cromatografiayafines

5/9/2018 cromatografiayafines - slidepdf.com

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ÍNDICE

1.CROMATOGRAFÍA DE FASE ENLAZADA 11.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 1

2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 2

2.1 Aplicaciones de las resinas de intercambio iónicoa la cromatografía 32.2 Cromatografía iónica basada en supresores 42.3 Aplicaciones al análisis de alimentos 5

3. CROMATOGRAFÍA DE PAR IÓNICO 63.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 6

4. CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS 74.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 8

5. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN 85.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 9

6. FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS 10

6.1 Tipos de electroforesis 107. ELECTROFORESIS CAPILAR 11

7.1 Flujo electroosmótico 127.2 Instrumentación 147.3 Inyección de la muestra 14

7.4 Modos de trabajo147.5 Detección 15

8. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR 168.1 Electroforesis capilar de zona (CZE) 168.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) 168.3 Isotacoforesis capilar (CITP) 168.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF) 1

Otros tipos de separación Cromatográfica.Electroforesis.

Rocío García Prieto

Ester Laína MateoLara López Merino



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ÍNDICE

1.CROMATOGRAFÍA DE FASE ENLAZADA 11.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 1

2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 22.1 Aplicaciones de las resinas de intercambio iónico

a la cromatografía 32.2 Cromatografía iónica basada en supresores 42.3 Aplicaciones al análisis de alimentos 5

3. CROMATOGRAFÍA DE PAR IÓNICO 63.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 6

4. CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS 74.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 8

5. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN 85.1 Aplicaciones al análisis de alimentos 9

6. FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS 106.1 Tipos de electroforesis 10

7. ELECTROFORESIS CAPILAR 117.1 Flujo electroosmótico 127.2 Instrumentación 147.3 Inyección de la muestra 147.4 Modos de trabajo 147.5 Detección 15

8. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR 168.1 Electroforesis capilar de zona (CZE) 16

8.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) 168.3 Isotacoforesis capilar (CITP) 168.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF) 178.5 Cromatografía capilar electrocinética micelar ((MEKC) 178.6 Aplicaciones al análisis de alimentos 18

9. BIBLIOGRAFÍA 19



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1. CROMATOGRAFÍA DE FASE ENLAZADA

La cromatografía de fase enlazada es un tipo de cromatografía de reparto, hallegado a ser la más utilizada de todos los procedimientos de cromatografía de líquidos.La cromatografía de reparto era al principio exclusivamente líquido-líquido; sinembargo, en la actualidad predominan los métodos de fase enlazada, habiendo sidorelegadas las separaciones líquido-líquido a ciertas aplicaciones especiales.

La mayoría de empaquetados de fase enlazada se preparan por reacción de unorganoclorosilano con los grupos –OH formados en la superficie de las partículas desílice por hidrólisis por ácido clorhídrico diluido caliente. El producto es unorganosiloxano. La reacción de un grupo SiOH situado en la superficie de una partículase puede escribir como:

donde R es a menudo la cadena lineal del grupo octilo u octadecilo (C8 H17--o C18H37--).Otros grupos funcionales orgánicos que se pueden unir a la superficie de la sílice sonaminas alifáticas, éteres, nitrilos e hidrocarburos aromáticos. Así pues es posibledisponer de una gama de fases estacionarias enlazadas de distinta polaridad.

Los empaquetados de fase enlazada son significativamente más estables que losde fase estacionaria retenida solo por fuerzas físicas. En este último caso hay que volver a recubrir periódicamente las superficies sólidas, porque la fase estacionaria se va

perdiendo gradualmente por disolución en la fase móvil. Además los empaquetadoslíquido-liquido no son adecuados para elución por gradiente, debido, de nuevo, ainevitables pérdidas de fase estacionaria por solubilización en la fase móvil. Ladesventaja principal de los empaquetados de fase enlazada es su capacidad de muestraalgo limitada.

1.1 Aplicaciones al análisis de alimentos

- Separar y determinar azúcares libres en alimentación.- Separar los ésteres de los lípidos en los alimentos.- Separar determinar y analizar aditivos.- Separar e identificar las vitaminas A y D en alimentos como aceite de hígado de- carne y pescado.- Separar e identificar las vitaminas A y D en productos lácteos.- Separar y determinar triglicéridos.- Tiene muchas otras aplicaciones alimentarias en edulcorantes artificiales,

antioxidantes, aflatoxinas, aditivos...



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2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La cromatografía iónica, cuya fase estacionaria es una resina de intercambioiónico, es un procedimiento de separación de iones de carga del mismo signo por elución de una columna empaquetada con resina finamente dividida.

Las resinas sintéticas de intercambio iónico son materiales poliméricos de alto peso molecular que contienen muchos grupos funcionales iónicos por molécula.

Las resinas de intercambio catiónico pueden ser de tipo ácido fuerte, con gruposácido sulfónico (RSO3

-H+), o de tipo ácido débil con grupos ácido carboxílico(RCOOH); el primer tipo tiene mas aplicaciones. Las resinas de intercambio iónicocontienen grupos funcionales básicos de amina unidos a la molécula polimérica. Losintercambiadores básicos fuertes son aminas cuaternarias; los de tipo base débilcontienen aminas secundarias o terciarias.

Una propiedad importante de todas las resinas de intercambio iónico es que son prácticamente insolubles en medio acuoso. De este modo, cuando el intercambiador catiónico se sumerje en una disolución acuosa que contiene el catión M+, se establecerápidamente el siguiente equilibrio de intercambio entre sólido y la fase en disolución:

donde Mx+, es un catión y R representa la parte de la molécula de la resina que contieneun grupo ácido sulfónico. El proceso análogo en el que participa una resina típica deintercambio aniónico se puede escribir como:

donde Ax– es un anión.

Es una técnica de alto poder resolutivo, ya que es capaz de separar moléculas que

presentan muy pocas diferencias de cargas.

2.1 Aplicaciones de las resinas de intercambio iónico a lacromatografía

En cromatografía iónica, los iones del analito se introducen en la cabeza de lacolumna empaquetada con una resina de intercambio iónico adecuada. La elución selleva a cabo después con una disolución que contiene un ión que compite con los ionesde analito por los grupos cargados sobre la superficie de la resina. Por ejemplo se

pueden separar aniones como cloruro, sulfato, fosfato y tiocianato utilizando una resinade intercambio aniónico en su forma básica. En esta aplicación, la muestra se introduceen la cabeza de la columna, donde los aniones se retienen por la reacción



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La elución se lleva a cabo luego con una disolución diluida de una base, que

invierte la reacción anterior, liberando así a los aniones. Puesto que los cocientes dereparto de los aniones difieren entre si, durante la elución tiene lugar su

fraccionamiento.Uno de los aspectos atractivos de la cromatografía ionica es que la medida de la

conductividad proporciona un método general adecuado para determinar laconcentración de las especies eluidas. La cromatografía ionica con detecciónconductrimétrica de iones eluidos de la columna se describió por primera vez en 1975, yen la actualidad es una eficaz e importante técnica de determinación cuantitativa tantode especies inorgánicas como de orgánicas cargadas.En la actualidad se usan dos tipos de cromatografía basadas en empaquetados deintercambio iónico: cromatografía iónica basada en supresor y de columna única. Sediferencian por el método usado para evitar que la conductividad del electrolito eluyente

interfiera con la medida de la conductividad de los analitos.

2.2 Cromatografía iónica basada en supresores

La columna supresora de eluyente esta empaquetada con una segunda resina deintercambio iónico, que convierte de forma eficaz los iones del disolvente eluyente enuna especie molecular poco ionizada, sin afectar la conductividad de los iones delanalito.Actualmente se comercializan supresores de micromembrana que operan de forma

continua. Por ejemplo, cuando se quiere eliminar carbonato o bicarbonato sódico, eleluyente pasa por encima de una serie de membranas ultrafinas de intercambiocatiónico, que lo separa de una corriente de disolución regeneradora ácida que fluye endirección opuesta. Los iones sodio del eluyente se intercambian con los iones hidrógenosituados en la superficie interna de la membrana del intercambiador, y a continuaciónmigran a la otra superficie intercambiándose con los iones hidrogeno del reactivoregenerador. Los iones hidrógeno de la disolución regeneradora migran en direcciónopuesta manteniendo así la neutralidad eléctrica.

La siguiente figura muestra dos aplicaciones de la cromatografía iónica basadaen una columna supresora y en detección conductimétrica. En los dos ejemplos, la

concentración de los iones es del orden de partes por millón; el tamaño de muestra es50uL en un caso y 20uL en el otro. El método es particularmente importante paraanálisis de aniones, porque no existe otro método rápido y cómodo para analizar mezclas de este tipo.



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1)F-

(1,5 ppm) 10)Piruvato 19)HPO23-

28)Ftalato2)α-hidroxibutirato 11)Monocloroacetato 20)SeO23- 29)Oxalacetato

3)Acetato 12)BrO3- 21)Br - 30)PO3

4-

4)Glicolato 13)Cl- (3 ppm) 22)NO3- 31)AsO3

4-

5)Butirato 14)Galacturonato 23)SO24

- 32)CrO24-

6)Gluconato 15)NO2- (5 ppm) 24)Oxalato 33)Citrato

7)α-Hidroxivalerato 16)Glucuronato 25)SeO24- 34)Isocitrato

8)Formiato (5 ppm) 17)Dicloroacetato 26)α-Cetoglutarato 35)cis-Aconitato9)Valeriato 18)Trifloruroacetato 27)Fumarato 36)trans-aconitato


- Aislamiento de pectinas en algunas frutas y verduras.- Determinación de la piridoxina en, cereales, leche y carnes. - Determinación y separación de cationes y/o aniones en el agua y- en otras bebidas, como la cerveza y el vino. - Recolección de trazas de elementos minerales, por ejemplo: Al, Si, Zn, Mn, Cu,

B, Cr, F, I.- Análisis de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos en leche y derivados,

café,- miel, zumos de fruta, vino, productos de repostería y hortalizas. - Separación e identificación de diferentes tipos de proteínas.

3. CROMATOGRAFÍA DE PAR IÓNICO

La cromatografía de par iónico utiliza una columna de HPLC en fase inversa, enlugar de una columna de intercambio iónico. Se utiliza para la separación y

determinación de especies iónicas.



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Se compone de una fase móvil formada por un tampón que contiene uncompuesto orgánico unido a un contraión. Éste se aloja en la fase estacionaria (apolar),convirtiéndola eficazmente en un intercambiador iónico. Cuando el analito pasa a travésde la columna, se puede unir a la fase estacionaria por atracción electrostática. Elmecanismo de retención es una mezcla de interacciones con fase inversa y de

intercambio iónico.

La elución de los pares iónicos se consigue mediante una disolución acuosa demetanol o de otro disolvente orgánico soluble en agua.

La cromatografía de par iónico es más compleja que la cromatografía de faseinversa porque el equilibrio de la fase móvil con la fase estacionaria es lento; laseparación es más sensible a variaciones de temperatura y de pH; además laconcentración del compuesto orgánico de la fase móvil afecta a la separación.


- Determinar la sacarina por par iónico-HPLC.- Determinar el acesulfamo-K por par iónico-HPLC. - Separar e identificar compuestos iónicos, cationes o aniones.

4. CROMATROGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Un fluido supercrítico es una sustancia que está expuesta a temperaturas y presiones por encima de su temperatura1 y su presión2 crítica (Williams & Clifford,2000). Estos fluidos supercríticos tienen interesantes propiedades: compresibilidad,homogeneidad y propiedades intermedias entre las que tiene en sus estados líquido ygaseoso.

En relación con las altas densidades de estos fluidos supercríticos, encontramosuna interesante propiedad: la de disolver moléculas grandes no volátiles. Además losanalitos disueltos pueden ser fácilmente recuperados al permitir que las disoluciones seequilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas. Esto es importante en elcaso de analitos termolábiles. También hay que tener en cuenta de que las difusividadesde los solutos son un orden de magnitud mayor y las viscosidades un orden de magnitud

menor que en líquidos. Sin olvidar que la mayoría de los fluidos supercríticos son baratos, inocuos y no son tóxicos (Skoog et al., 2001). Estas propiedades, además, se pueden controlar con la presión y la temperatura (Williams & Clifford, 2000).

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica híbrida entre lacromatografía de gases y la cromatografía de líquidos, combinando alguna de lasmejores características de cada una de ellas. Es una técnica importante de cromatografíaen columna, con una gran aplicación en laboratorios industriales, docentes y de control

1La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede

existir en fase líquida independientemente de la presión (Skoog et al ., 2001).2

La presión de vapor de una sustancia a su temperatura crítica es su presión crítica (Skoog et

al ., 2001).



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(Skoog et al., 2001). Se puede definir como la separación de componentes orgánicosusando un fluido supercrítico como fase móvil (Williams & Clifford, 2000).

Permite la separación y determinación de compuestos que no se manipulan biencon la cromatografía de gases ni con la cromatografía de líquidos. Las características

que presentan estos compuestos son (Skoog et al., 2001):

• Compuestos no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografíade gases es inaplicable.

• Compuestos con grupos funcionales que no son detectables por las técnicasespectroscópicas o electroquímicas empleadas en la cromatografía de líquidos.

Los equipos para este tipo de cromatografía son similares a los equipos de HPLC.Aunque en el caso de fluidos supercríticos es necesario un horno para mantener lacolumna a la temperatura deseada, e informando a su vez, de la temperatura de la fasemóvil. También es necesario un dispositivo de contrapresión, para mantener en lacolumna la presión deseada, convertir al fluido supercrítico en un gas y arrastrarlo aldetector.

Las variaciones de presión tienen un efecto muy marcado sobre el factor deretención; esto es consecuencia del incremento de densidad de la fase móvil

paralelamente al incremento de presión. Al cambiar la densidad del fluido cambia el poder de solvatación del disolvente de la fase móvil, al modificar la presión ejercida(Rousseac & Rousseac, 2003).

4.1 Aplicaciones al análisis de alimentos- Extracción de cafeína en café instantáneo (Dean et al., 2000), usando como

fluido supercrítico para la extracción el CO2.

- Extracción de almidón de la cúrcuma y el jengibre (Braga et al., 2006), usandocomo fluido supercrítico para la extracción el CO2.

5. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓNLa cromatografía de exclusión se basa en la diferencia de penetración de las

moléculas de la muestra a través de los poros de la fase estacionaria (Rousseac &Rousseac, 2003). Se aplica particularmente a especies de elevado peso molecular. Losrellenos para este tipo de cromatografía están constituidos por pequeñas partículas

poliméricas o de sílice (ambas de una tamaño en 5 y 10 µm) que contienen una red de poros uniformes en los que pueden difundir las moléculas de soluto y del disolvente.



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Las moléculas son atrapadas en los poros y eliminadas de la fase móvil. Las moléculasque son más grandes que el tamaño medio de los poros son excluidas, no se retienen yson las primeras que eluyen. Las de menor tamaño penetran, por lo que son atrapadasdurante más tiempo, siendo las últimas en eluir. Las moléculas de tamaño intermedio,dependiendo de su tamaño y forma, quedan retenidas más o menos tiempo (Skoog et al.,

2001).

Las partículas que rellenan la columna cromatográfica son de dos tipos; partículas poliméricas y partículas de sílice (Skoog et al., 2001):

• Las partículas de sílice confieren gran rigidez, facilitando el relleno y lautilización de presiones más elevadas; además da mayor estabilidad y permiteusar, además del agua, gran variedad de disolventes. Pero tienen grantendencia a retener solutos por adsorción y tendencia a catalizar ladegradación de las moléculas del soluto.

• Las partículas poliméricas, en principio, eran copolímeros de estireno-divinilbenceno entrecruzados. El tamaño del poro se controla con el grado deentrecruzamiento de cadenas poliméricas (la cantidad relativa dedivinilbenceno). Pero estos geles son hidrofóbicos y sólo pueden usarse confases móviles no acuosas. En la actualidad hay geles hidrofílicos, pudiendousar disolventes acuosos para la separación de moléculas grandes solubles enagua (como los azúcares).

Los métodos de exclusión por tamaño se dividen en cromatografía de filtraciónsobre gel (la fase móvil es acuosa) y cromatografía de penetrabilidad sobre gel (la fasemóvil es orgánica) (Rousseac & Rousseac, 2003).


- Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinaciónde glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

- Determinación de alérgenos en frutas (Zuidmeer et al., 2006).



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6. FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS

La electroforesis es un método de separación de especies distintas basado en eldiferente comportamiento de estas especies bajo la influencia de un campo eléctricoaplicado.

El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro de los electrodos: las moléculas con una carga neta negativa sedesplazarán hacia el ánodo (electrodo positivo) y las moléculas con una carga neta

positiva migrarán hacia el cátodo (electrodo negativo).

La velocidad de migración de un ión, v, en el seno de un campo eléctrico,medida en cm s-1, es:

v = µe E

siendo µe la movilidad electroforética del ión, medida en cm2V-1s-1, y E la intensidad delcampo eléctrico medida en V cm-1.

La movilidad electroforética de un ión es directamente proporcional a la fuerzaeléctrica del ión e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento.La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ión a partir de su tamaño y de laviscosidad del medio en el que migra. Las separaciones por tanto se basan en lasdiferencias en la relación carga-tamaño entre los diferentes analitos presentes en lamuestra; cuanto mayor sea esta relación más rápido migrará el ión en el seno del campoeléctrico. Para iones del mismo tamaño, el de mayor carga eléctrica migrará másrápidamente. Para iones con la misma carga migrará más aquel de menor tamaño, yaque tendrá una fuerza de retardo por rozamiento de menor valor. La resistencia del

medio al paso del ión también influirá en su movilidad electroforética, siendo éstamenor cuanto mayor sea la viscosidad del medio.

Para hacer una separación efectiva es necesario mantener constantes las cargasde cada especie de iones, de manera que la relación carga-tamaño (y por tanto lavelocidad de migración) permanezcan en el intervalo más estrecho posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier ácido o base quiere decir que lasseparaciones electroforéticas requieren disoluciones tampón.

6.1 Tipos de electroforesis

Existen principalmente dos métodos electroforéticos ampliamente utilizados: laelectroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva a cabo sobre

papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. La disolucióntampón, que será el medio conductivo, cubre la placa de papel o de gel. Seguidamentese aplica el potencial de corriente continua a través de la placa. Cuando se considera quese han completado las separaciones se interrumpe el paso de la corriente y, si esnecesario, las muestras se tiñen para visualizarlas.



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7. ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis convencional es actualmente una técnica de gran utilidad, lametodología clásica usada durante muchos años para separar especies complejas, deelevado peso molecular, de interés biológico y bioquímico. Sin embargo, este tipo de

separación electroforética es lenta, laboriosa y difícil de automatizar, y además no proporciona resultados cuantitativos precisos. Debido a estos inconvenientes, a partir dela década de los ochenta comenzó a desarrollarse un tipo de electroforesis más rápida ycon mejores resultados: la electroforesis capilar (EC).

Esta técnica está basada en la reducción drástica de la sección transversal delaparato de electroforesis, es decir, la separación se realiza en el interior de un tubocapilar con un diámetro menor de 0.1 mm. ¿Por qué se reduce la sección transversal?De esta manera, la temperatura del líquido que transcurre a través del capilar no va aaumentar si se aplica un potencial de corriente elevado (entre 20.000 y 60.000 V); estose traduce en una separación más rápida (ya que la velocidad de migración del iónaumenta proporcionalmente al potencial aplicado, como indica la ecuación v = µ e V/L )y con una mejor resolución. Por tanto, se pueden mantener voltajes más altos con un

bajo calentamiento de Joule (el calentamiento de Joule es el calor producido por lacorriente eléctrica).

Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas pueden detectarse directamente al aplicar el método. Se obtiene una gráfica de larespuesta en función del tiempo, llamada electroferograma (figura 7.1), en la que cada

pico representa una especie química separada.

Figura 7.1

Se ha comentado anteriormente la mejora de la resolución en la electroforesiscapilar. Por resolución se puede entender la capacidad de una técnica o método paraseparar dos componentes en una mezcla. En la electroforesis capilar se define de formaanáloga a la cromatografía:

R = Separación del pico / Anchura media del pico

La separación entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades

electroforéticas de las especies, y por tanto será la anchura de la banda la que determine



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la mayor o menor resolución del método. El flujo electroosmótico, que se verá másadelante, es el responsable de la disminución de anchura de las bandas.

Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que loscromatogramas, por ello, la nomenclatura utilizada para describir la separación de los

picos o bandas en cromatografía se usa también para la electroforesis capilar. Sinembargo, la mayor diferencia es que la posición de los picos se determina por lasmovilidades electroforéticas de los iones y no por las diferencias en las interaccionescon la fase estacionaria. De manera que la eficacia (o número de platos N ) enelectroforesis capilar vendría dada por:

N = µeV / 2D

donde D es el coeficiente de difusión del soluto. Por tanto, para aumentar la eficacia N ,y por tanto la resolución, es necesario aumentar lo máximo posible el potencial eléctricoV.

7.1 Flujo electroosmóticoFundamento: Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un

capilar que contiene un líquido, se constata que el líquido se mueve. Este movimiento sedenomina flujo electroosmótico (FE). La velocidad del flujo es proporcional al potencialaplicado y a la viscosidad del tampón y depende de la carga en la superficie del capilar.

La causa de la aparición del flujo electroosmótico es la formación de la doble

capa eléctrica. Básicamente es una separación de la carga iónica, una segregación decapas de iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar yla disolución.

Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de sílice fundida. A pH por encima de 3, la pared interna del capilar de sílice presenta carga negativa debido a ladesprotonación de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie. Los cationes de ladisolución formarán cerca de la superficie del capilar una primera capa interna, fija, enla que los cationes, inmóviles, están unidos fuertemente a la superficie del capilar. Unasegunda capa, denominada capa móvil o difusa, formada también por cationes aunqueunidos de manera más débil a la superficie del capilar, migrará hacia el cátodo(electrodo negativo) en presencia de un campo eléctrico. El resto de la disolución,mediante capilaridad, migrará a la misma velocidad y en la misma dirección, lo que

producirá un perfil de flujo plano, a diferencia de la cromatografía, que produce perfilesde flujo laminar (figura 7.2).

EC HPLCFigura 7.2

La segregación de las capas de iones produce un potencial en la superficie quedisminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie. Este potencial ψ es grande

en la capa fija, y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa difusa. El punto clave es que donde termina la capa fija aún existe un cierto potencial, llamado



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potencial zeta ζ, que permitirá el movimiento del fluido. La velocidad del flujoelectroosmótico es proporcional a la diferencia de potencial e inversamente

proporcional a la viscosidad del tampón.

La velocidad del FE va a variar en función de los cambios que se produzcan en

el tampón; por ejemplo, una variación del pH del tampón origina un cambio en laionización del capilar y un aumento de la concentración del tampón da lugar a unadisminución del flujo electroosmótico. En general, cualquier alteración en la disoluciónque modifique la carga en la superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampóno requiera un cambio en el potencial, altera la velocidad del FE.

Como se ha comentado, el flujo electroosmótico da lugar a un perfil de flujo plano, lo que reduce significativamente el ensanchamiento de banda y por tanto, mejorala resolución. Además, la gran ventaja que presenta el FE es que la separaciónelectroforética y la detección pueden realizarse a la vez para cationes y aniones. Sin elFE, o sólo aniones, o sólo cationes migrarían hacia el detector. El ión de carga opuesta

migraría retrocediendo al final de la inyección, y los compuestos neutros se quedarían alfinal y se dispersarían por difusión. Con FE todas las especies pasan por el detector.

Finalmente, la velocidad de un ión en la electroforesis capilar vendrádeterminada por su velocidad electroforética y por su velocidad de flujoelectroosmótico:

v = (µe + µ feo) E

En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el cátodo, los ionesnegativos tendrán una movilidad electroforética µe negativa, y por tanto estos ionesmigrarán más lentamente que los positivos. El resultado final en el electroferogramaserá una serie de picos que indican el siguiente orden de elución: primero los cationesmás rápidos, seguidos sucesivamente de los cationes más lentos, todas las especiesneutras en una única zona, y finalmente los aniones más lentos seguidos de los anionesmás rápidos (figura 7.3).

Figura 7.3



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7.2 Instrumentación

• Capilar, generalmente de sílice fundida, de diámetro entre 10 y 100 µm ylongitud de 40-100 cm.

• Recipientes depósito para el tampón y los electrodos.• Tampón, rellenando el capilar y los recipientes.• Electrodos de platino• Fuente de alimentación de alto voltaje (30 kV y 0.400 mA).• Detector.

Figura 7.4

7.3 Inyección de la muestra

Debido a que el volumen de líquido que cabe en el capilar es de 4-5 µL, elvolumen de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros: esto implica unaserie de dificultades al inyectar las muestras en el capilar. Existen varios métodos:

Inyección electrocinética: se retira del depósito del tampón uno de los extremos delcapilar junto con el electrodo, y se colocan en un pequeño recipiente que contiene lamuestra. Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo, por lo que la muestra

penetra en el capilar debido al flujo electroosmótico y a la migración iónica.Después el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en elrecipiente con la disolución tampón. Inconvenientes: la muestra no es del todorepresentativa, ya que se introduce en el capilar más cantidad de los iones másmóviles respecto a los más lentos.

Inyección por presión: el extremo del capilar se coloca momentáneamente en un pequeño recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presión para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presión provienede aplicar vacío en el extremo del detector o de la aplicación de presión en elrecipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevación del extremo quecontiene la muestra respecto al otro extremo. La inyección por presión no diferencialos iones según su movilidad, por lo que no es discriminativa; sin embargo, no es

posible utilizarla en capilares rellenos de gel.

7.4 Modos de trabajo

Cuando el ánodo (electrodo positivo) se encuentra en el extremo de inyeccióndel capilar se dice que se opera en modo normal. Si es el cátodo (electrodo negativo) el

que se encuentra en el extremo de inyección entonces el modo es de polaridad inversa.



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Para invertir el sentido de flujo electroosmótico normal se puede añadir untensoactivo catiónico al tampón: el tensoactivo se adsorbe sobre la pared del capilar yhace que ésta quede cargada positivamente, de manera que el flujo electroosmóticoqueda invertido (así, los aniones del tampón serán arrastrados hacia el cátodo másrápidamente). También es posible eliminar el flujo electroosmótico por recubrimiento

de la pared interna del capilar con un reactivo que elimine los grupos silanol.

7.5 Detección

Los detectores son semejantes en diseño y función a los de HPLC. Los másutilizados serían los detectores de absorbancia y de fluorescencia.

o Métodos de absorbancia. Se llevan a cabo directamente sobre el capilar, al que previamente se le ha eliminado el recubrimiento protector de poliimida quesuelen llevar. La parte del capilar “pelado” hace las veces de celda de detección;se incide a la muestra con radiación UV/ visible, y se detecta la absorbanciaejercida por la muestra. Este método también se puede realizar de formaindirecta para detectar especies con poca absortividad molar. En este caso seincorpora un cromóforo iónico, y el detector recibe una señal constante. Al pasar un analito, éste desplaza al cromóforo, y la señal detectada desciende.

o Detección por fluorescencia. Muy sensible y selectivo al analizar especiesfluorescentes. Su límite de detección es de 10-17- 10-20 moles detectados.

o Detección electroquímica. Se utilizan de dos tipos, la amperométrica y laconductimétrica. La amperométrica, al igual que en cromatografía, tiene unaextensa aplicabilidad sobre muy diversos grupos funcionales; es sensible aanalitos que se pueden oxidar o reducir en un electrodo. La detecciónconductimétrica es universal para especies cargadas, y tiene un límite de

detección de 1 x 10-16

moles de analito. o Detección por espectrometría de masas. El aparato electroforético está

acoplado a un espectrómetro de masas (figura 7.5). El efluente procedente delcapilar pasa directamente a un dispositivo de ionización por electronebulización(básicamente, consiste en aplicar un elevado potencial a la salida del capilar,creando un aerosol de gotas muy pequeñas cargadas, que se irán evaporando

para liberar iones gaseosos) y posteriormente los productos entran en el filtro demasas cuadrupolar para su análisis. Este método es muy usado para ladeterminación de moléculas grandes, entre las que incluimos proteínas,fragmentos de DNA y péptidos. El límite de detección para este método es de 1x 10-17 moles de analito.

Figura 7.5



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8. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

8.1 Electroforesis capilar de zona (CZE)

Los fundamentos son los que se han comentado en los apartados anteriores. Lacomposición del tampón es constante en toda la zona de separación, y los analitos sesepararán en función de su movilidad, llevando todos (cationes, aniones y especiesneutras) la misma dirección, debida al flujo electroosmótico.

Anteriormente, para el análisis de cationes se utilizaba fundamentalmente laespectroscopia de absorción atómica, y para los aniones la cromatografía de intercambioiónico. Sin embargo, los equipos más económicos, los menores requerimientos demuestra, la mayor rapidez y la mejor resolución hacen de la electroforesis capilar elmétodo más apropiado para separar estos analitos.

La CZE puede también separar moléculas de distintos tamaños (pesticidas,fármacos) siempre que sean moléculas cargadas o puedan derivatizarse para dar un ión.

8.2 Electroforesis capilar en gel (CGE)

En la electroforesis convencional se empezaron a usar geles para reducir ladispersión del analito debida a la difusión del propio analito y a la convección.Posteriormente se observó que el gel podía actuar de tamiz molecular, haciendo que lasespecies migrasen en grados diferentes según su tamaño y según el tamaño de poro delgel. Este tipo de separación por tamaños es útil para especies que tienen la misma carga

pero diferente tamaño.

La CGE se lleva a cabo en una matriz formada por un polímero de acrilamida(poliacrilamida), que deja una serie de poros en los que se aloja el tampón y en los quese lleva a cabo la separación. También es posible realizar la CGE con geles de agarosa.

8.3 Isotacoforesis capilar (CITP)

En esta modalidad de electroforesis las bandas de los analitos migran todas a lamisma velocidad. La muestra ha de inyectarse entre dos tampones: el frontal, quecontiene los iones de mayor movilidad (esta movilidad ha de ser mayor que la de los

componentes a analizar), y el terminal en el que van los iones de menor movilidad quelos iones de la muestra. Este método no puede utilizarse para separar a la vez aniones decationes.

En un principio, los iones migran a distintas velocidades, según v = µe E , y ladiferencia en las velocidades de migración da lugar a la separación de los distintosanalitos en bandas adyacentes, con la especie más rápida situada en la banda más

próxima al tampón conductor y la especie más lenta inmediatamente por delante deltampón terminal. Una vez que se han formado las bandas, todas se mueven a la mismavelocidad. Esto ocurre porque el potencial se hace más reducido para las bandas másmóviles y se hace más intenso para las bandas más lentas, de manera que la corriente es

la misma en todas las zonas del tampón. Las separaciones entre bandas son nítidas. Siun soluto empieza a difundir a la banda próxima más rápida, se encuentra con un campo



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más bajo, lo cual reduce su velocidad hasta hacerle caer, de nuevo, en su banda original.Las diferentes bandas de analitos están situadas a continuación las unas de las otras, yno hay bandas de tampón entre ellas que las separen. El resultado no es unelectroferograma con los distintos picos, sino un diagrama en función del tiempo conforma de escalera.

8.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF)

La separación de los analitos en este caso está basada en sus diferentes puntosisoeléctricos (la carga neta de la molécula es cero). Los analitos han de ser sustanciasanfóteras (sustancias que en disolución son capaces tanto de ceder como de aceptar un

protón, como aminoácidos y proteínas).

La separación se lleva a cabo en una mezcla de tampones cuyo pH varía a lolargo del sistema de separación, es decir, se establece un gradiente de pH mediante lamezcla de tampones especiales denominados anfolitos, que son compuestos anfóteros.

Los analitos se disuelven en la mezcla de anfolitos y se introducen en el capilar.Uno de los extremos del capilar se introduce en una disolución básica, en la cualtambién se aloja el cátodo. El otro extremo del capilar se introduce en una disoluciónácida que contiene el ánodo. Al aplicar el voltaje, los protones migrarán desde el ánodohacia el cátodo, y los iones hidroxilo migrarán desde el cátodo hasta el ánodo. De estamanera se establece el gradiente de pH. Cuando una molécula, bien sea un analito o

bien un anfolito, tiene una carga negativa neta, entonces migrará hacia el ánodo. Estamigración se detiene cuando la molécula alcanza una zona del capilar en la que el pH esigual a su punto isoeléctrico, es decir, la molécula tendrá una carga neta cero en ese

punto y dejará de migrar. El resultado es la separación de los analitos en bandasestrechas, situadas en el valor de pH correspondiente a su punto isoeléctrico. Estasseparaciones, por tanto, no se basan en las diferentes velocidades de migración de losanalitos.

Sin embargo, para poder visualizar el resultado de la separación es necesario quelas bandas ya enfocadas migren hacia el detector. La movilización de las bandas puedellevarse a cabo aplicando una diferencia de presión (al igual que se hace para cargar lamuestra en el capilar) o cambiando la disolución de uno de los dos compartimentos delelectrodo.

8.5 Cromatografía electrocinética capilar micelar (MEKC)

Este método, que combina la cromatografía y la electroforesis capilar, permite laseparación de moléculas no cargadas. Es necesario añadir un elemento tensioactivo enconcentraciones lo suficientemente grandes como para que forme micelas. Las micelasse forman en disolución acuosa cuando la concentración de sustancias tensioactivas, quetienen una cadena larga hidrocarbonada y un grupo iónico, se incrementa por encima deun valor denominado concentración crítica micelar (CMC). Las micelas formadasconstituyen una segunda fase que alojan en su interior los compuestos no polares. Eltensioactivo más utilizado es el dodecil sulfato sódico (SDS). La superficie de una

micela de SDS posee una elevada carga negativa, por lo que las micelas y loscompuestos apolares que lleven en el interior tendrán una movilidad electroforética alta



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y se desplazarán hacia el ánodo. Pero la velocidad del flujo electroosmótico del tampónhacia el electrodo negativo será mucho más alta, lo que provoca que las micelas tambiénse muevan hacia el cátodo, aunque a una velocidad mucho menor que la del resto de ladisolución. Por tanto, el orden de aparición en el detector será primero los analitos de lamuestra que sean polares (solubles en el tampón) y tras ellos, bastante separadas, las

micelas que contienen los compuestos no polares, El mecanismo de separación dependede las diferencias de los coeficientes de distribución de los analitos entre la “fase móvil”acuosa y la “fase pseudoestacionaria” hidrocarbonada.


Análisis de biopolímeros en los alimentos:- Determinación de proteínas de la leche (caseínas, α-lactoalbúminas, β-

lactoglobulinas).- Análisis de proteínas del trigo.

- Determinación de carbohidratos por CZE con detección amperométricamediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola).- Determinación de oligosacáridos mediante CZE (rafinosa, estaquiosa y

verbascosa de semillas de leguminosas).

Análisis del color/sabor de los alimentos:- Determinación de colorantes sintéticos mediante CITP (muestras de diversos

alimentos sólidos: puddings, golosinas)- Análisis de los flavonoides de la caña de azúcar mediante CZE.- Separación de los ácidos del lúpulo que dan amargor mediante CZE y MEKC

(ácidos α y β de extracto de lúpulo comercial).

Análisis de compuestos orgánicos en alimentos:- Determinación del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de

zumo de naranja).- Determinación cuantitativa de cafeína en bebidas mediante CE (muestras de

café, té, cola y cacao).- Comparación cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinación de

aditivos en alimentos (cafeína, aspartamo y ácido benzoico en refrescos).- Determinación cuantitativa de propionato en pan mediante CZE.

Análisis de iones inorgánicos:- Análisis cualitativo de aniones presentes en cerveza, salsa de soja, té y café.- Determinación semicuantitativa de calcio, sodio, cloruros, fosfatos y citratos en

muestras de leche.



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9. BIBLIOGRAFÍA

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• Rousseac F, Rousseac A. Análisis Químico. Métodos y técnicas instrumentalesmodernas. Madrid: Mc Graw Hill / Interamericana de España. 2003.•

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cromatografiayafines

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