cuantificación de la glucosa por el método de la o·toluidina
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Cuantificación de la glucosapor el método de la O·Toluidina
EDUARDO BRILLA* KARL SCHOSINSKY*
MIGUEL ESQuNEL** MIGUEL CHAVARRIA*
RESUMEJIo.
Se presenta un estudio analítico en torono al método de la O-Toluidina para glucosasérica. El límite máximo de la linearidadbajo las condiciones usadas fue de 500 mg!dI. Las pruebas de reproducibilidad most-:'lron coeficientes de variación para valol~.s bajos, intermedios y altos de glucosal'lérica de 3,6, 2.4 y 1.8% respectivamente.Las pruebas de recuperación en suero y enorina mostraron resultados aceptables dentro de los rangos permisibles.
Se observaron coeficientes de correlación muy buenos entre este método y losde Folin-Wu nlOdificados (r = 0.96) y ferricianuro automatizado (r=0.99). Los valores margen normales de una población estudiantil universitaria, de uno y otro sexo,fueron de 70 a 104 mgjdl (± 2 D.S.)
La determinación cuantitativa de glucosaen sangre ha preocupado a muchos químicos clínicos desde hace muchos años. Portratarse de un análisis rutinario, con frecuencia de informe urgente y ante la necesidadde ofrecer resultados exactos y precisos através de procedimientos sencillos, rápidosy económicos, nos dimos a la tarea de estudiar el método de la O-toluidina, cuyas bondades mencionadas en la literatura lo señalan como método de elección para cualquierlaboratorio.
La utilización de la O-toluidina en ladeterminación de aldosacáridos en un mediode ácido acético, fue establecido como método rutinario por Hultman (7), procedimiento que ha sido modificado por variosautores y utilizado en métodos manuales yautomáticos (2.10). Se fundamenta el procedimiento en una reacción de condensaciónde la glucosa y aminas aromáticas primariasen un medio de ácido acético glacial, segúnla siguiente secuencia de reacciones:
El producto coloreado fina les el resultado de la reacción de la O-to1uidina conla glucosa, formándose gIucosilamina y la
* Cátedra de Química Clínica, Departamentode Análisis Clínicos, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, HospitalSan Juan de Dios.
** Laboratorio Clínico, Hospital San Juan deDios.
18 Act. Méd. Costo 20-, 18 - 23, 1977
correspondiente base de Schiff (9). Esteproducto coloreado tiene un máximo de absorción de 625 a 635 nm (1), cuya densidad óptica se incrementa proporcionalmente de acuerdo a la ley de Beer-Lambertentre una amplia gama de concentraciones(O a 500 mg/dl en nuestro laboratorio), sinembargo se recomienda leer el productocoloreado final entre 0.1 a 1.0 de absorbancia.
Materiales y Reactivos:O-toluidina, 5%
Disuelva 1.5 gramos de tiourea (gradoreactivo) en 500 ml de ácido acético glacial (grado reactivo) contenido en un balón aforado de un litro. Agregue 50 mI deO-toluidina (The British Drug Rouses Ltd.,Englad) y complete a un litro con ácidoacético glacial. Mezcle esta solución y conserve a temperatura ambiente en un frascoámbar al abrigo de la luz. El reactivo sepuede utilizar recién preparado y es establepor un período de varios meses (9).
Patrón de Glucosa de reserva (10 mg/ml)
Disuelva en un balón aforado de 100mI un gramo (1.000 g) de glucosa anhidra (Q.P.) en una solución acuosa de ácidobenzoico (0.2 g/dI). Esta solución es establ ea temperatura ambiente.
Patrón de. glucosa de. trabajo
Diluya apropiadamente el patrón de reserva para obtener los distintos v¡tlores deseados en la calibración o para los controlesdiarios (una dilución 1:10 del patrón dereserva proporcionará un patrón de trabajo de 100 mg/dl).
Procedimiento
1) Coloque 5 mI del reactivo de O-toluidina en un tubo de rosca de 25 mI (estaoperación debe efectuarse mediante unapipeta automática).
2) Agregue 0.1 mI de suero, plasma uorina. Agite y cierre flojamente con untapón adecuado.
3) Coloque los tubos en baño de agua de95 9 a 1009C por la minutos.
4) Enfríe por 2 a 3 minutos en agua deltubo.
5) Lea a una longitud de onda de 630 nmcon una celdilla de 12 mm de diámetroprevio ajuste a cero de absorbancia conun blanco de reactivos utilizando aguaen lugar de muestra.
El blanco de reactivos y los patrones,recibirán idéntico tratamiento que la muestra.
El espectrofotómetro usado en este trabajo fue nu Coleman Junior Il A.
Calibración
Para establecer la curva de calibraciónrecomendamos determinar los siguientespuntos: 50, 100, 200, 300 Y 500 mg/dl.Con las concentraciones de más de 350 mg/ dI se obtienen absorbancias de más de1.0.
Cálculos
La concentración de glucosa en las muestras se calcula a partir de la siguiente expresión:
glucosa (mg/dl) =
Absorbancia de la muestra
Absorbancia del patrónX Concentración del patrón
La concentración del patrón usado eneste trabajo fue de 100 mg/dl.
Los mg/dI de glucosa se pueden obtener también haciendo uso de la curva decalibración.
Resultados y comentarios
El procedimiento manual para determinar gluocsa con el reactivo de la O-toluidinaes sensible, rápido, no requiere desproteinización y utiliza un solo reactivo, el cual esestable. El color fjnal, a la longitud de ondautilizada en la técnica es relativamente específico para la glucosa. La adición de tiourea al reactivo de O-toluidina, produce uncolor final verde, transparente, con escasocolor en el blanco de reactivos y más estabilidad en el reactivo en sí (3).
Como la reacción es muy sensible alagua, su concentración no debe exceder el10% (7). Las proteínas (hasta 11 g/dI) Yla bilirrubina (hasta 18,0 g/dI), no interfieem en la determinación (4). La hemoglobina en concentraciones mayores a 700mg/dl causa interferencia importante, porlo que estos casos se debe recurrir a un filtrado libre de proteínas obtenido con ácido tricloroacético. En ciertas ocasiones lasolución final lista para la lectura puedepresentar turbidez, lo cual puede deberse atemperaturas de reacción inferiores a lasrecomendadas; pero de ordinario este pro·blema sucede con muestras lipémicas. Enestos casos el análisis deberá repetirse conun filtrado libre de proteínas (9). La leyde Beer y Lambert se cumple en nuestrascondiciones de trabajo hasta un máximo
Brilla E.• Cuantificación de la Glucosa 19
CUADRO 1
EFECTO DE CONSTITUYENTES SERICOS EN EL METODODE LA O-TOLUIDINA
(PRUEBAS DE RECUPERACION) *
Muestra
SueroSuero +Suero +Suero +
20 mg/dl50 mg/dl
100 mg/dl
Glucosa
Valor observado
83.9104.8135.8183.6
(mag/dl)
Valor esperado
103.9133.9183.9
recuperación
20.951.999.7
* Promedio de valores obtenidos por triplicado.
de 500 mg/dl de glucosa. Muestras consu efecto interferente es despreciable. Basados en los resultados obtenidos en las pruebas de recuperación en orina (cuadro I1)
Los resultados de las pruebas de recuvalores superiores requieren previa dilución.peración (cuadros I y 11) muestran que nohay efecto apreciable de los constituyentesséricos o urinarios normales, lo que señalabuena exactitud del método en cuestión;sin embargo, debe tomarse en consideraciónque la reacción de la O-toluidina no es específica para la glucosa, siendo que la galactosa y la manosa reaccionan equimolecularmente en relación a glucosa (1,9). Otrassustancias reportadas como interferentes son:lactosas, arabinosas, maltosa (1,9), ribosa,xilosa y fructuosa (1,6). Debido a que estos componentes se encuentran generalmente en concentraciones muy bajas en suero,
podemos considerar este método, como unbuen procedimiento para cuantificar glucosa en orina. Sin embargo no hay que dejard.e. considerar los posibles interferentes poSItiVOS qeu pueden producir otros aldosacáridos presentes en la misma.
Las pruebas de precisión consistieron en20 determinaciones por el método en estudio, el de Folin-Wu modificado -conocido en nuestro medio como método modificado de Somogyi Nelson- (8) y el automatizado del ferricianuro.* Los análisis, porcada uno de los métodos, comprendieronconcentraciones bajas, intermedias y altasde glucosa sérica. Las determinaciones sellevaron a cabo en un lapso de 40 días.En el cuadro 111 puede observarse que los
* Autoanalyzer, Basic 1I, Technicon Corporation Instruments Corp., Tarrytown, N. Y.10591.
CUADRO II
EFECTO DE CONSTITUYENTES DE LA ORINA EN EL METODODE LA O-TOLUIDINA
(PRUEBAS DE RECUPERACION) *
Muestra
OrinaOrina + 25 mg/dlOrina + 50 mg/dlOrina + 200 mgldI
Valor observado
23.149.875.1
212.5
Glucosa (mg/dl)
Valor esperado
48.173.1
223.1
recuperación
24.152.0
192.6
* Promedio de valores obtenidos por triplicado.
20 Act. Méd. Costo 20-1 - 1977
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73.
82.
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83.
39.
29.
2
C.V
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65
3.8
2.4
2.9
3.2
1.8
4.8
4.8
1.0
o.•
06
Fig. 1 Espectros de absorción del producto co·loreado producido por la reacción de laO-toluidina con glucosa.
A Espectro de absorción contra agua
04
02
400 50
LONGITUD DE ONDA (nm)
B. Espectro de absorción contra blanC0de reactivos.
valores más bajos en cuanto a desviaciónestándar y coeficiente de variación correspondieron al método de la O-toluidina, loque lo señala, en las condiciones en que serealizaron los experimentos, como el máspreciso de los tres Los parámetros obtenidospara los otros dos métodos los señalan como de semejante precisión. Sin embargo,deben tenerse en consideración que se tuvocuidados extremos con los métodos de laQ·toluidina y el de Folin-Wu modificado,mientras que las muestras analizadas porel método automatizado del ferricianuro representan la forma como se corren de rutinaen un laboratorio clínico hospitalario.
Se observa también en las pruebas deprecisión que con el método de la O-toluidina, se obtuvo en menor coeficiente devariación con el suero de mayor concentración de glucosa (193 mg/dl), mientras quepara los otros dos métodos sucedió lo contrario. Por el método del ferricianuro, losvalores altos fueron los más imprecisos.
La mejor precisión obtenida con el método de la O-toluidina se puede atribuir ala sencillez del método que requiere de dosoperaciones de pipeteo por muestra.
Otro de los parámetros estudiados yque deben tenerse presente son el tiempo yla temperatura a la que se lleva a cabo lareacción. Si los tubos se dejan en agua aebullición por medio de 10 o más de 12minutos la intensidad del color final serámenor a la óptima. Reacciones con tiempoy temperatura, diferentes a las anotadas
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puede dar origen a resultados poco fidedignos. Recomendamos por lo tanto ajustarseal máximo a las condiciones propuestas enel procedimiento. observamos que la velocidad de desarrollo del color es, en cuantoa tiempo, independiente de la concentración; lo anterior coincide con los hallazgosde Dubowski (1).
La figuera 1 muestra el espectro de absorción del producto de reacción final leídocontra agua y contra blanco de reactivos.Como puede observarse, la obsorbanica máxima del producto coloreado se obtiene a630 nm, lo que coincide con los hallazgosde Dubowski (1). Cuadros 1, JI Y III).
Las pruebas de correlación comprendieron el análisis de de 98 muestras de sueropor tres métodos, el de la O-toluidina, el deFolin-Wu modificado y el del ferricianuroautomatizado. Todos los sueros fueron obtenidos del Laboratorio Clínico del Hospital San Juan de Dios, de pacientes internados con diversos padecimientos. La escogencia de las muestras a analizar fue alazar.
Los valores normales se analizaron enpoblación estudiantil. Para ello se obtuvieron 86 muestras de la ficha médica de laUniversidad de Costa Rica, de estudiantesde 18 a 32 años de edad, de uno y otrosexo, y aparentemente sanos. El valor pro·medio obtenido fue de 87 mg/dI de suero,con valores margen de 70 a 104 mg/dl,(-+- 2 desviaciones estándar).
Por los datos indicados en las figuras2 y 3, queda evidente la buena correlaciónentre los tres métodos (r=0.99 y r=O.96respectivamente); de lo que se infiere laventaja en la aplicación del método de laO-toluidina en nuestro medio ya que losvalores normales obtenidos corresponden,
U .../
con ligeras diferencias, a los valores margenséricos y plasmáticos, reportados para elmétodo de Folin-Wu modificado (5), yel automático del ferricianuro (70 alOamgldi). Esta buena correlación entre lostres métodos coincide con lo reportado porDubowski (1) Y Feteris (3).
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M(lOOO .DE LA o-TOlUl0lNA (",O/di)
Fi,g. 2 Comparación entre el Método de laO·Toluidina y el del FerricianuroAutomatizado.
METOOO DE LA O-TOLUlD+NA (mlil/dll
Fig. 3 Comparación entre el Método deO·Toluidina y el de Folin·WuModificado.
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