studied, 39% had an optimal response, 25% had a suboptimal response to
treatment and 36% has to therapy failure.
64% achieved a complete cytogenetic response (<1% IS), 43% have a major molecular
response (<0.1%) and finally the 36% that showed failure therapy did not achieve complete
cytogenetic response (> 1%).
The results obtained in the quantification of BCR-ABL, are comparable with those reported
in most similar studies.
As for the age, it is noteworthy that patients with chronic myeloid leukemia in Guatemala,
have a median age (<39 years) less than that reported in other countries, where the median
is between 50-60 years.
The platelet count shows that the group did not achieve a complete cytogenetic response
has more range of variation that goes from 89.000 to 1,332,000 platelets / ml. In this group
found that 62% have blood disorders including thrombocytopenia, thrombosis and
leukopenia.
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
En general, el cáncer sigue siendo un reto para la ciencia pues hasta el momento su
porcentaje de curación es muy bajo. Sin embargo, actualmente una gran variedad de
instituciones se han dedicado a investigar este tipo de enfermedades con el fin de tener un
mayor conocimiento de cómo se produce, y de esta manera poder encontrar un tratamiento
adecuado.
Las neoplasias suelen ser de origen genético adquirido es decir que se presentan como
resultado de una gran variedad de alteraciones genéticas, que pueden ir desde mutaciones,
deleciones e inserciones en genes; hasta pérdidas o ganancias de varios cromosomas.
Se han encontrado una gran variedad de marcadores genéticos asociados a los
distintos tipos de neoplasias; y se ha visto que estos marcadores pueden dar una gran
variedad de información al médico, hasta permitirle un diagnóstico certero, darle
información sobre el pronóstico, e incluso orientar a tratamientos más específicos.
Las neoplasias hematológicas se han estudiado ampliamente mediante técnicas
citogenéticas y moleculares. Este hecho ha permitido conocer mejor los mecanismos
alterados relacionados con el desarrollo de la neoplasia. Las neoplasias hematológicas
forman un grupo de enfermedades que provienen de la expansión clonal de células
hematopoyéticas y constituyen una colección heterogénea de neoplasias originadas en el
tejido formador de la sangre.
La leucemia linfoblástica aguda es un tipo de neoplasia hematológica que se
caracteriza por la alteración del crecimiento de las células de la línea hematopoyética
linfoide. Esta enfermedad se encuentra frecuentemente en la población en general. Se han
asociado a esta leucemia una gran variedad de marcadores genéticos, que brindan
información muy importante y que además son el blanco de estudio de muchos científicos.
Uno de los marcadores encontrados frecuentemente en LLA es la alteración BCR-ABL,
que suele ser de muy mal pronóstico. Se han encontrado una gran variedad de transcritos
(b2:a2, b3:a3, e1:a2) producidos por esta alteración.
El marcador genético BCR-ABL también se encuentra presente en leucemias
mieloides crónicas en un 90%. Sin embargo, en esta enfermedad se conoce que funciona
muy bien un tratamiento conocido con el nombre de Imatinib, que fue producido
específicamente para la alteración BCR-ABL. Es importante estudiar este marcador
también en LMC, debido a que el tratamiento con Imatinib posee un costo muy elevado,
por lo que debe administrarse únicamente en pacientes que posean dicha alteración.
En Guatemala, no se ha estudiado con anterioridad la genética de las leucemias, y
además por lo mismo no se ha podido contar con esta herramienta para el mejor manejo de
la enfermedad. Actualmente el Instituto de Investigaciones en Genética –INVEGEM- de la
Fundación Rozas-Botrán ha empezado este tipo de proyectos; el primer proyecto de
investigación ya concluido fue sobre cuatro marcadores genéticos asociados a LLA ( E2A-
PBX1, MLL-AF4, ETV6-AML1 y BCR-ABL), con el fin de orientar sobre el pronóstico y
tratamiento de la misma; este proyecto también obtuvo de co-financiación de la Secretaría
nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT-, mediante su línea FODECYT. Y luego
también se goza de financiamiento de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología,
mediante su línea FODECYT para determinar la presencia de monosomía del cromosoma 7
en pacientes con leucemia mieloide aguda.
Para continuar con el avance en el estudio de las neoplasias hematológicas, se ha
planteó cuantificar, mediante técnicas moleculares, la presencia de los distintos transcritos
(b2:a2, b3:a3, e1:a2) del gen BCR-ABL. Una vez evaluada la presencia de estos
marcadores, se procedió a utilizarlos para monitorear la respuesta al tratamiento; así como
para detectar la presencia de enfermedad mínima residual, es decir determinar la presencia
periódica de clones celulares con alguno de estos marcadores, que puedan indicar una
posible recaída.
Con este estudio se pretendió por un lado continuar con la caracterización genética de
leucemias de la población guatemalteca; así como ayudar al hemato-oncólogo en el manejo
de la enfermedad, al realizar un monitoreo periódico de la presencia de dichos marcadores.
Se analizaron un total de 30 pacientes con diagnóstico clínico de leucemia
linfoblástica aguda, a los cuales se les realizó un total de 4 monitoreos del % BCR-
ABL/ABL espaciados por 3-4 meses.
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)
En Guatemala, la genética humana se encuentra desarrollada pobremente.
Actualmente no existen publicaciones guatemaltecas que involucren estudios de genética en
humanos. La biología molecular es una herramienta útil para el área de genética humana.
Los estudios sobre enfermedades de origen genético como las neoplasias
hematológicas poseen un alto impacto en países en vías de desarrollo como Guatemala.
Pues gracias a estos estudios se puede apoyar en diagnóstico y pronóstico al clínico
hematólogo. Y por otro lado también es posible la caracterización genética de nuestra
población en distintas enfermedades.
El único estudio epidemiológico sobre leucemias infantiles realizado en
Centroamérica, incluyendo México, fue el realizado por Arangúre y colaboradores; en
donde se incluyeron datos de pacientes desde 1996 hasta el 2000. El promedio anual de
incidencia obtenido fue de: 44.9 por millón de niños para leucemia linfoblástica aguda –
LLA-( el principal tipo de leucemia infantil). (1)
A nivel mundial, principalmente en países desarrollados se han implementado como
técnicas de rutina, el análisis de la presencia de distintos marcadores genéticos para cada
una de las neoplasias hematológicas. Además se esta realizando una amplia investigación
para conocer mejor el desarrollo de esta afecciones, para encontrar también nuevos
biomarcadores y para establecer nuevas estrategias terapéuticas.(2)
En España, se ha tenido experiencia personal en la caracterización genética de
neoplasias hematológicas mediante la utilización de distintas técnicas moleculares
citogenéticas, principalmente en la búsqueda de nuevos mecanismos que expliquen la
sobreexpresión del gen EVI1, un gen importante en leucemias mieloides agudas. (3)
En Guatemala, El Instituto de Investigaciones en Genética –INVEGEM- de la
FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN; formado por la inquietud de varios investigadores
guatemaltecos y extranjeros en desarrollar la genética humana en Guatemala, y ser una
institución a la vanguardia en los países centroamericanos; se encuentra desarrollando una
gran variedad de proyectos relacionados.
En el área hemato-oncológica, nuestro equipo se encuentra desarrollando el primer
proyecto de investigación en Guatemala sobre neoplasias hematológicas. Este proyecto se
inició en el año 2009, y contó con financiamiento de la Secretaría Nacional de Ciencia y
Tecnología –SENACYT-, a través de su línea FODECYT. El objetivo global de este
estudio es detectar la presencia de los transcritos de fusión BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-
AF4 y ETV6-AML1 en leucemia linfoblástica aguda; estos transcritos confieren
información importante sobre el pronóstico y el tipo de terapia a escoger. Con este proyecto
se ha empezado un largo y extenso objetivo que es el de caracterizar genéticamente las
neoplasias hematológicas en la población guatemalteca. Todo esto a largo plazo nos
permitirá seleccionar algunos genes importantes, con el fin de estudiar sus funciones,
mecanismos de activación, etc. Y con todo esto describir nuevos procesos y buscar nuevos
tratamientos más eficaces (4)
Para continuar con este extenso proyecto, ahora se ha planteado cuantificar los
transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 del gen BCR-ABL. Y se piensa dar un paso más que el
proyecto anterior, ya que con los marcadores encontrados se va a monitorear la respuesta al
tratamiento de la enfermedad; y también se buscará encontrar la presencia de enfermedad
mínima residual.
En los países cercanos a Guatemala, el único que ya ha realizado el estudio de los
distintos transcritos del gen BCR-ABL fue el realizado por Arana, et al. en el país de
México en el año 2002. En donde se caracterizaron 250 pacientes con leucemia mieloide
crónica. (5)
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Las técnicas moleculares y citogenéticas se han convertido en países desarrollados en
herramientas clínicas importantes en neoplasias; pues sirven de soporte para el manejo
global de la enfermedad. Ya que como se ha descrito anteriormente proporcionan
información para obtener un diagnóstico más certero; así como indican el pronóstico de la
enfermedad, orientan al tratamiento y permiten el monitoreo del avance de la misma.
La utilización de estas técnicas en países en vías de desarrollo ha sido muy limitada;
debido a que suelen ser procedimientos de alto coste económico y además también por la
falta de personal calificado para realizar la misma.
Actualmente en Guatemala, no se cuenta con el apoyo de estas técnicas para el
manejo de neoplasias hematológicas; es por esta razón que INVEGEM, se ha propuesto el
desarrollo de las mismas, con el fin de detectar los marcadores genéticos principales en
nuestro país, y ponerlos a disposición de toda la población afectada por algún tipo de
leucemia. Con ello se pretende proporcionar un nuevo panorama al hemato-oncólogo en el
manejo de leucemias; y con ello lograr que una mayor cantidad de pacientes remitan y no
vuelvan a presentar recaídas.
La cuantificación de los distintos transcritos de BCR-ABL en la población
guatemalteca, permitirá monitorear la presencia de enfermedad mínima residual.
Por otro lado este proyecto permitirá continuar con la caracterización genética de las
leucemias en Guatemala, y con ello detectar los marcadores asociados a nuestra población;
para posteriormente seleccionar algunos para la realización de estudios más específicos
sobre mecanismos de acción, mutaciones, y búsqueda de nuevas opciones terapéuticas.
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1 OBJETIVOS
I.3.1.1 Objetivo General
• Cuantificar y evaluar la presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2
quiméricos del gen BCR-ABL y su utilidad para el estudio de enfermedad
mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica.
I.3.1.2 Objetivos Específicos
• Cuantificar y evaluar la presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2
quiméricos del gen BCR-ABL y su utilidad para el estudio de enfermedad
mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica.
• Estandarizar la técnica de PCR en tiempo real para cuantificar los distintos
transcritos de b2:a2, b3:a3, e1:a2 producidos por la translocación BCR-ABL.
• Evaluar la presencia de los transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 del gen quimérico
BCR-ABL mediante RT-PCR en todos los pacientes con leucemia linfoblástica
aguda y leucemia mieloide crónica.
• Monitorear y evaluar la respuesta al tratamiento de los pacientes con leucemia
linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica, mediante la cuantificación
periódica (cada 3-4 meses) de los transcritos de BCR-ABL encontrados.
• Establecer la presencia de enfermedad mínima residual en los pacientes con
leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica que han recibido
tratamiento.
• Divulgar los resultados obtenidos, a las distintas entidades que atienden
pacientes con leucemias para ofrecerles el mismo servicio.
I.3.1 Hipótesis descriptiva
Nuestra hipótesis es que la cuantificación de la presencia de los transcritos b2:a2,
b3:a3, e1:a2 del gen quimérico BCR-ABL en leucemia linfoblástica aguda y en leucemia
mieloide crónica; permitirá monitorear el desarrollo de enfermedad mínima residual, de
manera que se evite las posibles recaídas que la leucemia pueda presentar.
.
I.4 METODOLOGÍA (INCLUYE LA LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA )
I.4.1 LOCALIZACIÓN
El presente estudio, analiza pacientes con leucemia mieloide crónica y/o leucemia
linfoblástica aguda provenientes de todos los departamentos de Guatemala; y que han sido
referidos al Hospital San Juan de Dios y Hospital Roosevelt.
I.4.2 INDICADORES
La determinación del porcentaje en el sistema internacional, se obtendrá de la relación
copias BCR-ABL/copias ABL *100 * factor de conversión. Dichos datos se obtendrán de
un analizador llamado Real Time PCR fast 7500 de APPLIED BIOSYTEMS
I.4.3 ESTRATEGIA METODOLÓGICA
El estudio que se pretende realizar es de tipo descriptivo longitudinal prospectivo,
esto debido a que se cuantificará la presencia de los distintos transcritos de manera
periódica; cada 3 ó 4 meses, una vez identificado la presencia de alguno de ellos en medula
ósea, y con esto se pretende monitorear el transcurso de la enfermedad. Esto se realizará
por el período de un año y medio; una vez iniciado el proyecto.
I.4.3.1 POBLACIÓN
La población objetivo de este estudio la integran todos los pacientes con
diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide crónica; sin
importar la edad, ni el tiempo de padecer la enfermedad que posean cualquier
transcrito de BCR-ABL positivo, para permitir el monitoreo de la enfermedad.
I.4.3.2 TÉCNICA DE MUESTREO Y CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y
EXCLUSIÓN.
La técnica de muestreo a utilizar es por conveniencia. Y los criterios de inclusión
son:
• Paciente con leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide crónica
• Edad: 0 años a 99 años.
• Casos nuevos o paciente ya en tratamiento
• Presencia de algún transcrito de BCR-ABL
Y los Criterios de exclusión son:
• Paciente que presente otras formas de leucemia
• Casos que presenten transcritos diferentes de BCR-ABL
I.4.3.3 MUESTRA
Pacientes con diagnóstico de Leucemia linfoblástica aguda y leucemia
mieloide crónica referidos por el Doctor hematólogo Julio Caceres, presidente de la
asociación para tratamiento con Imatinib de pacientes BCR-ABL positivo; o
referidos del área de hematooncología del IGGS, del Hospital de Quetzaltenango y
del Hospital Roosevelt; que presenten todos los criterios de inclusión mencionados
anteriormente. La cantidad de muestras que se analizará, serán todas las
recolectadas en el período de un año y medio de realización del proyecto ( 100
aproximadamente), cuya fecha de inicio dependerá de la fecha de inicio del
proyecto.
I.4.3.4 PLAN ESTADÍSTICO
Al ser un estudio de tipo descriptivo, no se aplicará ningún modelo
estadístico, únicamente se cuantificará la presencia del transcrito para monitoreo de
la enfermedad.
I.4.3.4 EVALUACIÓN BIOETICA
Se solicitará mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de
los pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su
ejecución, en el caso de tratarse de menores de edad, el encargado responsable del
paciente debe aceptar el consentimiento; los niños que estén en uso de razón
firmarán la hoja de asentimiento.
I.4.3.4 IMPACTO AMBIENTAL
El único compuesto que es tóxico que se utilizará en el presente proyecto es el
bromuro de etidio, el cual se eliminará mediante el uso de carbón activado. Los
líquidos contaminados con bromuro de etidio se filtrarán con carbón activado para
su posterior eliminación. Los residuos solidos se colocarán en contacto con carbón
activado y posteriormente se enviarán para su incineración.
I.4.4 MATERIALES Y MÉTODOS
I.4.4.1 MATERIALES Y REACTIVOS.
A. Médula ósea de pacientes diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda o
leucemia mieloide crónica.
B. Kit para extracción de linfocitos de médula ósea (FICOLL, GENERAL
ELECTRIC)
C. Kit de extracción de RNA (APPLIED BIOSYSTEMS, USA)
D. Reactivos para retrotranscripción (APPLIED BIOSYSTEMS, USA)
• H2O DEPC
• Hexámeros
• dNTPs
• Buffer 5X
• DTT
• RNASE outTM
• enzima Transcriptasa
• Tubos eppendorf 1.5 ml RNAsa free
• Tubos eppendorf 0.5 ml y 0.2ml RNAsa free
• Hielo seco
E. PCR calidad cDNA
• Tris (10mM) pH 8,3
• MgCl2 (1.5 mM)
• KCl (50mM)
• dNTPs (0.25mM de dATP, dCTP, dTTP y dGPT)
• Oligonucleótidos (0.5 µM de A2 y C3)
• Taq Gold (1.5 U/µl)
• EDTA
• H2O DEPC
F. Reactivos de reacción de cadena de polimerasa
• Cebadores de los transcritos de fusión del gen BCR-ABL (p190,p210 y p230)
• Buffer PCR (10x)
• MgCl2 (50 mM)
• dNTPs (10mM)
• Taq Gold (5unids/µl)
• H2O DEPC
• Agarosa
• Buffer TAE
G. Curva de estandarización para cuantificación absoluta
• Estándar para transcritos de BCR-ABL
• Kit de clonación
• Primers
• Kit de purificación de plásmidos
• Kit de transcripción
• DNAsa I
• Caldo de cultivo LB
• Medio LB sólido
• IPTG
• X-gal
• Antibióticos
• Glicerol
• Fragmentos de DNA sintético
• Secuenciación de fragmentos de DNA amplificados anteriormente
• Cajás de petri
• Tubos falcon de 50 ml
• Tubos falcon de 15 ml
• crioviales
H. Controles positivos y su cultivo
• Se escogerán tres de las siguientes líneas celulares humanas: CML-T1,
HNT-34, JURL-MK1, JURL-MK2, K-562, KCL-22, SUP-B15,
TOM1.
• Medio RPMI 1640
• Suero fetal bovino
• antibióticos
• Glutamina
• Fitohemaglutinina
• Tubos falcon 15 ml
• Tubos falcon de 50 ml
• Frascos para cultivo celular
• Crioviales
• Nitrógeno líquido
• DMSO
• Bromuro de etidio (Sigma-Aldrich)
• Colcemid
• Cloruro de potasio KCl
• Metanol
• ácido acético glacial (3:1)
• tubos eppendorf de 1.5 ml
• Hank’s solución balanceada 10X libre de calcio y magnesio
• Solución de tripsina 5% w/v;
• Tinción Giemsa modificada para tinción de cromosomas
• Timidina
• fluorodeoxiuridina
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Heparina sódica
• Pipetas serológicas
• Pipetas automáticas
• Gradillas
• Equipo de filtración al vacío
• tubos vacutainer con heparina sódica
• pipetas Pasteur
• tubos de 50 mL para contener el medio
• Puntas con o sin filtro de distintos tamaños
• Kimwipes
• Guantes
• Parafilm
I. PCR en tiempo real
• Primer 10 picomoles
• Sonda Taqman MGB 6000 pico moles
• Taqman Control RNA 100 ul
• Taqman Fast Universal PCR master Mix
• Nuclease Free water 500 ml
• Micro Amp adhesive aplicator
• Micro amp 96 well film 100 per Pack
• Microamp Fast optical reaction plate 100 per Pack
• High capacity cDNA transcription kit 200 reaction
• DNAZAP
• Rna later 100 ml
• RNA ZAP
• RnasFree Micro tubes 1.5( 500 tubes)
• Barrier tips 10 ul 8x12 racks
• Barrier tips 100 ul 8x12 racks
• Barrier tips 200 ul 8x12 racks
• Barrier tips 1000 ul 8x12 racks
• Barrier tips 1000 ul 8x12 racks
• Micro amp optical 8 tube strip
• Micro amp optical 8 strip cap
J. Equipos
• Termociclador
• Termociclador para PCR EN TIEMPO REAL
• Vórtex
• Equipo de electroforesis
• Transiluminador
• Autoclave
• Centrifugas de alta velocidad
• Tanque almacenador de nitrógeno líquido; para almacenar líneas
celulares.
• Congelador -20
• incubadora con 5% de CO2
• soporte para tubos de 50 mL
• centrifuga
• vortex
• jarras coplin
• cronómetro
• estufa para secar láminas
• refrigeradora
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Microscopio óptico
• Soporte para tinción
• Bandeja para tinción
• Secadora
• Campana de flujo laminar
I.4.4.2 PROCEDIMIENTO
La metodología utilizada para el análisis molecular se ha obtenido de estudios
realizados por Martinelli y colaboradores en el año 2001, Hochhaus y colaboradores en el
año 1999 y 2007; Naoe y colaboradores en el año 2008; Fenaux y colaboradores en el año
1999; Lee y colaboradores en el año 2002; Lerma y colaboradores en el año 2000; Rosas y
colaboradores en el año 2003 ( ver Anexo No.1) (6-10).
A. Obtención de muestras de pacientes
Se solicitará mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de
los pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su
ejecución, en el caso de tratarse de menores de edad, el encargado responsable del paciente
debe aceptar el consentimiento (Anexo 1). Las muestras de médula ósea se obtendrán de
pacientes referidos por el Doctor hematólogo Julio Caceres y por el jefe de
hematooncología del IGSS; así como el hospital de Quetzaltenango y el Roosevelt,
principalmente; con diagnóstico de LMC y LLA durante el período comprendido de un año
y medio, correspondientes a enero 2011 a julio del 2012.
Las muestras se recolectarán mediante punción aspirativa de 1 cm3 de sangre
medular con aguja de 0,8 mm de diámetro, mediante técnica aséptica en cresta ilíaca
posterosuperior o en esternón. Las muestras de médula ósea serán colocadas en un tubo de
10cc con EDTA (Vacutainer®) para el diagnóstico molecular los cuales se conservarán a 4º
C hasta el momento del envío al laboratorio de referencia. El tiempo transcurrido desde la
extracción de las muestras hasta su procesamiento en el laboratorio no debe ser superior a
las 24 horas.
B. Obtención linfocitos de sangre periférica (pbls)
La separación de células mononucleares de sangre periférica se realizará utilizando
gradientes de densidad FICOLL (General Electric) (9). Las células obtenidas se
almacenarán en RNAlater a -20 C hasta su uso.
C. Extracción RNA a partir de PBLS (kit de applied biosystems)
El RNA total se extraerá utilizando el producto comercial RNAaqueous (APPLIED
BIOSYSTEMS, USA) a partir de las suspensiones de linfocitos obtenidos en el proceso
anterior. Se seguirá el procedimiento establecido en el manual del mismo kit ( ver manual
en www.appliedbiosytems.com ).
D. Retrotranscripción y amplificación (kit de RT applied biosystem)
Para la síntesis de cDNA se utilizará 1µg de RNA total con la enzima Multiscribe
(APPLIED BIOSYSTEMS) con hexámeros al azar en 20µl de reacción en condiciones
estándar.
La PCR para la evaluación de los transcritos de fusión del gen quimérico BCR-ABL, se
estandarizará con las siguientes condiciones: 5 minutos a 94ºC, 35 ciclos de 60 segundos a
94º C , 65 segundos a 55º C y 65 segundos a 72º C, seguidos por una extensión final de 5
minutos a 72º C. Se evaluarán los resultados según la tabla que se presenta a continuación:
TABLA No. 1: PESO MOLECULAR DE TRANSCRITOS
Fuente: FODECYT 24-2010
Translocación Transcrito Peso molecular (bp)
t(9;22) p210 (b3:a2) 407
t(9;22) p210 (b2:a2) 333
t(9;22) p190 (e1:a2) 281
Se tomarán las precauciones descritas por Kwok e Higuchi para mantener la calidad
de la reacción de la cadena de la polimerasa, y la secuencia de cebadores según las descritas
por Arana, et al. (5).
E. Visualización en gel de agarosa
Los productos de PCR se visualizarán mediante electroforesis en un gel de agarosa al
1.5 %, después de la tinción con bromuro de etidio.
F. Comprobación de calidad del cDNA obtenido (gen ABL)
Para comprobar que la RT había sido correcta, y de forma indirecta conocer la
integridad del ARN utilizado, se amplificara una secuencia del gen ABL, presente en todas
las células del organismo. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos A2 y CA3
correspondientes al gen ABL según la técnica descrita por Cross (11-15).
G. Curva de estandarización de cuantificación de transcritos
Se clonarán los productos obtenidos de la RT-PCR, amplificada con los primers
descritos anteriormente. Los transcritos se clonaran utilizando un kit de clonación de
novagen (perfectly blund), posteriormente se extraerán los plásmidos que contienen la
secuencia clonada. Este DNA que se encuentra dentro de los plásmidos se utilizará para
construir la curva estándar para la cuantificación de cada uno de los transcritos de BCR-
ABL; se realizaran diluciones seriadas empezando de 104 copias de plásmido hasta 108;
por triplicado.
H. Controles positivos
Se escogerán tres de las siguientes líneas celulares humanas: CML-T1, HNT-34,
JURL-MK1, JURL-MK2, K-562, KCL-22, SUP-B15, TOM1. Estas se cultivarán según lo
especificado por manual que acompaña cada línea celular de la casa comercial ATCC y se
almacenarán en nitrógeno líquido (ver procedimiento de cada línea celular en
www.atcc.org
I. Estandarización de PCR en tiempo real
Se utilizará el equipo para PCR en Tiempo Real, FAST 7500 de APPLIED BIOSYSTEMS,
se procederá a realizar y validar la curva de estandarización para la cuantificación absoluta
de los distintos transcritos de BCR- ABL.
Una vez validada la curva de estandarización, se procederá a cuantificar los transcritos
presentes en las médulas óseas analizadas de los pacientes con LLA o LMC, para realizar
esto se seleccionarán las condiciones de PCR, según el artículo escrito por Martenelli en el
2001. Del mismo artículo se obtendrán las secuencias para los cebadores y las sondas. Se
espera obtener resultados en 40 minutos a 2 horas.
J. Monitoreo de enfermedad mínima residual (EMR)
El monitoreo de la enfermedad se realizará con todos los pacientes con LLA y LMC
referidos que expresen al menos uno de los transcritos de BCR-ABL; El transcrito que se
encuentre presente se cuantificará cada 3-4 meses para monitorear el avance de la
enfermedad. Se espera que si el paciente está respondiendo bien a la quimioterapia, las
cantidades de los transcritos vayan decayendo hasta volverse negativos. Si por determinada
situación el paciente empezará a presentar una recaída una vez ya hayan estado negativos
las cantidades de los transcrito; esto se interpretará como la presencia de enfermedad
mínima residual, y se notificará inmediatamente al médico para que tome las medidas que
considere pertinentes.
K. Análisis de resultados
La recopilación de información del paciente y de los exámenes realizados se
realizará mediante el uso de la boleta de recolección de datos siguiente:
INVEGEM BOLETA DE RECOLECCION DE DATOS
IDENTIFICACION DEL PACIENTE
Iniciales de paciente
No. de Historia
Clínica
Código del paciente
DATOS SOCIODEMOGRÁFICOS
Edad
Género Masculino Femenino
INFORMACION CLINICA
Clasificación de
leucemias
según FAB
LLA 1 LMC2
DATOS
HEMATOLOG
ICOS
Recuento de Leucocitos:
Recuento de Plaquetas:
Nivel de Hemoglobina:
DATOS
CITOGENETI
COS
MARCADORE
S GENETICOS
Transcritos de
fusión del gen
BCR-ABL
e1a2 (p190 BCR-ABL)
P3 A4
b2a2 (p210 BCR-ABL) P A
b3a2 (p210 BCR-ABL) P A
e19a2 (p230 BCR-ABL) P A
CUANTIFICA 2 3 4 5 6
CIÓN DEL
TRANSCRITO
BCR-ABL
1
CONTR
OL
CONTR
OL
CONTR
OL
CONTRO
L
CONTR
OL
CONTR
OL
CANTIDAD
DE
TRANSCRITO
CLAVE 1: Leucemia linfoblástica aguda 2: Leucemia mieloide crónica 3: Presente
4: Ausente
PARTE II
MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)
A. APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS Y MOLECULA RES EN
EL ESTUDIO DEL CANCER
El cáncer es una enfermedad en la que se produce un crecimiento desordenado de un
clon celular, debido a una alteración en el proceso de crecimiento celular, en la
diferenciación celular o en la apóptosis celular.
Es una enfermedad considerada de origen genético adquirido; esto quiere decir que
su causa son las distintas alteraciones genéticas que se han desarrollado y adquirido con el
transcurso del tiempo.
Las principales técnicas que actualmente se utilizan para el diagnóstico, pronóstico
y monitoreo de las neoplasias son las técnicas citogenéticas y las moleculares.
Las técnicas de análisis citogenético permiten estudiar de manera global los 46
cromosomas, y detectar cualquier alteración presente. Estas técnicas se han desarrollado
más en neoplasias hematológicas debido a la facilidad de obtención de metafases en tejidos
líquidos. En neoplasias sólidas se tiene la dificultad de obtención de metafases adecuadas,
por lo que la utilidad de las técnicas citogenéticas es limitada.
Las técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa –
PCR- y sus distintas variedades, se han desarrollado también ampliamente para el estudio
de distintas neoplasias. Sin embargo estas técnicas no son pruebas de screening, por lo que
se necesita conocer específicamente la alteración genética que se desea estudiar. Entre las
ventajas de las técnicas moleculares sobre las citogenéticas es que poseen una mayor
sensibilidad y especificidad.
En el estudio de neoplasias hematológicas es posible la aplicación de métodos de
biología molecular por medio de la detección de transcritos (mRNA de una sección
genética especifica). Estas técnicas son de gran utilidad para el diagnóstico, pronóstico y
monitoreo de la enfermedad mínima residual (EMR) y, por tanto, ayudan en las decisiones
clínicas para definir nuevas estrategias terapéuticas que favorezcan la disminución de la
actividad oncogénica (7).
En resumen para un estudio genético completo de una neoplasia hematológica y
algunos tumores sólidos se recomienda utilizar tanto las técnicas citogenéticas como las
moleculares (1, 2, 3, 6, 8-12).
B. NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
Las neoplasias hematológicas forman un grupo de enfermedades que provienen de
la expansión clonal de células hematopoyéticas. La leucemia constituye una colección
heterogénea de neoplasias originadas en el tejido formador de sangre, que se caracteriza por
la expansión clonal de células hematopoyéticas como resultado de una alteración en los
mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte celular, en cualquiera de las etapas
de maduración de las células sanguíneas, habitualmente acompañada de la invasión al
torrente sanguíneo y producción de metástasis, con mayor o menor grado de
desorganización de los tejidos invadidos (6-15).
Las leucemias se clasifican basándose en el tipo de células afectadas y en su estado
de maduración. Las agudas se caracterizan por la presencia de células muy inmaduras
(denominadas blastos) y por un curso rápidamente mortal. Las crónicas se caracterizan por
una población expandida de células que proliferan y que conservan su capacidad para
diferenciarse y madurar. Se distinguen dos variantes: linfocíticas y mielocíticas. Así pues
de forma rudimentaria las leucemias se pueden clasificar en cuatro tipos: leucemia
linfocítica aguda (linfoblástica) (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia
mielocítica aguda (mieloblástica) (LMA) y leucemia mielocítica crónica (LMC) (8-14).
El diagnóstico se realiza, considerando, además de las manifestaciones clínicas, estudios de
laboratorio que incluyen hemograma, frotis de sangre periférica, inmunofenotipo, biopsia y el frotis
de médula ósea. En la actualidad la tinción con inmunohistoquímica de células malignas en sangre
periférica, es uno de los métodos más específicos para clasificar las leucemias por lo cual se
recomienda realizar este procedimiento en todo paciente con esta enfermedad, al igual que el
seguimiento de un protocolo que combine la citomorfología y citoquímica con el inmunofenotipo, y
siempre que sea posible acompañado por métodos citogenéticos y moleculares permitiendo con
ello no solo un diagnóstico certero, sino que además proporcionar una amplia información
sobre el pronóstico del paciente, así como del tratamiento a seguir (6,15).
B.I Leucemia mieloide crónica (LMC)
La leucemia mieloide crónica (LMC) es un síndrome mieloproliferativo crónico de
naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial común a las tres series
hematopoyéticas. Representa entre el 15% y el 20% del total de leucemias y su incidencia
en los países occidentales se ha estimado en 1,6 casos por cada 100.000 habitantes/año. La
edad media de presentación es de 53 años, la incidencia máxima se encuentra entre los 40 y
los 60 años y predomina ligeramente en varones, con una relación de 1,3:1 (15-21).
Alrededor de la mitad de los pacientes son asintomáticos al momento del
diagnóstico y la mediana de supervivencia global después de éste es de cuatro a seis años,
con un rango que oscila desde menos de un año a más de diez años. La mortalidad ajustada
por edad es de 0,6 por cada 100.000 habitantes/año; la gran mayoría de los sujetos que
fallecen por LMC tienen más de 55 años (74,7%) y se ha estimado que el 0,16% (1 de cada
619 hombres y mujeres) de las personas que nacen en la actualidad tendrán la enfermedad
en algún momento de sus vidas y que el 0,06% morirán por ella.
En la actualidad, la tasa de mortalidad anual de la LMC es menor al 10% durante los
dos primeros años después del diagnóstico; en los pacientes en fase crónica con bajo riesgo
es del 12% durante los tres primeros años, mientras que en los de riesgo intermedio y alto
es del 20% y 45%, respectivamente. La supervivencia después de cinco años en los grupos
de bajo, intermedio y alto riesgo es del 76%, 55% y 25%, respectivamente, y para los
sujetos en fase acelerada y blástica es inferior al 10% y 5%, respectivamente (15-21).
La enfermedad se presenta con un curso bifásico o trifásico, constituido por
diferentes etapas. Una es crónica, caracterizada por la expansión de las células mieloides
con maduración normal; el 90% de los pacientes se diagnostican en esta etapa, que suele
evolucionar a estados más agresivos, los cuales, habitualmente, siguen dos patrones clínico-
hematológicos: la fase acelerada y la crisis blástica (CB). Durante las fases tardías de la
enfermedad, las células leucémicas pierden la capacidad de diferenciarse; así, resulta en una
leucemia aguda resistente a la quimioterapia. La CB es inevitable, excepto para el subgrupo
de pacientes trasplantados tempranamente durante la fase crónica de la enfermedad (ver
Figura No.1) (17-20).
FIGURA No.1: CÉLULAS MIELOIDES INMADURAS
DE UN PACIENTE CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA.
Fuente: Artigas C. Rev. Int. J. Morphol 2003;21:205-209.
B.II Leucemia linfoblástica aguda (LLA)
Las leucemias agudas son enfermedades monoclonales que se originan
principalmente en la médula ósea, caracterizadas por el crecimiento incontrolado de formas
celulares inmaduras de los componentes sanguíneos llamados blastos. Dependiendo de la
estirpe celular afectada, se puede hacer la distinción de leucemias agudas mieloblásticas,
linfoblásticas o de estirpe indiferenciada. La leucemia linfoblástica aguda es la leucemia
aguda más común en los niños entre 2 y 15 años y representa cerca de 85 % de los casos.
Se ha descrito sin embargo un comportamiento bimodal con un segundo pico, mucho
menor hacia los 70 años. Los datos de diferentes registros demuestran que la incidencia de
LLA se incrementa de 0,39 por millón en adultos de 35 a 39 años a 2,1 por millón en
pacientes mayores de 85 años. Entre el 16% y el 31% de los pacientes adultos con LLA
tiene más de 60 años (15-20).
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) representa la proliferación clonal de las
células inmaduras, morfológicamente constituida por linfoblastos, en la ciudad de México
representan alrededor de 40 % de todas las neoplasias, mientras que en otros países
constituyen entre 30 y 34 %. Actualmente se reconoce que en diferentes partes del mundo
la frecuencia de las leucemias agudas se ha incrementado. De 1982 a 1991, en la ciudad de
México se observó aumento importante en la incidencia de las leucemias agudas
linfoblásticas: en 1982 se reportó una tasa de incidencia de 7.75 por millón de niños
menores de 15 años y para 1991 se alcanzó 22.19 por millón. Entre 1993 y 1994, en el
Instituto Mexicano del Seguro Social se encontró una frecuencia de 34 por millón; entre
1996 y 1998, de 60.3. Datos que abarcan el periodo de 1996 a 2000 muestran que el
promedio anual de incidencia es de 44.9 por millón de niños para leucemia linfoblástica
aguda, siendo una de las más altas a nivel mundial (ver Figura No. 2) (15-21).
FIGURA No. 2: LINFOBLASTOS EN UN FROTE DE MÉDULA
ÓSEA DE UN PACIENTE CON LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGU DA.
Fuente: Artigas C. Rev. Int. J. Morphol 2003;21:205-209.
Existe una leve preponderancia de los hombres sobre las mujeres, con una relación
de 1.4:1.0, así mismo, en la raza blanca se observa una mayor frecuencia que en la raza
negra, lo cual podría reflejar una diferente susceptibilidad genética. Se calcula que en el año
2006 en Estados Unidos se diagnosticarán 3.930 casos nuevos de LLA en adultos (2.150
hombres y 1.780 mujeres); de forma similar, la enfermedad causará cerca de 1.500 muertes
(900 hombres y 590 mujeres) en este país. Se ha descrito que a nivel mundial la letalidad media
anual de las leucemias agudas es de 3 a 5 casos por cada 100,000 habitantes y hay una tendencia
notable al aumento del padecimiento (15-21).
Con los modernos tratamientos, los niños con leucemia linfoblástica aguda (LLA)
obtienen una tasas de remisión completa (RC) del 95-100% y una probabilidad de
supervivencia del 80%, lo que supone uno de los grandes triunfos de la oncohematología.
Por el contrario, los avances en el tratamiento de la LLA en los adultos han sido modestos,
con tasas de RC del 80% y de supervivencia del 40% (15-21).
La LLA es la consecuencia de la transformación maligna de una célula progenitora
linfoide inmadura que tiene la capacidad de expandirse y formar un clon de células
progenitoras idénticas bloqueadas en un punto de su diferenciación. La secuencia de
eventos que llevan a la transformación maligna es multifactorial. Estos eventos se producen
durante el desarrollo linfoide, momento en el que los precursores linfoides tienen mayor
riesgo de presentar mutaciones espontáneas debido a la alta tasa de proliferación de estas
células y al reordenamiento genético que se lleva a cabo en ese proceso. La acumulación de
estos linfoblastos en la médula ósea y en diversos órganos provoca las manifestaciones
clínicas de las LLA tales como: malestar general, pérdida de apetito, fiebre, palidez, anemia
y trompocitopenia entre otros (15,17-20).
La LLA se clasifica por criterios citomorfológicos e inmunológicos de las células
blásticas. El grupo de trabajo Franco anglo americano (FAB) ha propuesto una clasificación
basándose en la morfología de las células leucémicas en el momento del diagnóstico,
reconociendo tres tipos morfológicos L1, L2 y L3. En el subtipo L1 se evidencia un
tamaño celular pequeño, núcleo regular, nucléolos ausentes y es reconocida como la
leucemia linfocítica infantil presente en el 85% de los casos reportados. En el subtipo L2 la
población celular es más heterogénea con una morfología irregular, también es denominada
leucemia linfocítica del adulto y se evidencia en un 14% de la población. Como leucemia
tipo Burkitt es identificado el subtipo L3 que se caracteriza por la presencia de células
grades, homogéneas, con núcleo redondo, cromatina dispersa, citoplasma basófilo y
vacuolado, cuya población celular se evidencia en menos del 3% de pacientes con leucemia
( Ver Tabla No. 2) (15-20).
TABLA NO. 2 CLASIFICACIÓN CITOMORFOLÓGICA DE LEUCEM IAS
AGUDAS LINFOBLÁSTICAS (LAL) DE ACUERDO AL GRUPO
COOPERATIVO FRANCO AMERICANO - BRITÁNICO (FAB)
Rasgos citológicos L1 L2 L3
Tamaño celular Pequeño Grande
heterogéneo
Grande
homogéneo
Cromatina nuclear Homogénea Variable
heterogénea
Finamente
homogénea
Forma nuclear Regular Irregular Regular redondo u
oval
Nucléolos Ausentes o
escasos
Visibles Prominentes uno o
más
Citoplasma Escaso, poco
intenso,
vacuolización
variable
Moderada cantidad,
débilmente
basófilo,
vacuolización
variable
Moderada cantidad
fuertemente
basófilo,
vacuolización
prominente
Frecuencia 85% 14% 1-3%
Fuente: Bennett J, et al. The French American British (FAB) cooperative grou.
Concordance among observers and clinical correlations. British Journal of Haematology.
1981;553-561
C. CITOGENETICA DE LEUCEMIAS
El estudio citogenético puede realizarse mediante método directo o a través de
cultivos de células de médula ósea, de ganglios linfáticos y de bazo (en pacientes con
leucemia y otras enfermedades que afecten dichos órganos), los cromosomas se requieren
en metafase del ciclo celular para su análisis y una vez obtenidos se efectúa la tinción con
bandas G (Giemsa), Q (Quinacrina), C (heterocromatina constitucional) o R (revés), cada
colorante brinda un patrón de bandas diferente al otro, que puede evidenciar patrones
específicos o marcadores cromosómicos diferentes, dicha técnica se denomina cariotipo y
permite evidenciar alteraciones numéricas y/o estructurales, las primeras llevan consigo
pérdida (hipoploidías) o ganancias (hiperploidías) de cromosomas, las estructurales
reordenan el material genético de un cromosoma, pierden o ganan material genético o lo
intercambian entre ellos (translocación), dicho análisis se reporta en base a las sugerencias
del International System for Human Cytogenetic Nomenclature 1995 (ISCN) (16, 24).
C.I Citogenética de la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA)
Entre el 60 y 85% de los pacientes con LLA presentan un cariotipo anormal con
alteraciones numéricas y/o estructurales, estas alteraciones tienen gran importancia debido
a que tienen un valor pronóstico (16,24).
Las alteraciones numéricas se pueden presentar tanto de forma aislada como en
asociación con alteraciones estructurales. Las alteraciones numéricas, comprenden la
pérdida o ganancia de cromosomas e incluyen los siguientes tipos:
- Hiperdiplodía: es la presencia de 47 o más cromosomas, se presenta en
aproximadamente el 7% de los pacientes adultos con LLA y en un 25% en niños, la
presencia de más de 50 cromosomas se denomina como Hiperdiploidía masiva, esta
representa un muy buen pronóstico, a diferencia de la Hiperdiploidía entre 47 y 50
cromosomas que presenta un pronóstico moderado (64,65).
- Hipodiploidía: es la presencia de 45 o menor cantidad de cromosomas, se presenta en
aproximadamente el 1% de los pacientes adultos con ALL y en un 2% en niños, debido a
la existencia de sólo un cromosoma del par correspondiente ( monosomía). Se han
identificado monosomías en pacientes hipodiploides con LLA en los cromosomas: 1, 5,
6, 10, 11, 18, 19, 21 y 22. La hipodiploidía presenta un valor pronóstico individual a
variables relevantes, como lo es la combinación con el sexo o edad del paciente,
representando un mal pronóstico (16-24).
Otro tipo de alteraciones presentes en los pacientes con LLA, son de tipo
estructural, que pueden llagar a ser hasta 30 diferentes alteraciones abarcando hasta el 78%
de las anormalidades en la LLA. Las translocaciones constituyen el grupo más común, con
un 30 a 39%. La translocación se origina por el intercambio de material genético entre
cromosomas, generando dímeros que se traducen en proteínas diméricas que alteran la
actividad celular (16-24). Entre las translocaciones más importantes presentadas en
pacientes con LLA se encuentran:
- t(9;22)(q34;q11): a esta translocación se le conoce con el nombre de cromosoma
filadelfia, se presenta en aproximadamente el 30% de los pacientes adultos con LLA y
un 4% en niños (Fig.1), la alteración generada es la producción del dímero BCR-ABL
(ver reordenación BCR-ABL), es un marcador de muy mal pronóstico, y entre
características asociadas a su presencia se encuentra elevado conteo de leucocitos y
pacientes de edad avanzada (16).
- t(1;19)(q23;p13.3): la alteración genética producida como consecuencia de la
translocación es la fusión de los genes E2A-PBX1, representando un 4% en adultos con
LLA y en un 5% en niños (Fig.1), dicha translocación representa un mal pronóstico en
los pacientes ante la terapia con antimetabolitos, y su presencia se asocia a elevados
conteos de leucocitos (24).
- t(12;21): la alteración genética producida es la fusión de genes TEL-AML1, se presenta
en cerca del 3% en adultos con LLA y en un 25% en niños (Fig.1), este marcador
representa un buen pronóstico (16,24).
- t(4;11)(q21;q23): la alteración genética producida es la fusión de genes MLL-AF4, se
presenta en el 13% en adultos con LLA y en un 9% en niños (Ver figura No. 3), este
marcador se encuentra asociado a conteos elevados de leucocitos, y conlleva un mal
pronostico para el paciente (21,22).
Existen otras anomalías en la LLA pero se presentan en menores porcentajes, siendo
las principales, mencionadas anteriormente.
FIGURA No. 3: ALTERACIONES GENÉTICAS ENCONTRADAS EN LEUCEMIA
LINFOBLÁSTICA AGUDA INFANTIL (A) Y ADULTOS (B).
Fuente: Scott A, Look T. JCO 2005;23:6306-6313
C.II Citogenética de la Leucemia mieloide Crónica (LMC)
La LMC fue la primera enfermedad en la que se determinó una anormalidad
genética en el cariotipo, denominada cromosoma filadelfia, el cual se asoció en gran
medida a la patogenia de dicha leucemia. El cromosoma filadelfia, como ya se mencionó
anteriormente es el resultado de la translocación entre los cromosomas 9 y 22, esta
translocación genera la fusión de los genes BCR-ABL (ver reordenación BCR-ABL); esta
reordenación se encuentra en el 95% de los pacientes con LMC. Sin embargo a pesar de
que el cromosoma fiñadelfia existe como única anormalidad cromosómica a través de la
fase crónica de la enfermedad y se mantiene también durante las fases avanzadas, entre el
50 y 80 % de los pacientes adquieren anormalidades cromosómicas adicionales,
desarrollando cariotipos complejos que incluyen trisomía 8, trisomía 19, isocromosoma 17
y copias adicionales distintos cromosomas (21,22).
En los análisis citogenéticos de pacientes con LMC también se han identificado
otras translocaciones después del cromosoma filadelfia que son: t(5;12)(q33;p13) y
t(8;13)(p11;q12), ambas translocaciones generan la fusión de genes, y tienen en común la
alteración de genes que codifican receptores tirosin cinasa, en el caso de la t(5;12) la
alteración ocurre en el receptor del factor de crecimiento B, mientras en el caso de la
translocación t(8;13) la alteración se da en el receptor del factor de crecimiento de
fibroblastos, esto sugiere que ambas alteraciones activan las mismas vías que activa la
presencia del cromosoma filadelfia, razón por la cual se considera que ambas
translocaciones son capaces de desarrollar LMC (21-22).
D. REORDENACION BCR-ABL
La fusión génica BCR-ABL resulta de la formación del cromosoma Filadelfia, en la
que ocurre la translocación de la región q11 del cromosoma 22 (BCR) a la región q34 del
cromosoma 9 (ABL) (Ver figura No. 4) (23).
FIGURA No. 4: ESQUEMA DE LA T(9;22) Y LA LOCALIZAC IÓN DE LOS
GENES ABL Y BCR.
33´ BCR
22q11
ABL9q34
5´BCR
3´BCR
5´BCR
ABL
9 22 der(9) der(22)
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.)
El gen ABL localizado en el cromosoma 9q, es el homólogo humano del oncogen v-
abl del virus de la leucemia murina y codifica para un receptor de tirosina cinasa. ABL es
un gen constituido por 8 exones que como resultado del corte y empalme (splicing)
alternativo del primer exón 1a y 1b, codifica para dos isoformas de una proteína de 145
KDa. La proteína está constituida por tres dominios homólogos a secuencias SRC (SH1,
SH2 y SH3), que se localizan en la región NH2-terminal. El dominio SH1 tiene la función
de tirosina cinasa, mientras que los dominios SH2 y SH3 permiten la interacción con otras
proteínas. Hacía la región 3’ se localiza la secuencia señal de localización nuclear y los
dominios de unión a DNA y actina. La proteína normal ABL está involucrada en la
regulación del ciclo celular, en la respuesta al estrés genotóxico y en la transmisión de
información acerca del ambiente celular a través de la señalización mediada por las
integrinas. Al parecer la proteína ABL tiene un complejo papel como modulador celular que
integra las señales del ambiente extracelular e intracelular e influye en las decisiones para
mantener el ciclo celular y la apoptosis (23-44).
El gen BCR, se localiza en la región q34 del cromosoma 22 y está constituido por 23
exones que codifican para una proteína de 160 KDa. La proteína BCR posee un dominio de
dimerización y un dominio de cinasa, en la región NH2-terminal, además de un dominio
con actividad de GTPasa hacia la región COOH. La proteína BCR está presente en varios
tejidos y aunque existen datos que apoyan la hipótesis de que BCR participa en la
transducción de señales, su verdadero papel permanece sin ser determinado (25,44).
A nivel molecular, la t(9;22) resulta en una fusión cabeza-cola de los genes BCR y
ABL cuando parte del gen ABL localizado en el cromosoma 9 es transferida e insertada
dentro del gen BCR del cromosoma 22, originando el transcrito de fusión del gen quimérico
BCR-ABL, mismo que codifica para una proteína que aumenta la actividad tirosina quinasa
con potencial neoplásico asociado a un pronóstico adverso (Ver figura No. 5) (23-44).
FIGURA No. 5 : TRANSLOCACIÓN t(9;22)(q34:q11) EN LM C.
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.
La localización precisa del punto de ruptura en el gen BCR y ABL, así como la
composición de la proteína producto de la fusión BCR-ABL puede servir para determinar el
fenotipo de la enfermedad y por tanto, para orientarse en la estrategia terapéutica a seguir
(40).
El oncogén quimérico BCR-ABL lleva a la síntesis de proteínas de diferente peso
molecular dependiendo de la localización del punto de rotura. Así es posible distinguir tres
9 22 t(9;22)(q34;q11)
9 22
nuevas proteínas de fusión (p190BCR-ABL, p210BCR-ABL y p230BCR-ABL). Los puntos de
rupturas más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones 1(e1), 12(b2), 13(b3) y
19(e19) y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exón 2(a2) (23-
44).
Cuando se da la unión de los exones b3a2 y/o b2a2 (Región M-bcr) se codifica para
una proteína de 210kD (p210BCR-ABL) la cual se presenta en el 20% a 40% de los pacientes
con Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) y es característica en más del 95% de pacientes
con leucemia mieloide crónica (LMC); si los exones e1 y e2 son removidos por el corte y
empalme (Región m-bcr) la unión de e1a2 se transcribe en una proteína de 190kD
(p190BCR-ABL) la cual se detecta en el 60% a 80% de los pacientes con LLA y en menos del
10% para aquellos con LMC. Es posible observar una tercer proteína de fusión próxima a
3’ del extremo distal del gen BCR denominada p230BCR-ABL, la cual resulta de la fusión de
los exones e19a2 (Región µ-bcr), cuya expresión se asocia a leucemias crónicas neutrofilas
y trombocitosis (Ver figura No. 6) (23,44).
FIGURA No. 6: LOCALIZACIÓN DE LOS PUNTOS DE ROTURA EN LOS
GENES ABL Y BCR.
Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.
Tanto la p210 como la p190 presentan una mayor actividad de tirosina cinasa
comparada con la proteína ABL normal. La proteína BCR-ABL fosforila residuos de
tirosina de muchas proteínas celulares y activa diferentes rutas de señalización, lo cual
conlleva a la transformación celular. En modelos experimentales, se ha observado que estas
proteínas son capaces de transformar precursores hematopoyéticos por la activación de
señales mitógenas, inhibición de apoptosis y alteraciones en la adhesión de las células al
estroma (25, 30-37).
Vías de señalización activadas por Bcr-Abl
Una consecuencia del incremento de la actividad de la tirosina quinasaradica en que
el BCR-ABL puede fosforilar diferentes sustratos, activando múltiples señales de
transducción en las células. Las vías activadas son RAS, vía Fosfatidilinositol-3-cinasa, Jak-
Stat, MAPK y ROS.
- Vía RAS: la activación de Ras se poduce por transducción de señales mediadas por
receptores con actividad tirosin cinasas. Una vez realizada la unión al ligando y
dimerización, los receptores tirosincinasas activados, se unen a moléculas adpatadoras
que contiene los dominios SH2 y SH3 como son Grb-2 y SHC formando complejos de
señalización con factores intercambiadores Ras en la membrana celular. Estos complejos
desencadenan una acumulación de la forma Ras e inducen un efecto antiapoptótico que,
aunque sea insuficiente, es necesario para la transformación derivada de BCR-ABL. La
activación inapropiada del gen Ras por una mutación del gen, ha demostrado ser una
importante vía de la señal de transducción celular para la proliferación y transformación
maligna de los tumores.
- Vía Fosfatidilinositol-3-cinasa: esta vía funciona en la regulación del metabolismo
lipídico fosfoinositídico y en la generación de segundos mensajeros lipídicos
relacionados con la transducción de señales. Se ha visto que una subunidad de esta
proteína se fosforila en residuos tirosina en células que expresan BCR-ABL y forma
complejos con cbl y moléculas adaptadas crk y crkl. PI3 está activado de forma
constitutiva por la translocación BCR-ABL jugando un papel importante en su
transformación (84,85).
- Vía Jak-Stat: El crecimiento de las células hematopoyéticas normales se controla por
citocinas. Los receptores para estas citocinas traducen señales mediante activación de
proteínas denominadas genéricamente Jak (Janus tirosine kinases), que es una familia de
cinasas citoplasmáticas que fosforilan y activan los factores de transcripción STAT
(Signal Transducer and Activators of transcription), BCR-ABL activa constitutivamente
las vías de señalización de JAK y STAT en células hematopoyéticas, siendo STAT 1 y
STAT 5 las tirosin-fosforiladas más importantes. La fosforilación constitutiva de factores
de transcripción STAT han sido reportados en líneas celulares positivas BCR-ABL y en
células primarias con LMC, la activación STAT 5 contribuye a la transformación
maligna a pesar de sus funciones pleiotropicas; su efecto en la transformación de células
BCR-ABL parece ser anti-apoptotico e implica la activación trasncripcional de Bcl-xl. En
contraste con la activación de la vía Jak-Stat por medio de estímulos fisiológicos, BCR-
ABL activa directamente STAT 1 y STAT 5 sin previa fosforilación de proteínas Jak (35-
44).
- Vía MAPK: un primer acontecimiento de señalización que sigue a la activación de RAS
es la activación de la vía de señalización de proteínas activadoras de mitogénesis con
actividad cinasa (MAPK). Se conocen claramente tres cascadas de MAPK: la cinasa
regulada extracelularmente (ERK), la vía de las Jun cinasas o cinasas activadas por
estrés (SAPK) y la vía de la p28 cinasa. El punto final para cada una de estas vías es la
fosforilación y activación de transcripción. BCR-ABL y v-ABL activan la vía SAPK en
fibroblastos y células hematopoyéticas. Así mismo activan promotores dependientes de
Jun de manera dependiente de RAS, MEPK y SAPK. Mientras que los efectos de BCR-
ABL en la vía JNK parecen ser claros, estudios de la vía ERK muestran que la BCR-ABL
funciona de manera distinta a la mayoría de los receptores con actividad tirosincinasa
(35-44).
- Vía ROS: la transformación de las líneas celulares con BCR-ABL presenta un incremento
de ROS, comparado con las líneas celulares no BCR-ABL. Este incremento es suficiente
para la transformación fenotípica en sí misma. Se ha sugerido que ROS podría actuar
como segundo mensajero en la regulación de la actividad de las enzimas sensibles a la
acción de oxidorreducción (redox), como son las cinasas y fosfatasas. La inhibición de la
proteína tirosin fosfatasa (PTPasa) mediante la modulación redox explicaría el amplio
espectro de las actividades biológicas de ROS. Un incremento de ROS amplifica las
señales de BCR-ABL, posiblemente regulando las proteínas redox-sensibles, como es la
PTPasa celular, la cual también está incrementada. También es de particual interés en la
LMC humana, el hecho de que un incremento de ROS pueda tener consecuencias a largo
plazo en la estabilidad genética. Los niveles de ROS no sólo son modulados por
enzimas, antioxidantes y grupos sulfhidrilos, sino también reaccionados con las bases
del ADN. Aunque las modificaciones pueden ser corregidas eficientemente por los
mecanismos de reparación de ADN, un incremnto persistente de ROS podría inducir la
acumulación de mutaciones en las células de la LMC, que podría contribuir a la
progresión de la enfermedad (35-44).
E. EVALUACION DEL RIESGO EN PACIENTES CON LEUCEMIA
La evaluación rigurosa del riesgo o posibilidad de recaida en un paciente con leucemia
es necesaria en el momento del diagnóstico para evitar un tratamiento inefectivo. Existe un
notable desacuerdo para definir los subgrupos de riesgo, sin embargo de forma común se
dividen en tres categorías: riesgo bajo, riesgo moderado y alto riesgo (44-50).
Deacuerdo con los criterios de definición de un riesgo bajo, se presenta en pacientes
con edad entre los 1 y 9 años y un recuento de leucocitos menor a 50,000/mm3, pacientes
con conteos por arriba de 50,000 leucocitos/mm3 se encuentran en un riesgo alto. Una
mejor clasificación para el riesgo se basa en marcadores genéticos, como por ejemplo: se
ha observado que niños menores a un año, los cuales son evaluados como pacientes de alto
riesgo, en el 70 al 80% presentan reordemamientos en el gen MLL el cual es un marcador
de mal pronóstico, previamente explicado, este reareglo genético junto con el gen
quimérico BCR-ABL, son dos alteraciones que se presentan con frecuencia en adultos,
colocandolos en un riesgo alto, pero marcadores como la hiperdiploidía masiva y la
reordenación TEL-AML1 se presentan con una frecuencia mayor en niños (fig 1), ambos
marcadores son de muy buen pronóstico lo cual coloca a pacientes con dichos rearreglos
como pacientes de bajo rieso, además se han observado ciertas carácteristicas en conjunto
de tal forma que pacientes que presentan hiperdiploidía masiva tambien presentan bajos
conteos de leucocitos. En el caso de pacientes con riesgo moderado son considerados
aquellos con edad inferior a un año o mayores a 10 años y un recuento superior a 50,000
leucocitos/mm3 que no presenten marcadores genéticos favorables o desfavorales (44-50).
Es por ello que la clasificación e identificación de perfiles de riesgo se realiza en
base a lo que la institución determine como parámetros claves, y ello depende en gran
medida de los recursos institucionales.
La determinación del riesgo, permite identificar la probabilidad de sobrevivencia libre
de eventos años depues del diagnóstico, es decir como por ejemplo: para pacientes con un
riesgo alto se espera que el 40% sobrevivan 10 años post-diagnóstico, por el contrario
pacientes identificados como de bajo riesgo hasta el 80% puede sobrevivir 10 años sin
eventos (recaídas) (Ver figura No. 7) (44-50).
FIGURA NO. 7: PROBABILIDAD DE SOBREVIVENCIA LIBRE D E
EVENTOS, SEGÚN EL RIESGO
Fuente: Ching-Hon P. NEJ 1995;332(24).
F. TRATAMIENTO DE PACIENTES CON LEUCEMIA
En la actualidad debido al desarrollo de terapias más efectivas, se ha incrementado
la tasa de cura de pacientes con LLA. El tratamiento se divide en tres fases:
- Induccíon a la remisión: el primer objetivo de la terapia en pacientes con leucemia es
inducir la remisión completa con el reestablecimiento de una hematopoyesis normal, la
inducción incluye el uso de glucocorticoides (prednisona o dexametasona, esta última
ofrece una vida media mayor y penetracion en LCR, por lo que es más segura). Por otro
lado la vincristina y la asparginasa (para evitar recaidas en el sistema nervioso central)
para niños o antraciclina para adultos, ha llevado a tasas de remisión completa de 97 a
99% en niños y de 75 a 90% en adultos. (50-62).
- Intensificacion de la terapia o consolidación: Los pacientes que logren el
reestablecimiento de la hematopoyesis, pueden seguir a la fase de consolidación. El
tratamiento es aplicado en poco tiempo después de la inducción, entre las drogas se
encuentran altas dosis de metrotrexato con o sin 6-mercaptopurina (50-62).
- Continuación de tratamiento: es una prolongación en el tratamiento para eliminar
cualquier posibilidad de que existan células malignas en el post tratamiento (55).
Otras posibilidades de tratamiento son:
- Profilaxis del sistema nervioso central (SNC): esto se debe como consecuencia de que el
SNC puede ser un reservorio de células malignas, sin embargo niveles altos de
quimioterapia sistémica eliminan la necesidad de irradiación craneal, en ciertos casos
(50-62).
- Trasplante de progenitores hematopoyéticos: este se recomienda en el caso de pacientes
que no logran un remisión inicial, pacientes que presentan una segunda recaída después
de la remisión hematológica, y en niños con LLA en los cuales se lleva una terapia de
más de 36 meses con antimetabolitos, sin remisión. Debido al pronóstico desfavorable
de los pacientes con reordenamiento BCR-ABL, se indica un trasplante cuando se logra
la primera remisión (50-62).
Los pacientes con reordenamiento BCR-ABL requieren de regímenes más
agresivos, en la actualidad en el caso de pacientes con LLA se recomienda el trasplante de
médula ósea que provee de un 30% de remisión, el mesilato de imatinib (Gleevec), el cual
es un inhibidor de la actividad tirosin cinasa (que genera la fusión BCR-ABL), se ha
incorporado en los regímenes de mantenimiento de pacientes con LLA positiva al Ph (55-
62).
En el caso de la LMC, el objetivo del tratamiento es la prevención de una crisis
blástica (ver LMC), ya que cuando ocurre el pronóstico es muy pobre, aunque se puede
lograr una rápida reducción de conteo de células blancas con quimioterapia (bilsulfán o
hidroxiurea en la crisis blástica), sin embargo estas drogas fallan en prevenir la progresión
de la enfermedad. El interferón alfa (IFN) fue el primer agente en modificar la historia
natural de la LMC prolongando la sobrevida en pacientes con una remisión hematológica
completa (<35% de células Ph positivas). Un segundo avance en la tratamiento de la LMC
ocurre cuando el 60-80% de pacientes trasplantados presenta una sobrevida libre de eventos
de 5 años, pero tanto el INF como el trasplante son considerados como posibles inductores
de toxicidad para la LMC. En el año 2001, se reporta que estudios que utilizan como
tratamiento el mesilato de imatinib (Gleevec), presentan altas tasas de remisión
hematológica completa. (50,52,55).
G. ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL (EMR)
La EMR consiste en la persistencia de un clon anormal, aún en niveles bajos,
durante o tras finalizar el tratamiento. La EMR tiene significado pronóstico ya que predice
la recaída de la enfermedad y por este motivo, conocer su presencia ayuda a plantear
estrategias terapéuticas que permitan prevenirla (14,131-135).
Las técnicas para determinar la EMR, se basan en monitorear la presencia de un
marcador asociado a la enfermedad por determinados períodos, hasta determinar su
ausencia total. Esta evaluación del marcador citogenética se puede realizar por distintas
técnicas como cariotipo, Hibridación in situ con Fluorescencia –FISH-, reacción en cadena
de la polimerasa – PCR- y Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real –RQ PCR-
(50-62).
PARTE III
RESULTADOS
TABLA No. 3: RESULTADOS DE LOS CUATRO MONITOREOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS
CODIGO GENERA
L
RESULTADO PRIMER
MONITOREO (%IS)
RESULTADO SEGUNDO
MONITOREO (%IS)
RESULTADO TERCER
MONITOREO (%IS)
RESULTADO CUARTO
MONITOREO (%IS)
OBSERVACIONES
12-LMC 1.21 2.95 0.20 0.19
Fecha de diagnóstico 04/11/2010
13-LMC 0.35 0.0496 0.003
No se presentó Fecha de diagnóstico
19/01/2010
14-LMC Indetectable 0.02 0.003 0.003 Fecha de diagnóstico
06/12/2010
15-LMC 0.40 0.022 0.012 0.004
Fecha de diagnóstico: 04/11/2010
16-LMC 2.83 48.33
50.25
No se presentó
Fecha de diagnóstico: 01/10/2010 Resistencia a Glivec, es necesario cambiar a Nilotinib pero no se cuenta con los recursos necesarios. Medico tratante sugiere ingreso al IGSS para recibir el medicamente de la institución, sin embargo no ha sido posible.
17-LMC 3.51 No se presento 0.029 No se presentó
Fecha de diagnóstico: octubre del 2010
18-LMC 8.11 41.22
31.38
32.92
Fecha de diagnóstico: Enero del 2010 Posible Resistencia, no fue posible hablar con el médico tratante sobre la evolución del paciente.
19-LMC 16.72 0.56 0.61
0.73
Fecha de diagnóstico: 30/09/2010
20-LMC No se presentó No se presentó 35.28 48.79
23-LMC 10.51 No se presentó
No se presentó
No se presentó
Fecha de diagnóstico: 05/04/2004 Falleció, no se tienen datos exactos de la fecha de fallecimiento o las causas del mismo.
24-LMC
15.44 0.53
0.31
0.093
Fecha de diagnóstico: 09/02/2011
36-LMC
0.13 0.17
No se presentó
0.030
Fecha de diagnóstico: 03/11/2009 No se presento el día de la jornada, sin embargo se logro tomar muestra de sangre del paciente el día de la consulta en el Hospital San Juan de Dios. No se ha procesado y sigue en espera de que entren mas muestras.
37-LMC 0.12 0.16 0.12
0.052
Fecha de diagnóstico 09/07/2010
38-LMC 1.16 1.22 0.67 0.56
Fecha de diagnóstico 10/01/2011
39-LMC 2.68 40.19
13.37
7.93
Fecha de diagnóstico 28/12/2007 Paciente con buena adherencia al tratamiento, sin embargo presenta resistencia a Glivec. Presento toxicidad al inicio del tratamiento, a la fecha tolera la dosis de 400 mg/dia. La resistencia se debe posiblemente a las dosis bajas y medicación con suspensión parcial e intermitente.
40-LMC 0.81 0.81 0.18
0.28
Fecha de diagnóstico: 11/01/2008
41-LMC 0.46 No se presento 0.13
indetectable
Fecha de diagnóstico: 12/07/2010
42-LMC 0.26 0.10 0.64
15.29
Fecha de diagnóstico: 15/10/2010
43-LMC 1.45 No se presento
No se presentó 0.64 Fecha de diagnóstico. 08/09/2010
Fuente: FODECYT 24-2010
CODIGO GENERA
L
RESULTADO PRIMER
MONITOREO (%IS)
RESULTADO SEGUNDO
MONITOREO (%IS)
RESULTADO TERCER
MONITOREO (%IS)
RESULTADO CUARTO
MONITOREO (%IS)
OBSERVACIONES
44-LMC
BCR-ABL: 168,401.719 ABL: 28,934.201 RATIO: 5.82016
BCR-ABL: 155,965.141
ABL: 55,561.035
RATIO: 2.8070
No se presentó
No se presentó
Fecha de diagnóstico 06/07/2005 Resistencia a Glivec. Toma actualmente 800 mg/ día de Glivec sin embargo no responde al tratamiento.
45-LMC 0.09
BCR-ABL: 1,444,219.5
ABL:47,373.125
RATIO: 30.4860
falleció
falleció
Fecha de diagnóstico: 03/06/2010 Falleció el 24 de Octubre de 2011, sexto día de quimioterapia para la inducción a la remisión, como consecuencia de hemorragias múltiples. Fenotipo compatible con LMA.
46-LMC 2.86 0.0097
0.003
No se presentó
Fecha de diagnóstico: 19/12/2006 Paciente con tratamiento con Glivec desde 2007 y sin alcanzar respuesta molecular mayor. Presento toxicidad al Glivec, por lo que medico tratante decide cambiar a 400 mg/día de Tasigna en agosto de 2011. Obteniendo buenos resultados.
47-LMC 1.24 0.22
0.24
0.23 Fecha de diagnóstico: 23/01/2003
48-LMC 0.10 0.098
0.022 No se presentó Fecha de diagnóstico: 13/10/2010
49-LMC 13.59
BCR-ABL: 17,167.045
ABL:12,581.998
RATIO: 136.44
333.73
108.459
Fecha de diagnóstico: 25/04/2005 Paciente resistente a Nilotib, actualmente no existe otra opción de tratamiento.
50-LMC 36.47 No se presento 1.25
14.66
Fecha de diagnóstico: 04/05/2011
59-LMC 0.26 No se presentó
indetectable
indetectable
Fecha de diagnóstico: Abril del 2011 Paciente con ingreso reciente al estudio.
60-LMC 2.50 0.30
0.42
No se presentó
Fecha de diagnóstico: Marzo del 2011 Paciente con ingreso reciente al estudio
61-LMC 98.49 No se presentó
3.71 0.19
Paciente con ingreso reciente al estudio. Paciente diagnosticada en 6 de Septiembre de 2011, inicio tratamiento el 11 de octubre Glivec 300 mg/día. Se sugiere esperar respuesta.
62-LMC 19.84 No se presentó
0.11
0.023
Fecha de diagnóstico: noviembre del 2008. Paciente con ingreso reciente al estudio. Tiene 3 años de tratamiento con Glivec y no muestra mejora completa, posible resistencia al tratamiento por no alcanzar respuesta molecular mayor ante el tiempo de tratamiento.
En la tabla No. 3, presentada anteriormente se observa un resumen de los valores en %IS
obtenidos en cada uno de los monitoreos por paciente; así como la fecha de diagnóstico y
algunos datos clínicos de interés. En los anexos 2 al 7, se observan los datos y gráficas
obtenidos por las corridas de muestras en PCR en Tiempo Real.
Según Baccarani, et al. Se indica en la tabla No. 4 a continuación los parámetros que se
utilizan para clasificar la respuesta al imatinib como óptima, subóptima y fallo a terapia; y
que fueron los parámetros utilizados para la clasificación de respuesta a tratamiento que se
muestra en la tabla No. 4. (63-70)
TABLA 4: EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO IMATINIB
MESES OPTIMA SUBÓPTIMA FALLO DE
TERAPIA
3 CHR No CgR ( Ph>95%) Menos de CHR
6 PCgR (Ph<35%) Menos de PCgR (
Ph<35%)
No CgR (Ph> 95%)
12 CCgR PCgR ( 1% a 35%) Menos de PCgR
(Ph>35%)
18 MMolR Menos de MMolR Menos de CCgR, no
MMolR
Cualquier tiempo
durante duración de
tratamiento
MMolR estable Pérdida de MMolR,
presencia de
Mutaciones
Perdida de CHR,
perdida de CCgR;
CHR: respuesta hematolótica completa; CCgR: respuesta citogenética completa; PCgR:
respuesta citogenética parcial; MMolR: respuesta molecular mayor.
Fuente: Baccarani M, et al. Journal of Clinical Oncology, 27:6041-6051, 2009.
En la Tabla 5, se observa que un 39% de los pacientes analizados obtuvieron una respuesta
óptima, en base a los parámetro expuestos en la tabla anterior; es decir que alcanzaron una
respuesta citogenética completa a los 12 meses o una respuesta molecular mayor a los 18
meses. Y luego se observa que un 25% de los pacientes incluidos en el presente estudio
tuvieron una respuesta subóptima, menos de respuesta molecular mayor a los 18 meses; y
por último presentaron fallo a la terapia un 36% de pacientes; los cuales no alcanzaron ni
respuesta citogenética completa a los 18 meses; de estos pacientes fallecieron 3. Y por
último se obtuvieron dos pacientes falsos positivos, es decir que el diagnóstico de
philadelphia positivo se había realizado por otras técnicas y por Tiempo Real fueron
negativos. (63-70)
TABLA 5 : RESPUESTA AL IMATINIB DEL TOTAL DE PACIEN TES
ANALIZADOS
RESPUESTA
ÓPTIMA
RESPUESTA
SUBÓPTIMA
FALLO DE
TERAPIA
FALSOS
POSITIVOS
39% 25% 36% 6%
Fuente: FODECYT 24-2010
A continuación se presenta la tabla No. 6, que agrupa los tipos de respuesta molecular al
Imatinib presentada por los paciente incluidos en el estudio; los tipos de respuesta
molecular se definen como Respuesta Molecular completa (MR), cuando el porcentaje en
escala internacional de BCR-ABL es menor a un 0.01%; y luego se define como respuesta
molecular mayor (MMR) cuando se tiene un valor menor o igual a 0.1%; la respuesta
citogenética completa equivale a <1% de BCR-ABl/ABL en la escala internacional. La
respuesta citogenética mayor (CCM) corresponde a valores <10% y por último No CCM si
la respuesta es mayor al 10%. (63-70)
En cuanto a la MR; se suele dividir en tres subclasificaciones: MR 4.0 si el valor es menor
o igual a 0.01% en Escala internacional; MR4.5 si el valor es menor o igual al 0.0032%, y
por ý último MR5.0 si el valor es de 0.001%. (66)
TABLA No. 6: PACIENTES Y LAS RESPUESTAS ALCANZADAS
MR
( <0.01%)
MMR
(<0.1%)
CCR
(< 1%)
CCM
(<10%)
NO CCM
( >10%)
13-LMC 0.003 12-LMC 0.19 19-LMC 0-73 39-LMC 7.93 16-LMC 50.25
15-LMC 0.004 17-LMC 0.029 38-LMC 0.56 18-LMC 41.22
41-LMC 0.003 24-LMC 0.093 40-LMC 0.28 20-LMC 48.79
46-LMC 0.003 36-LMC 0.030 43-LMC 0.64 42-LMC 15.29
37-LMC 0.052 47-LMC 0.23 44-LMC >100%
48-LMC 0.022 60-LMC 0.40 45-LMC >100%
61-LMC 0.10 49-LMC >100%
62-LMC 0.023 50-LMC 14.66%
23-LMC 10.51
Fuente: FODECYT 24-2010
TABLA No 7: RESPUESTA AL IMATINIB ALCANZADA DURANTE EL
MONITOREO MOLECULAR
TOTAL DE
PACIENTES
ANALIZADOS
MCgR % CCgR % MMR %MR
28 4% 21% 29% 14%
Fuente FODECYT 24-2010
En la tabla anterior se observa que todos los pacientes con CCgR, MMR y MR, alcanzaron
una respuesta citogenética completa; lo que corresponde con un 64% de paciente que
alcanzaron dicha respuesta. Y el total de pacientes con MMR y MR, corresponde a un 43%
de paciente que alcanzaron una respuesta molecular mayor. Y por último un 36% de
pacientes que no alcanzaron respuesta citogenética completa.
En la tabla No. 8 se observan los datos clínicos y hematológicos de los pacientes,
agrupados según MMR, CCR Y NO CCR. En cuento la edad se puede observar que los
que alcanzaron una respuesta molecular mayor tienen menos edad, con una mediana de 25
años en relación a los que no alcanzaron respuesta citogenética completa; es decir que
tienen arriba de 1% IS que tienen una mediana de 39 años. En general la mediana de edad
de los tres grupos se encuentra debajo de los 39 años.
En relación al sexo, se puede observar; que existe un predominio del sexo Masculino con
leucemia mieloide crónica; ya que en los tres grupos de respuesta el porcentaje de hombres
oscila entre 70-80%.
En cuanto al recuento de glóbulos blancos se observa una mediana entre 5000-6000
leucocitos/ml. En el recuento de plaquetas se puede observar en el grupo que no alcanzó
una respuesta citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000
a 1,332,000 plaquetas/ml. La mediana de hemoglobina en los tres grupos se encuentra de
11.7-12.85 g/dl. En el recuento de plaquetas se puede observar en el grupo que no alcanzó
una respuesta citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000
a 1,332,000 plaquetas/ml.
TABLA No. 8 DE DATOS CLÍNICOS Y HEMATOLÓGICOS.
CARACTERÍSTICAS RESPUESTA
MOLECULAR
MAYOR (MMR)
RESPUESTA
CITOGENÉTICA
COMPLETA
(CCR)
NO RESPUESTA
CITOGENÉTICA
COMPLETA ( NO
CCR)
N= 12 N=18 N=10
EDAD
Mediana (años) 25 32 39
Rango (años) 5 a 85 5 a 85 25 a 64
mayor de 60
años 3 ( 25%) 3 (17%) 1 (10%)
SEXO
Masculino 9 ( 75%) 13 ( 72%) 8 (80%)
Femenino 3 (25%) 5 (28%) 2 (20%)
RECUENTO
GLÓBULOS
BLANCOS
unidades/ml
Mediana (/ml) 6205 6010 5100
Rango ( ml) 4500-239000 1500-239000 2800-15000
RECUENTO
PLAQUETAS
Mediana ( /ml) 260000 234000 172000
Rango (/ml) 128000-388000 128000-348000 89000-1332000
HEMOGLOBINA
Mediana (g/dl) 12.85 12.3 11.7
Rango (g/dl) 7.89-15.09 6.6-15.5 6.0-15
Fuente: FODECYT 24-2010
PACIENTES CON BUENA RESPUESTA AL TRATAMIENTO
A. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA MOLECULAR
COMPLETA (MR)
a. CASO 13-LMC
Este paciente fue diagnosticado en enero del 2010; se le realizaron tres
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 8. El último monitoreo de
esta paciente se encuentra en 0.003% , lo cual se considera una respuesta
molecular completa; por esta razón la respuesta al tratamiento de este
paciente se considera óptima.
FIGURA NO. 8: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 13 -LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
0.35235 0.0496449 0.003
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
Series1
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 13-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12
b. CASO 15-LMC
Este paciente fue diagnosticado en noviembre del 2010; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 9. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.004% , lo cual se considera una
respuesta molecular completa; por esta razón la respuesta al tratamiento de
este paciente se considera óptima.
FIGURA NO. 9: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 15 -LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
c. CASO 41-LMC
Este paciente fue diagnosticado en julio del 2010; se le realizaron cuatro
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 10. El último monitoreo de
esta paciente se encuentra en 0.003% , lo cual se considera una respuesta
molecular completa; por esta razón la respuesta al tratamiento de este
paciente se considera óptima.
0.4
0.022 0.012
0.004-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
% IS
% IS
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 15-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 10: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 1-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
d. CASO 46-LMC
Este paciente fue diagnosticado en el año 2006; y presentó resistencia al
Imatinib por lo que se cambio al medicamento de segunda línea, a nilotinib
con 100 mg. Y ahora tiene una buena repuesta; se le realizaron tres
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 11. El último monitoreo de
esta paciente se encuentra en 0.003% , lo cual se considera una respuesta
molecular completa; por esta razón la respuesta al Nilotinib de este paciente
se considera óptima.
0.46 0.13 0.003
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 41-LMC
% IS
16/3/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 11: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 6-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
B. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA MOLECULAR
MAYOR (MMR)
a. CASO 12-LMC
El paciente 12-LMC fue diagnosticado el 4 de noviembre del 2010; ; se le
realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 12. El
último monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.19% , lo cual se
considera una respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al
tratamiento de este paciente se considera óptima.
2.860.0097
0.003-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 46-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12
FIGURA NO. 12: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 1 2-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
b. CASO 17-LMC
El paciente 17-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010; ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 13. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.029% , lo cual se considera una
respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al tratamiento de este
paciente se considera óptima.
1.212.95
0.2
0.19-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
% IS
% IS
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 12-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 13: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 1 7-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
c. CASO 24-LMC
El paciente 24-LMC fue diagnosticado en noviembre del 2011; se le
realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 14. El
último monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.093% , lo cual se
considera una respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al
tratamiento de este paciente se considera óptima.
3.51
0.029
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
Series1
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 17-LMC
% IS
16/3/11 13/3/12
FIGURA NO. 14: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 2 4-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
d. CASO 36-LMC
El paciente 36-LMC fue diagnosticado en noviembre del 2009; ; se le
realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 15. El
último monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.030% , lo cual se
considera una respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al
tratamiento de este paciente se considera óptima.
15.44
0.53 0.31 0.093
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 24-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 15: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 3 6-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
e. CASO 37-LMC
El paciente 37-LMC fue diagnosticado en julio del 2010; ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No.16. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.052% , lo cual se considera una
respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al tratamiento de este
paciente se considera óptima.
0.130.17 0.03
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 36-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 15/7/2012
FIGURA NO. 16: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 3 7-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
f. CASO 48-LMC
El paciente 48-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010; ; se le realizaron
tres monitoreos, como se puede ver en la figura No. 17. El último monitoreo
de esta paciente se encuentra en 0.022% , lo cual se considera una respuesta
molecular mayor; por esta razón la respuesta al tratamiento de este paciente
se considera óptima.
0.120.16 0.12 0.052
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 37-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 17: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 8-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
g. CASO 61-LMC
El paciente 61-LMC fue diagnosticado en septiembre del 2011; se le
realizaron tres monitoreos, como se puede ver en la figura No.18. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.1% , lo cual se considera una
respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al tratamiento de este
paciente se considera óptima.
0.1 0.00980.022
-1
2
5
8
11
14
17
20
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 48-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12
FIGURA NO. 18: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 6 1-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
h. CASO 62-LMC
El paciente 62-LMC fue diagnosticado en el año 2008; ; se le realizaron tres
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 19. El último monitoreo de
esta paciente se encuentra en 0.023% , lo cual se considera una respuesta
molecular mayor; sin embargo se tardó tres años en alcanzar esta respuesta
por lo que se considera subóptima. Y alcanzó MMR cuando se subió la dosis
de imatinib de 400 mg a 600 mg.
98.49
3.710.19
-1
9
19
29
39
49
59
69
79
89
99
109
119
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 61-LMC
% IS
16/3/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 19: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 6 2-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
C. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA
CITOGENÉTICA COMPLETA (CCR; <1% IS)
a. CASO 19-LMC
El paciente 19-LMC fue diagnosticado en septiembre del 2009; ; se le
realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 20. El
último monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.73% , lo cual se
considera una respuesta citogenética completa; se considera una respuesta
subóptima debido a que lleva tres años de monitoreo y no ha alcanzado la
MMR.
19.84
0.11 0.023
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 62-LMC
% IS
16/3/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 20: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 1 9-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
b. CASO 38-LMC
El paciente 38-LMC fue diagnosticado en enero 2011; ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 21. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.56%, lo cual se considera una
respuesta citogenética completa; se considera una respuesta subóptima
debido a que no alcanzo la MMR en 18 meses.
16.72
0.56 0.61 0.73
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 19-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 21: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 3 8-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
c. CASO 40-LMC
El paciente 40-LMC fue diagnosticado en enero del 2008 ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No.22. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.28%, lo cual se considera una
respuesta citogenética completa; se considera una respuesta subóptima
debido a que no alcanzo la MMR en 18 meses.
1.161.22 0.67 0.56
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 38-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 22: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 0-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
d. CASO 43-LMC
El paciente 43-LMC fue diagnosticado en septiembre del 2010 ; se le
realizaron tres monitoreos, como se puede ver en la figura No.23. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.64%, lo cual se considera una
respuesta citogenética completa; se considera una respuesta subóptima
debido a que no alcanzo la MMR en 18 meses.
0.810.81 0.18 0.28
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 40-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO.23: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 43-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
e. CASO 47-LMC
El paciente 47-LMC fue diagnosticado en el año 2003 ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 24. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.23%, lo cual se considera una
respuesta citogenética completa; se considera una respuesta subóptima
debido a que no alcanzo la MMR en 18 meses.
1.45 0.64
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 43-LMC
% IS
16/3/11 15/7/2012
FIGURA NO. 24: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 7-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
f. CASO 60-LMC
El paciente 60-LMC fue diagnosticado en abril del 2011 ; se le realizaron
tres monitoreos, como se puede ver en la figura No.25. El último monitoreo
de esta paciente se encuentra en 0.40%, lo cual se considera una respuesta
citogenética completa; se considera una respuesta óptima debido a que
alcanzó la CCR en 11 meses.
1.240.22
0.240.23
-1
2
5
8
11
14
17
20
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 47-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 25: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 6 0-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
D. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA
CITOGENÉTICA MAYOR (CCR; <10% IS)
a. CASO 39-LMC
El paciente 39-LMC fue diagnosticado en diciembre del 2007 ; se le
realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No.26. El
último monitoreo de esta paciente se encuentra en 7.93%, lo cual se
considera una respuesta citogenética mayor; sin embargo se considera un
fallo de terapia debido a que tienen 4 años de tratamiento y no ha alcanzado
ni CCR ni MMR.
2.5
0.3 0.42
-1
3
7
11
15
19
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 60-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12
FIGURA NO. 26: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 3 9-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
E. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES SIN RESPUESTA CITOGENÉTICA
MAYOR (CCM; > 10% IS)
a. CASO 16-LMC
El paciente 16-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010 ; se le realizaron
tres monitoreos, como se puede ver en la figura No. 27. El último monitoreo
de esta paciente se encuentra en 50.25%, se considera un fallo de terapia
debido a que el paciente presenta toxicidad al medicamento, por lo que los
valores de plaquetas suelen estar muy bajos.
2.68
40.19
13.37
7.93
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 39-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 27: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 1 6-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
b. CASO 18-LMC
El paciente 18-LMC fue diagnosticado en enero del 2010 ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 28. El último
monitoreo de esta paciente se encuentra en 31.38%, se considera un fallo de
terapia debido a que el paciente presenta toxicidad al medicamento, por lo
que los valores de plaquetas suelen estar muy bajos.
2.83
48.33
50.25
-1
6
13
20
27
34
41
48
55
62
69
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
Series1
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 16-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12
FIGURA NO. 28: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 1 8-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
c. CASO 20-LMC
El paciente 20-LMC fue diagnosticado en el año 2010 ; se le realizaron dos
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 29. El último monitoreo de
este paciente se encuentra en 48.79%, se considera un fallo de terapia, y se
le aumentó la dosis a 600 mg de Imatinib.
8.11
41.22
31.3832.92
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
Series1
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 18-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 29: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 2 0-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
d. CASO 42-LMC
El paciente 42-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010 ; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 30. El último
monitoreo de este paciente se encuentra en 15.29%, se considera un fallo de
terapia, ya que perdió la respuesta molecular mayor.
35.28
48.79
10
20
30
40
50
60
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 20-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 30: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 2-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
e. CASO 44-LMC
El paciente 44-LMC fue diagnosticado en julio del 2005; se le realizaron dos
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 31. El último monitoreo de
este paciente posee más de un 100% de copias de BCR-ABL; por lo que se
considera un fallo de terapia y una posible resistencia; tomaba una dosis de
800 mg, y falleció.
0.26 0.1 0.64
15.29
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 42-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 31: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 4-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
f. CASO 45-LMC
El paciente 44-LMC fue diagnosticado en junio del 2010; se le realizaron
dos monitoreos, como se puede ver en la figura No. 32. El último monitoreo
de este paciente posee más de un 100% de copias de BCR-ABL; por lo que
se considera un fallo de terapia y una posible resistencia; tuvo una
complicación con LMA y falleció.
582
280.7
-1
99
199
299
399
499
599
699
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 44-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11
FIGURA NO. 32: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 5-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
g. CASO 49-LMC
El paciente 49-LMC fue diagnosticado en el año 2005; se le realizaron dos
monitoreos, como se puede ver en la figura No. 33. El último monitoreo de
este paciente posee más de un 100% de copias de BCR-ABL; por lo que se
considera un fallo de terapia y una posible resistencia; actualmente se
encuentra con tratamiento de segunda línea, nilotinib.
0.09
3049
-1
299
599
899
1199
1499
1799
2099
2399
2699
2999
3299
3599
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 45-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 33: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 9-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
h. CASO 50-LMC
El paciente 50-LMC fue diagnosticado en mayo del 2011; se le realizaron
cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 34. El último
monitoreo de este paciente presentó un 14.66 % IS; por lo que se considera
un fallo de terapia y una posible resistencia.
13.59
136.45
333.73
108.459
-1
49
99
149
199
249
299
349
399
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 49-LMC
% IS
16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012
FIGURA NO. 34: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 5 0-LMC
Fuente: FODECYT 24-2010
i. CASO 23-LMC
El paciente 23-LMC fue diagnosticado en enero del 2011; se realizó
únicamente un monitoreo, en el cual presentó 10.57% IS; y luego
posteriormente falleció, se desconoce la causa de su muerte.
Los paciente 14 y 59 se consideraron falsos positivos porque no presentaron copias en
ninguno de los monitoreos realizados.
36.47
1.25
14.66
-1
6
13
20
27
34
41
48
% I
S B
CR
-AB
L/A
BL
FECHAS DE MONITOREO
SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 50-LMC
% IS
16/3/11 13/3/12 15/7/2012
III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En la tabla No. 3 se observa el total de pacientes analizados (30), y sus respectivos
resultados de BCR-ABL en el sistema internacional (%IS). A partir de esta tabla se
analizaron distintos aspectos, como la clasificación de la respuesta del paciente al
tratamiento Imatinib como óptima, subóptima y fallo de la terapia. Esta clasificación se
realizó según lo expuso Baccarani en la tabla No. 4. En dicha tabla se clasificó como
respuesta óptima, a todos aquellos pacientes que presentaron respuesta molecular mayor
(MMR) a los 18 meses y el equivalente a la respuesta citogenética completa ( CCgR) a los
12 meses. Como respuesta subóptima, se clasificaron los pacientes que no alcanzaron la
CCgR a los 12 meses ni la respuesta molecular mayor a los 18 meses. (63-70)
Según la tabla No. 5, el 39% de pacientes alcanzaron una respuesta óptima, este grupo es el
que tendrá un mejor pronóstico en cuanto a la respuesta al Imatinib; y luego un 25% tiene
una respuesta subóptima, es decir que si han descendido el % BCR-ABL/ABL pero no en
los valores esperados, dicho grupo necesita un monitoreo y un seguimiento más cercano
para poder prevenir un fallo de terapia, y determinar la necesidad de cambiar a inhibidores
de la tirosinkinasa de segunda línea como el Nilotinib y dasatinib. Y por último un 36% de
pacientes presentaron un fallo de terapia, esto se puede deber a la presencia de resistencia al
Imatinib debido a mutaciones en BCR-ABL o a toxicidad al medicamento; de estos
pacientes 3 fallecieron.
En las tablas No. 6 y 7 se agrupan los pacientes que alcanzaron MR, MMR, CCgR Y
MCgR, de esto se puede observar que únicamente 14% ( 4 pacientes) alcanzaron una
respuesta molecular completa (MR), y los cuatro con valores MR4.5 es decir con copias
alrededor de 0.0032%. En estudios presentados por Druker et. al en el año 2006,
Kantarjan, et. a. en el año 2004 y Rosti G, et al en el año 2004, se encontró que el
porcentaje de MR era de 28%, 15% y 22%, respectivamente. Datos que no difieren
demasiado del 14% encontrado en pacientes guatemaltecos. (63-70)
Por otro lado se obtuvo que un 29% se encuentra en respuesta molecular mayor (MMR), es
decir con %IS de 0.01 a 0.1%; y un 21% se encuentre en CCgR, es decir con valores de
%IS entre 0.1-1%.
En porcentajes acumulados, se obtuvo un 64% del total de pacientes analizados tiene una
CCgR ( <1%), y un 43% del total de pacientes incluidos en el presente estudio se encuentra
en MR ( < 0.1%); y un 36% no tiene CCgR. En estudios anteriores se ha reportado un
aumento de estas respuestas conforme ha aumentado el tiempo de monitoreo de los
pacientes, por ejemplo el estudio IRIS, en el cual se incluyeron 1106 pacientes y se
monitorearon por 5 años, se encontró que un 87 % alcanzaron un CCgR, y un 37%
alcanzaron MMR. En otro estudio realizado por Kantarjan, en el año 2004, se obtuvieron
un 63% de pacientes en CCgR y un 31% en MMR a los 45 meses de seguimiento. Y por
último en el estudio GINEMA realizado por Rosti, et al. en 2004, se obtuvieron 44% de
CCgR y CMR 22%; en este proyecto se realizó un seguimiento de 2 años. En el presente
estudio se realizó un seguimiento de 16 a 18 meses, y los resultados de 64% de CCgR y un
43% de MMR, se encuentran en rangos comparables al resto de estudios realizados. Es
importante destacar que comparando con el estudio realizado por Rosti, en el cual se dio un
seguimiento de dos años, se obtuvieron porcentajes del gen más bajos que los reportados en
el presente estudio en el que se dio un seguimiento menor. (63-70)
A continuación se presenta la tabla No. 9 se observa un resumen de los resultados, según
respuesta reportados en varios estudios realizados a nivel mundial; en el último renglón se
presentan los resultados del presente estudio, que al compararlos con los reportados en el
resto de publicaciones, se puede determinar claramente que en pacientes guatemaltecos se
observa el mismo patrón de respuesta, es decir porcentajes similares de respuesta. En esta
tabla la respuesta MMR se obtuvo no del total de pacientes analizados, sino del total de
pacientes en CCgR.
TABLA No. 9: RESULTADO DE MCgR, CCgR Y MMR EN DISTINTOS ESTUDIOS
ESTUDIO No.
PACIENTES
MCgR CCgR MMR
Kantarjan, et al. 2002 454 60 41 NR
Cervantes, et al. 2003 150 66 44 NR
Rosti et al, 2004 191 61 44 60
Lahaye, et al. 2005 139 61 49 63
Silver, et. Al. 2004 532 65 52 NR
Kantarjan, et al. 2004 261 73 63 74
Palandri et al, 2008 277 71 55 68
Presente estudio 30 68 64 67
Fuente: Palandri, F. et. al. 2008, Journal of Clinical Oncology, 26: 106-111.
En la tabla No. 8 se encuentran los datos clínicos y hematológicos de los pacientes
agrupados según el tipo de respuesta. En cuanto a la edad se puede observar que los
pacientes con MMR tienen una edad ligeramente menor ( mediana de 25 años), que los que
no alcanzaron la MMR, y los que alcanzaron la CCgR tienen una mediana de 32 años, y por
último los que no alcanzaron la CCgR tienen una mediana de 39 años. Es decir que se
observa que cuando hay mayor edad, menos respuesta se alcanza. Y en general en cuando a
la edad, cabe destacar que se puede observar que en los pacientes con leucemia mieloide
crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la reportada en el
resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre 50-60 años; es
necesario realizar más estudios que ayuden a determinar la causa de esto.
En relación sexo se observa claramente un predominio de esta enfermedad en pacientes del
sexo masculino ( 70-80%), este dado concuerda con lo reportado en otros estudios.
La mediana de glóbulos blancos en general se encuentra entre 5000-6000 leucocitos por
mililitro; es decir que en general los pacientes con LMC incluidos en el presente estudio
presentan rangos normales de leucocitos, lo que concuerda con una respuesta hematológica.
En cuanto al recuento de glóbulos blancos se observa una mediana entre 5000-6000
leucocitos/ml. La mediana de hemoglobina en los tres grupos se encuentra de 11.7-12.85
g/dl.
En el recuento de plaquetas se puede observar en el grupo que no alcanzó una respuesta
citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000 a 1,332,000
plaquetas/ml. Esto se debe a que en este grupo se encontró que un 62% presenta
alteraciones hematológicas como trombocitopenia, trombosis y leucopenia. Uno de los
efectos secundarios más frecuentes en pacientes que toman Imatinib, es la presencia de
trombocitopenia; a los pacientes que presentan trombocitopenia más agresiva, se les ha
disminuido las dosis del tratamiento; lo que podría ser la causa del fallo al mismo.
En las figuras No. 8 a 11 se puede observar que los casos 13-LMC, 15-LMC, 41-LMC y
46 LMC; presentaron una excelente respuesta al tratamiento ya que se encuentran en
respuesta molecular completa (MR).
Luego los casos 12-LMC, 17-LMC, 24-LMC, 36-LMC, 37-LMC, 48-LMC, 61-LMC Y 62-
LMC, presentan también una respuesta óptima ya que se encuentran en respuesta molecular
mayor, como se puede observar en las figuras No. 12-19.
Los pacientes 19-LMC, 38-LMC, 40-LMC, 43-LMC, 47-LMC, 60-LMC, se encuentran en
respuesta citogenética completa, si bien no han alcanzado respuesta molecular mayor, han
mantenido valores menores del 1% de BCR-ABL/ABL, lo cual también indican que están
respondiendo al tratamiento, aunque más lentamente.
Y por último, los casos 39-LMC, 16-LMC, 18-LMC, 20-LMC, 42-LMC, 44-LMC, 45-
LMC, 49-LMC, 50-LMC Y 23-LMC; tienen valores arriba del 10% de BCR-ABL/ABL. Y
de estos el 23-LMC, 44-LMC Y 45-LMC fallecieron durante la realización del presente
estudio. El caso 16-LMC y 18-LMC presentan toxicidad al medicamento Imatinib, por lo
que la dosis del tratamiento ha sido variable y en ocasiones ha debido suspenderse. El resto
de casos posiblemente tienen resistencia, sería necesario realizarles un panel de mutaciones.
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
1. En el presente se cuantificó y evalúo la presencia de los transcritos de BCR-
ABL, mediante 4 monitoreos en un período de 18 meses a un total de 30
pacientes con diagnóstico clínico de leucemia mieloide crónica.
2. Se estandarizó la técnica de PCR en Tiempo Real para la cuantificación de los
transcritos de BCR-ABL en los pacientes incluidos en el presente estudio.
3. En este estudio se realizaron un total de 120 cuantificaciones de BCR-ABL con
el fin de evaluar su respuesta al tratamiento.
4. Los treinta pacientes incluidos en el estudio se monitorearon cada 3-4 meses
para evaluar la respuesta al Imatinib.
5. Del total de pacientes analizados, veinticuatro presentaron presencia de copias
del gen BCR-ABL; demostrándose que poseen enfermedad mínima residual.
6. El 39% de los pacientes incluidos en el presente estudio alcanzaron una
respuesta óptima al tratamiento Imatinib, alcanzando la respuesta molecular
mayor dentro de los 18 meses posteriores al inicio del tratamiento.
7. El 25% de los pacientes alcanzaron una respuesta subóptima y el 36% de
pacientes tuvo fallo de respuesta al tratamiento; en ninguno de los dos casos se
alcanzó una respuesta molecular mayor.
8. Únicamente un 14% de pacientes se encontraron en respuesta molecular
completa (MR) es decir libres de enfermedad mínima residual.
9. Un 64% de pacientes se encontraron en respuesta citogenética completa, CCgR
( menos de 1% IS), los cuales son considerados como de buen pronóstico.
10. Del total de pacientes con respuesta citogenética completa, un 66% alcanzaron
una respuesta molecular mayor en un período menor a 18 meses de monitoreo.
11. En relación con los datos de los pacientes, la mediana de la edad de los
pacientes es menor a 39 años, y la mayoría son de sexo masculino.
12. Un 62% de pacientes que no alcanzaron respuesta citogenética completa
(>1%IS) presentan alteraciones hematológicas como trombocitopenia,
trombosis y leucopenia.
13. Los resultados obtenidos en el presente proyecto han sido divulgados a los
hematólogos de los hospitales: San Juan de Dios, Roosevelt y Unidad de
Oncología Pediátrica –UNOP-
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Ampliar el monitoreo a un mayor número de pacientes, para obtener un estudio con
mayor confiabilidad.
2. Estandarizar nuevas técnicas aplicadas a distintos tipos de cáncer que permitan un
mejor manejo de la enfermedad del paciente.
3. Establecer con los hematólogos protocolos de seguimiento y tratamiento, según el
número de copias del gen BCR-ABL, en las instituciones guatemaltecas.
4. Expandir a un mayor número de meses el estudio de estos 30 pacientes, para
determinar cuales alcanzan respuesta molecular mayor en períodos superiores a los 18
meses.
5. Brindar este servicio a los países centroamericanos, ya que Guatemala es el primer país
de Centroamérica que realiza estos monitoreos.
6. Determinar las causas de que en Guatemala la mediana de edad de los pacientes con
leucemia mieloide crónica sea tan baja.
7. Divulgar y publicar a nivel internacional los resultados del presente proyecto de
investigación.
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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IV.4 ANEXOS
ANEXO No. 1: ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE TÉCNIC A
La extracción de células mononucleares se realiza por medio de ficoll, con el fin de
obtener una mayor cantidad de células se probó una nueva metodología la cual consiste en
extraer células mononucleares a partir de una solución de lisis de amonios (Buffer de lisis y
Solución salina isotónica) llevando a cabo una lisis específica de eritrocitos para luego
realizar la separación de leucocitos por centrifugación en frío, al obtener las células
separadas se procedió a realizar la extracción de ARN utilizando el kit con su respectiva
retrotranscripción para verificar que la nueva metodología si había funcionado a la muestra
se le realizó ABL, los resultados fueron muy buenos ya que la banda que se observó fue
bien definida lo cual muestra la buena cantidad de muestra que se obtuvo.
Posteriormente se comparó la extracción de ARN por trizol y con el kit, obteniéndose
mejores resultados con el trizol, como se puede observar en la figura No. 35
FIGURA NO. 35: BANDAS COMPARANDO EXTRACCIÓN DE ARN CON
TRIZOL Y CON KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
Las células mononucleares obtenidas de los pacientes se almacenaron en RNAlater a -20 C
( Ver Figura No. 36)
FIGURA NO. 36: ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS DE SANGRE
PERIFÉRICA EN RNALATER
Fuente: FODECYT 24-2010
Posteriormente se procedió a realizar la extracción utilizando el método de trizol. En la
figura NO. 37-45, ser observan los pasos para la extracción de ARN, mediante el método de
trizol.
FIGURA NO. 37: TRIZOL, REACTIVO QUE SE UTILIZARÁ P ARA LA
EXTRACCIÓN DE ARN
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 38: EL REACTIVO TRIZOL ES AGREGADO A LA S MUESTRAS
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 39: EL TRIZOL DE COLOR ROSA SOBRE LA MU ESTRA DE
PACIENTES
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 40: LISIS CON TRIZOL DE LA MUESTRA.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 41: DISPENSACIÓN DE CLOROFORMO PARA LA S EPARACIÓN
DE FASES DEL ARN OBTENIDO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 42: TUBO MEZCLADO CON CLOROFORMO Y TRIZO L, LISTO
PARA CENTRIFUGACIÓN
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 43: CENTRIFUGACIÓN DE MUESTRAS PARA SEPA RACIÓN DE
FASES
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 44: SEPARACIÓN DE FASES; LA FASE SUPERIOR
CLOFÓRMICA CONTIENE EL ARN DE INTERÉS.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 45: DISPENSACIÓN DE ETANOL PARA PRECIPIT ACIÓN DEL
ARN
Fuente: FODECYT 24-2010
Una vez extraído el ARN se procedió a agregar los reactivos necesarios para la RT-PCR en
tiempo real, que permitirá cuantificar los genes ABL y BCR-ABL ( Ver figura No. 46)
FIGURA NO. 46: PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y REACTIVOS PAR QRT-
PCR
Fuente: FODECYT 24-2010
ANEXO No. 2: EVALUACIÓN DEL KIT:
a. Primera evaluación:
Para iniciar la evaluación del kit se hizo la primera corrida, utilizando los
estándares y controles positivos del kit; en la figura No. 13 se observa la
curva estándar del gen ABL y del BCR-ABL. Posteriormente en las figuras
No. 47-51 se observa la amplificación de los estándares de ABL y de
BCRABL. En las figuras No. 52-54, se observa la amplificación de los
controles negativos y positivos del gen ABL y BCR-ABL.
FIGURA NO. 47: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL , PRIMERA
EVALUACIÓN DEL KIT
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 48: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL
NORMALIZADA DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 49: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL,
DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 50: AMPLIFICACIÓN NORMALIZADA DE LOS
ESTÁNDARES DE ABL DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 51: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL, DE
LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 52: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL DE LOS CON TROLES
POSITIVOS, DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 53: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS
DEL GEN BCR-ABL NORMALIZADA, DE LA PRIMERA EVALUACI ÓN
DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 54: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS
DEL GEN BCR-ABL DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
De los resultados obtenidos de la primera evaluación se puede observar en la Tabla
No. 10; que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia, lo
que confirma que la primera prueba realizada fue exitosa.
TABLA NO. 10: PARÁMETROS EVALUADOS DURANTE LA PRIME RA
CORRIDA
Parámetro a evaluar Resultado
obtenido
Valor de referencia Interpretación
Pendiente BCR-ABL -3.27 -3,45+/- 0.3 Aceptable
Intercepto b BCR-ABL 39.9 Ct 35-40 Aceptable
Coeficiente de correlación BCR-
ABL
1 > 0.99 Aceptable
Blanco 0
No amplificación Aceptable
Control MMR ( copias de ABL) 17,895.00 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL control
MMR
0.05 % 0.06%- 0.24% Aceptable
Control High ( copias de ABL) 18,613.00 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL control
alto
10.5% 6%- 24% Aceptable
Control negativo 0
> 5,000 copias de ABL, no
copias de BCR-ABL
Aceptable
Fuente: FODECYT 24-2010
b. Segunda evaluación:
Con el fin de corroborar los resultados obtenidos en la primera evaluación,
se procedió a realizar una segunda evaluación del kit.
En la figura No. 55 se observa la curva estándar del gen ABL y del BCR-
ABL. Posteriormente en las figuras No.56-59 , se observa la amplificación
de los estándares de ABL y de BCR-ABL. En las figuras No. 60-61, se
observa la amplificación de los controles negativos y positivos del gen ABL
y BCR-ABL.
FIGURA NO. 55: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL DE LA
SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 56: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL DE
LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 57: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL
NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 58: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL
DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 59: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL
NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT .
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 60: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS DEL
GEN BCR-ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DE L KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 61: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS DEL
GEN ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KI T.
Fuente: FODECYT 24-2010
De los resultados obtenidos de la segunda evaluación se puede observar en la Tabla
No. 11; que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia, lo
que confirma que la primera prueba realizada fue exitosa.
TABLA NO. 11 PARÁMETROS EVALUADOS DURANTE LA PRIMER A
CORRIDA
PARÁMETRO A
EVALUAR
RESULTADO
OBTENIDO
VALOR DE
REFERENCIA
INTERPRETACIÓN
Pendiente BCR-ABL -3.28 -3,45+/- 0.3 Aceptable
Intercepto b BCR-ABL 39.95 Ct 35-40 Aceptable
Coeficiente de correlación
BCR-ABL
0.998 > 0.99 Aceptable
Blanco 0 No amplificación Aceptable
Control MMR ( copias de
ABL)
24509 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL
control MMR
0.09 % 0.06%- 0.24% Aceptable
Control High ( copias de
ABL)
26059 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL
control alto
12.87% 6%- 24% Aceptable
Control negativo 0 > 5,000 copias de ABL,
no copias de BCR-ABL
Aceptable
c. Evaluación de segundo kit
Para iniciar la evaluación del segundo kit comprado se hizo la primera corrida,
utilizando los estándares y controles positivos del kit; en la figura No. 62 se observa
la curva estándar del gen ABL y del BCR-ABL. Posteriormente en las figuras No.
63-66, se observa la amplificación de los estándares de ABL y de BCR-ABL. En
las figuras No. 67-68, se observa la amplificación de los controles negativos y
positivos del gen ABL y BCR-ABL.
FIGURA NO. 62: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL DE LA
EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 63: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE
ABL NORMALIZADA DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 64: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL DE
LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 65: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL
NORMALIZADA DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT .
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 66: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL
DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 67: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS
DEL GEN BCR-ABL NORMALIZADA DE LA EVALUACIÓN DEL
SEGUNDO KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 68: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS
DEL GEN BCR-ABL DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.
Fuente: FODECYT 24-2010
De los resultados obtenidos de la segunda evaluación se puede observar en la Tabla No. 12;
que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia, lo que confirma que
la primera prueba realizada fue exitosa.
TABLA NO. 12: PARÁMETROS EVALUADOS DURANTE CORRIDA
PARÁMETRO A
EVALUAR
RESULTADO
OBTENIDO
VALOR DE
REFERENCIA
INTERPRETACIÓN
Pendiente BCR-ABL -3.36 -3,45+/- 0.3 Aceptable
Intercepto b BCR-ABL 40 Ct 35-40 Aceptable
Coeficiente de correlación
BCR-ABL
1 > 0.99 Aceptable
Blanco 0 No amplificación Aceptable
Control MMR ( copias de
ABL)
13447 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL
control MMR
0.20 0.06%- 0.24% Aceptable
Control High ( copias de
ABL)
15201 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL
control alto
17.74 6%- 24% Aceptable
Control negativo 0 > 5,000 copias de ABL,
no copias de BCR-ABL
Aceptable
Fuente: FODECYT 24-2010
ANEXO No. 3: RESULTADOS DEL PRIMER MONITOREO DE PAC IENTES
a. Primera corrida
Se observa en la figura No. 69 la amplificación de todos los pacientes
analizados. Posteriormente en la figura No. 70 se observa la curva estándar
del gen ABL y del BCR-ABL. En la figura 71-73, se observa la
amplificación de los estándares para ambos genes. En la figura 74 se
observan los controles positivos, y por último en la figura No. 75 y 76 se
observa la amplificación de las muestras de pacientes.
FIGURA NO. 69: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL Y BCR-ABL DEL PRIMER
MONITOREO DE PACIENTES .
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 70: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL DEL
PRIMER MONITOREO DE PACIENTES
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO.71: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE BC R-ABL
NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 72: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL
NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 73: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS
DEL GEN ABL NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO DE
PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 74: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS
DEL GEN BCR-ABL DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 75: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENT ES DE
NO. 1-11 DEL PRIMER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 76: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENT ES DE
NO. 1-11 NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
De los resultados obtenidos en el análisis de los primeros 11 pacientes se puede observar
en la Tabla No. 13; que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia,
lo que confirma que la primera prueba realizada fue exitosa.
TABLA NO. 13: PARÁMETROS EVALUADOS
PARÁMETRO A
EVALUAR
RESULTADO
OBTENIDO
VALOR DE
REFERENCIA
INTERPRETACIÓN
Pendiente BCR-ABL -3.35 -3,45+/- 0.3 Aceptable
Intercepto b BCR-ABL 40.21 Ct 35-40 Aceptable
Coeficiente de correlación
BCR-ABL
0.999 > 0.99 Aceptable
Blanco 0 No amplificación Aceptable
Control MMR ( copias de
ABL)
10506 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL
control MMR
0.16 0.06%- 0.24% Aceptable
Control High ( copias de
ABL)
13,279 > 5,000 copias Aceptable
Ratio BCR-ABL/ABL
control alto
16.32 % 6%- 24% Aceptable
Control negativo 0 > 5,000 copias de ABL,
no copias de BCR-ABL
Aceptable
Fuente: FODECYT 24-2010
Se puede observar en la tabla No. 14, el número de copias obtenidos de los pacientes
analizados, de los cuales los que se encuentran en amarillo se volverán a repetir debido
a que las copias del gen control ABL son muy bajas.
TABLA No.14: RESULTADOS DE PACIENTES PRIMERA CORRID A
MUEST
RA GEN CT COPIAS GEN CT COPIAS
INTERPR
ETACIÓN
1 BCR-ABL 34.611469 5.8383417 ABL 33.772156 83.433746 repetir
2 BCR-ABL 36.005787 2.1450379 ABL 31.188538 493.18369
3 BCR-ABL 38.968128 0.2555943 ABL 27.334051 6986.4189
4 BCR-ABL 34.93325 4.6337609 ABL 30.266048 930.11115
5 BCR-ABL 33.280006 15.189419 ABL 31.372162 434.67471
6 BCR-ABL 37.225002 0.8936977 ABL Undetermined repetir
7 BCR-ABL 34.375885 6.9145298 ABL 34.049854 68.928627 repetir
8 BCR-ABL 31.875544 41.644703 ABL 32.489086 201.63454
9 BCR-ABL 33.210331 15.968763 ABL 32.917599 150.16826 repetir
10 BCR-ABL 29.024527 322.64447 ABL 28.836058 2486.7952
11 BCR-ABL Undetermined ABL Undetermined repetir
Se validaron las muestras No. 2,,3,4,5,8 y 10 debido a que tienen cantidades adecuadas de
BCR-ABL.
b. Segunda corrida
Se realizó una segunda corrida para validar los resultados de los cuatro
pacientes restantes, a los cuales se les tomó nueva muestra de sangre. En la
Figura No. 77 Y 78 se observan las curvas estándares del gen ABL y del
BCR-ABL. En la figura No. 79 se observa la amplificación de todas las
muestras, incluyendo los controles. En la figura 80-81 la amplificación de
los estándares de ambos genes. En la figura No. 82-83 la amplificación de
los controles de ambos genes y por último en la figura No.84-85 la
amplificación de las muestras.
FIGURA NO. 77: CURVA ESTÁNDAR DE BCR-ABL DE LA SEGU NDA
CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES .
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 78: CURVA ESTÁNDAR DE ABL DE LA SEGUNDA CORRIDA
DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 79: AMPLIFICACIÓN DE CADA UNA DE LAS MU ESTRAS, DE LA
SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 80: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL
NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER
MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 81: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL
NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER
MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 82: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES DEL G EN ABL
DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE
PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 83: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES DEL G EN
BCR-ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIME R
MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 84. AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DEL GE N BCR-
ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 85: AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DEL GE N ABL
DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
En la tabla No. 15, se observan los resultados de los pacientes en la segunda corrida; en la
cual sólo se validó la muestra No. 7 ya que tenía cantidad suficiente del gen control ABL,
el resto se volverá a repetir.
TABLA No. 15: RESULTADOS DE PACIENTES DE SEGUNDA CORRIDA
No. de Muestra GEN COPIAS GEN COPIAS INTERPRETACIÓN
Sample 4 BCR-ABL 9.702967 ABL 125.1519 repetir
Sample 5 BCR-ABL 9.151321 ABL 133.1228 repetir
Sample 6 BCR-ABL 19.57079 ABL 202.0391 repetir
Sample 7 BCR-ABL 535.4651 ABL 2807.513 valida
Fuente: FODECYT 24-2010
C. TERCERA CORRIDA
Se realizó una tercera corrida para validar los resultados de los tres pacientes
restantes, a los cuales se les tomó nueva muestra de sangre. En la Figura No.
86 y 87 se observan las curvas estándares del gen ABL y del BCR-ABL. En
la figura No. 88 se observa la amplificación de todas las muestras,
incluyendo los controles. En la figura 89-90 la amplificación de los
estándares de ambos genes. En la figura No. 91-92 la amplificación de las
muestras.
FIGURA NO. 86: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN ABL DE LA TER CERA
CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 87: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DE LA
TERCERA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 88: AMPLIFICACIÓN DE TODAS LAS MUESTRAS, DE LA
TERCERA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 89: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DEL GEN
CONTROL ABL NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA DEL
PRIMER MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 90: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DEL GEN
CONTROL BCR-ABL NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA D EL
PRIMER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 91: AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DEL G EN ABL
NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA DEL PRIMER
MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 92: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL BCR-AB L
NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA DEL PRIMER
MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
En la tabla No. 16, se encuentran los tres pacientes que se repitieron, y se validaron todos
por tener alta cantidad de copias del gen control ABL
TABLA No. 16: RESULTADOS DE TERCERA CORRIDA DE PACI ENTES
No. Muestra Gen copias Gen copias
Sample 4 BCR-ABL 14.85121 ABL 988.9869 Validado
Sample 5 BCR-ABL 17.04087 ABL 392.2223 Validado
Sample 6 BCR-ABL 447.5057 ABL 4461.953 Validado
Fuente: FODECYT 24-2010
En la tabla No.17, se observa el resumen de los resultados obtenidos de los 10 pacientes
analizados; encontrándose algunos pacientes con respuesta óptima de acuerdo al
tratamiento y algunos con respuesta subóptima; lo cual se podrá ir confirmando a medida
que se hagan los monitoreos cada tres o cuatro meses.
TABLA No. 17: RESULTADOS GLOBALES DE LOS 10 PACIENT ES
Fuente: FODECYT 24-2010
No. MUESTRA RESULTADO SI% MESES EN
TX
INTERPRETACION
01-LMC-TR 1.21 7 CCR(1%) casi alcanza CCR
02-LMC-TR 0.35% 8 Ya CCR, falta para MMR ( 1%)
03-LMC-TR indetectable 3
04-LMC-TR 0.403 % 4 Ya CCR, falta para MMR ( 1%)
05-LMC-TR 2.83 % 5 No CCR ni MMR
06-LMC-TR 3.51 % 8 No CCR ni MMR; posible resistencia
07-LMC-TR 8.11 % 18 No CCR ni MMR; posible resistencia
08-LMC-TR 16.72 % 4 Inicio de Tx.
11-LMC-TR 15.45 % 3 Inicio de Tx
10-LMC-TR 10.51% 10 años Posible resistencia, el paciente falleció
no respondió a la segunda línea de
tratamiento.
EVALUACIÓN DE PACIENTES No. 11-25
Para el 15 de julio se programó la segunda jornada para los pacientes restantes; se realizó la
extracción de ARN, para luego realizar la RT-PCR en Tiempo Real; en la figura No. 93 y
94 se observa la amplificación de los estándares de ABL y en las figuras No.95 y 96 se
observa la amplificación de los estándares de BCR-ABL. La curva de estandización de
ABL y de BCR se puede observar en las figuras No. 97 y 98. Los controles positivos se
observan en la figura No. 99. Y la amplificación del gen control ABL en los pacientes se
observa en la figura No. 100 y 101. Y por último la amplificación del transcrito BCR-ABL
en los pacientes se observa en las figuras No.102 y 103.
FIGURA NO. 93: AMPLIFICACIÓN DE LOS CUATRO ESTÁNDAR ES DEL GEN
CONTROL ABL NORMALIZADA PARA LA CUARTA CORRIDA DEL
SEGUNDA JORNADA
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 94: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DEL GEN ABL DE LA
CUARTA CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 95: AMPLIFICACIÓN DEL TRANSCRITO BCR-ABL DE LA
CUARTA CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 96: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE LA CUARTA
CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 97: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN CONTROL ABL D E LA
CUARTA CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 98: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DE L A
CUARTA CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 99: SE OBSERVA LA AMPLIFICACIÓN DE LOS
CONTROLES ALTO, MEDIANO Y NEGATIVO DEL GEN BCR-ABL .
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 100: SE OBSERVA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN
CONTROL ABL EN LAS MUESTRAS DE PACIENTES NO. 11-25.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 101: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL EN MUESTR AS DE
PACIENTES DE LA CUARTA CORRIDA SEGUNDA JORNADA
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 102: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL BCR-A BL EN
LAS MUESTRAS DE PACIENTES NO. 11-35.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 103: SE OBSERVA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN
CONTROL BCR-ABL EN LA MUESTRAS DE PACIENTE NO. 11-2 5.
Fuente: FODECYT 24-2010
Los resultados obetenidos en los pacientes se observan en la tabla No. 18; y el único
paciente que no se pudo validar es la muestra No. 12 por tener demasidas copias del
gen ABL, y por lo tanto haberse inhibido la reacción; el resto de pacientes tienen
arriba de 1000 copias de ABL, que es lo mínimo recomendado para validar un
resultado.
TABLA No. 18 : RESULTADOS OBTENIDOS DE LA CORRIDA D E PCR
EN TIEMPO REAL DE LOS PACIENTES 11-25
No.
muestra
No.
correlativo GEN copias GEN copias ratio % %IS
Sample 1 high BCR-ABL 683.7939 ABL 10806.9 0.063274 6.33 5.13
Sample 2 mmr BCR-ABL 71.68877 ABL 2079.783 0.034469 3.45 2.79
Sample 3 neg BCR-ABL 2.844461 ABL 9109.073 0.000312 0.03 0.03
Sample 4 36 BCR-ABL 7.990568 ABL 4852.754 0.001647 0.16 0.13
Sample 5 37 BCR-ABL 7.136006 ABL 4994.364 0.001429 0.14 0.12
Sample 6 38 BCR-ABL 192.1618 ABL 13416.5 0.014323 1.43 1.16
Sample 7 39 BCR-ABL 430.9462 ABL 13029.03 0.033076 3.31 2.68
Sample 8 40 BCR-ABL 62.53309 ABL 6268.76 0.009975 1.00 0.81
Sample 9 41 BCR-ABL 25.12766 ABL 4428.705 0.005674 0.57 0.46
Sample 10 42 BCR-ABL 31.31583 ABL 9803.065 0.003194 0.32 0.26
Sample 11 43 BCR-ABL 57.08937 ABL 3192.088 0.017885 1.79 1.45
Sample 12 44 BCR-ABL 51473.81 ABL 31472.83 1.6355 163.55 132.48
Sample 13 45 BCR-ABL 14.06899 ABL 12465.58 0.001129 0.11 0.09
Sample 14 46 BCR-ABL 112.3535 ABL 3185.546 0.03527 3.53 2.86
Sample 15 47 BCR-ABL 121.7362 ABL 7967.16 0.01528 1.53 1.24
Sample 16 48 BCR-ABL 10.23766 ABL 8262.257 0.001239 0.12 0.10
Sample 17 49 BCR-ABL 917.3088 ABL 5467.948 0.167761 16.78 13.59
Sample 18 50 BCR-ABL 6687.486 ABL 14854.04 0.450213 45.02 36.47
En la tabla No. 19, se muestra el análisis de resultado de los pacientes según el número de
meses en tratamiento. Y también se observa los que ya han alcanzado la respuesta
molecular mayor (MMR) o la respuesta citogenética completa (CCR)
TABLA No. 19: RESULTADOS E INTERPRETACIÓN DE LOS
PACIENTES
Fuente: FODECYT 21-2010
No. MUESTRA RESULTADO
SI%
MESES EN TX INTERPRETACIO
N
36 0.13 MMR
37 0.12 13 MMR
38 1.16 4 CCR
39 2.68 3 años 7 mese No CCR No MMR
40 0.81 3 años 6 meses CCR
41 0.46 12 meses CCR
42 0.26 9 meses CCR
43 1.45 10 meses No CCR
44 132.48 repetir Repetir
45 0.09 14 meses MMR
46 2.86 4 años 7 meses No CCR
47 1.24 8 años 7 meses No CCR
48 0.10 9 meses MMR
49 13.59 No CCR
50 36.47 No CCR
ANEXO No. 5: SEGUNDO MONITOREO DE LOS 25 PACIENTES:
En el mes de noviembre se realizó el segundo monitoreo de los pacientes incluidos en el
estudio; y se hizo mediante dos jornadas.
Para el 10 de noviembre del 2011, se citaron los primeros 10 pacientes de LMC, para su
segundo monitoreo. Las figuras 104 a 110 muestran las curvas de amplicación de los
estándares y muestras para los genes ABL y BCR-ABL.
FIGURA NO. 104: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE MU ESTRAS
DE PACIENTES SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 105: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL EN MU ESTRAS DE
PACIENTES EN EL SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 106: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL EN EL SEGUNDO
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 107: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL EN E L
SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 108: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL
NORMALIZADA EN EL SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 109: AMPLIFICACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DEL GEN
ABL EN EL SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO.110 : AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES Y 10 PACIENTES, DEL
SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
El 11 de noviembre se repitieron 6 pacientes, para confirmar los resultados obtenidos en la
primera jornada. Las figuras 111-114, muestran las curvas de amplificación de las muestras
de los pacientes y de las curvas estándar para los genes BCR-ABL y ABL.
FIGURA 111: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENTES DEL GEN
BCR-ABL EN LA SEGUNDA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 112: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL DE LO S
PACIENTES ANALIZADOS EN LA SEGUNDA JORNADA DEL SEGU NDO
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 113: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS Y ESTÁNDARES DE LA
SEGUNDA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 114: CURVA DE ESTÁNDARES DEL GEN CONTROL ABL DE LA
SEGUNDA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
Los siguiente 15 pacientes se citaron para el 21 de noviembre del 2011; y en las figuras de
la 115-118 se muestran las curvas de amplificación de los pacientes y de los estándares para
los genes BCR-ABL y ABL.
FIGURA 115: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE 15 PACIENT ES Y CURVA
ESTÁNDAR DE LA TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITORE O
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 116: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENTES DE LA
TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO.
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 117: AMPLIFICACIÓN DE GEN CONTROL ABL DE LA TERCERA
JORNADA DE LA SEGUNDA MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 118: AMPLIFICACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DEL GE N BCR-ABL
DE LA TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 119: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL EN MUESTRAS DE
PACIENTES DE LA TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOR EO
Fuente: FODECYT 24-2010
ANEXO NO. 6: TERCER MONITOREO DE PACIENTES:
En el mes de marzo se realizó el tercer monitoreo de los pacientes incluidos en el estudio; y
se hizo mediante dos jornadas.
En la tabla No. 20, se muestran los resultados obtenidos en la corrida de los primeros 9
pacientes.
TABLA NO. 20 RESULTADOS DE VALIDACIÓN DE CORRIDAS D EL
TERCER MONITOREO
PARÁMETRO A
EVALUAR
RESULTADO
OBTENIDO
VALOR DE
REFERENCIA
INTERPRETACIÓN
Pendiente BCR-ABL -3.252 -3,45+/- 0.3 Aceptable
Intercepto b BCR-ABL 37.162 Ct 35-40 Aceptable
Coeficiente de correlación
BCR-ABL
0.992 > 0.99 Aceptable
Blanco 0 No amplificación Aceptable
Control negativo 0 > 5,000 copias de ABL,
no copias de BCR-ABL
Aceptable
Fuente: FODECYT 24-2010
Para el 13 de marzo del 2012, se atendieron 9 pacientes de LMC, para su tercer monitoreo.
Las figuras 120 a 126 muestran las curvas de amplificación de los estándares y muestras
para los genes ABL y BCR-ABL.
FIGURA NO. 120: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE MU ESTRAS
DE PACIENTES DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 121: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL EN
MUESTRAS DE PACIENTES DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 122: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DEL T ERCER
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 123: AMPLIFICACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DEL GEN
ABL DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO.124 : AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES Y P ACIENTES,
DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 125: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN CONTROL ABL DEL TERCER
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 126: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DEL TERCER
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
Y por último en la Tabla no. 21, se muestran los resultados obtenidos en pacientes en
Número de copias.
TABLA No. 21: RESULTADOS EN NUMERO DE COPIAS DE BCR-ABL
MUESTRA GEN CТ
CТ
MEDIA CANTIDAD
Sample 1 BCR-ABL 31.00253 27.95307 78.36212
Sample 2 BCR-ABL 25.71436 28.78662 3314.255
Sample 3 BCR-ABL 31.77541 34.40226 45.33394
Sample 4 BCR-ABL 30.83566 30.83566 88.19154
Sample 5 BCR-ABL 35.68541 35.68541 2.844297
Sample 6 BCR-ABL 31.42579 31.42579 58.06888
Sample 7 BCR-ABL 35.58514 35.58514 3.0536
Sample 8 BCR-ABL 37.99069 37.99069 0.55594
Sample 9 BCR-ABL 26.52043 26.52043 1872.813
Sample 1 ABL 25.98226 32.45761 9451.753
Sample 2 ABL 24.88852 24.88852 20076.82
Sample 3 ABL 29.49559 29.49559 840.4831
Sample 4 ABL 23.49025 23.49025 52598.67
Sample 5 ABL 26.38093 26.38093 7182.145
Sample 6 ABL 24.90013 24.90013 19916.88
Sample 7 ABL 31.50833 31.50833 210.105
Sample 8 ABL Undetermined
Sample 9 ABL 22.27419 22.27419 121548.1
Los siguientes 15 pacientes se citaron para el 19 de marzo 2012; y en las figuras de la 127-
133, se muestran las curvas de amplificación de los pacientes y de los estándares para los
genes BCR-ABL y ABL.
En la tabla No. 22, se muestran los resultados obtenidos en la corrida de los 15 pacientes.
TABLA NO. 22: RESULTADOS DE VALIDACIÓN DE CORRIDAS
PARÁMETRO A
EVALUAR
RESULTADO
OBTENIDO
VALOR DE
REFERENCIA
INTERPRETACIÓN
Pendiente BCR-ABL -3.247 -3,45+/- 0.3 Aceptable
Intercepto b BCR-ABL 40.9 Ct 35-40 Aceptable
Coeficiente de correlación
BCR-ABL
0.999 > 0.99 Aceptable
Blanco 0 No amplificación Aceptable
Control negativo 0 > 5,000 copias de ABL,
no copias de BCR-ABL
Aceptable
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 127: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE 15 PACIENT ES Y CURVA
ESTÁNDAR DE LA SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA 128: AMPLIFICACIÓN DE GEN CONTROL ABL DE LA
SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 129: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN ABL DE LA
SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 130: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN BCR-ABL DE
LA SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 131: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE LO S PACIENTES
ANALIZADOS DE LA SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOR EO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 132: GRÁFICA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL DE LA
SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 133: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN ABL DE LA SE GUNDA
JORNADA DEL TERCER MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
Y por último en la tabla No. 23, se muestran los resultados de los pacientes en número de
copias de cada gen.
TABLA No. 23: RESULTADOS EN NÚMERO DE COPIAS DE LOS PACIENTES
ANALIZADOS
MUESTRA GEN Cт
Cт
MEDIA CANTIDAD
Sample 4 BCR-ABL 37.1872 37.1872 1.881849
Sample 5 BCR-ABL 37.44374 37.44374 1.574433
Sample 6 BCR-ABL 34.73423 34.73423 10.35709
Sample 7 BCR-ABL 21.66268 21.66268 91639.16
Sample 8 BCR-ABL 36.23236 36.23236 3.655022
Sample 9 BCR-ABL 22.30116 22.30116 58789.46
Sample 10 BCR-ABL 30.83853 30.83853 155.4222
Sample 11 BCR-ABL 30.49467 30.49467 197.3957
Sample 12 BCR-ABL 32.4288 32.4288 51.445
Sample 13 BCR-ABL 31.50919 31.50919 97.50163
Sample 14 BCR-ABL Undetermined
Sample 15 BCR-ABL 30.6846 30.6846 172.9779
Sample 4 ABL 25.95381 25.95381 42197.52
Sample 5 ABL 24.84394 24.84394 92715.45
Sample 6 ABL 25.26685 25.26685 68689
Sample 7 ABL 24.18726 24.18726 147715
Sample 8 ABL 27.55034 27.55034 13599.32
Sample 9 ABL 24.14941 24.14941 151734
Sample 10 ABL 26.95535 26.95535 20739.05
Sample 11 ABL 25.66483 25.66483 51796.44
Sample 12 ABL 26.19166 26.19166 35646.84
Sample 13 ABL 27.69549 27.69549 12268.92
Sample 14 ABL 28.01905 28.01905 9753.071
Sample 15 ABL 25.8228 25.8228 46306.23
ANEXO No. 7 : CUARTA MONITOREO DE PACIENTES
En la figura No.134 a 138; se muestran los resultados de amplificación y curva estándar
para el gen BCR-ABL y el gen ABL
FIGURA NO. 134: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS Y CALIBRA DORES DEL
CUARTO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 135: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN BCR-ABL
DEL CUARTO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 136: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DEL CUAR TO
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 137: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN ABL DEL
CUARTO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 138: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN CONTROL ABL DEL
CUARTO MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010
FIGURA NO. 139: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DEL CUARTO
MONITOREO
Fuente: FODECYT 24-2010