Clase 7Purificación de proteínas

Veamos entonces purificación de proteínas. Hay técnicas Cromatográficas, Técnicas Electroforéticas, Técnicas de diálisis, Técnicas de precipitación (que es lo que estamos comenzando ahora), Criterios de Purificación, que son: a) Pureza y Rendimiento, y b) Actividad Total y Actividad Específica. Y de eso vamos a hablar ahora.

¿Para qué les puede servir a ustedes la purificación de proteínas, si un médico va a comprar todo en polvo, en una caja…no tiene que purificar nada? Ésta es mi opinión: para leer papers. Porque cuando lean un artículo científico y estén trabajando con una proteína (sobretodo si es una proteína nueva), va a aparecer en metodologías cómo se purificó esa proteína, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para seguir esa metodología y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la literatura científica de proteínas que son emergentes o de algún artículo clásico en el cual se indique cómo se purificó el ¿?. Y ¿para qué también les sirve? Es un pretexto para poner en práctica todo lo que hemos aprendido desde acá hacia atrás.

Veamos la separación de proteínas. A ver, aquí hay dos elementos que son importantes cuando uno separa una proteína, ¿y de qué la estamos separando? Imagínense, tenemos una célula, las células tienen miles de proteínas, y miles de tipos de moléculas, que no son proteínas, no todas son proteínas. Lo que nosotros nos proponemos es aislar UNA proteína, una sola (y probablemente esté en muy baja concentración) para hacer estudios de funcionalidad y saber esa proteína en qué tipo de proceso biológico está. Aislar esa proteína tiene un desafío doble: 1) que ojalá pueda aislar mucha proteína, de tal manera que la pueda manipular fácilmente, o sea hablar de mg. y g. de proteínas purificadas para hacer estudios con esa proteína, y 2) ojalá que esa proteína que yo aíslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el polvo, por ejemplo), esa proteína, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no tenga contaminantes. No me sirve una proteína que esté muy contaminada para un estudio de funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo último que dije) y de rendimiento (que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cuánto estoy obteniendo, y la pureza tiene que ver con qué estoy obteniendo. Entonces todas las técnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un compromiso entre Rendimiento y Pureza, ¿de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o sea para obtener gramos de una proteína, necesito sacrificar la pureza de la proteína. Y otras veces para obtener mucha pureza, necesito sacrificar el rendimiento porque supone hacerla pasar a través líneas sucesivas de purificación, que hacen que yo vaya perdiendo proteína en el camino, pero me estoy asegurando que esa proteína va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se contraponen y por lo tanto la purificación de la proteína supone un compromiso entre purificación y rendimiento. Entonces, vamos a ver distintas técnicas, y muchas de estas técnicas se utilizan una a continuación de la otra, de tal manera que me asegure que el producto está puro. Pero probablemente hay un orden obligado de algunas técnicas y por ejemplo una de las técnicas que primero se aplica en un compuesto, en un extracto del cual yo quiero purificar una proteína es la Precipitación Salina y les voy a explicar por qué.

Precipitación Salina

¿Qué es lo que hay que hacer primero si yo quiero obtener una proteína? Vamos a poner un ejemplo verídico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal, así que les diré que purifiqué una vez la proteína de la alcayota, sí, la alcayota, y es una enzima proteolítica, es decir, capaz de romper proteínas, es decir, hidroliza el enlace peptídico. Entonces, ¿qué debía hacer yo para purificar la enzima de la alcayota? (la enzima proteolítica). Es una enzima ¿ya?, la mayoría de las enzimas son proteínas. Recientemente se está hablando que hay RNA que tienen actividad enzimática, por eso hago el alcance, pero realmente, y en general, las enzimas son proteínas. Entonces, había una enzima que rompía proteína (que era la enzima proteolítica de la alcayota), y había que purificarla. ¿Qué harían? Romper la alcayota ¿cierto?, sacar la pulpa. Sacamos el jugo de la alcayota. Aquí tenemos que tomar una decisión. Primero, ¿la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular, no hay ningún problema en sacarle el juguito. Si es intracelular hay que romper toda la célula para que la enzima salga, así que ya tenemos un primer problema. Tendría yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota, de tal manera que me asegure que están todos los citoplasmas expuestos digamos y la proteína por tanto la puedo obtener en el exudado de la alcayota. Así que, de acuerdo, ésta es extracelular y es fácil, sacamos el juguito a la alcayota. ¿Qué hacemos? Tengo pedazos de alcayota, tengo la cochina’ no más…¿qué hago? Filtro. Colamos, filtramos. Y después tengo un jugo que yo supongo que es relativamente “puro”. Una de las primera técnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba), lo que uno hace es aplicar sal, para variar la solubilidad de las proteínas. Y cuando agregamos sal, suceden dos cosas. Y veamos la proteína B en este gráfico:

Y esto es solubilidad versus

concentración de sal. Primero aumenta la solubilidad y después disminuye la solubilidad. ¿Por qué? ¿De qué modo aumenta? Primero, pensemos, vienen de poco soluble, ¿qué significa que sean poco soluble? ¿cómo están entre sí? ¿se quieren o se odian? Se quieren, se abrazan. Si son hidrofóbicas están juntas porque los demás las rechazan ¿cierto? Si son hidrofílicas están juntas porque tienen afinidad mutua, y por lo tanto no interactúan tanto con el agua. Si fuese así, diríamos que tienen poca solubilidad. [pregunta ké es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto depende de la pareja solvente-soluto. Y hasta aquí no más disuelve la proteína del agua, hasta aquí no más con esa concentración de sal, esta concentración de sal es la máxima [q disuelve]. Y lo que pasa es que para interferir con la afinidad que hay entre moléculas de las proteínas que hacen que se vayan al fondo y no interactúen con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interacción entre las proteínas, de tal manera que las cargas de la proteína interactúen más bien con la sal que con la misma proteína, y como la sal es soluble, todo feliz. El problema es cuando agrego más sal, porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteína B, pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilización por saldo [cuando la curva sube] y a éste [cuando la curva baja], salting-out = precipitación por salado) agrego más sal, ¿por qué empiezan a precipitar las proteínas? [un niño responde algo de que le kitan el lugar…disminuyen las interacciones con las proteínas]. Exacto, entonces las proteínas se sienten rechazadas y precipitan. Ahora, esto es espicífico para una proteína, la proteína B, la proteína A y C van a responder de manera distinta, y ESE es el secreto para purificar. Porque significa que si yo agrego una oncentración de sal determinada va a haber proteínas más solubles que otras. Por ejemplo a ésta concentración, la soluble va a ser la C y las

Fig. 1. Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una proteína: - Solubilización por salado. - Precipitación por salado.

insolubles la B y la A. [Señala en el gráfico, cuando la curva C está arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo centrifugo este compuesto a esa concentración de sal, voy a obtener precipitado de A y B, y soluble de C, y así me quedo con la proteína C. Uds. dirán: “pero si esto no precipita completamente”, bueno obvio ¬¬, si es la primera etapa de purificación, pero indudablemente enriquecí la proteína C. Y lo mismo pasa si agrego poquita sal, voy a tener más soluble la A que la B y la C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteínas y eso es empleado como una etapa primera de purificación de proteínas. Ojalá no la denature, porque si la denatura, sonamos con la purificación…es difícil renaturar las proteínas. No se dice “redenaturar”, se dice “Renaturar”

¿Cómo puedo ver una proteína que es microscópica? ¿Cómo puedo saber que la proteína está presente? Viendo la funcionalidad de la proteína.

¿Qué es la solubilidad? (una vez más) cantidad máxima de soluto que se puede disolver en un solvente determinado, por lo tanto depende de la pareja solvente- soluto , así que hasta aquí no mas disuelve la proteína del agua , hasta aquí no mas con esta concentración de sal, hasta aquí no mas esta concentración de sal es la máxima. Y lo que pasa es que, para interferir con la afinidad que hay entre las moléculas de la proteína, que hace que se vayan al fondo y no interactúen con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interacción entre las proteínas, de tal manera que las cargas de las proteínas interactúen mas bien con la sal que con la misma proteína, y como la sal es soluble, todos felices. El problema es cuando agrego mas sal, porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteina B, a eso se le llama salting in, y a este proceso que viene salting out, que significaria (solubilidad por salado, y precipitación por salado) Entonces salting in le denominamos a esta primera fase, y cuando agregamos mas sal, ¿porque empiezan a precipitar estas proteínas? Porque ahí la sal empieza a interactuar con el agua, no permite que las proteinas lo hagan, y por lo tanto a las proteínas no les queda mas que interactuar entre si, se sienten rechazadas y luego precipitan. Ahora esto es especifico para la proteina B, la proteina A y C van a reaccionar de manera distinta, y ese es el secreto para purificar, porque significa que si yo agrego una concentración de sal determinada, va a haber proteinas más solubles que otras. Por ejemplo a esta concentración X, la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B, y significa que si yo centrifugo ese compuesto a esa concentración de sal, voy a obtener precipitado de Ay B, soluble de C y me quedo con esa proteina. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificación, pero indudablemente enriquecí la proteina C si agrego sal. Y lo mismo podría pasar si agrego poquita sal, voy a obtener mas oluble la A, que la B y C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso fue empleado como una etapa primaria de purificación Ojala no la denature, por que si lo hace no se puede purificar, porque es difícil renaturar.

Entonces la solubilidad aumenta porque al agregar sal, el primer efecto al haber pocas concentraciones de sal, es disminuir las interacciones entre las proteínas, porque la sal compite. La sal esta disuelta asi que todo bien para que las proteínas tambien esten disueltas, no se van al fondo.Pregunta: ¿como saber hasta que punto agregar

sal, si se poco de la proteina? Ensayo y error, y te vas dando cuenta cuando tienes mucha mas pura la proteina que te interesa.¿Como veo una proteína que es microscópica? Viendo la funcionalidad de la proteina, por ejemplo si tengo una proteína que es inflamatoria, para saber si la tengo los extractos de la proteína se los inyecto en la pata de una rata, y veo si se inflama o no midiendo el diámetro de la pata. Eso se llama ensayo biológico, tenemos ensayos quimico, bioquimicos y biológicos del extracto que estas obteneniendo y saber si la tienes en mayor o menor concentración, y al mismo tiempo mides proteína total, para saber con cuanta proteína te estas quedando. Se hacen los 2 tipos de mediciones proteina total y funcionalidad de la proteina, asi que, es necesario poder observar la proteina de alguna manera, sino no se si la tengo o no la tengo.

Hay otro método de purificación: La diálisis. Imagínense que precipite la enzima proteolitica de la alcayota, y lo que obtuve, me quede con el precipitado, no con el soluble. Y la redisuelvo, y va a estar contaminada con sal, porque el método anterior que utilice fue precipitación salina, entonces lo que esta

rojo seria la sal, y lo que esta en verde seria la proteína. Y si pongo una membrana de celofán o semipermeable, con un diámetro de poro que permita que salgan los iones de sal, pero no permita que salgan la proteína, entonces a través de difusión simple yo veo que sal empieza a migrar hacia el espacio del compartimento que esta a fuera que es pura agua, y voy a quedar con la proteína mucho mas pura, voy a eliminar contaminantes de bajo peso molecular a través de la diálisis.

Ahora piensen que tal vez esa proteína tenía una molécula que siempre la acompaña y que la inhibía o bajaba su actividad, probablemente esa molécula en ese paso salga y la pierda. Entonces tengo que tener conciencia del proceso que estoy aplicando, porque estoy introduciendo modificaciones en la muestra, y probablemente haya algún factor que sea importante para la actividad de la enzima, y que a lo mejor encendía o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si era de bajo peso molecular, así que puede que suceda y puede que no. Si son moléculas de alto peso molecular, se aplican otras técnicas más gruesas, y se va afinando con otras mas especificas.Cuando uno trabaja con una proteína que no se conoce, se debe estar atento a todos los resultados y tratar de interpretarlos. Esa era una segunda etapa de purificación, y es bastante gruesa. Ahora yo tomo los extractos que obtengo acá, y los ocupo en técnicas que voy mostrando a continuación.

Hay un tipo de cromatografía que es la de partición, es cuando a través de la solubilidad se separa un soluto que se distribuye en forma diferente en fase sólida como un papel, a una fase móvil que puede ser una muestra de distintos solventes, agua con etanol, con butanol, distintos alcoholes para dar la polaridad apropiada. Consistía en una cámara con un solvente o mezcla de solventes con una polaridad determinada, y ponían un fase sólida que podía ser un papel, que es pura celulosa (que a su vez esta formada por glucosa), la celulosa tiene enlaces glucosidicos, B 1-4 para establecer las cargas, son puros polimeros de enlaces B 1-4. Cuando tienen estos enlaces en la celulosa se establece un polimero, que ese constituye el papel en este caso. Pero esa celulosa tiene afinidad por el agua, por lo tanto esta hidratada.Cuando agregamos una muestra, esta sube por cuanto tiene afinidad por el solvente, y el solvente sube por capilaridad. ¿Por qué sube por capilaridad? El solvente tiene polaridad, la glucosa tiene polaridad, por lo tanto empieza a interactuar con la glucosa y tiende a subir, porque tiene afinidad, hay fuerzas que la une a la glucosa, y si hay mucha glucosa arriba en al celulosa, tiende a subir el liquido porque se están encaramando las moléculas del solvente sobre la celulosa, entonces sube el solvente (no solo es agua, puede ser con componentes mas apolar, como ser alcohol) a través del papel y el soluto que estaba en la línea de partida con línea segmentada, va a seguir el frente del solvente como pueda, porque ama al solvente, al agua que hidrata a la celulosa, y a la celulosa (afinidad por el solvente y la fase estacionaria). Entonces si tengo un aminoácido muy polar, va a tener atracción por la fase estacionaria que es glucosa y agua, y si la fase movil, que es agua y una componente hidrofobica, va a tener menor afinidad por el aminoácido. Entonces este aminoácido no sigue al frente, se va retrasando. ¿Por qué se retrasa? La

molécula comparte su tiempo entre la fase movil y la estacionaria, se sienta a descansar o avanza con el solvente, eso es al azar, pero pasa más tiempo con quien tiene más afinidad.

Si tengo distintas moléculas, que tienen distinta afinidad relativa entre fase movil y estacionaria, no van migrar de la misma forma, algunas llegaran más lejos y otras se quedaran mas cerca de la línea de partida. Ahí aparece Rf: que es un

coeficiente dado entre lo que migro el soluto, y lo que migro la fase estacionaria. Ustedes calculan ese Rf y lo pueden utilizar en casos para propositos de comparación.

Entonces aquí agregamos una muestra, una gota que se resuelve en 3 manchas, son 3 aminoácidos distintos que estoy separando. Entonces los identifico, porque después los rocío con un colorante para aminoácidos ( hay uno que interactúa con el grupo alpha amino, que se llama ninhidrina, y ese colorante cuando se rocía sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente sospecho que era por ejemplo aspartico, glutámico y fenilalanina, y pondré en paralelo los mismos pero comprados y comparo los Rf, y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho, por ejemplo, si el que pienso es aspartico, y migra igual que el aspartico es porque debe serlo.

Pero estas técnicas ya no se usan, pero sirven para procesar y aplicar lo que sabe, actualmente se usan identificadores para aminoácidos, técnicas de cromatografía de alta presión, pero son técnicas caras.

La cromatografía en columna se ocupa siempre, porque tiene muchas variantes tecnológicas, y consiste en que agregan la muestra arriba, ahí esta mi extracto, imagínense que purifique a través de precipitación por saldo, resuspendi,

hice diálisis, tengo algo medianamente puro, pero quiero algo mas puro, al punto que este tan puro que cristalice, y si cristaliza puedo hacer difracción de rayos X para que pueda conocer la estructura, y asi vamos avanzando en el conocimiento de lo que estoy buscando. Entonces agrego la muestra arriba, y esta es una columna que tiene un relleno que interactúa con la muestra, interactúa diferencialmente con las moléculas dependiendo de su son mas grandes o mas chicas, mas cargadas o menos, mas hidrofobicas o menos, o si tiene afinidad por algún anticuerpo, estas son todas las variantes que pueden tener una cromatografia, así que esto es genérico. Esto interactua y dependiendo como interactúa, voy a ver si se va resolviéndola muestra en distintos componentes, asi como se ve en la figura artificialmente en distintos colores, significa que cada color es una proteina distinta.Podría tener una separación mas dramatica, de tal manera que al final puedo diferencialmente aislar la proteina C de la B y la A, y para lo que hago veo la concentracion de proteina versus volumen de elusión. Cuando cae un ml estoy midiendo que el tubo de ensayo que tiene 1 ml, mientras mas a la derecha tengo un goteo posterior o mas tardio que hacia la izquierda. Uno va colectando en distintos tubos, porque se esta separando. Eluir: es salir a través de un colector inferior de la columna, gotear, lo que escurre de la columna.

Entonces aquí tenemos el volumen, primero sale la proteína A, después sale la proteína B, ¿Pero cómo sé que la proteína A es A y la B es B?, por que lo único que estoy midiendo es concentración total de proteínas. La concentración total de proteínas la pueden medir a través de métodos químicos o bioquímicos, como el método de Lowry, el método de Bradford, unos se basan en el enlace peptídico, qué se yo (O_o)….. Pero uno puede medir proteínas aprovechando la propiedad de que los aminoácidos aromáticos absorben a 280nm, y

como en general todas las proteínas tienen aminoácidos aromáticos, entonces van a absorber a 280nm, y normalmente lo que obtenemos acá es una absorbancia de 280nm, o sea ultravioleta, versus volumen de elusión. Si hay DNA estamos mal, ya que el DNA absorbe más o menos en el mismo rango, pero uno podría pensar que a esa altura en que ya se ha precipitado, se hizo diálisis, la proteína está relativamente

pura y tengo pura proteína; uno podría hacer un test para ver si tengo DNA o no, y probablemente no lo tenga. ¿Entonces qué deberíamos hacer?: ver actividad biológica, y si la enzima era proteolítica, o sea capaz de romper proteínas, entonces lo que yo veo abajo es un test de actividad proteolítica, o sea veo cuánta actividad enzimática para romper proteínas tiene versus volumen de elusión; si fuera un veneno de serpiente y tiene un componente que es capaz de hidrolizar tejidos como la hialuronidasa, entonces yo haría test para la hiarulonidasa, depende de lo que quiera observar lo que quiero determinar; si yo quiero medir insulina, estoy aislando insulina, entonces haré un test biológico del efecto de la insulina en un ratón y mediré el efecto de la insulina en el ratón, como baja la glicemia lo que estoy inyectando en el ratón, esto sería un test biológico. ¿Realmente cuando uno hace el experimento (cromatografía en columna) cambia de color?: no, uno solamente ve agua, no se ve nada, salvo que sea hemoglobina que sea coloreada o que quieras purificar un pigmento como la clorofila, que no es proteína, y que es verde, se podría ver, pero en la realidad no se ve absolutamente nada, es el espectrofotómetro el que dice cuál tiene mas proteína que otro y en qué tubo está la proteína que te interesa.

Distintos tipos de cromatografía en columna

Esta la cromatografía de intercambio iónico que utiliza una propiedad del soluto que es la capacidad de adquirir ciertas cargas, la ionización, el soluto sería la proteína, por ejemplo. ¿Cuál es la fase de relleno de la columna, denominada fase sólida, la matriz que contiene moléculas que están cargadas, grupos ionizados. ¿Cuál es el solvente? Un buffer. ¿Por qué es importante usar un buffer a un pH determinado?: para que no se desnaturalice la proteína, así que uno tiene que elegir muy bien el buffer cuando está haciendo el ensayo, y la concentración de sal también y todo eso...

Filtración en gel, otra técnica. ¿Qué usa la cromatografía en gel? Tamaño y forma de la proteína. Es un gel hidratado, el solvente usualmente es agua. La cromatografía de afinidad, se basa en la afinidad por una molécula, está anclada a una fase sólida, y que va a retener a la proteína cuando esté próxima a ella, puede ser un anticuerpo por ejemplo que se va a unir a la proteína. ¿Cómo la retiene? Por que el anticuerpo estaría pegado a la columna y cuando haces fluir la proteína se queda pegada en el anticuerpo. ¿Eso sería el ligando?: sí. La última cromatografía que vamos a ver es la cromatografía de adsorción (adherencia, adhesión), que utiliza la propiedad de adsorberse. La fase sólida absorbente es usualmente material inorgánico y el solvente sería no polar. Un ejemplo de adsorción, el carbono es capaz de adsorber un sinnúmero de partículas en suspensión, por eso las pastillas para evitar la intoxicación intestinal son pastillas de carbón, que sería el mismo que ustedes obtendrían si hacen un pan tostado, lo carbonizan y se lo comen, es capaz de depurar el solvente porque se adsorben las moléculas que son tóxicas, asi que tiene esa propiedad de purificar el medio.

Entonces, veamos primero la cromatografía de intercambio iónico.

¿Y como funciona? Ustedes tienen una columna que tiene partículas, que aquí están exageradas, estas partículas son microscópicas y tienen una carga pegada, como en el caso de estas partículas que tienen carga negativa y por lo tanto ¿Qué tipo de moléculas se van a quedar pegadas en la columna?: las de carga positiva que se representan en rojo. Se agrega de todo a la columna, moléculas positivas, de carga neta negativa, de mucha carga positiva y mucha carga negativa. Cuando agrego eso y veo cómo migra, observo que las primeras que salen son muy negativas, ya que tienen poca afinidad con

la columna, la que es de carga negativa. Cuando sigue escurriendo el buffer, lo que yo obtengo en los tubos sucesivos, por que esos tubos automáticamente se van cambiando, las moléculas que eran más afín. Ahora las que se quedaron pegadas no van a salir simplemente. Las moléculas con carga neta negativa (no las de mayor carga negativa, sino simplemente negativa) van a salir después de las que tenían la mayor carga neta negativa, pero se van a quedar pegadas todas las positivas, y ahí viene el problema. ¿Cómo hago para sacar todas aquellas que se quedaron pegadas pero que tienen afinidad diferenciada? No se puede cambiar la carga de la columna por que pierde la afinidad por todas, van a salir las positivas y las muy positivas. Variamos el pH, supongan que las que quedan pegadas, quedan ahí porque son positivas, por que hay cadenas laterales de aminoácidos que están positivos. ¿Qué pasa si yo cambio el pH y tengo un pK?: cambio el estado de ionización del grupo ácido, lo puedo hacer pasar de neutro a negativo en los aminoácidos ácidos, o lo puedo hacer pasar de positivo a neutro en los aminoácidos básicos. ¿Cuáles son los ácidos?: glutámico y aspártico. Y, ¿Cuáles son los básicos?: histidina, lisina y arginina. Si yo cambio el pH cambio el estado de ionización de los grupos ionizables, y eso va a depender del pH y del pK, y eso ustedes DEBERIAN saberlo o habérselo cuestionado.. si pH es mayor que pK este grupo se disoció, si pH es menor que pK el protón está en el grupo, y si pH es igual a pK es mitad y mitad, es situación de buffer. ¿Entonces qué vamos a hacer?: vamos a cambiar los pH de tal manera que primero se vea afectado un grupo ionizable o un conjunto de grupos ionizables de una molécula y después los de la otra molécula. En buenas cuentas cada molécula va a tener un valor de pH al cual va a tener carga neta 0, el que se llama punto isoeléctrico, entonces si el pH es menor que todos los puntos isoeléctricos, ¿Cómo están ambas moléculas?: positivas, por que con cada valor de pH igual al punto isoeléctrico están neutras, y si el pH es menor, tienen un protón que las saca de la neutralidad, por lo que están positivas. ¿Qué pasa si el pH está entre los dos puntos isoeléctricos?: una molécula es positiva y la otra es negativa. Y, ¿Qué pasa si el pH es mayor que los dos puntos isoeléctricos?: ambas son negativas porque estoy aumentando el pH del medio por sobre los puntos isoeléctricos y por lo tanto las cargas son negativas porque perdieron protones. Así que si yo jugara, y aquí lo que queremos hacer es que las moléculas menos positivas dejen de serlo... ¿Las menos positivas van a tener un punto isoeléctrico mayor o menor?: menor, así al aumentar gradualmente el pH la menos positiva se vuelve negativa y se desprende de la columna. Se queda pegada la molécula muy positiva. No se puede subir el pH por sobre los dos puntos isoeléctricos por que las obtendría juntas, así que se sube gradualmente. Esto se puede hacer en vez de pH, con sal, de tal manera que subo la concentración de NaCl u otra sal, para afectar la unión entre la proteína y la columna y se despega, si la subo más se despegan las más resistentes. Pero también se hace con pH, y en la guía ustedes van a ver problemas con pH. Esta técnica, se ocupa, está vigente. ¿Cómo es la matriz de intercambio iónico?, puede ser de poliestireno entrecruzada con

divinilbenceno.

Lo importante es que estas matrices tienen pegadas cargas. Entonces ustedes tienen columnas que pueden ser de resinas diferentes a las que les dije anteriormente de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos ionizables, grupos carboxílicos que se pueden deprotonar, grupos amino

que se pueden deprotonar. Estos pasan a configuración negativa, estos pasan a estado neutro, de positivo a neutro. Y tienen nombre, la que tiene grupo carboxílico y es de celulosa se llama carboximetilcelulosa, y estas tienen cargas netas negativas, por que uno prepara la columna a un pH tal que este ionizada. Y la otra es la dietilaminoetilcelulosa, que se abrevia DEAE-celulosa, y que el pK es 9.5. ¿A qué pH esta ionizada la carboximetil si el pK es 3.5?: mayor que 3.5, así que esta columna tiene que estar preparada a un pH mayor que 3.5. Cómo es la matriz. La matriz de este cambio iónico, puede ser de poliestireno, estas moléculas que están

acá, entre cruzadas con dimetilbenceno que es lo que tienen ahí. Se compra, para que se queden tranquilos: uno se gana un proyecto, agarra un catálogo, intercambio iónico, quiero tal columna y se compra, pero hay que saber cómo funciona. Lo importante es que esas matrices tienen pegadas cargas, como les decía. Entonces, ustedes tienen columnas que pueden ser una resina diferente a las que les dije anteriormente, de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos ionizables, cómo cuáles: grupos carboxílicos que se pueden deprotonar, grupos amino que se pueden deprotonar. Estos pasan a configuración negativa, estos pasan a estado neutro, de positivo a neutro… y tienen nombre: la que tienen el grupo carboxílico y es de celulosa, se llama carboximetilcelulosa y estas tienen cargas netas negativas, porque uno prepara la columna a un pH tal que sea ionizada; la otra es la dietilaminoetilcelulosa que se abrevia DEAE-celulosa y que el pKa es 9,5.Ejercicio, a qué pH está ionizada la carboximetil si el pKa es 3,5… mayor o menor que 3,5: mayor que 3,5, ahí va a estar ionizada, así que esa columna debe estar preparada a un pH mayor que 3,5. Y la otra: 9,5 si es menor que 9,5 ¿qué carga va a tener la columna? Esta es la columna: aquí está positiva protonada, neutra deprotonada. El pKa es 9,5 y el pH es 7,0 ¿qué carga tiene esta columna? Positiva.Así que ustedes tendrán columnas, como la dietilaminoetil, que son positivas y ahí intercambian aniones… porque tiene su ión anulando la carga, puede ser cloruro, sodio, dependiendo de la columna y ese ión se va a intercambiar por la molécula (…), por ejemplo: la dietilaminoetil tiene grupos aminos positivos, pero puede tener cloruro contraponiendo sus cargas; cloruro es solvente, está disuelto en el solvente ¿qué va a suceder? Cuando agregue una proteína negativa, va a desplazar al cloruro y se va a unir a la dietilaminoetil, que es positiva. Y esta columna, intercambio un cloruro por una proteína negativa, y por lo tanto es un intercambiador de cargas negativas, sería un intercambiador aniónico. La carboximetil, es negativa por los grupos carboxílicos, los que están neutralizados por sodio que está disuelto en el

solvente; cuando paso una proteína positiva, el sodio se va a intercambiar por la proteína positiva: es un intercambiador catiónico. Por lo tanto, habrá intercambiadores aniónicos e intercambiadores

catiónicos.Veamos otro tipo de cromatografía, que es la cromatografía de exclusión. Esta cromatografía separa por tamaño, que es natural, hasta ahora no habíamos pensado en el tamaño, sólo habíamos pensado en la carga de las proteínas. Entonces imagínense que hay proteínas que tienen la misma carga y siempre van a salir en la cromatografía de intercambio iónico próxima, va a costar obtenerlas en tubos separados porque son muy parecidas, entonces miro otra propiedad: el tamaño. Ya

que, que tengan la misma carga y el mismo tamaño, es como mucha la mala suerte, pero sucede. Entonces vamos a separar por tamaño. Así que exageramos las partículas, y estas partículas están entrelazadas y son hidratadas y ahí el agua está como en pañal de guagua: está quieta el agua hidrata el gel del pañal de guagua, es decir, el agua es el gel junto con la resina que tiene, no está fluida, está como en un estado de gelatina, porque hay tantas moléculas que hidratar que el agua está más quieta que en medio acuoso ¿me entienden? Hay demasiado estorbo molecular: no es lo mismo tener moléculas de agua fluyendo entre sí, que obligarlas a interactuar con una matriz porque las moléculas de agua van a estar más quietas, pierden su libertad. Entonces, aquí tenemos un estado de gel y esta es una partícula en la cromatografía de exlusión, uno agrega una mezcla de proteínas de distinto tamaño y va viendo la elusión de las proteínas conectándola a distintos tubos. Vamos a mirar actividad y concentración de proteínas, igual que antes, pero qué va a suceder ¿cuáles creen que llegan primero abajo? Antes les digo una cosa: las partículas de gel, entre sí, establecen ciertos espacios de solvente porque hay lugares en los que las partículas no se tocan, como bolitas de ping pong, hay espacio por donde puede fluir el solvente libremente, pero al interior de la partícula que aquí está exagerada, hay gel. ¿Cuáles llegan primero? Y si me dicen cuáles, díganme por qué ¿las grandes o las chicas llegan primero abajo? Grandes ¿por qué? Las grandes se distraen menos, porque las chicas se van a meter al interior de la matriz. Significa que la grande es capaz de sortear todas las bolitas de ping pong y es capaz de pasar a través de los espacios, y las chicas se distraen. Y si yo les dijera que las chicas, como tienen acceso por tamaño a todos los lugares, no deberían ver columnas, por lo tanto las chicas deberían llegar rápido, porque tienen acceso a todos los lugares: es como que para ellas no hay resina. Yo haría casi una apuesta de, a quien le preguntasen de cromatografía de exclusión, va a decir que las chicas se demoran porque se distraen porque tienen más espacio, pero eso nunca a mí me cuadró, porque si las chicas tienen acceso a todos los lugares, deben fluir como si no hubiera resina: lo que sucede es que las chicas se meten al entramado de las partículas y ahí hay gel y ahí fluye más lento, porque el agua está gelificada, por lo tanto no hay movimiento browniano como si estuviera líquida, así es que como que ahí se sienta a descansar: la partícula entra, se atrapa y descansa. Se sienta más veces en la silla que la grande porque tiene acceso a la silla, que son las partículas de gel que están ahí.Así que salen primero las grandes, salen después las chicas.Si son más garbees ¿no deberían también ser atrapadas por esta porosidad?Es que las grandes no entran a los poros de la partícula, pasan por los intersticios, que son los espacios que habría entre las pelotas de ping pong, Ahora, habrá algunas partículas que como que entran y no entran y esas son las que salen entre las últimas y las primeras. Hay algunas que entran en algún porcentaje.Así que aquí veamos concentración de proteínas. Hay una absorción de luz de 280 nm versus los tubos de ensayo que vamos colectando: 0 mL, 50 mL si ustedes quieren; A, B, D, C. Imagínense la sensación de estar haciendo este experimento, de ser el que obtiene una proteína por primera vez, y ver dónde les sale,

en realidad es fascinante el hecho de que ustedes se están enfrentando a algo que nunca nadie ha hecho. Si ustedes quieren obtener la proteína y están midiendo actividad biológica en estos de ensayo, y se encuentran que obtienen, pero no de actividad biológica sino que de concentraciones solamente: A, B, D, C ¿cuál es más grande? ¿la A, la B, la D o la C? la A es más grande porque sale primero, la más chica es la C y después sale la B y la D. Si hay una que cabe completamente en el poro, por ejemplo la C, imagínense que la F es más chica que la C ¿dónde va a salir la F? cae junto con la C, porque la C es más chica y que entre, no tiene diferencia con las que son

más chicas y también entran, así que salen juntas. Y las que son grandes y no entran, no tienen diferencia con las que son más grandes y no entran también, así que saldrían antes… y si es una más grande que la A, y la A no cabe en los poros, entonces van a salir juntas. Lo que tiene que hacer el bioquímico es seleccionar otro gel con un rango de poro determinado para separar estas proteínas que salen juntas, porque son más grandes que el diámetro de poro que ustedes eligieron: ensayo y error.

¿Cuál es la cromatografía de afinidad? La misma técnica: un tubo, la muestra arriba, el gel abajo, si ustedes quieren obtener la proteína de interés que está en rojo, agregan un ligando, pero e también está agregado a la partícula de resina que tienen ahí, que está rellenando la columna. Por ejemplo: imagínense que es la enzima acetilcolinesterasa, útil en la sinapsis neuromotora, en la placa neuromotora ¿cierto? Y yo quiero aislarla, entonces agarro el ssutrato y lo pego covalentemente a la resina (se compra, alguien ya lo hizo y lo vende). Entonces, por lo tanto, está la resina con el sustrato, la enzima se va a pegar al sustrato y por lo tanto agrego la muestra que tiene de todo, porque hice puré el tejido neuronal y va todo ahí, pero la acetilcolinesterasa se va a pegar sobre la acetilcolina que está unida a la resina. ¿Cómo la despego inteligentemente? Agregas sustrato: agrego sustrato suelto para que compita, con el sustrato unido a la resina, por la enzima. Entonces, si agrego acetilcolina, la acetilcolinesterasa se a distraer uniéndose a ese sustrato y va a fluir con este sustrato y ya no va a estar pegada a la resina. Si quiero una proteína rara, que no es enzima y necesito de alguna manera tenerla más pura y la tengo medianamente pura: la tomo, la inyecto a un conejo, espero que el conejo genere anticuerpos, aíslo los anticuerpos del conejo, pego los anticuerpos del conejo a la resina, agrego la proteína medianamente pura sobre la columna y se me pega mucho más que las demás proteínas que son contaminantes y tengo la proteína ya no medianamente pura, sino que muy pura. Esa es una tesis de doctorado por lo menos, pero así de simple el protocolo, requiere de mucho trabajo, pero se hace.

La otra técnica que es importante, es la técnica de electroforesis, que no utiliza el tamaño de la proteína… no, no he dicho nada. Utiliza la carga de la

molécula a separar y muchas veces la carga en relación con el tamaño, porque hay una relación carga-tamaño. La electroforesis se puede realizar en gel de agarosa, generalmente se utiliza para separar DNA; la electroforesis en gel de poliacrilamida, se

utiliza para separar proteínas; electroforesis en poliacrilamida, pero con un agente que se llama SDS, ese agente lo que hace es denaturar la proteína. Y hay una electroforesis muy elegante que se llama desfocalización isoeléctrica, que es la que vamos a ver al final. ¿Cuáles son las propiedades que tiene el soluto para cada una de ellas? Las vamos a ir viendo a medida que veamos las técnicas una a una: una es carga eléctrica, carga eléctrica, tamaño y carga, la última. Y cuáles son las fases sólidas: tres soportes inertes, en el caso de las tres primeras tiene una cierta porosidad y el solvente siempre es un amortiguador, un buffer, con agua.La electroforesis, que la van a hacer en el laboratorio: ustedes agregan en el gel, en unos bolsillitos que forman, unos moldes especiales, la muestra con la micropipeta y pueden ver como migra cuando someten a un campo eléctrico esa muestra. Acá tenemos el polo positivo que se llama ánodo, y acá el polo negativo que se llama cátodo, porque uno atrae aniones y el otro cationes, no se confundan con el nombre. La movilidad electroforética de una molécula es la razón que hay entre la velocidad que ésta logra en el gel y la diferencia de potencial que hubo que aplicar, esa es la movilidad electroforética. Y se puede demostrar teóricamente que es la carga partido por un coeficiente propio de la molécula: coeficiente de roce.

Ahí tienen un ejemplo de un gel que ya fue revelado y sostiene las marcas de proteinas que ustedes pueden teñir con […] que puede marcar aminoácidos y no al gel. Ustedes ven, en una primera etapa de purificación ustedes obtienen todas estas muestras, en una segunda todas estas, estas, estas, estas y las de acá. Y acá, si se dan cuenta, cuando está proteína pura, en este caso, una RNApolimerasa ¿qué hace la RNApolimerasa? Sintetiza RNA a partir de DNA. Entonces aquí al final obtenemos una banda, otra banda: dos bandas y es que esta RNApolimerasa tiene subunidades: una, otra y las dos asociadas.[pregunta de la Aguayo]

A ver, déjame ver si te respondo la pregunta con lo que voy a decir: cuando uno pone una muestra arriba y las partículas tienen carga positiva, los que tengan mayor movilidad electroforética en relación a los positivos, o sea, en relación a los negativos, van a llegar más lejos, porque abajo está el positivos y arriba está el negativo; pero si yo, además, quiero separar sólo por tamaño, entonces voy a pintar de cargas negativas a todas las

proteínas, para separar sólo por tamaño. Y la manera de pintarlas con carga neta negativa es agregar un compuesto que es el SDS, y ese compuesto, significa, de la abreviación al castellano: dodecil sulfato de sodio, y este que está acá para los amigos: SDS. Fíjense que tiene una carga, una cabeza cargada y una cola hidrofóbica porque aquí tenemos once carbonos. Esta cola hidrofóbica se va a insertar en la

porción hidrofóbica de las proteínas y todas las proteínas tienen aminoácidos hidrofóbicos en alguna parte, la mayoría, esto es en general. Entonces se va a incrustar en la porción hidrofóbica, y si la porción hidrofóbica va hacia adentro, lo que es natural, va a dar vuelta la proteína, como quien mete la mano a un calcetín y lo tira para afuera: va a desnaturalizar la proteína. Estas proteínas están todas desnaturalizadas, y la carga negativa queda mirando hacia el solvente, es decir, van a estar todas estar cargas negativas de sulfato mirando hacia el solvente. Y caben tantas moléculas de SDS en la proteína por igual que en distintas proteínas por centímetro cuadrado. Todas van a tener la misma relación carga-tamaño, así que ya no separa más por movilidad electroforética en el sentido de carga-tamaño, sino que separa solamente por tamaño, porque todas tienen el barniz de SDS que les confiere la misma carga: algunas más negativas porque eran más grandes y otras menos negativas porque son moléculas más chicas, admiten menos moléculas de SDS. Entonces cuando tienen SDS las moléculas, la carga ya no es motivo para la separación porque todas tienen el mismo atributo: muchas cargas negativas, lo que permite que se separen es el tamaño y el gel de poliacrilamida es entrecruzado, es así, así que ¿cuáles van a llegar más lejos, las chicas o las grandes? Las chicas; y en la cromatografía de exclusión ¿cuáles llegaban más lejos? Las grandes. No hay contradicción porque aquí no hay partículas hidratadas ni con intersticios entre partículas hidratadas, aquí tenemos una trama de gel que es el gel de poliacrilamida que es un entrecruzado covalente y las más chicas pasan, las más grandes se quedan, por lo tanto, las más chicas son las de acá, al final, las más grandes son las que están acá arriba… ¿te contesto con eso la duda? Las más chicas son las que llegan más abajo, migran más rápido.

¿Qué podemos decir? Bendita técnica, porque permite separar de una manera con mucha resolución proteínas que normalmente no eran separadas por otra técnica, la cromatografía en gel de poliacrilamida. ¿Puedo separar DNA a través de esta técnica? no se usa, porque el SDS no se va a pegar al DNA, por gel de agarosa separo DNA, como les decía en la tabla.¿Qué sucede, ahora, en el ejemplo que tenemos ahí?

Ya, seguimos la próxima clase.

Vamos a ver un detalle: cómo depende el tamaño de la proteína, cómo depende la migración respecto del tamaño de la proteína… y nos queda esta diapositiva y quizás este gráfico… o lo vemos ahora.Veámoslo al tiro, si no queda nada.

Ahí ustedes tienen un gel de cromatografía de electroforesis con poliacrilamida que es con SDS, y lo que ven ustedes es que la miosina, que es la proteína del músculo, se queda arriba porque es muy grande, tiene 200.000 daltons ¿cuántos aminoácidos tiene? Dos mil. Entonces lo que podemos ver, es que llegan primero estas y las otras se van quedando atrasadas. Entonces, lo que

podríamos hacer es graficar la migración de estas moléculas respecto del logaritmo del peso molecular, y por qué el logaritmo: porque varía tanto, como ya lo vieron, que es mejor trabajar con el exponente. Grafican ustedes esto y da una línea recta, lo que permitiría, si yo tengo una molécula desconocida y sé la migración, yo grafico la migración, intercepto, interpolo y obtengo el peso molecular de la proteína. Entonces uno podría interpolar en este caso.La migración relativa es porque uno divide la migración de la más grande, la usa para dividir las migraciones de las otras, para obtener una relación entre 0 y 1, por eso, la que migra más lejos es ésta. Estas las compro y trabajo con la desconocida.

Entonces, hay otra técnica, que es la que utiliza el punto isoeléctrico de las proteínas y ustedes ven que hay proteínas que tienen cada un punto isoeléctrico diferente. Si yo agrego esas proteínas en un gel y realizo una electroforesis a un pH determinado, agrego la proteína, establezco el campo eléctrico: voy a obtenerlas separas, como aparece ahí. Pero lo que deberíamos pensar acá es que la muestra está a un pH determinado, pero la verdad es que el gel tiene un gradiente de pH, o sea que deberíamos pensar que aquí está de un mayor pH a un menor pH. ¿Dónde van a detenerse las proteínas? Cuando la carga neta sea cero: cuando la carga neta es cero, hasta ahí no más llegó la migración. Así que la banda de allá es con carga neta cero.

Entre pH 9 y 3 tú no vas a tener desnaturalización de las proteínas, pero para el caso, tú haces el estudio previo.Después tú tomas el gel que tiene todas las proteínas en banda, lo das vuelta y haces una electroforesis convencional y tiñes, y esta electroforesis es con SDS y separas por tamaño ¿qué obtuve? Fíjense que toda esta banda se me resuelve en todas estas manchas, esta banda se separó en todas estas manchas, separé por tamaño, es decir, había muchas proteínas con el mismo punto isoeléctrico y que estaban saliendo juntas, pero como ahora hago una electroforesis con SDS, separo por tamaño y por lo tanto, separo las de menor tamaño con las de mayor tamaño y me queda arriba y lo que obtengo es esto. Y esto, hay programas computacionales que lo interpretan y que les pueden decir la anomalía en una o dos manchitas y detectan una patología en el laboratorio clínico. Esto es proteómica, ahora uno puede hacer la proteómica también identificando algunos RNAm con unos chips especiales y veís cuánto RNAm estay sintetizando. Pero uno puede hacer esto y lo que estás determinando es la proteómica: es decir, qué proteínas se están expresando en ese tejido

y saber si hay alguna que está ausente o alguna presente que no debería estar. La genómica, les dije que era la Edad de Piedra, en eso estamos, en la genómica. En todo proceso de purificación interesa el grado de purificación y rendimiento, y cómo los estimamos: esta es la muestra inicial, esta es la muestra definitiva, nos interesan las bolitas rojas ¿dónde hay más bolitas rojas? Acá ¿dónde están más puras las bolitas rojas? Allá. Aquí habría un caso donde sacrificamos rendimiento por purificación. Por lo tanto, lo que nosotros queremos es que la proteína esté rodeada de proteínas iguales y saquemos las impurezas, eso significa deshacernos, en el transcurso de la purificación, de la proteína, y eso es lo que no queremos, pero a veces es inevitable. Así que allá tenemos purificación lograda, pero con un rendimiento que se ha sacrificado en cuanto a la proteína, pero para estudiarla es fabuloso, lo ideal es tenerla pura, y la etapa más eficiente de la purificación es la de focalización isoeléctrica, que ustedes vieron denante, combinada con la electroforesis de SDS, y a ambas juntas se le llama “electroforesis bidimensional”. Así que ustedes tienen tablas como estas, donde aparece la etapa de purificación, cuánto volumen mantiene, cuánta proteína total mantiene, cuánta actividad mantiene y cuál es la actividad específica, y eso se los voy a explicar.

En el caso de la alcayota, por ejemplo: teníamos diez mil miligramos, cuánta actividad: cien mil unidades; después, precipito en el sulfato de amonio, tengo 3000 miligramos, cuánta actividad: 96 mil unidades de actividad, qué obtengo: actividad específica de 32. Qué es la actividad específica:

unidades dividido por miligramos. Mientras más actividad tenga, la que sea, significa que está más puro ahí, así que nosotros vamos a obtener, en las etapas sucesivas, después del intercambio iónico, cromatografía, etcétera, obtenemos mayor actividad específica, o sea que está más pura, y el rendimiento cuál sería si tenemos 45.000 unidades y teníamos 100.000 ¿cuál sería el rendimiento? Un 45%, porque de 100, obtuve 45 unidades de actividad… la que sea, invéntese. Pero cuál es la purificación si tenía 10 por gramo y ahora tengo 15 por gramo, 15.000 por gramo… dividan: 1.500 veces más pura. En cambio al pasar del extracto puro a la precipitación por sulfato ¿cuántas veces se purificó? 3,2 veces simplemente. Así que una cosa es cuántas veces se purificó y otra es el rendimiento, y eso es importante que ustedes lo puedan entender.