Cuantificación de Legionella mediante real time PCR.

Resultados de un estudio experimental.

Gemma Saucedo.Laboratorio Aguas de Barcelona

22-23 de noviembre de 2006

IntroducciónPCR: Polymerase Chain ReactionTécnica de Biología Molecular inventada en 1985 por Kary B. Mullis(Premio Nobel de Química, 1993)

Objetivo de la PCR: amplificación del material genético para hacer posible su detección. Aplicaciones múltiples.

Cada organismo tiene una secuencia genética única, pero compartegenes con los organismos de su especie, género, etc..

ADN de Legionella

Selección de una región de su ADN

Región de un gen específico de Legionella

Realización de múltiples copias

Muestra DNA/RNA cDNA Producto

Preparación Extracción Retro Amplificación Detecciónmuestra ácidos nucleicos transcripción

Máxima variabilidad de los resultadosEquipos, técnicas y reactivos

estandarizados

Introducción

¿Cómo funciona la PCR?

PCR product compared with DNA ladder in agarose gel. DNA ladder (lane 1), the PCR product in low concentration (lane 2), and high concentration (lane 3). Image published with permission of Helmut W. Klein, Institute of Biochemistry, University of Cologne, Germany From Nupedia

• Técnica de amplificación selectivade una región de DNA escogida. Reacción cíclica de síntesis. • Reactivos necesarios: DNA + Enzima TaqPol + nucleótidos + primers específicos • Pasos: 1) Desnaturalización de la doble cadena de DNA

2) Hibridación de los primers (annealing)

3) Amplificación (elongation)• Es cualitativa

¿Cómo funciona la PCR cuantitativa?

• Mide la relación entre la cantidad de ácidos nucleicos diana iniciales y la cantidad de producto amplificado durante la fase exponencial• Un reactivo más: las sondas (probes)• Es real time.• Permite calcular la Tm (temperatura de melting)

By Qiagen

EL CICLO EN EL QUE SE INICIA EL INCREMENTO DE FLUORESCENCIA POR ENCIMA DEL UMBRAL ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE DNA

http://www.cytochemistry.net/Cell-biology/

Transcriptasa inversa

Aplicaciones • Obtención de cDNA a partir del cual se puede hacer real time

PCR (cuantitativa)• Recuento de viables (mRNA)• Recuento de la mayoría de virus

El RNA es extremadamente sensible a la degradación por RNAsas

¿Cómo funciona la reverse transcriptase PCR?

¿Por qué la PCR?VENTAJAS • Rapidez: plazo de obtención de resultados muy reducido• Especificidad, fiabilidad, sensibilidad, reproducibilidad y robustez• Complementaria a las técnicas tradicionales• Posibilidad de analizar diferentes microorganismos de varias muestras en un mismo análisis• Análisis de microorganismos para los cuales no existen metodologías tradicionales de detección• Unificación de las técnicas de detección y cuantificación de diferentes microorganismos• Posibilidad de estandarización y de automatización de análisis • Apertura de nuevas líneas de investigación • Económicamente viable con una relativa inversión inicial

INCONVENIENTES• Métodos no incluidos como métodos oficiales en la legislación vigente• Posibles falsos positivos• Inhibiciones de la reacción• Es necesario acondicionar el laboratorio de biología molecular

Cepa de L.pneumophila ambiental o de colección

250 ml medio de cultivo líquido (variante CYE): 10 g/l extracto levadura + cisteína + hierro + antibióticos

Inocular: 10 µl (duplicado)

Análisis:• Recuento de cultivables: siembra directa de 100 µl

por duplicado• Recuento de viables por Chemscan.• PCR cuantitativa• (DO)

Variables:• Crecimiento en agitación• A temperatura ambiente

Tiempo: • 0 h • 24 h• 48 h• 72 h• 7 días• 10 días• 15 días

Comparación entre métodos de detección

1 criobola

BHI infusión 0,5 ml

4,47 ± 0,084,334,504,464,524,54PCR mip monocopia

(copias genoma / ml)

5,21 ± 0,085,095,295,195,195,29PCR 16S multicopia(copias / ml)

4,38 ± 0,204,064,324,454,524,56Viables (viables/ml)

1,21 ± 0,730*1,151,321,751,83Cultivables (UFC/ml)

Promedio63210Día

Datos logarítmicos de los diferentes métodos

Resultados obtenidos con diferentes métodos de detección

*: log (n+1)

0,74 ± 0,040,760,790,730,670,7516S vs mip

0,09 ± 0,1300,180,010-0,02mip vs Viables

0,83 ± 0,161,020,970,740,670,7316S vs Viables

4,00 ± 0,6854,143,873,443,45PCR 16S vs cultivo

3,17 ± 0,544,063,173,132,772,73Viables vs cultivo

Promedio63210Día

Comparación numérica entre métodos de detección (diferencias logarítmicas)

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 6

Días

Log

resu

ltado Cultivo

Viables

PCR16S

PCR MIP

Comparación gráfica entre métodos de detección

Detección de Legionella por real time PCR

• Norma AFNOR XP T 90-471 “Qualité de l’eau – Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR)”

• Informe técnico sobre Normalización de métodos moleculares de análisis microbiológico de alimentos y aguas. Comisión de Normalización de la Sociedad Española de Microbiología (SEM).

100%2152,9%37Positivas para el género Legionella

47,6%108,6%6Positivas para L. pneumophila mip

52,4%1111,4%8Positivas para L. pneumophila 16S

2170n

%Torres refrigeración%Aguas

TratadasTipo muestra

Tabla con los resultados de q-PCR de L. pneumophila(16S, gen MIP) y Legionella spp. en aguas tratadas y torres de refrigeración

• Aguas tratadas y Torres Refrigeración

Resultados q-PCR en muestras reales

17778%29

119.63022%8

53%37<lq47%33

PCR (copias/litro)

1423%2<lq97%68

Cultivo (UFC/litro)

Género Legionella

1421%1<lq99%69

Cultivo (UFC/litro)Legionella spp

47211%8<lq89%62

PCR (copias/litro)

Pres/20ml1%1<lq99%69

CultivoLegionella

pneumophila

Promedio%nAnálisis

Comparación qPCR vs. cultivo• Aguas tratadasTabla con los resultados de q-PCR y de cultivo de L. pneumophila y Legionella spp. (16S) en aguas tratadas

1,38E+03-Negativo<50<50<5011

4,18E+04-Negativo<50<50<5010

1,81E+03-Negativo-<50<509

1,27E+031281,3E+03105--8

3,50E+035683,4E+03Positivo--7

334118292<1<1<16

864Negativo328<50<50<505

674Negativo710<10<10<104

598188666<1<1<13

626105548<1<1<12

320105290<1<1<11

16s ARN gén. Legion.

MIP gene L. pneumo

16s ARN L.pneumophilaLeg. sppL. pneumo

2-14L. pneumo

1

Cuantificación por PCR (copias/litro)Cuantificación por cultivo (UFC/l)Muestras aguas

tratadas

Tabla comparativa resultados de cultivo y de q-PCR de L. pneumophila(16S, gen mip) y Legionella spp. en aguas tratadas

Resultados cultivo y q-PCR en muestras reales• Aguas tratadas

8,60E+045,90E+041,3E+053011

1,51E+033,33E+017,0E+025010

1,75E+087,53E+067,0E+0740.0009

2,52E+048,27E+021,9E+0416.0008

4,47E+033874,8E+035007

3,87E+043,1E+033,7E+045.3006

3,67E+03Negativo1,8E+03<205

6,77E+069,9E+046,6E+06<2.0004

6,84E+038041,0E+04603

1,56E+059,8E+031,5E+0524.0002

2,42E+051,3E+042,1E+051.1005501

16s ARN gén. Legion.

MIP gene L. pneumo

16s ARN L. pneumophilaLeg. sppL. pneumo

2-14L. pneumo

1

Cuantificación por PCR (copias/litro)Cuantificación por cultivo (UFC/l)Muestras torres

refrigeración

Tabla comparativa resultados de cultivo y de q-PCR de L. pneumophila(16S, gen MIP) y Legionella spp. en torres refrigeración

Resultados cultivo y q-PCR en muestras reales• Aguas de torres de refrigeración

CONCLUSIONES• La concentración de la muestra y la extracción del DNA son pasos básicos en la eficiencia del proceso global• Las técnicas moleculares y concretamente la qPCR ya son una herramienta básica para los laboratorios de análisis• La cuantificación de una cepa de colección de Legionella en medio líquido por qPCR (gen 16S) es del orden de 4 logaritmos superiorque la cuantificación por cultivo• Tanto con muestras reales como en cepas de colección la PCR cuantitativa es mucho más sensible que el cultivo• La cuantificación de Legionella por qPCR utilizando el gen 16S es más sensible que el gen mip (0,74 logaritmos superior)• Un 88,6% de las muestras de aguas tratadas analizadas son negativas para Legionella pneumophila por qPCR. Sólo un 47,1% lo son para el género Legionella

AGRADECIMIENTOS

LABORATORIO MICROBIOLOGÍAAGUAS DE BARCELONA

• Ingrid Salazar• Belén Galofré

• Anna Terradillos• Ferran Ribas

EMATSA

A USTEDES POR SU ATENCIÓN

Enzima Taq polimerasa

Thermus aquaticus, denominado también Thermophilus aquaticus, es una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente (de 50 a 80 °C).

Thermus aquaticus fue descrito por Thomas Brock en 1969 en una fuente del parque de Yellowstone. Es una bacteria gram-negativa, aerobia y heterótrofa.Esta bacteria vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 °C,debido a que su cóctel enzimático resiste tales condiciones. Normalmente a esas temperaturas, las proteínas constitutivas de la mayoría de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales. Es por ello por lo que, una de sus enzimas, la ADNpolimerasa de Thermus aquaticus, la Taq polimerasa, es ampliamente utilizada por sus propiedades de termo resistencia en las reacciones de PCR. En efecto, esta enzima tiene una temperatura óptima de funcionamiento alrededor de los 75 °C.