citometria de flujo ii
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1. CUAL FUE EL TRABAJO DE W. COULTER?
El principio Coulter de medición de volumen y recuentos de partículas se lo debemos a Wallace H. Coulter quien el año 1956 inventó el primer contador automático de células sanguíneas (1)
W. Coulter describió su método "El instrumento emplea un sistema de medición no óptico que provee un rango de medición que excede las 6.000 células individuales por segundo con un intervalo de conteo de 15 segundos. Una suspensión de células sanguíneas es pasada a través de un pequeño orificio simultáneamente con una corriente eléctrica. Las células sanguíneas individuales pasando a través del orificio producen un cambio de impedancia (resistencia) en el orificio el cual está determinado por el tamaño de la célula. El sistema cuenta las células individuales y provee distribución de tamaños. El número de células contadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscópicos, reduciendo el error estadístico aproximadamente 10 veces"(1)
Figura que muestra el
Principio Coulter
El número de pulsos eléctricos indica la cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño de los pulsos es proporcional al volumen de las partículas (2, 3, 4,5).
Los contadores modernos aún siguen usando este método, el cual es el método de referencia para recuentos de células
Los contadores COULTER realizan este recuento por triplicado para eritrocitos, leucocitos y plaquetas
Este sistema es actualmente el método de referencia para el recuento de células y es usado por todos los fabricantes de contadores celulares
El Coulter Counter Model S fue el primer instrumento que de manera automática procesó datos multiparamétricos en sangre.
2. ¿COMO SE DEFINE EL CITÓMETRO DE FLUJO?
Se define como citómetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades celulares (partículas biológicas) que fluyen en suspensión. Existen citómetros que poseen, además, la capacidad de separar partículas de forma selectiva, a partir de una suspensión líquida, denominándose "sorters".
3. ¿DESCRIBA UN CLITÓMETRO DE FLUJO?
Un citómetro de flujo tiene tres sistemas principales:
Sistema hidráulico Se compone de un conjunto de controles neumáticos y fluídicos necesarios para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo de forma estable e individual.
Sistema óptico Consta de: láser, filtros, lentes y detectores. La fuente de luz es producida normalmente por un láser (en algunos modelos, sobre todo en investigación, se combinan varias fuentes de luz).
En la mayoría de los citómetros se instala un láser de gas (comunmente argón) refrigerado por aire, que produce una luz monocromática de 488 nm. Esta luz es utilizada para la excitación de la mayoría de los fluorocromos y provoca la dispersión de luz que nos informa de las características celulares.
Sistema electrónico-informático Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su posterior análisis. La perfecta integración de estos sistemas permite un rápido y preciso análisis de un elevado número de células en poco tiempo.
4. ¿CUAL ES LA UTILIDAD DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA MEDICINA?
1. Detección y cuantificación de antígenos:Identificación de antígenos mediante anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos, que permiten la identificación y clasificación de diferentes células tanto normales como patológicas. El isotiocianato de fluoresceína, la ficoeritrina y el PerCP son los fluorocromos más empleados en el marcaje de anticuerpos monoclonales.
Todos ellos se excitan a 488 nm (luz azul) y emiten en la zona del verde, naranja y rojo, respectivamente. El citómetro mediante una compensación electrónica permite su utilización simultánea. La posibilidad de realizar un triple marcaje con diferentes anticuerpos monoclonales en una misma muestra ha permitido profundizar en el conocimiento de las diferentes poblaciones celulares estudiadas. Así, se han logrado importantes avances en el diagnóstico clínico y clasificación de leucemias y linfomas.
En otras áreas tambien se ha demostrado su utilidad como en la detección de autoanticuerpos e inmunocomplejos, en el diagnóstico de trombocitopatías adquiridas, y en la realización del test cruzado linfocitario.
1.A. Subpoblaciones linfocitarias:
La monitorización de las subpoblaciones linfocitarias en el sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), fundamentalmente la cuantificación en sangre periférica de las células CD4+ y los linfocitos CD8+, aporta un valor diagnóstico y pronóstico en esta patología En la actualidad representa una técnica de rutina en muchos laboratorios, ante la necesidad de establecer controles periódicos del número de células CD4+ en estos pacientes.En otras áreas ha demostrado su utilidad como en el diagnóstico y clasificación de las inmunodeficiecias primarias, en la monitorización de enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide.
También se ha demostrado útil en el seguimiento de la recuperación inmune trás el trasplante de médula ósea, en la identificación precoz del rechazo en pacientes que han recibido un trasplante alogénico, o en la monitorización terapeútica de los enfermos con anemia aplásica.
Por último, reseñar la utilidad de la determinación de poblaciones linfocitarias en liquidos de lavados broncoalveolares con fines diagnósticos en la sarcoidosis y en la neumonitis por hipersensibilidad. 1.B. Inmunofenotipaje de leucemias y linfomas:
El inmunofenotipaje es útil en la clasificación de las leucemias linfoblásticas agudas, así como en las crisis blásticas de los sindromes mieloproliferativos y mielodisplásicos, con implicaciones terapeúticas y pronósticas. En las leucemias mieloblásticas agudas tambien permite su clasificación.
Su utilidad es evidente en el diagnóstico de las leucemias megacarioblásticas. Además la reactividad de algunos antígenos como el CD34, CD11b y CD7 se ha relacionado con el pronóstico.
En los sindromes linfoproliferativos crónicos permite un diagnóstico diferencial rápido entre una linfocitosis reactiva y un proceso monoclonal, facilitando su diagnóstico. El triple marcaje CD19/kappa/lambda permite detectar monoclonalidad B en sangre periférica, médula ósea, ganglio o bazo.
Otro aspecto es la detección de enfermedad mínima residual en las leucemias agudas en remisión. En estos pacientes, la comprobación de la persistencia de células con fenotipos leucémicos durante el tratamiento quimioterápico o su incremento tras la remisión completa, facilita el diagnóstico precoz de recaídas. 1.C. Otras aplicaciones de la determinación de antígenos:
La detección de inmunoglobulinas humanas mediante citometría de flujo facilita el diagnóstico de diferentes enfermedades autoinmunes como la púrpura trombopénica idiopática, las anemias hemolíticas y las neutropenias autoinmunes.
La realización del test cruzado linfocitario constituye el método de mayor sensibilidad y especificidad para demostrar antes del trasplante la presencia de anticuerpos preformados dirigidos frente a antígenos HLA de clase I y II, antígenos de células del endotelio vascular y del sistema monocitario.
El diagnóstico de trombocitopatías congénitas como la enfermedad de Glanzman y el sindrome de Bernard-Soulier, mediante el hallazgo de la ausencia de expresión en la membrana plaquetaria de las glicoproteinas IIb/IIIa y Ib, respectivamente.
Otras aplicaciones son el tipaje dirigido frente al antígeno HLA-B27, la cuantificación de receptores de progesterona/célula en los tumores de mama, el recuento de células "stem" en muestras de sangre periférica y de médula ósea obtenidas para posterior trasplante.
2. Cuantificación de ADN:
Existen diferentes fluorocromos capaces de unirse al ADN celular, de ellos el yoduro de propridio y el bromuro de etidio son los más utilizados en citometría de flujo. Ambos se excitan a una longitud de onda de 488 nm y se une de forma estequiométrica a la doble cadena de ADN.
El problema es que se unen también al ARN de doble cadena lo que obliga a tratar a las células previamente con una ARNasa. La tinción con estos fluorocromos obliga a fijar o permeabilizar la membrana celular.
La cuantificación de ADN nos informa sobre la existencia o no de anomalías clonales de ADN (aneuploidias de ADN) y, por otra parte nos permite conocer la distribución de una población celular determinada a lo largo de las distintas fases del ciclo celular. En el área de la patología tumoral contribuye al diagnóstico y a la valoración pronóstica de estos pacientes. Los principales usos clínicos en tumores sólidos son:
1. Ayudar en el diagnóstico de malignidad cuando los cambios morfológicos son equívocos. 2. Subclasficar las lesiones de baja malignidad ("borderline"). 3. Aportar información pronóstica de valor independiente al estadio y grado. 4. Monitorizar la respuesta al tratamiento. 5. Valorar la posibilidad de recidiva. 6. Establecer el origen síncrono o metácrono de los tumores.
Hoy día se sabe que la presencia de aneuploidía (cantidad no diploide de ADN) constituye un factor pronóstico adverso en la gran mayoría de los tumores sólidos y hemopatías malignas, con excepción del neuroblastoma, el rabdomiosarcoma y la leucemia linfoblástica aguda del niño en los que condiciona una mejor evolución. Así mismo, se ha observado en algunos
estudios que la existencia de una elevada tasa proliferativa en tumores sólidos y en hemopatías malignas se asocia con una supervivencia más corta.
Aquí son excepción los síndromes mielodisplásicos donde la existencia de una mayor proporción de células en fase S (síntesis) en la médula ósea se asocia con un mejor pronóstico. El empleo combinado de cuantificación de ADN y marcaje para diferentes antígenos de células tumorales y/o oncoproteínas permite la identificación y cálculo selectivo del ciclo celular de la población neoplásica.
3. Cuantificación de ARN:
La cuantificación de ARN con fluorocromos como el naranja de tiazol, la tioflavina T o la pironina Y se utiliza como técnica de rutina en el recuento de reticulocitos y en general en la producción celular de la médula ósea. Además la citometría de flujo proporciona información sobre el contenido de ARN de cada reticulocito dato que indica su estadío madurativo.
4. Otras aplicaciones de la citometría de flujo:
El cariotipo de flujo representa un complemento y una alternativa a los métodos clásicos de estudio de los cromosomas en metafase. Los cromosomas se aislan a partir de preparaciones en metafase y se tiñen con fluorocromos. Los cromosomas en suspensión se analizan pasando de uno en uno por delante de la fuente de luz del citómetro. Permite la detección de anomalías cromosómicas. La separación de cromosomas permite purificar cromosomas en relación con su intensidad de fluorescencia o contenido en ADN. Es de utilidad en la realización de mapeo genético y en la producción de librerias de ADN recombinante.
La utilización conjunta de hibridación in situ por métodos fluorescentes y de la citometría de flujo permite una cuantificación rápida y precisa de distintas proteínas a estudiar como es el caso de la P-glicoproteina y del gen MDR1 en los fenómenos de resistencia a multidrogas de células tumorales.
La citometría de flujo, utilizando yoduro de propridio, también permite realizar cuantificación de células en situación de apoptosis (muerte celular inducida). Esta técnica se ha utilizado para estudiar células CD4+ de pacientes VIH+ con una alta tasa de apoptosis.
5. ¿CUÁLES SON LAS MUESTRAS QUE SE UTILIZAN?
La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de células o partículas en suspensión. Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología y medicina y son la identificación de antígenos celulares mediante técnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular. La CMF se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos:
En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de médula ósea.
En farmacología: estudios de cinética celular. En inmunología: subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulación linfocitaria. En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento. En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos. En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.
6. QUE SON FLUOROCROMOS Y PARA QUE SE UTILIZAN?
Son productos químicos que al ser estimulados con fotones con longitud de onda comprendida entre determinados rangos (de excitación) emiten a su vez otro fotón de longitud de onda mayor (de emisión). El prototipo es la fluoresceína que al ser estimulada con luz ultravioleta (no visible) emite luz de color verde (visible) aunque existen muchos otros como picoeritrina, rodamina, rojo de texas etc.
Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la estructura, función y vitalidad de las células.
En citometría, el fluorocromo ideal debería tener un alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación (probabilidad de absorber la luz), un alto rendimiento cuántico (emisión de luz), una elevada fotoestabilidad y un corto estado de excitación. Si el fluorocromo va unido a otra molécula, por ejemplo un anticuerpo monoclonal que le confiera especificidad de marcaje, debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente.
1.- Marcadores fluorescentes de unión covalente:
Se utilizan para marcaje de proteínas, lípidos o bién otras moléculas biológicas. El más empleado es el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Otros que se han descrito son rodamina, rojo texas, cianinas y ficoeritrina. Este último se utiliza mucho porque, tras ser excitado a 488 nm, emite más allá del espectro de la fluoresceína, permitiéndo el doble análisis con un sólo láser.
2.- Marcadores fluorescentes de unión no covalente:
Marcadores del contenido en ADN y ARN: Hoechst, DAPI, DIPI, cromomicina A3, mitramicina, naranja de acridina, y otros. De uso común es el yoduro de propidio, que se excita con un láser de 488 nm y se une al ADN por intercalación entre la doble cadena de bases.
Marcadores de potencial de membrana: cianinas y RH 123. También se utilizan para marcaje de mitocondrias, dado la alta diferencia de potencial de su membrana.
Otros fluorocromos: fluorocromos que se utilizan para estudiar la actividad de bombas de membrana, receptores celulares o actividad enzimática. Se emplean sustancias fluorescentes que se acumulan en el interior celular o que cambian su capacidad fluorescente o espectro de emisión/excitación por acción sobre ellas de un proteinas que las expulsan o introducen en las células o que ejercen sobre ellas una acción enzimática.
3.- Marcadores fluorescentes sensibles al microambiente:
Pueden ser empleados para estimar las propiedades del ambiente en que se encuentran, puesto que varían su espectro de absorción o emisión en función de las características del microambiente que les rodea o de la concentración que se alcanza. Se emplean para determinar diferentes estados funcionales: pH, calcio, potencial red-ox, actividad enzimática, cinética de fármacos y función de P-gp 170.
7. ¿CUALES SON LOS PAREMTRO MEDIDOS POR CMF?
Consecuentemente los parámetros medidos son: Eritrocitos (RBC), Leucocitos (WBC), Plaquetas (PLT) y Hemoglobina (Hgb)
Los parámetros derivados de las mediciones de volumen: Volumen corpuscular medio (VCM), Ancho de distribución eritrocitaria (ADE) y Volumen plaquetario medio (VPM)Los parámetros calculados son: Hematocrito (Hct), Hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración corpuscular media (CHCM
8. ¿COMO SE HACE EL ANÁLISIS DE DATOS?
La suspensión celular es preparada previamente con anticuerpos monoclonales conjugados con diferentes fluorocromos (FITC, PE, PerCP, PECy5, APC, etc.) y es introducida en el sistema hidráulico de manera que las células atraviesen individualmente la cámara de flujo, donde el haz del laser intercepta las células.
El contacto del haz del láser con una célula produce dos tipos diferentes de dispersión: frontal y lateral (90º).
La dispersión frontal (Forward Scatter,A) nos da información acerca del tamaño celular, mientras que la dispersión lateral (Side Scatter,B) nos informa de la complejidad celular.
Los anticuerpos monoclonales adheridos a la superficie celular son a la vez excitados por la luz del láser y generan fluorescencias que son recogidas por fotomultiplicadores (hasta 4 fluorescencias actualmente) que transforman la señal óptica en electrica, enviándose toda la información al sistema informático para su análisis.
Figura 1- De forma esquemática, las células teñidas entran en la cámara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por un sistema informático.
OBJETIVOS.
Adquirir conocimientos sobre la técnica medición de volumen y recuentos
de partículas, CMF.
Conocer las partes y el análisis de datos de CMF.
Conocer Las Aplicaciones De Citómetro De Flujo
Entender el funcionamiento del la citometría de flujo
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA
DE FLUJO, CMF.
LABORATORIO DE INMUNÓLOGIA.
PRESENTADO A:
Dra. MARIA LOURDES ÁLVAREZ G.
UNIVESITARIA DE SANTANDER.
BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO.
CÚCUTA.
2004 - A.
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA
DE FLUJO, CMF.
LABORATORIO DE INMUNÓLOGIA.
PRESENTADO A:
Dra. MARIA LOURDES ÁLVAREZ G.
PRESENTADO POR:
LEIDY YUDITH ANGARITA BAUTISTA
CODIGO: 02171043.
ANDREA PORTILLO GALVIZ
CODIGO: 02171046
UNIVESITARIA DE SANTANDER.
BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO.
CÚCUTA.
2004 – A.
BIBLIOGRAFÍA.
www.galenica.cl/productos_inmunologia.html
http://www.opolanco.es/Apat/Boletin2/CITOFLUJO.htm
http://www.udl.es/dept/medicina/dept/cmfhtml
http://www.country.cnb.uam.es/
http://citometria.furebtip.org/cast/manual.htm
CONCLUCIONES.
La técnica de citometria de flujo es muy específico y se obtienen resultados
más exactos.
El procedimiento de La citometria de flujo tiene aplicaciones en
hematología: farmacología, inmunología, oncología, microbiología y
genética.
La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y
funcionales de células o partículas en suspensión.