construcción de huellas dactilares seguimiento de marcadores … · 06/08/2010 1 facultad de...
TRANSCRIPT
06/08/2010
1
Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasUniversidad Nacional de Rosario
Construcción de huellas dactilaresSeguimiento de marcadores por métodos
cromatográficos y espectroscópicos
Ricardo L. E. Furlán
VIII CURSO INTERNACIONAL DE TECNOLOGÍA FITOFARMACÉUTICA`Profesor Nikolai Sharapin´
26 de julio – 6 de agosto de 2010
Medicamento fitoterápico:Es toda preparación farmacéutica usada para curar o aliviar enfermedades, que contiene exclusivamente órganos de plantas, exudados, aceites esenciales y sus extractos y tinturas.
06/08/2010
2
Planta
Secado
Material vegetal fresco
Recolección
D C d
alto numero de compuestos químicos ≠: formándose, degradándose e interconvirtiéndose
Droga CrudaAlmacenamiento
Extracción
Extractos
Concentración
E t t
FITOTERÁPICOS
Extractos secos
FraccionamientoAislamiento
Compuestos puros
OHO
MeN
HO
H
H
OO
O
OH
O
OMeOMe
MeO
OHMeO
OH
NMe
OH
O
MeO
OHHOOH
CO2HHN
ONH
O HN
ONH
O
Cl
OCl
HN
O
O
O
NH2
OH
NH
HOO
HN
O
O
NH2
HO O
OHOHO
HO
N OO
HO
OH
CO2H
H
H
OHOH
OO HOOH
OH
CO2H
OH
O
O
OH
OH
OH O
HO
Glc-Rha
O
OH
OO
H
OOH
OH
OHO
O
O
O
CO2HO
O
HOO
HOH
OH
O
H
CO2H
O
O
O
CO2HCO2H
O
O
O OH
O OH
H H
OHOHO
OH
OOH
HOHOOH
OHO
O
O
O
HO
MeO
OH
OH
H
OH
O
O
O
O
O
O
OHHO
O
O
OH
OMe
HONMe2
O
O OH OH
OH
OH OH O
OHOH
CO2H
OOHOHO
HO
OOH GlcO
HO
OHHO
OHHO H
HO
HO
O
OHO
O
O
O
O
O
O
OHO
HOCHO OH
OH CHOOH
OH
O
O
OO
O
OO
O
O
HO
OHOH
OHO2C
HOHO
OHO
OHO2C
HOHO
O
H
H
H
OMezcla compleja de productos naturales
O
ONH
NS
O
HO2C
O OH HOH2N
O
O O
NH
NH
HN
OO
O
O
O
O
OH
OH
HOOH
OHHO
O
O
O
OH
OH O
OH
OO
O
O
O
OO
OOH
HO
OH OOH
OMe
OH
OO OH
O
CO2Me
OHC
H
H
OGlc
HOO
O
OH OO
O O
O
ONH
OHO
O
O
H
O
OHC
O
O
H
H
HO
H
H H
H CO2H
HOH
HH
H
HO
06/08/2010
3
OHO
MeN
HO
H
H
OO
O
OH
O
OMeOMe
MeO
OHMeO
OH
NMe
OH
O
MeO
OHHOOH
CO2HHN
ONH
O HN
ONH
O
Cl
OCl
HN
O
O
O
NH2
OH
NH
HOO
HN
O
O
NH2
HO O
OHOHO
HO
N OO
HO
OH
CO2H
H
H
OHOH
OO HOOH
OH
CO2H
OH
O
O
OH
OH
OH O
HO
Glc-Rha
O
OH
OO
H
OOH
OH
OHO
O
O
O
CO2HO
O
HOO
HOH
OH
O
H
CO2H
O
? ?
?
O
O
CO2HCO2H
O
O
O OH
O OH
H H
OHOHO
OH
OOH
HOHOOH
OHO
O
O
O
HO
MeO
OH
OH
H
OH
O
O
O
O
O
O
OHHO
O
O
OH
OMe
HONMe2
O
O OH OH
OH
OH OH O
OHOH
CO2H
OOHOHO
HO
OOH GlcO
HO
OHHO
OHHO H
HO
HO
O
OHO
O
O
O
O
O
O
OHO
HOCHO OH
OH CHOOH
OH
O
O
OO
O
OO
O
O
HO
OHOH
OHO2C
HOHO
OHO
OHO2C
HOHO
O
H
H
H
O
??
No se conoce la identidad de todos los componentes
O
ONH
NS
O
HO2C
O OH HOH2N
O
O O
NH
NH
HN
OO
O
O
O
O
OH
OH
HOOH
OHHO
O
O
O
OH
OH O
OH
OO
O
O
O
OO
OOH
HO
OH OOH
OMe
OH
OO OH
O
CO2Me
OHC
H
H
OGlc
HOO
O
OH OO
O O
O
ONH
OHO
O
O
H
O
OHC
O
O
H
H
HO
H
H H
H CO2H
HOH
HH
H
HO
?
?
OHO
MeN
HO
H
H
OO
O
OH
O
OMeOMe
MeO
OHMeO
OH
NMe
OH
O
MeO
OHHOOH
CO2HHN
ONH
O HN
ONH
O
Cl
OCl
HN
O
O
O
NH2
OH
NH
HOO
HN
O
O
NH2
HO O
OHOHO
HO
N OO
HO
OH
CO2H
H
H
OHOH
OO HOOH
OH
CO2H
OH
O
O
OH
OH
OH O
HO
Glc-Rha
O
OH
OO
H
OOH
OH
OHO
O
O
O
CO2HO
O
HOO
HOH
OH
O
H
CO2H
O
activo
? ??
O
O
CO2HCO2H
O
O
O OH
O OH
H H
OHOHO
OH
OOH
HOHOOH
OHO
O
O
O
HO
MeO
OH
OH
H
OH
O
O
O
O
O
O
OHHO
O
O
OH
OMe
HONMe2
O
O OH OH
OH
OH OH O
OHOH
CO2H
OOHOHO
HO
OOH GlcO
HO
OHHO
OHHO H
HO
HO
O
OHO
O
O
O
O
O
O
OHO
HOCHO OH
OH CHOOH
OH
O
O
OO
O
OO
O
O
HO
OHOH
OHO2C
HOHO
OHO
OHO2C
HOHO
O
H
H
H
O
?
activo?
activo
?
activo
O
ONH
NS
O
HO2C
O OH HOH2N
O
O O
NH
NH
HN
OO
O
O
O
O
OH
OH
HOOH
OHHO
O
O
O
OH
OH O
OH
OO
O
O
O
OO
OOH
HO
OH OOH
OMe
OH
OO OH
O
CO2Me
OHC
H
H
OGlc
HOO
O
OH OO
O O
O
ONH
OHO
O
O
H
O
OHC
O
O
H
H
HO
H
H H
H CO2H
HOH
HH
H
HO
?
?
?De los muchos compuestos que contienen varios
o muchos poseen actividad farmacológicaOtros no.
06/08/2010
4
OHO
MeN
HO
H
H
OO
O
OH
O
OMeOMe
MeO
OHMeO
OH
NMe
OH
O
MeO
OHHOOH
CO2HHN
ONH
O HN
ONH
O
Cl
OCl
HN
O
O
O
NH2
OH
NH
HOO
HN
O
O
NH2
HO O
OHOHO
HO
N OO
HO
OH
CO2H
H
H
OHOH
OO HOOH
OH
CO2H
OH
O
O
OH
OH
OH O
HO
Glc-Rha
O
OH
OO
H
OOH
OH
OHO
O
O
O
CO2HO
O
HOO
HOH
OH
O
H
CO2H
O
activo
? ??
O
O
CO2HCO2H
O
O
O OH
O OH
H H
OHOHO
OH
OOH
HOHOOH
OHO
O
O
O
HO
MeO
OH
OH
H
OH
O
O
O
O
O
O
OHHO
O
O
OH
OMe
HONMe2
O
O OH OH
OH
OH OH O
OHOH
CO2H
OOHOHO
HO
OOH GlcO
HO
OHHO
OHHO H
HO
HO
O
OHO
O
O
O
O
O
O
OHO
HOCHO OH
OH CHOOH
OH
O
O
OO
O
OO
O
O
HO
OHOH
OHO2C
HOHO
OHO
OHO2C
HOHO
O
H
H
H
O
?toxico
activo?
activo
?
activo
O
ONH
NS
O
HO2C
O OH HOH2N
O
O O
NH
NH
HN
OO
O
O
O
O
OH
OH
HOOH
OHHO
O
O
O
OH
OH O
OH
OO
O
O
O
OO
OOH
HO
OH OOH
OMe
OH
OO OH
O
CO2Me
OHC
H
H
OGlc
HOO
O
OH OO
O O
O
ONH
OHO
O
O
H
O
OHC
O
O
H
H
HO
H
H H
H CO2H
HOH
HH
H
HO
?
?
?toxico¿Algunos tóxicos?
L t i i bl Las concentraciones son variables y eso es inevitable
06/08/2010
5
No se conoce la identidad de todos los componentes
Uno o unos pocos componentes(composición definida)
Las concentraciones son variables y eso es inevitable
¿Algunos tóxicos?
De los muchos compuestos que contienen varios o muchos poseen actividad farmacológicaOtros no.
Farmacología definida
Toxicidad definida
Concentración definida y constante
En una situación ideal debe controlarse la composición total de la mezcla
“Huella Dactilar”
¿Como se construye?- Métodos cromatográficos
Mét d t ó i- Métodos espectroscópicos- Métodos acoplados
06/08/2010
6
Como se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Una huella dactilar cromatográfica de un fitoterápico es en la práctica un perfil cromatográfico del extracto en el que se observan algunos componentes
químicos comunes farmacologicamente activos y/o químicamente característicos
El extracto de una sola planta puede contener un gran numero de compuestos químicos, y la combinación de varios extractos en un medicamento fitoterápico puede dar lugar a la interacción de cientos de compuestos naturales. Las huellas dactilares g p
cromatográficas deben representar de una forma bastante integral al conjunto de componentes del fitoterápico.
Como se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Las huellas dactilares cromatográficas implican la separación física de los componentes y una posterior detección de los mismos
Mezcla de compuestos
Compuestos separados
Detección Universal
Detección
Detección Selectiva
Mayor selectividad
06/08/2010
7
Como se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Las huellas dactilares cromatográficas implican la separación física de los componentes y una posterior detección de los mismos
Mezcla de compuestos
Compuestos separados
Detección
Sensibilidad relativa
Como se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Entonces la calidad de la huella dactilar cromatográfica dependerá de:-La calidad de la separación-La capacidad la detecciónp
La calidad de la separación de una determinada muestra dependerá del sistema cromatográfico utilizado (fase estacionaria y fase móvil, formato cromatográfico).
La capacidad de la detección dependerá del método o combinación de métodos utilizados.
06/08/2010
8
Como se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Columna t áfi
Mezcla de compuestos
Compuestos separados
cromatográfica
PlacaPlacacromatográfica
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Cromatografía en capa delgada (CCD)Cromatografía en columnaCromatografía en columna
Cromatografía líquida de alta performanceCromatografía gaseosa.
06/08/2010
9
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Cromatografía en capa delgada (CCD)
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Cromatografía en capa delgada (CCD)
Equipo simple y de bajo costoFácil comprensiónRapidez, reproducibilidad y versatilidadBaja cantidad de muestraPosibilidad de análisis de varias muestrasPosibilidad de separaciones semipreparativas.
TECNICO
06/08/2010
10
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Placa de silica gel 60 (TLC) Placa de silica gel 60 (HPTLC)
Tamaño de partícula promedio 5-6μmDistribución de tamaños de partícula 4-8μm
Tamaño de partícula promedio 10-12μmDistribución de tamaños de partícula 5-20μm
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Placa de silica gel 60 (TLC) Placa de silica gel 60 (HPTLC)
Tamaño de partícula promedio 5-6μmDistribución de tamaños de partícula 4-8μm
Tamaño de partícula promedio 10-12μmDistribución de tamaños de partícula 5-20μm
06/08/2010
11
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Placa de silica gel 60 (TLC) Placa de silica gel 60 (HPTLC)
Tamaño de partícula promedio 5-6μmDistribución de tamaños de partícula 4-8μm
Tamaño de partícula promedio 10-12μmDistribución de tamaños de partícula 5-20μm
Volumen de siembra: 4μlDistancia de desarrollo: 10cmTiempo requerido: 42min
Volumen de siembra: 0,3 μlDistancia de desarrollo: 5cmTiempo requerido: 13min 45seg
FM: Acetato de etilo/metanol/ácido propiónico (22/10/3)Detección : UV 366
Siembra- Posición exacta (en particular para análisis cuantitativo)- El volumen de siembra debe ser exacto y preciso
Siembra- Posición exacta (en particular para análisis cuantitativo)- El volumen de siembra debe ser exacto y preciso
Hay dos maneras de sembrar. Hay dos maneras de sembrar. Siembra por contacto Siembra por espraySiembra por contacto Siembra por espray
Contacto en punto
06/08/2010
12
Siembra- Posición exacta (en particular para análisis cuantitativo)- El volumen de siembra debe ser exacto y preciso
Siembra- Posición exacta (en particular para análisis cuantitativo)- El volumen de siembra debe ser exacto y preciso
Hay dos maneras de sembrar. Hay dos maneras de sembrar. Siembra por contacto Siembra por espraySiembra por contacto Siembra por espray
Contacto en punto
En siembras por contacto en punto se dá cromatografía circular”
Distribución irregular de los componentes de la muestra a lo largo de la siembra
Siembra- Posición exacta (en particular para análisis cuantitativo)- El volumen de siembra debe ser exacto y preciso
Siembra- Posición exacta (en particular para análisis cuantitativo)- El volumen de siembra debe ser exacto y preciso
Hay dos maneras de sembrar. Hay dos maneras de sembrar.
Contacto en punto Espray en punto Espray en banda
Siembra por contacto Siembra por espraySiembra por contacto Siembra por espray
06/08/2010
13
Este no es un problema en siembras por espray
Contacto en punto Espray en banda
Polaridad del solvente de siembra
hexano tolueno metanol hexano tolueno metanol
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Espray de nitrógeno o aire
06/08/2010
14
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Consejos útiles:
- Cuidado al marcar con lápiz los lugares de siembra.
- No sembrar demasiado cerca de los bordes laterales.
- El borde de la siembra debe estar al menos 2 mm por encima del nivel de solvente.
06/08/2010
15
Desarrollo
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Cromatografía en capa delgada (CCD)
Ocurren tres procesos simultáneos
1 Equilibrio entre los componentes de la fase móvil y su fase 2 1. Equilibrio entre los componentes de la fase móvil y su fase vapor. (la composición puede diferir significativamente de la composición de la FM)
2. La fase estacionaria seca absorbe moléculas de la fase gaseosa los componentes más polares pasan de la fase gaseosa a la FE
3 La fase estacionaria solvatada también interacciona con la
3
13. La fase estacionaria solvatada también interacciona con la fase gaseosa (los componentes más apolares pasan a la fase gaseosa)
06/08/2010
16
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Ocurren tres procesos simultáneos
1 2 f t d
Cromatografía en capa delgada (CCD)
1 y 2 son afectados por:
- papel de filtro humectado con el solvente de elución.
- intervalo de tiempo entre la introducción de Sv en la cámara y el comienzo de la cromatografía (saturación)
- permitir el contacto entre la placa y la fase gaseosa (pero no p p y g (pcon el solvente) por un momento antes del comienzo de la cromatografía (pre-acondicionamiento)
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Ocurren tres procesos simultáneos2 y 3 se pueden prevenir colocando una contra placa a una distancia de uno o unos pocos milímetros de la placa
Cromatografía en capa delgada (CCD)
distancia de uno o unos pocos milímetros de la placa cromatográfica. (configuración sándwich)
Durante la cromatografía, los componentes del solvente de elución que se encuentran adsorbidos en la placa seca vía la fase gaseosa (proceso 2) son empujados hacia adelante del frente del solvente. Esto no ocurre con solventes apolares tales como agua, Esto no ocurre con solventes apolares tales como agua, metanol, ácidos y bases. Esto resulta en valores de Rf menores en cámaras saturadas y pre acondicionadas que en cámaras no saturadas y en conf . sándwich.
06/08/2010
17
Consecuencias:
En la mayor parte de los casos la cromatografía se desarrolla en un estado de no-equilibrio lo que hace que sea difícil de describir en detalle las condiciones en la cámara de desarrollo. Esto puede producir falta de reproducibilidad.
Opción:
Cámaras de corrida horizontales
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
1 placa cromatográfica(cara hacia abajo)2 placa de vidrio para configuración sandwichp p g3 reservorio para el solvente de elucion4 placa de vidrio5 cubierta6 bandeja de acondicionamiento
06/08/2010
18
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Procedimiento:
La placa cromatográfica (1) se coloca en la cámara con la cara hacia abajo.p g ( ) j
El reservorio (3) se carga con el solvente de elución.
La cromatografía se comienza cuando la placa de vidrio (4) se coloca en posición vertical.
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Configuraciones posibles
NO saturada: la bandeja de acondicionamiento (6) vacía y la placa de vidrio (2) se saca.
Saturada: la bandeja (6) contiene eluyente y la placa de vidrio (2) se saca.
Pre-acondicionada: la bandeja (6) contiene el solvente, la placa (2) se saca, y la corrida se comienza luego de que se complete el pre-acondicionamiento.
Sandwich: la bandeja (6) esta vacía y la placa (2) en su lugar.
06/08/2010
19
Calle 1 extracto Schisandra chinensisCalle 2 extracto de Schisandra spenantheraHPTLC silica gel 60 F 254 (Merck), eluyente tolueno – acetato de etilo – ácido acético (70:30:3).
vertical saturada
verticalno saturada
horizontalsaturada
horizontal no saturada
horizontalsaturada y preacond.
horizontal sandwich
UV 254 vertical saturada
verticalno saturada
horizontalsaturada
horizontal no saturada
horizontalsaturada y
d
horizontal sandwich
Ac. Sulfúrico (10% en MeOH) y luz blanca
preacond.
Efecto de la distancia de desarrollo sobre la resolución
La velocidad de la fase movil no puede controlarse Puede ser afectada por la naturaleza de la fase estacionaria (porosidad, empaque, tamaño de partícula, etc) y de la fase móvil (viscocidad, tensión superficial, presion de vapor, etc.)
Generalmente decrece a lo largo del desarrollo de la placa.
Relación entre la distancia de corrida y el tiempo (HPTLC silica gel 60) Relación entre la distancia de corrida y el tiempo (HPTLC silica gel 60). FM: tolueno – acetato de etilo 19:1 (rojo) FM: acetato de etilo – metanol – agua –ácido fórmico 50:2:3:6 (azul)
06/08/2010
20
Si se mantienen todos los otros parámetros constantes, la resolucion Rs de dos compuestos depende tanto de su posición relativa en el cromatograma (Rfs) como de la distancia de migración del frente de solventes
Resolución entre dos componentes en función de la distancia de migración del frente de solventes (HPTLC).
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,40,3
0,2
0,1
Influencia de los valores de Rf sobre la resolución para un sistema HPTLC con una distancia de migración del frente de solvente de 6 cm.
En placas de HPTLC la mejor resolución se obtiene con desarrollos de 6 cmEste desarrollo suele tomar entre 7-20 minutos.Las mejores resoluciones se obtienen para valores de Rf de 0,3-0,4. (la FM debería ajustarse para que los compuestos críticos se posicionen en ese rengo de Rfs)
06/08/2010
21
Separación por HPTLC del aceite de manzanilla romana
Si nos basamos en el par de compuestos de Rf 0,4-0,5 la resolución parece aumentar con el aumento en la distancia de migración del frente de solvente.
7cm
8cm
3
4cm
5cm
6cm
7cm
3cm
Separación por HPTLC del aceite de manzanilla romana
Si nos basamos en el par de compuestos de Rf 0,4-0,5 la resolución parece aumentar con el aumento en la distancia de migración del frente de solvente. Sin embargo si ponen todos los cromatogramas en la misma escala se observa que la posición relativa de estos compuestos no cambia y la máxima resolución para estos dos compuestos se obtiene en el cromatograma de 6 cm compuestos se obtiene en el cromatograma de 6 cm
3cm 4cm 5cm 6cm 7cm 8cm
06/08/2010
22
Separación por HPTLC del aceite de manzanilla romana
Si nos basamos en el par de compuestos de Rf 0,4-0,5 la resolución parece aumentar con el aumento en la distancia de migración del frente de solvente. Sin embargo si ponen todos los cromatogramas en la misma escala se observa que la posición relativa de estos compuestos no cambia y la máxima resolución para estos dos compuestos se obtiene en el cromatograma de 6 cm compuestos se obtiene en el cromatograma de 6 cm
4cm 5cm 6cm 7cm 8cm
Consejos útiles:
- Desarrollar las placas de HPTLC en cámaras saturadas paramejorar la reproducibilidad.
- Hacer corridas de 6 cm.
- Es deseable que los componentes de la mezcla se separen a lo largo de toda la placa
- Para obtener mejor separación de las sustacias más críticas el par debería ubicarse en un Rf de aproximadamente 0,3-0,4
06/08/2010
23
- 1D y 2D
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Demanda mayor aporte del operador (o no es mas barato)
Detección: - UV (254, 365)- Reactivos (derivatizacion post corrida)- Scanners
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
06/08/2010
24
Derivatización
Razones para derivatizar.
• Convertir sustancias que no absorben en derivados detectables.
• Mejorar la detectabilidad (disminuir el límite de detección)
• Detectar un mayor número de compomentes de la muestra
• Detección selectiva de ciertas sustancias
Aplicación a través de fase gaseosa, por espray o por inmersión
Detección: - UV (254, 365)- Reactivos (derivatizacion post corrida)- Scanners
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
06/08/2010
25
Densitometría
Permite convertir a la CCD en una metodología cuantitativa.
Las mediciones son relativas, es decir que las propiedades de un compuesto “incógnita” se comparan con las de un compuesto “conocido” .
Se puede utilizar luz monocromática en el rango de 90 a 800 nm la cual se puede ajustar de a los máximos de absorción/fluorescencia de cada compuesto lo que le otorga gran sensibilidad. (nanogramos o picogramos)
Se puede realizar el escaneado secuencial de cada cromatograma con hasta 31 longitudes de onda y posteriormente hacer la evaluación cuantitativa de cada compuesto a su longitud de onda optima.
También se puede utilizar los espectros UV con fines de identificación También se puede utilizar los espectros UV con fines de identificación.
254 nm
06/08/2010
26
Dimetridazol(268 nm)
Sulfametacina (276 nm)
Sulfametoxazol 308 nm
Trimetoprima(273 nm)
(268 nm)
Sulfamerazina (203 y 288 nm)
06/08/2010
27
254 nm 308 nm
Fig. 5: Calibration curve for sulfamerazine at 288 nm
06/08/2010
28
Detección: - UV (254, 365)- Reactivos (derivatizacion post corrida)- Scanners
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Espectrometría de Masas
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Cafeína
06/08/2010
29
Demanda mayor aporte del operador (o no es mas barato)
Documentacion:- Digitalizadores de imágenes
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
06/08/2010
30
0.5 g polvo
10 ml MeOH 10 i
Appl Note Camag
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOHseguido de PEG 4000
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
10 min.Filtrac.Diluir 1:4
(2 μl)
seguido de PEG 4000FM: EtOAc-DCM-ac formico-ac. acetico-agua (100:25;10:10:11:11)
sensibilidad selectiva
Ejemplo. Ginkgo
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
06/08/2010
31
Ejemplo. Flavonoides del Ginkgo
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
FE: silica gel 60 F254.1 g de Droga
10 mL MeOH
Appl Note Camag
FM: EtOAc, Ac. Acético, Ac, Fórmico, Agua (100:11:11:27)
Detección: a) UV 254 nm, b) UV 366 nm,
c) NP/Macrogol. UV 366 nm.
10 mL MeOHRefl 10 minFiltrar
5 μl
Ejemplo. Flavonoides del Ginkgo
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
FE: silica gel 60 F254.1 g de Droga
10 mL MeOH
Appl Note Camag
FM: EtOAc, Ac. Acético, Ac, Fórmico, Agua (100:11:11:27)
Detección: a) UV 254 nm, b) UV 366 nm,
c) NP/Macrogol. UV 366 nm.
10 mL MeOHRefl 10 minFiltrar
5 μl
06/08/2010
32
Ejemplo . Ginkgolidos del Ginkgo
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
FE: silica gel 60 F254 impregnadas con acetato de sodio1 g de Droga
10 mL MeOH
Appl Note Camag
FM: Tolueno, EtOAc, acetona, MeOH (20:10:10:1.2)
Detección: spray con anhídrido acético y calentar a 180ºC 10 min:
a) UV 254 nm, b) UV 366 nm
10 mL MeOHRefl 10 minFiltrar
5 μl
Ejemplo . Ginkgolidos del Ginkgo
CCDComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
FE: silica gel 60 F254 impregnadas con acetato de sodio1 g de Droga
10 mL MeOH
Appl Note Camag
FM: Tolueno, EtOAc, acetona, MeOH (20:10:10:1.2)
Detección: spray con anhídrido acético y calentar a 180ºC 10 min:
a) UV 254 nm, b) UV 366 nm
10 mL MeOHRefl 10 minFiltrar
5 μl
06/08/2010
33
Alta automatizaciónAlta resoluciónFases estacionarias: muchas alternativasFases móviles: isocráficas y en gradienteDetección: Alta sensibilidad (Selectivos VS
CLAEComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Detección: Alta sensibilidad (Selectivos VS universales)FlourescenciaUVElectroquímico (sust, que se oxidan o reducen)Conduct. Electr (iones)Indice de refraccionEspectroscópicos (MS, DAD, RMN) Alto costo
Derivatización Pre-columna
Cuantitativos (calibracion previa)Extraccion Selectiva VS uso de pre-columnasPosibilidad de realizar separaciones preparativas.
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
CLAEComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
06/08/2010
34
0.5 g polvo
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
CLAEComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
g p
20 ml EtOH/H2O (5:5)sonic. 30 min.EtOH/H2O (5:5)hasta 25 ml.
(10 l)Filtrar
FE: Vydac 201 TP54, C18, 5µm, 4.6 x 250mmFlujo: 1.0 mL/min.FM: GradienteDeteccion: MS
J. Chrom. A, 825, 1998, 9-16
UV
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
CLAEComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
06/08/2010
35
CLAEComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Alta automatizaciónAlta resoluciónFases estacionaria: sólidas o líquidas y Empacadas Vs CapilaresFases móviles: Nitrógeno, Helio, Hidrógeno, Argon
CGComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
Detección: Alta sensibilidad (Selectivos VS universales)Conductividad térmicaIonización de llamaCaptura de electronesMS
Cuantitativos (calibración previa)
Universalidad (?)
Aceites esenciales y ácidos grasos.
06/08/2010
36
Ejemplo. Ac grasos de Serenoa repens por GCPara el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata
Se desconoce el principio activo.
Componentes:Ac. Grasos, libres y esterificados, esteroides y aceite esencial.
CGComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
150 mg extr. oleoso5 ml AcCl/MeOH cerrar85°C, 2 hs 5 ml. standard int.5 ml. aguaagitar 1 min.(dos fases)sacar 4 ml fase sup5 ml eter5 ml MeOH/NaOH5 ml MeOH/NaOHagitar 2 min5 ml aguaagitar 1 min(dos fases)fase sup.
(1 μl)
Ejemplo. Ac grasos de Serenoa repens por GCPara el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata
Se desconoce el principio activo.
Componentes:Ac. Grasos, libres y esterificados, esteroides y aceite esencial.
CGComo se construye una huella dactilar: Métodos cromatográficos
150 mg extr. oleoso5 ml AcCl/MeOH cerrar85°C, 2 hs 5 ml. standard int.5 ml. aguaagitar 1 min.(dos fases)sacar 4 ml fase sup5 ml eter5 ml MeOH/NaOH5 ml MeOH/NaOHagitar 2 min5 ml aguaagitar 1 min(dos fases)fase sup.
(1 μl)
06/08/2010
37
En una situación ideal debe controlarse la composición total de la mezcla
“Huella Dactilar”
¿Como se construye?- Métodos cromatográficos
é d ó i- Métodos espectroscópicos- Métodos acoplados
Las huellas dactilares espectroscópicas detectan los compuestos en mezcla
Como se construye una huella dactilar: Métodos espectroscópicos
Mezcla sin separar
06/08/2010
38
Como se construye una huella dactilar: Métodos espectroscópicos
Las huellas dactilares espectroscópicas detectan los compuestos en mezcla
Mezcla sin separar
Detección
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
1HRMNComo se construye una huella dactilar: Métodos espectroscópicos
06/08/2010
39
1HRMNComo se construye una huella dactilar: Métodos espectroscópicos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
1HRMNComo se construye una huella dactilar: Métodos espectroscópicos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
06/08/2010
40
CCD, CLAE y 1HRMNComo se construye una huella dactilar: comparacion
Ejemplo . HIPERICOCCD
CLAE
1HRMN
Mezcla de
Como se construye una huella dactilar: Métodos acoplados
Mezcla de compuestos
Separación
detección
Huella dactilar con métodos acoplados
06/08/2010
41
Mezcla de
Como se construye una huella dactilar: Métodos acoplados
CG-EM CLAE-UV(DAD) CLAE-UV-RMN-MS CCD-UVCLAE-MS CCD-MSCLAE-RMN
Mezcla de compuestos
Separación
detección
Huella dactilar con métodos acoplados
Como se construye una huella dactilar: Métodos acoplados UV (DAD)
06/08/2010
42
En una situación ideal debe controlarse la composición total de la mezcla
“Huella Dactilar”
¿Como se construye?- Métodos cromatográficos- Métodos espectroscópicos- Métodos acoplados
¿Qué información brinda?
Extraccion de informacion de huellas dactilares.
Identificar:Las huellas dactilares pueden utilizarse para identificar la muestra, en cuyo caso su huella dactilar es comparada con una monografía o con un estándar de referencia.
Clasificar:Clasificar o agrupar muestras de acuerdo a su origen o para distinguirlas en base a otras variables.
Modelar:Relacionar huellas dactilares con parámetros de calidad cuantitativos (actividad). Se modela la actividad como funcion de la huella dactilar para poder predecir actividad desde huellas dactilares de otras muestras.
06/08/2010
43
“Huella Dactilar”
Muestras auténticas
¿Con qué se compara?¿Como se compara?
Muestras auténticas
Uso de MarcadoresMonografías de Farmacopeas
MarcadoresCompuestos químicos definidos que pueden utilizarse como testigos para estudiar su presencia/ausencia en la muestra a
analizar.
Características de un marcador:•Ser característico del material herbario que se va a evaluar.
•Ser una sustancia química de estructura definida.
Clase pasada
•Estar presente en el material vegetal y en el producto terminado en suficiente cantidad como para el desarrollo de un método validado de detección en ambos.
•Ser accesible de cuantificación con equipos analíticos comunes (GC, HPLC, para que los costos sean moderados.
•Ser suficientemente estable bajo las condiciones de almacenamiento.
•No estar presente en otras hierbas, de modo de cuantificarlo selectivamente en el producto final de un preparado multicomponente.
•Ser comercialmente disponible ó poder ser aislado por el propio laboratorio
06/08/2010
44
Marcadores Positivos:Compuestos que deben estar presentes en la mezcla . Es deseable que sean principios activos (marcadores activos).
Marcadores Negativos:Compuestos que NO deben estar presentes en la mezcla (tóxicos, adulterantes, etc).
La utilización de marcadores debe ser siempre criteriosa, teniéndose en cuenta el objetivo
MATERIALA1
Identificación del material vegetalHuella Dactilar – Uso de marcadores
British Herbal Pharmacopoeia, 1996
MATERIAL VEGETAL Pi1
Pi 2
A 2
PF
A 3HuellaDactilar
06/08/2010
45
Identificación del material vegetalBritish Herbal Pharmacopoeia, 1996. (General Notices, pp13)
CCD se utiliza como el método principal de identificación de los materiales vegetales definidos en las monografías.
En algunos pocos casos en los que algunos constituyentes aislados están disponibles comercialmente, los constituyentes separados cromatográficamente en la placa son relacionados con los constituyentes conocidos utilizados como marcadores.
En otros casos la huella digital de los constituyentes separados es obtenida y las posiciones de las mayores bandas en el cromatograma son descriptas relativas a un marcador no constituyente o al frente del solvente.y
Si bien no se requiere específicamente en las monografías, queda claro que con el objeto de aumentar la credibilidad de la identificación un cromatograma de una muestra auténtica de la droga vegetal en cuestión debería ser desarrollado sobre la misma placa, en paralelo.Esto permite la comparación completa de todas las bandas separadas y debería ser adoptado como una práctica estándar siempre que sea posible.
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
06/08/2010
46
CCD
1 g polvo
10 ml MeOH 10 min. tibio
Filt
BHP 1996 (174)
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)
Huella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Las bandas principales relativas a rutina son aproximadamente las siguientes: - roja 2.0
Filtrac.
(20 μl)
Marcador: rutina.
j- amarilla 1.9- amarilla 1.7- amarilla 1.5- turquesa 1.3- amarilla 1.0
1 g polvo
10 ml MeOH 10 min. tibio
Filt
BHP 1996 (174)
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Filtrac.
(20 μl)
Marcador: rutina.
0.5 g polvo FE: Silica agel 60F254
Wagner (58-70)
5 ml MeOH5 min. tibio
Filtrac.
(25 μl)Marcadores: hipericina, rutina, ac. clorogenico, hiperosido
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:26)
06/08/2010
47
1 g polvo
10 ml MeOH 10 min. tibio
Filtrac.
(20 μl)
BHP 1996 (174)
FE: Silica gel 60F254
Marcador: rutina.
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)
0.5 g polvo
5 ml MeOH5 min. tibio
Filtrac.
(25 μl)
FE: Silica agel 60F254
Marcadores: hipericina, rutina, ac. clorogenico, hiperosido
Wagner (58-70)
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:26)
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Las bandas principales relativas a rutina son aproximadamente las siguientes: - roja 2.0- amarilla 1.9- amarilla 1.7- amarilla 1.5- turquesa 1.3
Hyperoside
Hypericin
- amarilla 1.0RutinChlorogenic Acid
TestigosH.p.ComercialH.p.Hipericina
1 g polvo
10 ml MeOH 10 min. tibio
BHP 1996 (174)
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Filtrac.
(20 μl)
Marcador: rutina.FM: EtOAc ac. acetico ac formico agua (100:11:11:27)
0.5 g polvoAppl Note Camag
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH10 ml MeOH 10 min.Filtrac.Diluir 1:4
(2 μl)
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-DCM-ac formico-ac. acetico-agua (100:25:10:10:11)
Marcadores: hipericina, rutina, ac. clorogenico, hiperosido y quercitrina
06/08/2010
48
1 g polvo
10 ml MeOH 10 min. tibio
Filtrac.
(20 μl)
BHP 1996 (174)
FE: Silica gel 60F254
Marcador: rutina.
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)
0.5 g polvo
10 ml MeOH 10 min.Filtrac.Diluir 1:4
(2 μl)
Appl Note Camag
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-DCM-ac formico-ac. acetico-agua (100:25;10:10:11:11)
Huella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Las bandas principales relativas a rutina son aproximadamente las siguientes: - roja 2.0- amarilla 1.9- amarilla 1.7- amarilla 1.5- turquesa 1.3- amarilla 1.0 Quercitrin
Hypericin
Extractos comerciales
Rutin
HyperosideChlorogenic Acid
Drogas Vegetales
0.5 g polvo
10 ml MeOH 10 min.Filtrac.Diluir 1:4
(2 μl)
Appl Note Camag
FE: Silica gel 60F254
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-DCM-ac formico-ac. acetico-agua (100:25;10:10:11:11)
0.5 g polvo
5 ml MeOH5 min. tibio
Filtrac.
(25 μl)
FE: Silica agel 60F254
Marcadores: hipericina, rutina, ac. clorogenico, hiperosido
Wagner (58-70)
Revelador: difenilboryloxietilamina/MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:26)
Huella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Hyperoside
QuercitrinHypericin
Chlorogenic
Extractos comerciales
Rutin
Drogas Vegetales
ChlorogenicAcid
TestigosH.p.Comercial
H.p.Hipericina
06/08/2010
49
Ejemplo . Ginkgo biloba
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
CCD
1 g hojas secas
10 ml MeOH 10-15 min. Tibio.
FE: Silica agel 60F254Revelador: difenilboryloxietilamina en MeOH seguido de PEG 4000
BHP 1996 (88) Análisis de Flavonoides
Huella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Las bandas principales relativas a rutina son aproximadamente las siguientes: - turquesa 2.2- amarilla 1.4
Filtrac.
(20 μl)
FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)Marcador: Rutina
- amarilla 1.2- turquesa 1.1- amarilla 1.1- naranja 1.0-turquesa 0.9- naranja 0.8-amarilla 0.75- naranja 0.65
06/08/2010
50
1 g hojas secas
10 ml MeOH 10-15 min. Tibio.
FE: Silica agel 60F254Revelador: difenilboryloxietilamina en MeOH seguido de PEG 4000
BHP 1996 (88) Análisis de Flavonoides
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Filtrac.
(20 μl)
FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:27)Marcador: Rutina
1 g hojas secas30 ml MeOH
Wagner (240) Análisis de Flavonoides
30 ml MeOH 30 min. refl.Filtrac.
Conc.
2 ml.(10-20 μl)
extracto secoMeOH
FE: Silica agel 60F254Revelador: difenilboryloxietilamina an MeOH seguido de PEG 4000FM: EtOAc-ac. acetico-ac formico-agua (100:11:11:26)Marcadores: Rutina, Ac. clorogeninco, Hiperosido
Wagner (240)
CCD
BHP 1996 (88)
Análisis de Flavonoides
Huella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Hyperoside
Chlorogenic Acid
Las bandas principales relativas a rutina son aproximadamente las siguientes: - turquesa 2.2- amarilla 1.4- amarilla 1.2- turquesa 1.1- amarilla 1.1
Rutin
Rutina
- naranja 1.0- turquesa 0.9- naranja 0.8- amarilla 0.75- naranja 0.65
G.b.Corea
G.b.Italia
G.b.Alemania
06/08/2010
51
Appl NoteBHP 1996 (88)
Análisis de Flavonoides
CCDHuella dactilar, uso de Marcadores: Identificación de material vegetal
Las bandas principales relativas a rutina son aproximadamente las siguientes: - turquesa 2.2- amarilla 1.4- amarilla 1.2- turquesa 1.1- amarilla 1.1
T 2.2
A 1.4
A 1.2
RutinaRutina
- naranja 1.0- turquesa 0.9- naranja 0.8- amarilla 0.75- naranja 0.65
G.b.1secas
G.b. 2secas
A 1.2
T y A 1.1N 1
T 0.9N 0.8A 0.75N 0.65
MATERIALA1
¿Cuantificar todos los componentes?
MATERIAL VEGETAL Pi1
Pi 2
A 2
PF
A 3Cuantif.Marcadores
06/08/2010
52
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
HPLC tifi ió d hi i iHPLC: huella dactilar
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
1 g Dr polvo80 ml MeOHRefl 20 minFiltrar60ml MeOHRefl 20 minFiltrarCombinar filtradosconcentrar hasta 3 ml
2 veces
HPLC: cuantificación de hipericinay pseudo hipericina
0.5 g polvo
20 ml EtOH/H2O (5:5)sonic. 30 min.EtOH/H2O (5:5)hasta 25 ml.
(10 μl)Filtrar
HPLC: huella dactilar
FE: Vydac 201 TP54, C18, 5µm, 4.6 x 250mmFlujo: 1.0 mL/min.FM: GradienteDeteccion: 270 nm FE: Kromasil 4.0 x 125 mm201, 5µm, RP18
FM: isocrática. MeOH:pH 2.1 buffer fosfato:acetato de etilo(1893:618:526)Flujo 1.0 mL/min. Deteccion: 590 nm
(10 μl)
MeOH hasta 25 ml.cetrifugar 5 minsobrenadante luz 30 min
06/08/2010
53
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
HPLC tifi ió d hi i i
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
1 g Dr polvo80 ml MeOHRefl 20 minFiltrar60ml MeOHRefl 20 minFiltrarCombinar filtradosconcentrar hasta 3 ml
2 veces
HPLC: cuantificación de hipericinay pseudo hipericina
FE: Kromasil 4.0 x 125 mm201, 5µm, RP18 FM: isocrática. MeOH:pH 2.1 buffer fosfato:acetato de etilo(1893:618:526)Flujo 1.0 mL/min. Deteccion: 590 nm
(10 μl)
MeOH hasta 25 ml.cetrifugar 5 minsobrenadante luz 30 min
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
Tiempos necesariosSeparación a línea de base
06/08/2010
54
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
Misma droga
Diferente extracciónDiferente método de análisis por CLAE
HuellaDigital
CuantificaciónH y p-H
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
HPLC: cuantificación de hiperforinaHPLC: huella dactilar
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
HPLC: cuantificación de hiperforina
0.50 g droga en polvo
80 ml MeOHsonic. 30 min.MeOHhasta 100 ml.Centrifugar 5 minsobrenadante
(20 μl)
0.5 g polvo
20 ml EtOH/H2O (5:5)sonic. 30 min.EtOH/H2O (5:5)hasta 25 ml.
(10 μl)Filtrar
HPLC: huella dactilar
FE: MetaChem Polaris™ C18-A, 5µm, 4.6 x 150 mmFM: isocratic: ACN:pH 2.5 buffer fosfato (85:15)Flujo: 1.5 mL/minDetección: 270 nm
( 0 μ )
FE: Vydac 201 TP54, C18, 5µm, 4.6 x 250mmFlujo: 1.0 mL/min.FM: GradienteDeteccion: 270 nm
06/08/2010
55
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
.
Tiempos necesariosSeparación a línea de base
CLAECuantificación de marcadores: Métodos cromatográficos
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
Misma droga
Diferente extracciónDiferente método de análisis por CLAE
HuellaDigital
CuantificaciónM1 y M2
CuantificaciónM3 y M4
06/08/2010
56
MATERIALA1
HuellaDactilar
MATERIAL VEGETAL Pi1
Pi 2
A 2
PF
A 3HuellaDactilar
Cuantif.Marcadores
Cuantificación
CLAEHuella dactilar : Métodos cromatográficos
Huella dactilar de M t i l t l (CLAE)
Huella dactilar de Prod Interm (CLAE)
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
0.5 g polvo
20 ml EtOH/H2O (5:5)sonic. 30 min.EtOH/H2O (5:5)hasta 25 ml.
(10 μl)Filtrar
0.15 g extr. en polvo20 ml EtOH/H2O (5:5)sonic. 30 min.EtOH/H2O (5:5)hasta 25 ml.
(10 μl)Filtrar
Diferente Cantidad de muestraMismo método de extracciónMismo análisis CLAE
Material vegetal (CLAE) Prod. Interm. (CLAE)
FE: Vydac 201 TP54, C18, 5µm, 4.6 x 250mmFlujo: 1.0 mL/min.FM: GradienteDeteccion: 270 nm
06/08/2010
57
MATERIALA1
HuellaDactilar
MATERIAL VEGETAL Pi1
Pi 2
A 2
PF
A 3HuellaDactilar
Cuantif.Marcadores
MATERIALA1
HuellaDactilar
CuantifMATERIAL VEGETAL Pi1
Pi 2
A 2
PF
A 3HuellaDactilar
Cuantif.Marcadores
Cuantif.Marcadores
06/08/2010
58
CLAECuantificacion de marcadores : Métodos cromatográficos
Cuantificacion de marcadores Hipericina y Pseudo Hipericina (CLAE)
Ejemplo . HIPERICOAntidepresivo
El efecto terapéutico sería resultado de la combinación de sus componentes.
Prod. Intermediario 1 g Dr polvo
80 ml MeOHRefl 20 minFiltrar60ml MeOHRefl 20 minFiltrarCombinar filtradosconcentrar hasta 3 ml
2 veces
0.75 g extr. en polvo40 ml MeOHsonic. 15 min.MeOH hasta 50 ml.sacar 10 mlcetrifugar 5 minsobrenadante luz 30 min
Hipericina y Pseudo Hipericina (CLAE)Material vegetal
(10 μl)
MeOH hasta 25 ml.cetrifugar 5 minsobrenadante luz 30 min
(10 μl)
FE: Kromasil 4.0 x 125 mm201, 5µm, RP18FM: isocrática. MeOH:pH 2.1 buffer fosfato:acetato de etilo(1893:618:526)Flujo 1.0 mL/min. Deteccion: 590 nm
Diferente método de extracciónMismo análisis CLAE
CCDCuantificacion de marcadores : Métodos cromatográficos
Cuantificacion de marcador Artemisinina
M t i l t l
Ejemplo . ARTEMISIAAntimalárico
Material vegetal
200 mg hoja molida seca
10 mL toluenoSonicación por 10mincentrifugación
2 µL sobrenadante
FE: HPTLC Si 60 F 254, 10x10 cmBandas de 8 mm FM: ciclohexano, acetato de etilo, ác. acético (20:10:1)Vertical, saturada durante 20 min (papel de filtro)5mL Sv Reactivo anisaldehído, dipping 1 segundo y 100°C 12 min
06/08/2010
59
CCDCuantificacion de marcadores : Métodos cromatográficos
Cuantificacion de marcador Artemisinina
Ejemplo. ARTEMISIAAntimalárico
Material vegetal
200 mg hoja molida seca10 mL toluenoSonicación por 10mincentrifugación
2 µL sobrenadante
FE: HPTLC Si 60 F 254, 10x10 cmBandas de 8 mm FM: ciclohexano, acetato de etilo, ác. acético (20:10:1)Vertical, saturada durante 20 min (papel de filtro)5mL Sv Reactivo anisaldehído, dipping 1 segundo y 100°C 12 min
MATERIALA1
HuellaDactilar
CuantifMATERIAL VEGETAL Pi1
Pi 2
A 2
PF
A 3HuellaDactilar
Cuantif.Marcadores
Cuantif.Marcadores
HuellaDactilar
Cuantif.Marcadores
HuellaDactilar
Cuantif.Marcadores
Productos Estandarizados
06/08/2010
60
Objetivo de la estandarización
Lograr potencia terapéutica constante
Conceptos erróneos
Estandarización consiste en controlar la cantidad de un componente del extractop
Cuanto más, mejor!
Como se preparan los extractos estandardizados?
Estandarizando todo el proceso (Clase pasada)
Evaluación de proveedores: control químico antes de la recolección
Metodología de extracción y concentración estandarizada
Rol del control de calidad Qco.:Cuantificación de marcadores y huellas dactilaresMezcla de lotes
06/08/2010
61
Extraccion de informacion de huellas dactilares.
Identificar:Las huellas dactilares pueden utilizarse para identificar la muestra, en cuyo caso su huella dactilar es comparada con una monografía o con un estándar de referencia.
Clasificar:Clasificar o agrupar muestras de acuerdo a su origen o para distinguirlas en base a otras variables.
Modelar:Relacionar huellas dactilares con parámetros de calidad cuantitativos (actividad). Se modela la actividad como funcion de la huella dactilar para poder predecir actividad desde huellas dactilares de otras muestras.
Extraccion de informacion de huellas dactilares.
Identificar:Las huellas dactilares pueden utilizarse para identificar la muestra, en cuyo caso su huella dactilar es comparada con una monografía o con un estándar de referencia.
Clasificar:Clasificar o agrupar muestras de acuerdo a su origen o para distinguirlas en base a otras variables.
Modelar:Relacionar huellas dactilares con parámetros de calidad cuantitativos (actividad). Se modela la actividad como funcion de la huella dactilar para poder predecir actividad desde huellas dactilares de otras muestras.
06/08/2010
62
06/08/2010
63
Extraccion de informacion de huellas dactilares.
Identificar:Las huellas dactilares pueden utilizarse para identificar la muestra, en cuyo caso su huella dactilar es comparada con una monografía o con un estándar de referencia.
Clasificar:Clasificar o agrupar muestras de acuerdo a su origen o para distinguirlas en base a otras variables.
Modelar:Relacionar huellas dactilares con parámetros de calidad cuantitativos (actividad). Se modela la actividad como funcion de la huella dactilar para poder predecir actividad desde huellas dactilares de otras muestras.
Extraccion de informacion de huellas dactilares.
Identificar:Las huellas dactilares pueden utilizarse para identificar la muestra, en cuyo caso su huella dactilar es comparada con una monografía o con un estándar de referencia.
Clasificar:Clasificar o agrupar muestras de acuerdo a su origen o para distinguirlas en base a otras variables.
Modelar:Relacionar huellas dactilares con parámetros de calidad cuantitativos (actividad). Se modela la actividad como funcion de la huella dactilar para poder predecir actividad desde huellas dactilares de otras muestras.
06/08/2010
64
Muchas gracias