CREACIÓN Y MANEJO DE CEPARIO

LUZ ESTHELA PARODI URANGOYIRA STEFANI REYES TAVERA

CEPARIO

Es la colección de microorganismos en unas condiciones que permitan que mantenga su viabilidad con el fin de conservarlos en el tiempo y poder utilizarlos posteriormente.

Material de referencia

Provenientes de una colección conocida nacional o internacionalmente.

Certificado que especifique las características genotípicas y fenotípicas.

CEPARIO

Cepas de Referencia: M.O definidos por lo menos a nivel de género y especie.

Cepas de reserva: Obtenidas a partir de la reactivación y resiembra de un cultivo de referencia.

Cepas de trabajo: Subcultivos obtenidos de un cultivo de reserva, destinado al uso como control del trabajo diario

Requisitos: Viabilidad: Células microbianas capaces de crecer.Cultivos de referencia.Pureza: Debe ser un cultivo puro.Estabilidad: Estabilidad genética (Genotípica y fenotípicamente)

CEPARIO

Los CR son necesarios para la evaluación de la calidad de los medios de cultivo y controles de calidad internos durante la ejecución de los ensayos.

Número EspecieGénero

Ensayos y necesidades metodológicas

Los controles de calidad a los reactivos son necesarios, así como realizar pruebas confirmatorias.

Debe documentarse los procedimientos para manejo de estos cultivos de referencia.

PREVENCIONES PARA EL MANEJO Y ALMACENAMIENTO DE LAS CEPAS

Importante: - Prevenir el deterioro de las cepas.- Contaminación cruzada.- Mutaciones.- Deterioro o alteración o alteración de las características típicas de las cepas.

El crecimiento característico debe documentarse para cada medio en el cual se utiliza como cepa control.

Se admiten hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia , para evitar lo anterior.

Si la cepa se adquiere por una vía diferente a la propia colección, debe anotarse como derivada de la cepa de colección, más no el número de ésta cuando se quiera identificar.

ADQUISIÓN DE CEPAS DE REFERENCIAPRIMERA OPCIÓN

• ATCC (American Type Culture Collection).• SVM (Foundation for the Advacement of Public Environmental

Protection).• CECT (Colección española de cultivos tipos).• CNMC (Collection Nationale de Cultures de Microorganismos) Institut

Pasteur.

SEGUNDA OPCIÓNProveedores comerciales certificados por ISO 9001 que comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas de una colección reconocida, generalmente tercer o cuarto repique.Se requiere para la compra, el certificado de orígen donde conste el número de repique y el orígen.

RECONSTITUCIÓN DE CEPAS DE REFERENCIA

Al llegar deben ser registradas, se almacenan de 0-5°C hasta su uso, se reconstituyen y se siembran. Se realiza control de viabilidad y pureza y se registra.

Registro de cepas de referencia:• Identificación de la cepa.• Género y especie del microorganismo.• Tipo y N° de colección.• N° de lote.• Control de calidad con la cepa referenciada conforme (Sí/No)• Fecha de caducidad de la cepa.• Personal responsable.

CONTROL DE CALIDAD VIABILIDAD Y PUREZA

A diferentes niveles del proceso con el fin de asegurar que las cepas conservan su viabilidad y características bioquímicas.

La frecuencia será establecida por el laboratorio.De no presentar las características solicitadas, se deben ejecutar las acciones

correctivas establecidas en el procedimiento.

REGISTRO DE CONTROL DE PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS CEPAS.

Fecha del control. Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. Tipo y N° de

colección. Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo). Coloración de Gram. Características de las colonias en medios selectivos. Pruebas bioquímicas y serológicas.

CEPAS DE RESERVA

Son preparadas en el laboratorio y conservadas como fuente de preparación de cultivos de trabajo.

Lugar destinado para el almacenamiento, señalado como cepas potencialmente peligrosa y su manejo exclusivo por personal autorizado.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

Obtenidas a partir de cepas de referencia.

LiofilizadasAgentes crioprotectores:Leche descremada de calidad

microbiológica al 10 o 20% P/V.Puede conservarse en refrigeración o a

temperatura ambiente por años.Congelación a bajas temperaturas.Agentes crioprotectores:Leche descremada de calidad

microbiológica al 10 o 20% P/V.Glicerol al 10%Caldo BHI con glicerol 20%.

PROCESO DE CONGELACIÓN

Equipos e insumos: Congelador o cámara de Nitrógeno líquido.°T de congelación: Deseanle a -70 ó -80°C, temperaturas más altas como -20°C no es lo ideal.

Envases: Uso criovial o tubo estéril.Productos: Se puede conservar en la temperatura de congelación por años.Inconveniente: Problemas y pérdida de las cepas, la falta de suministro de energía,

falta de insumos o avería del equipo.

Con cada subcultivo hay riesgo de pérdida de la cepa.

FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA

Tipo de cepa: Las bacterias Gram positivas, resisten mejor que las Gram negativas.El cultivo debe estar expuesto a las mejores condiciones posibles antes de ser

expuestos a bajas temperaturas.Condiciones necesarias:Edad del cultivo: Puede afectar la supervivencia, cultivos demasiado jóvenes o viejos

son menos resistentes al shock térmico, idealmente debe ser final de la fase logarítmica- inicio de la fase estacionaria (24 horas).

Pseudomona a -20°C sobrevive 18 meses.

PROCEDIMIENTO CEPAS DE RESERVA

Paso 1: Tubos o crioviales se rotulan. Identificación de la cepa. Tipo y N° de colección. N° de repique. Fecha de realización del cultivo de reserva. Fecha de vencimiento del criovial. N° de tubo o criovial.

Paso 2:El desarrollo microbiano obtenido, se inocula asépticamente en el medio líquido

sobrenadante que contiene los crioviales.Registro de cepas de reserva. Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. Tipo y N° de colección. N° de criovial o vial. Fecha de reconstitución de la cepa de referencia. N° de repique. Frasco en uso. Fecha de baja criovial. Ubicación de almacenamiento. Observaciones.

OJO!En caso de descongelamiento no volver a congelar.Criovial vencido se elimina del cepario y se registra.Cuando se fraccionan alícuotas de crioprotectores, si se usan,

congelan y descongelan no deben volver a usarse.Las cepas liofilizadas reconstituidas ya no pueden volverse a

usar

CEPAS DE TRABAJO

Son subcultivos de M.Os obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos

que lo precisen.

Obtención de las cepas de trabajoSe obtienen de cepas de reservas sobre un medio líquido o sólido no selectivo, adecuado, utilizando

un asa estéril y e incubándolos en condiciones adecuadas

Los cultivos de trabajo no pueden ser subcultivados.