citometria de flujo teor

7/31/2019 Citometria de Flujo Teor

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CITOMETRIA DE FLUJO


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Citometra de Flujo


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PARMETROS CELULARES MEDIDOS

El tamao celular relativo

La complejidad interna o granularidad relativa

Intensidades relativas de emisin de fluorescencia

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El tamao celular relativo LUZ DIFRACTADA- SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA

CELULARES-SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER

La complejidad interna o granularidad

relativa LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA-SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE

LA CELULA Y SU GRANULARIDAD

Intensidades relativas de emisin de

fluorescencia-SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ

DEL LASER

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MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOSFLUORESCENTES

Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contraantgenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantesfluorescentes.

Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismofluorocromo pero que no reconoce ninguna de las molculas de lasuperficie.

Control negativo: clulas que no fueron marcadas para determinarautofluorescencia.

Control positivo: clulas normales, clulas de lneas celulares.

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Fluorocromos utilizados

Citometra de Flujo

FL1

FL2

FL3FL4


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ANALISIS DE DATOS

Los datos colectados sepueden observar de 2maneras:

1) Histograma

Eventos

medidos

FLUORESCENCIA

Los datos colectados por el citometro los podemosanalizar de 2 maneras:

1)Histograma: Muestra cuantas celulas estan

marcadas con cierto color, y las distintasintensidades de fluorescencia de cada una.

2)Dot-plot: Muestra 2 valores a la vez, y cadapunto representa una celula individual. Sedividen en general en los 4 cuadrantes.


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HISTOGRAMA

En este grafico vemos el pico del control de isotipo (gris), que me marca loque se considera que no hay marca.Y despues veo 2 poblaciones con distinta intensidad de fluorescencia.


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Intensidad de fluorescencia y sitios deunin

Intensidad de fluorescencia FITC

Nmerodeeventos

FITC

FITC

FITC

FITCFITC

FITC

FITC

FITC

FITC FITC

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Citometra de Flujo

Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:

2) Dot-plot

1)Dot-plot: Muestra 2

valores a la vez, y cadapunto representa unacelula individual. Sedividen en general en los

4 cuadrantes.

Analisis de datos


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Linfocitos

Monocitos

Analisis de datos

Granulocitos


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Aca vemos un resultado real.Vemos una muestra de sangre periferica, dondepodemos reconocer las 3 subpoblaciones deleucocitos.Los GR y plaq son mas chicos.Las 3 poblaciones de leucocitos las reconozco

mediante dot-plot de forward-scatter.Ademas esas celulas las marque con antiCD3 yanti CD4, y veo los histogramas de CD3 y CD4.


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CD3- CD4 en sangre total CD3 CD4 en gate de linfocitos

Elijo un gate:

Ej. linfocitos


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Aca vemos marca de CD3 y CD4.Queremos saber el porcentaje deCD3 y CD4 en sangre entera (verporcentajes en cuadrantes) y en elgate de linfocitos.


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Expresin de Resultados

Datos porcentuales Datos absolutos : Partculas de cuantificacin Datos estadsticos

Quadrant Statistics

Fi le: Normal01.05 Log Data Uni ts: L inear Value

Sample ID: Patient ID:

Tube: CD3/CD8 Panel : IMK-Lymphocyte

Acqui si tio n Date: 1 5-Jun -9 5 Gate: G1

Gated Events: 2383 Total Events: 6000

X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log

Quad Location: 17, 17

Quad Event s % Gated % Total X Mean X Geo Mea Y Mean Y Geo Mea

UL 126 5.29 2.10 4.51 4.12 324.82 171.35

UR 508 21.32 8.47 268.00 249.17 2472.09 1624.51

LL 420 17.62 7.00 3.92 3.50 3.13 2.53

LR 1329 55.77 22.15 306.66 289.43 1.50 1.28

Citometra de Flujo


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EL programa tambien nos provee datosde:

-Porcentaje de celulas en el gate que yoelegi o en cada cuadrante

-El promedio de fluorescencia de ese gatepara la FL de X y para la de Y


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Separacin de clulas usando citometra de flujo(Cell sorting)

-El citmetro permite separar fsicamente,poblaciones de clulas-Se puede realizaren condiciones de esterilidad.

Citometra de Flujo

La separacion de las celulas de

interes se realiza por aplicacin deuna carga electrica a las gotas.El equipo mira la celula y si esa gotatiene una celula de interes le agregauna carga. Esa gota cargada esdeflectada por electrodos hacia el tubode coleccin.Luego uno lo que hace es volver apasar la muestra por el citometro, paradeterminar la pureza de la poblacion ysu fluorescencia.

Despus del cultivoBasal


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CFSE

X

luorescencia / clula

X / 2 X / 4

Despus del cultivoBasal

M1


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Se observan los picos querepresentan las distintas

generaciones decelulasprovenientes de laproliferacion de las celulas

parentales.


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Cytometric bead arrays (CBA)

Tonos de un color

Ac. unidos abeads, emitiendoa distintasintesidades deFL3

Varios analitos

Ac conjugados con PE

(emitiendo en FL2),proporcionales a la concdel analito.

Multiplex ensayo por CF

Citoquinas Determinacin de citoquinas secretadas por citometra


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IL-6

IL-10

MCP-1

IFN-g

TNF-a

IL-12

CBA para citoquinas inflamatorias

PBS CBE

FL-2 FL-2

FL-2: Da cuenta de la concentracin de la citoquina.

FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas.

Citoquinas Determinacin de citoquinas secretadas por citometra


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Medida de fluorescencia en clulas


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Medida de fluorescencia en clulasindividuales por citometra de flujo

Propiedades Ventajas

Es especfica de color Permite estudio

multiparamtrico simultneoEs cuantitativa con un

amplio rango de medida

Altsima sensibilidad1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel)

Altavelocidad

Mide en cantidades elevadasde clulas

Obtener conclusiones

estadsticamente fidedignas

bj ti d ibl

citometria de flujo teor

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