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Control de calidad en cultivos celulares.

Research · September 2015

DOI: 10.13140/RG.2.1.3226.4163

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Javier Garcia Palomo

Banco Nacional de ADN Carlos III

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www.bancoadn.org

F. JAVIER GARCÍA PALOMO

Banco Nacional de ADN Carlos III, Universidad de Salamanca

Salamanca, 1 al 3 julio 2013

“Control de calidad en biobancos”

“Control de calidad de líneas celulares”

Es un cultivo in-vitro de células que consigue la “supervivencia indefinida” y que puede se congelada y recuperada un número

teóricamente infinito de veces.

• NO DEBE suponer una “pérdida” de la capacidad replicativa en cultivo.

• DEBE poder producir más células iguales a la original con la mínima pérdida de su identidad genética y/o funcionalidad.

• DEBE mantenerse libre de contaminación por microrganismos u otras células.

Carcinogenesis vol.26 no.5 pp.867--874, 2005

Líneas celulares

Banco Nacional de ADN Carlos III Universidad de Salamanca

• Conseguir gran cantidades de ADN y ARN de una muestra o asegurar muestras únicas o “irremplazables”.


• Reponer los “almacenes” de ADN genómico, cuando estos se han degradado, consumido,…, sin tener que recurrir de nuevo al donante. • Utilizar las células inmortalizadas como base para la investigación (testado de fármacos, desarrollo de vacunas,búsqueda de dianas terapeúticas,…)

Líneas celulares

Transfiriendo y/o modificando la dotación/expresión genética de aquellos genes implicados en muerte celular y/o proliferación. Para ello se pueden

utilizar método “naturales” (EBV) y métodos de ingeniería genética (vectores virales).


Líneas celulares

INFECCIÓN DIRECTA con EBV (SÓLO linfocitos B humanos).

INDUCCIÓN VIRAL mediante la introducción en las células de combinaciones de genes clonados (SV40, Herpes Virus Humano, telomerasa,…, )

REPROGRAMACIÓN de RNAi mediante siRNA (short interfering RNAs) o con miRNA (micro RNAs), sobre genes como Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog,…


Líneas celulares


El valor de un cultivo reside en:

Estabilidad genética adecuada al uso que se le va a dar Inexistencia de microrganismos contaminantes. Pureza de la línea establecida (autenticidad e identidad).

Day 15

Líneas celulares


1. Establecer y comprender de los factores más relevantes que pueden afectar al sistema in-vitro.

2. Asegurar la calidad y reproducibilidad de materiales y métodos utilizados.

3. Generar documentación asociada. 4. Establecer y mantenimiento de medidas adecuadas de

protección individual y medioambientales. 5. Satisfacer de cualquier marco legal, regulación o principios

éticos aplicables. 6. Dotar de educación y entrenamiento adecuado a todo el

personal implicado, para conseguir alta calidad de producto y mantener niveles de bioseguridad adecuados.

Control de calidad en cultivo celular

Adaptado de: Coecke, S. et al. “Guidance on Good Cell Culture practice”. Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. ATLA 33,261-287, 2005



EXTRACCIÓN SEPARACIÓN de PBMC

EXPANSIÓN Explotación: reposición de almacenes, investigación

CRIOPRESERVACIÓN

DESCONGELACIÓN Y/O CULTIVO

Estudio del sistema



PROCESADO DE MUESTRAS/ALMACENADO

Puntos de posible CONTROL PROCESOS •Tipo de anticoagulante •Temperatura de almacenamiento durante el transporte. •Volumen de muestra •Características de la muestra

•Nº de células recuperadas en FICOLL •Condiciones de almacenamiento en LN2

•Cultivos: nº de PBMC iniciales •Control del Banco celular escalonado •Control de stocks virales •Control de medios de cultivo

INMORTALIZACIÓN

RECEPCION DE MUESTRAS


Control de calidad en cultivos celulares

SEPARACIÓN de PBMC Ficoll, nº de células recuperadas

1. Volumen de sangre de partida 2. Tipo de anticoagulante 3. Temperatura de almacenamiento previo y de trabajo. 4. Recuperación final.

DIAS DESPUÉS DE

LA EXTRACCIÓN

ANTICOAGULANTE Y MODO DE ALMACENAMIENTO

ACD EDTA 4ºC AMBIENTE TOTAL

0-7 DÍAS 85% 58% 68% 67% 68%

8-14 DÍAS 56% 24% 31% 0% 31%

>15 DÍAS 0% 0% 0% 0% 0%

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

12.000.000

14.000.000

16.000.000

18.000.000Células/ml vial



Tipo de muestra recibida

Sexo Hombres 33% (4/12)

Mujeres 33% (5/15)

Edad

<20 años 25% (2/8)

20-40 años 40% (4/10)

>50 años 22% (2/9)

Nonagenarios (*) 10/50 (20%) PBMC Congelados

3/3 (100%) PBMC fresco

Volumen < 3 ml 38% (3/8)

3 – 5’9 ml 33% (4/12)

6 + 29% (2/8)

En negrita: de “Establishment of Stably EBV Transformed Cell Lines from Residual Clinical Blood Samples for use in performance evaluation and Quality Assurance in molecular genetic testing”, Susan H. Bernacki et al. Journal of molecular diagnostics, vol. 5, nov 2003. (*) En rojo: datos obtenidos de cultivos de Banco Nacional de ADN Carlos III en 2011


Criopreservación

1. Crioprotector: ensayo de toxicidad 2. Rampa de congelación elegida: Criomed©,

Mr.Frosty™, Coolcell®,… 3. Condiciones de almacenamiento. 4. Método de recuperación (rampa de

calentamiento, dilución de crioprotectores,…)

Para nuevas líneas


0% 20% 40% 60% 80% 100%

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

Muestra 6

Muestra 7

Muestra 8

% Recuperado5. Tasa de recuperación: ¿es suficiente?


Inmortalización

1. Número de células al inicio del cultivo:

Linfocitos B son ±8-10% de PBMC Densidad en cultivo: 300.000-900.000 cel/ml Inicio de cultivo con 1,5ml

Recuperación mínima necesaria > 4,5 millones de PBMC

2. Plásmidos, stocks virales,…, comerciales o de fabricación

propia: testado in-vitro.

+


Expansión del cultivo

1. Número de células de partida: recuperadas de LN2 o cultivo continuo. 2. Tipo de línea celular:

Línea finita: senescencia a 70-80 pases (ej. líneas fibroblatoides) Línea celular contínua: alcanzan los 160 pases sin alteración genética aparente (ej.

lineas linfoblastoides, SH5Y-SY, HL-60,..). Stem-cells: líneas continuas , pero que pueden evolucionar hacia otras estirpes (ej. cel.

embionarias, líneas germinales, cel. madre,….). 3. Densidad celular durante el cultivo: Métodos de conteo celular:

Tinción vital, en cámara de recuento (Trypan blue, Evans blue,…) Espectrofotométrico (absorbancia a 600nm, Neutral red assay,…) ELISA (reducción de MTT) FACS (Ioduro de propidio/anexina V)



Expansión del cultivo Viabilidad celular durante el cultivo



Marcaje mediante Ioduro de propidio/anexina V-FITC (Immunostep Cat. Nº ANXVKF-

100T y citómetro FACSaria B&D) Muestras con 30 días de cultivo

bna-19755

29 %

bna-17300

33 %

IP

+ -

Anexina + Muertas Necr.

- Apopt. Vivas


Cultivo continuo y envejecimiento

El cultivo continuo de células : • Acumula cambios genéticos • Aumenta la posibilidad de contaminación con bacterias, hongos e incluso otras células (contaminación cruzada) • Para LCL se ha establecido un máximo de 150 pases antes de perder la diploidía y quedar invalidadas (*).

El resultado: Pérdida de importantes características genotípicas y/o fenotípicas, que comprometen su reproducibilidad y posible uso final.

Una solución es generar Bancos celulares escalonados, para asegurar la utilización cultivos con pocos pases


(*) L. Sie, S. Loong and E.K. Tan .”Utility of Lymphoblastoid Cell lines”, Mini-review. Journal of Neuroscience research 87:1953-1959, 2009


Banco celular escalonado en dos niveles para LCL


PBMC de Ficoll

Inmortalización Viales

congelados Línea celular congelada: Master cell

bank

Expansión de LCL

Working cell bank

ADN para biobanco

Indefinido Pase 1 a 50 Indefinido Pase 50 a 100

Pase 100 a 150


Control de stocks virales: banco celular escalonado para B95-8


• Variabilidad en titulación lote a lote: mejor producir lotes grandes.

• Celulas productoras: testado funcional y micoplasma antes de “banking”: banco celular escalonado, para producción viral.

Recepción de la línea

productora B95-8

Congelación de 3-5 viales

Cultivo

TEST MICOPLASMA ABANDONAR PROCEDIMIENTO POSITIVO

RESUCITACIÓN DE UN VIAL

CREACIÓN DE BANCO MAESTRO

(10-100 VIALES)

CONTROLES MICROBIANO,

AUTENTIFICACIÓN,,…

POSITIVO

RESUCITACIÓN DE UN VIAL

CREACIÓN DE BANCO

DE TRABAJO (20-200 VIALES)

NEGATIVO

PRODUCCIÓN VIRAL

NEGATIVO

Medio de cultivo: componentes

Medio basal

Para inmortalización con EBV: RPMI 1640 con glutamina y HEPES

• Medio de composición definida: aa., vitaminas, azúcares, elementos traza y sales, para simular un medio “natural”.

• Sirve como fuente de C y N a las células. • Contiene Glu:

Fuente de ATP, que es rápidamente consumido (3 días) Se descompone en 5 días a 37ºC, pero depende de pH y temperatura

también. • Sales, aminoácidos y HEPES ayudan en el tamponamiento de pH • Solo necesita testado de esterilidad por el usuario (métodos)




Suero Bovino Fetal (SBF)

• Mezcla compleja (>10.000 componentes) • Fuente de hormonas, factores de crecimiento, lípidos,… • Se utiliza tanto en cultivo como en criopreservación • Elevada variabilidad en composición lote a lote, entre

fabricantes,.. • Fuente también de contaminación: micoplasma, BSE,… • Necesitará testado de funcionalidad por el usuario



Stacey, G. “Fundamental Issues for cell-line Banks in Biotechnology and regulatory affairs”. Cell Biology, 2004


Suero Bovino Fetal (SBF): TESTADO

• Utilizar muestras certificadas (Low Endotoxin Level) de varios fabricantes. • Realice test funcional en condiciones equivalentes . • Seleccione/reserve el mejor lote para el trabajo de varios años.



Densidad celular (abs a 600nm) Fabricante Lote Linea A Linea B Linea C Linea D Linea E VWR S098789 0,590 0,070 0,030 0,230 0,410 Biowest 35K890-2 0,030 0,500 0,060 0,370 0,430 Bio-Whitacker 3SB9800 0,570 0,300 0,420 0,410 0,320 Sigma A0434-23 0,300 0,290 0,020 0,350 0,400 Lonza BE12F-102 0,060 0,150 0,600 0,020 0,020

Puntuación Resultado Fabricante Lote Linea A Linea B Linea C Linea D Linea E VWR S098789 1 5 4 4 2 16 Biowest 35K890-2 5 1 3 2 0 11 Bio-Whitacker 3SB9800 2 2 2 1 4 11 Sigma A0434-23 3 3 5 3 3 17 Lonza BE12F-102 4 4 1 5 5 19


Antibióticos

• Protegen el cultivo de contaminación: bacterias, virus y hongos. • Protegen al operador frente a posibles microorganismos patógenos

presentes en la muestra inicial o procedentes de SBF. • Se degradan/consumen en 3 días a 37ºC. • No se deberían utilizar de rutina en cultivos, para así poner de

manifiesto posibles contaminaciones en las muestras procesadas. • No deben nunca ser sustituto de buenas técnicas asépticas





Medio de cultivo: pureza

Micoplasmas

• Son los procariotas más pequeños (0,3 micras), ubicuos y habituales en cultivos. • En cultivo, encontramos cinco especies principales: M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M.

fermentans y Acholeplasma laidlawii. • Sus efectos son más insidiosos que el de las bacterias, induciendo cambios

irreversibles en los cultivos: • Tasas de crecimiento alteradas • Cambios morfológicos • Aberraciones cromosómicos • Alteraciones en el metabolismo de aminoácidos y ácidos nucléicos

• Se detectan fácilmente mediante PCR y debería ser una rutina de laboratorio para líneas celulares (o al menos para productoras de partículas virales para inmortalización).

• Difíciles de erradicar, pues algunos traspasan los filtros de 0,22 micras

Adaptado de “www.bionique.com/mycoplasma-resources/faq/what-are-mycoplasmas.html”

http://www.ibiantech.com/ibian/wp-content/uploads/2012/06/Micoplasma.jpg



Micoplasma: detección por PCR

Ladder Ladder

Realice test de micoplasma en muestras antes de ponerlas en servicio El cultivo debería estar activo unos días antes de realizar el test



Autentificación

• Perfiles genéticos de muestras de cultivos, frente a patrón genético de ADN extraído bien de papel FTA o bien células mononucleadas.

• Se utiliza PCR múltiple con 5

marcadores de STR, y a veces marcador de sexo como 6º comparador.

Patrón A Patrón B



Toda línea celular debe poseer registros lo más completos posibles, para poder seguir, reevaluar o mejorar el proceso y

pueden incluir: • Procedencia de la línea:

Identificación de muestra (anonimizada) Fecha de obtención Cuestionario de salud y pruebas diagnósticas relevantes (HIV, hepatitis,…), si

procede. Fecha de inmortalización. Viales generados y en reserva

• Pruebas de cultivo realizadas: Conteo antes de congelación Conteo al inicio del cultivo y adicionales. Calendario de eventos del cultivo Pruebas diagnósticas: autentificación, micoplasma, viabilidad,…



Información de entrada

Información de proceso

Cuestionario de salud

Hemograma



Información de procesado

Calendario de eventos

DIA 1 8 15 22 29 36 43 50 57 64 70 77 84

Inmortalización (2 crioviales)

Inicio en placa con

2 pocillos 1,5ml totales

en cada

Añadir 1 ml

Cambio a dos F-25

añadiendo 2ml (destruir

placa)

Añadir 2 ml Añadir 3,5 ml

Cambio F-75 y añadir 8ml

(Trasvasar ambos F25 y destruir F25)

Añadir 15 ml Alicuotar 1º Asp.20ml para 2 criov./

Disp.10ml

Alicuotar todo (2 criov.) y CERRAR

Volúmenes…... 1,5 + 1,5 2,5 + 2,5 5 + 5 7 + 7 10 + 10 28 40 30 35 ml

Inmortalización (1 criovial)

Inicio en placa en 1 pocillo con

1,5ml

Añadir 1 ml

Duplicar pocillo

(traspasar 1,2 ml y rellenar hasta

2,5 ml)

Cambio F-25 cada pocillo (+2,5ml)



(Trasvasar ambos F25 y destruir F25)

Añadir 10 ml Alicuotar 1º; Asp.20ml para 2 criov./

Disp.10ml

Alicuotar todo (2 criov.) y CERRAR

Volúmenes…... 1,5 2,5 2,5 + 2,5 5 + 5 7 + 7 10 + 10 28 38 30 ml

Inmortalización con extracción de ADN

(1 criovial)

Inicio en placa en 1 pocillo con

1,5ml

Añadir 1 ml Duplicar pocillo

(traspasar 1,2 ml y rellenar hasta

2,5 ml)

Cambio F-25 cada pocillo (+2,5ml)



(Trasvasar cada F25 a F75 y destruir F25)

Añadir 10 ml Añadir 15 ml

Alicuotar 1º:

Asp.15+15ml para 2 criov./ Disp.10+10ml

Alicuotar 2º:

Asp.10+10ml para 2 criov./ Disp.10+10ml

Añadir 15 ml RETIRAR TODO PARA

EXTRACCIÓN ADN



IDENTIFICACIÓN DE PROCESOS CON POSIBLE RIESGO

BIOLÓGICO

DISEÑO DE MEDIDAS PARA EL CONTROL DEL RIESGO BIOLÓGICO

IMPLEMENTACIÓN DE MEDIDAS A TRES NIVELES DE ACTUACIÓN

PRACTICAS DE LABORATORIO (PNT´s Y GLP´s)

INSTALACIONES EQUIPOS DE PROTECCIÓN

(E.P.I.)

Evaluación contínua



Gestión del riesgo

• Utilizar instalaciones BSL2 al menos para el cultivo con seguridad biológica. • Mantener prácticas de nivel BSL3 durante la producción y purificación viral. • Compartimentación temporal y/o física de los distintos tipos de líneas celulares. • Personal entrenado/cualificado, conocedor de los riesgos potenciales. • Programas específicos para desinfección, mantenimiento y validación de salas y de equipos. • Programas de inactivación de TODOS los residuos. DIRECTIVA 2009/41/EC del Parlamento y del Consejo de 6 de mayo de 2009 sobre el uso confinado de microrganismos modificados genéticamente



Control medioambiental

Si no se dispone de zonas de “ambiente controlado” (salas de cultivos, salas blancas, salas NSB3,…) deberíamos realizar controles periódicos de la calidad microbiológica de nuestras cabinas de seguridad e incubadores.

Materiales Desinfectante (propano-AF, Perasafe,…). No utilice en las superficies metálicas compuestos que contengan cloro o derivados. Placas petri con agar-Saboreaud o similar (crecimiento bacteriano y fungico). Incubador

Metodología Limpiar cabinas (tambien debajo de rejilla) con trapo exento de fibras y “barriendo” partículas y desinfectar apropiadamente Encender UV durante 30 minutos c√on flujo encendido. Pasado el tiempo, colocar abiertas 5 placas: una en cada esquina y una en el centro: 30 minutos- 1 hora. (dos para incubadores y √(area) para una sala). Recoger placas e incubar 72 horas a 33ºc.

Criterios de aceptación y rechazo No debe aparecer más de una colonia en cada placa (al menos en cabinas). En el caso de aparecer más, proceder a esterilización con HPV, formol u otro esterilizante adecuado.



Consentimiento informado



Formación contínua y SOP´s

• Todo el personal implicado realiza cursos para el trabajo en condiciones BSL2+.

• Todo personal de nueva incorporación es formado en técnicas de cultivo y Buenas Practicas de Laboratorio (BPL)

• Todo el personal asiste a seminarios sobre seguridad biológica tanto internos como externos.

• Todos los protocolos de trabajo están escritos y son de conocimiento obligado

• El responsable del área asiste a cursos de formación específica sobre bioseguridad, grupos de trabajo y participa en grupos de discusión relacionados (AEBIOS, ABSA, EBSA, CDC, NIH,…) para mantener el nivel de formación necesaria y poder transmitirla.

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