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Reconocimiento "in vivo”por Inmunogammagrafía de tumores de origen epitelial con los Anticuerpos Monoclonales ior c5, ior egf/r3y hR3
humanizado.
Trabajo de Tesis para optar por el grado de Dr. en Ciencias de la Salud
Autora: Lie. Mayra Ramos Suzarte.
Tutora: Dra. Teresita Rodríguez Obaya
Ciudad de la Habana
2003
Centro de Inmunología Molecular
“La ciencia no tiene calzadas reales, quien intente escalar sus luminosas cumbres, deberá hacerlo por senderos escabrosos"
Karl Marx
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, agradezco a mi esposo Julio Oscar, el apoyo incondicional, la confianza y
comprensión que siempre tuvo en mí y el entusiasmo que siempre le imprimió a este trabajo,
sus horas de desvelo y dedicación hicieron posible la culminación del mismo.
A mis hijos, a los cuales les he querido dejar como ejemplo que con esfuerzo y perseverancia
se logran todas las metas que nos propongamos en la vida, por muy difíciles que resulten, por
quienes me esfuerzo cada día por ser mejor.
Al Dr. Agustín Lage y al Dr. Rolando Pérez, quienes confiaron en mí desde el primer momento
y me impulsaron a completar la investigación hasta el final, les agradezco sus consejos y
exigencias científicas con las que me ayudaron a madurar profesionalmente.
A mi tutora Dra. Teresita Rodríguez Obaya, quien a pesar de estar comprometida con otras
tutorías, le a dedicado parte de su tiempo a esta investigación desde hace varios años, quien me
ayudó a integrar los datos clínicos con la interpretación molecular que se presentan en este
trabajo, teniendo una visión más profunda de un fenómeno aparentemente sencillo, el
Diagnóstico por Inmunogammagrafía.
A los Drs. Juan Perfecto Oliva y Nelson Rodríguez Mesa, especialistas en Medicina Nuclear,
quienes me permitieron entrar en este complejo mundo de la Imagenología por Emisión de
Radiaciones, con quienes aprendí a analizar una imagen inmunogammagráfica y siempre
estuvieron dispuestos a discutir y profundizar en los resultados de los pacientes que se
evaluaban.
A mis compañeros de grupo y muy especialmente a la Dra. Tania Crombet Ramos, en quien
encontré un ejemplo profesional, una amiga y una hermana, quien me compulsó a terminar en
tiempo y me demostró que siempre que se quiere, se puede, a pesar de las dificultades.
A la Dra. Alina Alerm, especialista en Inmunología y a la Dra. Irene Rodríguez, especialista en
Histología del ISCM Victoria de Girón quienes hicieron suyo este trabajo, revisándolo
minuciosamente y contribuyendo con sus consejos a perfeccionarlo.
Y por último, un espacio especial a nuestra Revolución, donde todos tenemos oportunidad de
llegar cada vez más lejos en el escabroso camino de la ciencia, sin distinción de etnia o sexo,
sólo con la confianza en el ser humano.
A mi comprensivo esposo Julio Oscar. A Jorge Daniel y Julio Adrián, mis hijos queridos. A mi abuela, a mis padres. A la memoria de mi abuelo Jorge.
SINTESIS.
En Cuba se han desarrollado Anticuerpos Monoclonales (AcM) que reconocen con alta
afinidad antígenos tumor asociados. El objetivo de este trabajo fue demostrar que los AcM
murinos ior c5, ior egf/r3 y el AcM humanizado hR3 pueden reconocer tumores de origen
epitelial por Inmunogammagrafía. Se estudiaron durante 1992-1999, pacientes entre 18 y 85
años de edad, de cualquier sexo y etnia, portadores de tumores de origen epitelial. Los AcM
fueron marcados previamente con 99mTc con una eficiencia superior al 95 %. Se evaluaron
301 pacientes: 148 con el AcM ior egf/r3, 14 con el hR3, 59 con el ior c5 y 80 combinado en el
mismo paciente los AcMs ior c5 e ior cea 1. Se suministró la dosis prevista por vía endovenosa
en forma de bolo y se tomaron imágenes inmunogammagráficas anteriores y posteriores de
tórax, pelvis y abdomen a los siguientes tiempos: 1,2, 4 y 24 horas posteriores a la
administración el radiofármaco. La sensibilidad y la precisión diagnóstica fue superior al 80 %.
No se encontraron lesiones falsas positivas. No se detectaron eventos adversos. Los AcMs ior
c5, ior egf/r3 y hR3 son útiles en el diagnóstico de los tumores primarios de origen epitelial,
sus metástasis y recidivas post quirúrgicas. Está tecnología se convierte en una "prueba de
concepto" para la inmunoterapia con estos AcM.
Indice
1 Introducción 1 1.1 Anticuerpos monoclonales para el diagnósticos por 1.2 Imunogammagrafía 1 1 2 Estrategia en Cuba 4 1.3 Hipótesis de Trabajo 7 1.4 Objetivos 7 1.5 Novedad Científica de los Resultados. Aplicabilidad 8 1.6 Consideraciones finales 10 2 Revisión Bibliográfica 11 2.1 Anticuerpos Monoclonales y el cáncer 11 2.2 Radiomarcaje de Anticuerpos monoclonales 17 2.3 Modelo EGF.rEGF y su relación con el cáncer 23 2.4 Antigenos tumor asociados al cáncer de colon 29 2.5 Estado actual de la competencia en cuanto a AcM para el 34
radioinunodiagnóstico 3. Materiales y Métodos 35 3.1 Pacientes Evaluados 35 3.2 Método de mareaje y control de la pureza radioquímica 38 3.3 Inmunogammagrafía 41 3.4 Respuesta Humana contra el anticuerpo murino 46 3.5 Anticuerpos Monoclonales 47 3.6 Administración del Radiofármaco y diseño clínico del estudio 48 3.7 Evaluación de la eficacia y estadística 51 4. Resultados 55 4.1 Anticuerpos Monoclonales anti receptor del factor de crecimiento 55
epidérmico. 4.2. Anticuerpos Monoclonales contra antígenos asociados la cáncer 67 de colon. 5. Discusión. 76 5.1 Anticuerpos Monoclonales anti receptor del factor de crecimiento 76
epidérmico 5.2 Anticuerpos monoclonales contra antígenos asociados la cáncer 89
de colon. 6 Conclusiones Generales 107 7 Recomendaciones 8 Referencias Bibliográficas 110 9 Autobibliografía 143
Anexos
Abreviaturas: Por orden alfabético. 1. 2-ME: 2-mercaptoetanol 2. 99Mo: Molibdeno-99 3. 99mTc: tecnecio 99 metestable. 4. Ac: Anticuerpo 5. AcM : anticuerpo monoclonal. 6. AcMs: anticuerpos monoclonales 7. ADN: ácido desoxirribonucléico 8. ARNm: ácido ribonucléico mensajero 9. ATP: Trifosfato de adenosina. 10. CAM: Molécula de adhesión celular 11. CDR: Regiones Determinantes coplementarias 12. CEA: antigeno carcinoembrionario. 13. CECMED: Centro Estatal de Control de Medicamentos 14. CIM: Centro de Inmunología Molecular. 15. E: Especificidad. 16. EGF: Factor de Crecimiento epidérmico. 17. ELISA: Ensayo Inmunoenzimático de fase solida. 18. FN: Falso Negativo 19. FP: Falso Positivo. 20. HAMA: respuesta humana contra anticuerpos murinos (human antimurine antibody). 21. Ig: inmunoglobulina. 22. Igs: inmunoglobulínas. 23. InGG: inmunogammagrafía. 24. ITLC: cromatografía instantánea en capa fina. 25. Ka: Constante de afinidad. 26. Kd.: Constante de disociación. 27. MDP: Metilén Difosfonato 28. NCA: Antígeno no específico del colon 29. P: Precisión. 30. PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetas. 31. PET : Tomografía de emisión de positrones 32. PM. Peso Molecular. 33. PSG: Proteína específica del embarazo. 34. r-EGF: receptor del factor de crecimiento epidérmico. 35. RAID: Radioinmunodiagnóstico. 36. RAIT: Radioinmunoterapia 37. rFN: receptor para la fíbronectina 38. RMN: Resonancia Magnética Nuclear. 39. S: Sensibilidad. 40. SDS: Duodecil Sulfato de Sodio. 41. SPECT: Tomografía Computarizada de Emisión Simple de fotones. 42. TAC: Tomografía Axial Computarizada. 43. TGF: Factor de Crecimiento transformante 44. US: Ultrasonido. 45. VN: Verdadero Negativo. 46. VP: Verdadero Positivo 47 VPN: Valor Predictivo Negativo 48. VPP: Valor Perdictivo Positivo. 49. xR: rayos X.
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1.- INTRODUCCIÓN.
1.1. Anticuerpos Monoclonales en el Diagnóstico por Inmunogammagrafía.
Anualmente en el mundo mueren más de 5 millones de personas a causa de los tumores malignos. La
brusca disminución de la mortalidad por enfermedades infectocontagiosas y otras enfermedades, ha
colocado al cáncer entre las cinco primeras causas de muerte a nivel mundial en el último decenio del siglo
XX. En los Estados Unidos, 560 000 personas mueren cada año por esta enfermedad, con un costo superior
a los 107 billones de dólares (Parker SL y cols., 1996; Sheryl L y cols., 1996).
Estadísticas mostradas en el año 2001 por el Registro Nacional de Cáncer Cubano, evidencian que el
cáncer, es la segunda causa de muerte en Cuba para todos los grupos etáreos desde 1958, reportándose 15
690 casos en 1998, superada sólo por las enfermedades cardiovasculares con 21 467 casos. Cada año se
diagnostican entre 20 000 y 25 000 nuevos casos y fallecen por esta causa entre 13 000 y 14 000 personas.
Dentro de los tumores malignos, las localizaciones como pulmón y mama han mostrado las mayores
incidencias, con una tasa por 100 000 habitantes de 31.92 y 17.72 respectivamente (7 118 y 3 952 casos
anuales por localización). Los tumores de colon también ocupan una elevada incidencia, siendo su tasa de
13.3 con un número de casos de 2 928 en el año 1998. Los tumores de origen epitelial resultan los más
comunes.
En el tratamiento del cáncer se han logrado adelantos significativos, aplicando métodos convencionales de
cirugía, radioterapia y quimioterapia o combinación de estas, además de los procedimientos más recientes
de radioinmunoterapia y manipulación genética (Tennvall J y cois., 1998, Petit AM y cols., 1997). Un
factor clave que determina el desenlace final del
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paciente oncológico sigue siendo el diagnóstico precoz, no sólo del tumor primario, sino de las metástasis
y las recidivas post quirúrgicas, las cuales, en la mayoría de los casos, son las que causan la muerte en
menor tiempo por una acelerada progresión de la enfermedad, disminuyendo la calidad de vida del
paciente. Por esta razón se hace necesario contar con métodos de diagnóstico efectivos que permita
identificar las lesiones malignas lo más temprano posible.
En la década de los 80, se pensó que el uso de los marcadores tumorales para el diagnóstico "In vitro" del
cáncer, resultaría una técnica poco invasiva y efectiva (Go VLW y cols., 1976, Pressmar K y cols, 1990).
La gran mayoría de los marcadores tumorales, no son específicos para un órgano o un tipo de enfermedad,
no siendo además, exclusivos de enfermedades malignas, por lo que la información que aporta no es
coincidente con el estado real del paciente en todos los casos estudiados.
Los métodos clásicos empleados para visualizar los tumores involucran los rayos X, el ultrasonido y la
resonancia magnética nuclear. Todos en general, adolecen de la posibilidad de reconocer la lesión tumoral
desde el punto de vista funcional. Si bien es cierto que anatómicamente pueden mostrar la presencia de una
lesión anómala, no muestran el carácter maligno de la misma y en algunas ocasiones estas lesiones son
benignas o son artefactos imagenológicos.
A mediados del siglo pasado, se habló por primera vez acerca de la posibilidad de marcar anticuerpos
policlonales producidos contra determinados antígenos tumor asociados, con radioisótopos, para detectar
tumores malignos en algunas especies animales, acoplando la mezcla de inmunoglobulinas (Igs)
purificadas con iodo radiactivo, pero este material
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resultaba limitado y los experimentos poco reproducibles, una vez que se cambiaba el lote de Ig o de
animales productores, cambiaba la respuesta esperada (Presmar K y cols., 1990).
La tecnología de hibridomas establecida por Kóhler y Milstein en 1975, para la obtención de anticuerpos
monoclonales (AcMs), brindó una poderosa herramienta para el posterior desarrollo del diagnóstico y la
terapia del cáncer. La posibilidad de seleccionar AcM de elevada afinidad y especificidad por antígenos
tumor-asociados (Gold P y cols., 1965, Koprowski H y cols, 1979) ha generado un gran interés no sólo
para el diagnóstico in vitro sino también in vivo de lesiones tumorales.
La posibilidad de "fabricar " biomoléculas que reconocieran con alta especificidad y capacidad de
enlazamiento a antígenos asociados a los tumores, hizo pensar en acoplarlas a isótopos radioactivos para
ser utilizadas como radioinmunolocalizadores de las lesiones malignas que presentaran el antígeno
evaluado. Los AcMs han resultado de gran utilidad en el diagnóstico clínico por inmunogammagrafia
(InGG) de diferentes enfermedades, desde que los mismos fueron introducidos en las técnicas de Medicina
Nuclear (Goldenberg DM y cois., 1989). En estas aplicaciones el Tecnecio-99 metaestable (99mTc)
(Hnatowich DJ,1990, Goldemberg DM ,1990), ha desplazado a otros radioisótopos como el iodo por su
inocuidad ( Epenetos AA, 1986), pero en general esta tecnología se ha extendido a nivel mundial por las
ventajas que ofrece de poder visualizar a través de toda la extensión corporal, en una única prueba
diagnóstica, posibles metástasis y recidivas relacionadas con el marcador empleado, en algunas ocasiones,
no identificada previamente por otros métodos, con alta especificidad y sensibilidad (Britton KE y cois.,
1996, Oliva JP y cols., 1999, Pikas L y cols., 1999, Oriuchi N y cols., 1999, Avital S y cols., 2000). Por
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tales motivos, muchos investigadores dedican grandes esfuerzos en la búsqueda de nuevos y eficientes
anticuerpos que reconozcan antígenos tumor asociados, ya no sólo pensando en su posibilidad diagnóstica,
sino para su uso en la radioinmunoterapia, dirigiendo la radioactividad directamente a la lesión tumoral,
guiada en este caso por el AcM ( Riva P y cols., 1998, Goldemberg D y cols., 1998, Alan F y cols., 1999,
Siriseiro R y cols., 2000).
1.2. Estrategia en Cuba.
A principio de la década de los 80 se comienza a desarrollar en Cuba, en el Instituto Nacional de
Oncología y Radiobiología, AcMs dirigidos contra antígenos tumor asociados para el tratamiento de los
mismos ya fuera por radioinmunoterapia o inmunoterapia pasiva o activa. De esta manera se trabajó en dos
blancos fundamentales: El Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (r-EGF) y los antígenos
asociados al Cáncer de Colon.
1.2.1. Sistema EGF/r-EGF
Se conoce que el r-EGF es una proteína transmembranal que media el efecto mitogénico en las células
epiteliales. Esta sobre expresado en un amplio rango de tumores humanos incluyendo cáncer de pulmón de
células no pequeñas ( Brabender J y cols., 2001, Nicholson RI y cols., 2001), astrocitomas (FeldKaamp M
y cols., 1997), tumores de cabeza y cuello (Dessonoville O, 1993), ovario (Alper O y cols.y cols., 2001),
cervix (Bianco C y cols., 2000), vejiga (Chown H y cols., 2001) y esófago (Inada S y cols., 1999), mama
(Pérez R and Lage A., 1884, Ríos MA y cols., 1992), próstata (Ware JL y cols., 1993), tracto digestivo
(Lida A y cols, 1995, gliomas (Stragliotto G y cols, 1996). Este ha sido asociado con el alto grado de
malignidad y el mal pronóstico del paciente con cáncer.
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Más recientemente, la expresión del r-EGF se ha correlacionado con alteraciones en la progresión del ciclo
celular (Giordano A y cols., 1998), incremento de la capacidad invasiva (Damstrupl L y cols., 1998),
angiogénesis ( Petit AM y cols, 1997) y disminución de la apoptosis (Gigson S y cols., 1999, Mendelson J
y cols., 2000) en las células tumorales, convirtiéndose en un blanco atrayente para el diagnóstico y la
terapia de estos tipos de tumores. Existen numerosas evidencias experimentales que apuntan a la relación
existente entre el sistema EGF/r-EGF y el cáncer (Anzano, MA y cols., 1983, Ullrich A y cols., 1984, Rios
MA y cols, 1988, Macias A y cols, 1991).
En 1989 Fernández y colaboradores obtuvieron el AcM ior egf/r3 el cual reconocía el receptor del Factor
de Crecimiento Epidérmico (r EGF), convirtiéndose este en una herramienta para el análisis de la
expresión de este receptor en diversas enfermedades tumorales de origen epitelial. (Ríos MA y cols.,
1992).
1.2.2. Sistema Antígeno IORC2: AcM ior c5.
Existen numerosos AcM dirigidos contra antígenos asociados al cáncer colorectal. El más conocido, el
antígeno carcinoembrionario (CEA), clasificado como una familia de isoantígenos, compuesto por
glicoproteínas (Schumann D y cois., 2001), que muestra un marcado reconocimiento en adenocarcinomas
de colon y ovario. Ensayos clínicos realizados en pacientes portadores de cáncer colorrectal, demostraron
la posibilidad de detectar el tumor con AcMs generados contra este antígeno y marcados con isótopos
radioactivos (Oliva JP y cols. 1993, 1995). Más recientemente, se reportó por Vázquez AM. y
colaboradores (1993, 1994) un nuevo antígeno glicoproteico asociado al cáncer colorrectal: el IOR C2, que
presenta un patrón de reconocimiento diferencial en tejido
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tumoral con respecto al tejido normal, identificado a través del empleo de AcM ( AcM ior c5) generados
contra la línea celular SW1116 originada de un tumor de colon. Por las características de reconocimiento
inmunohistoquímico del AcM ior c5 a su antígeno in vitro, se pensó en la posibilidad de acoplarlo al
99mTc para el radioinmunodiagnóstico de metástasis y recidivas de tumores colorrectales (Vázquez AM y
cois., 1992, 1994)
Como se ha descrito en la literatura (Schumann D y cois., 2001) los AcMs, a diferencia de los citostáticos,
actúan independientes del ciclo celular, su acción viene dada por la unión especifica a estructuras
moleculares presentes en la superficie de la célula, esto lo hacen altamente electivos incluso en lesiones
micrometastásicas, donde los “ nidos celulares “ generalmente están en estado de hibernación y son
resistentes a los agentes quimioterapéuticos, sin embargo pueden ser "descubiertos" por AcM que
reconozcan los antígenos que están en su superficie, contra los cuales han sido generados.
El Centro de Inmunología Molecular cuenta en la actualidad con un panel de AcMs que reconocen
antígenos tumor asociado, presentes en los tumores de origen epitelial. Entre ellos se encuentran:
ior cea 1: Reconoce el antígeno carcinoembrionario.
ior egf7r3: Reconoce específicamente el r-EGF.
hR3: Versión humanizada del ior egf/r3 con similar reconocimiento.
ior c5: Reconoce la glicoproteína IOR C2.
La ausencia de estudios “in vivo” acerca de la capacidad de esos AcM para reconocer esos blancos
tumorales y teniendo en consideración la necesidad de un fármaco para el diagnóstico efectivo “in vivo”de
los tumores de origen epitelial, nos hizo plantear la siguiente hipótesis de trabajo.
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1.3. Hipótesis de trabajo:
Los AcMs ior c5, ior egf/r3 y hR3, marcados con Tecnecio 99 metaestable, reconocen " in vivo" los
tumores epiteliales con una sensibilidad y precisión superior al 80%, un valor predictivo positivo y una
especificidad mayor del 90 %.
1.4. OBJETIVOS
1.4.1. - Objetivo General.
Demostrar que los anticuerpos monoclonales ior c5, ior egf/r3 y hR3 pueden reconocer las lesiones
neoplásicas primarias, sus recidivas post quirúrgicas y metástasis.
1.4.2. Objetivos específicos.
1. Evaluar la sensibilidad, precisión, valor predictivo positivo y la especificidad del AcM murino ior
egf7r3 y del AcM humanizado hR3 para reconocer “ in vivo”, tumores de origen epitelial, sus metástasis y
recidivas localizados en cabeza y cuello, en el cerebro, el pulmón, la mama y el Tracto Digestivo.
2. Evaluar la sensibilidad, precisión, valor predictivo positivo y la especificidad del AcM murino ior c5
para detectar tumores colorrectales de origen epitelial, sus metástasis y recidivas.
3. Estimar si existen diferencias entre los AcM ior c5 e ior ceal para reconocer “in vivo” el antígeno
carcinoembrionario y el antígeno IOR C2 en tumores colorrectales de origen epitelial.
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4. Evaluar la aparición de anticuerpos humanos contra las inmunoglobulinas de ratón, respuesta
HAMA (Human antimurine antibody), después de tratados los pacientes con los AcMs de origen
murino
1.5. - Novedad Científica de los resultados. Aplicabilidad.
• Estas formulaciones han sido registradas como medicamentos en el país y su comercialización
internacional.
• Se establece con esta tecnología el concepto de evaluación "in vivo" del reconocimiento específico de
los AcMs a tumores de origen epitelial, como posible criterio para la inclusión de los pacientes
positivos a la InGG en una estrategia terapéutica con este, ya sea en inmunoterapia pasiva, activa o
radioimmunoterapia
• Por primera vez se demuestra la eficiencia diagnóstica de un AcM humanizado en Cuba, el hR3, que
abre el camino para su empleo en la inmunoterapia del cáncer.
• Este trabajo ha permitido profundizar en la biología del tumor "in vivo" demostrándose una clara
diferencia entre los tumores de tipo adenocarcinomas y carcinomas epidermoides no previamente
reportada en la literatura.
• No se había reportado con anterioridad un estudio "in vivo" que evidenciara que la expresión del
receptor de egf en las metástasis es un indicador de mal pronóstico de la enfermedad. La activación
autocrina de sobre-expresión del receptor de EGF en células tumorales, se convierte en una función
"tumor específica" en estos tumores, relacionada además con la malignidad. Las imágenes
inmunoganmagráficas mostradas por el AcM murino y humanizado anti receptor del EGF, dan clara
evidencia de la correlación entre
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malignidad y expresión de este marcador, aspecto sólo estudiado por técnicas de histopatología. El mal
pronóstico de la enfermedad frente a la alta expresión del receptor se constata con la detección de
metástasis no identificadas por otros métodos imagenológicos en estadios muy incipientes por la InGG.
• La formulación liofilizada del anticuerpo murino ior-egf/r3 lista para el mareaje con tecnecio-99m,
recibió el Registro de Medicamento (avalado por los resultados clínicos del presente trabajo), por la
Agencia Reguladora Cubana: Centro Estatal Para el Control de los Medicamentos (CECMED) en
1999, DiaCIM® R3 (Registro No. 1051).
• Las evidencias clínicas mostradas por el presente trabajo de reconocimiento "in vivo” de tumores de
origen epitelial fueron cruciales para avalar los resultados de estudios preclínicos de bloqueo del
receptor de egf por parte del hR3 humanizado. Los resultados mostrados en el presente trabajo
facilitaron la aprobación por parte del CECMED, de la ejecución de cuatro ensayos clínicos en
pacientes con tumores de origen epitelial: cabeza y cuello (2), gliomas en estadios avanzados (1) y
radioinmunoterapia con el hR3 marcado con 188Re tumores cerebrales. En estos ensayos se ha
constatado la acción terapéutica de este AcM, encontrando pacientes con remisiones parciales y
completas de la lesión. El 15 de Febrero del 2002 se concedió un Registro Temporal por parte de la
Agencia Regulatoria Cubana (CECMED) para el uso en la terapia de tumores de origen epitelial de
Cabeza y Cuello del AcM humanizado hR3.
• Con este trabajo demostramos la eficacia diagnóstica de un AcM sin precedente en la literatura
mundial, para ser utilizado en InGG, el AcM murino ior c5, que reconoce un antígeno tumor asociado
al cáncer colorrectal, glicoproteína de 170 -190: IORC2,
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demostrándose alta especificidad, precisión y sensibilidad de reconocimiento frente al tejido tumoral
• Se obtiene por primera vez "in vivo" (en pacientes con cáncer), evidencias del fenómeno de
transmodulación en la biología del tumor al ser administrado en un mismo individuo AcMs que
reconocen antígenos diferentes: CEA e IOR C2.
• Con este trabajo se constata que el Diagnóstico por Inmunoganmagrafia con AcMs es una prueba de
concepto que da un criterio real de la utilidad terapéutica de estas biomoléculas por su capacidad de
llegar, acumularse en el tumor y desestabilizar su autonomía biológica. La experiencia alcanzada ha
sido útil para seleccionar el AcM adecuado, para la terapia correcta en el paciente a ser tratado y sentó
pautas para el empleo de nuevos AcMs en el diagnostico de tumores.
1.6. - Consideraciones finales.
La presente tesis está compuesta por los siguientes capítulos: Introducción, Revisión bibliográfica,
Materiales y Métodos, Resultados y Discusión, Discusión General, Conclusiones, Recomendaciones,y
Referencias Bibliográficas y Autobibliografía.
Los resultados contenidos en esta tesis han sido sometidos a la crítica pública en 28 Congresos y
Conferencias Nacionales e Internacionales y han recibido 7 premios nacionales y 1 internacional (ver
anexo 1 y 2)
Los resultados del presente trabajo han sido publicados por la autora en 19 publicaciones en revistas
internacionales (ver AUTOBIBLIOGRAFIA).
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2. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA.
2.1. Anticuerpos Monoclonales y el Cáncer.
2.1.1. Anticuerpos monoclonales.
La diversidad de respuesta inmunológica en los seres humanos viene dada por la presencia de millones de
inmunoglobulinas (Igs) o anticuerpos (Ac) diversos que muestran reconocimiento específico contra
variados determinantes antigénicos o epítopos diferentes. A pesar de esto, cada especie de Ig individual
exhibe un reconocimiento dado por sólo un epítopo particular. Al aislar un clon específico contra un
determinante antigénico y expandirlo, se obtiene un AcM, donde cada lg se une al determinante antigénico
seleccionado previamente. La estabilidad en cultivo de las células linfocitarias, productoras de anticuerpos,
es muy limitada, por lo que fue necesario encontrar una vía de inmortalizarlas. La fusión entre una célula
productora de anticuerpo (linfocito) y una de mieloma blanco, le confiere a la célula hija (hibridoma) las
propiedades de cada una de las células progenitoras: adquiriendo información genética para producir
anticuerpos (heredada del linfocito) y la capacidad de crecimiento descontrolado "in vitro" (heredado del
mieloma). Esta tecnología, establecida por Kóhler y Milstein en 1975 constituyó una poderosa herramienta
para la obtención de anticuerpos de elevada afinidad y especificidad, que al ser procedentes de un mismo
clon, son denominados anticuerpos monoclonales (AcMs). Teniendo en cuenta la homogeneidad de los
AcMs, así como su alta reproducibilidad en el tiempo, inagotabilidad y las facilidades creadas para
purificarlos, se han convertido en una herramienta importante para el estudio de la medicina moderna y han
suplantado con creces los anticuerpos policlonales que hasta 1975 constituían la base de la investigación
del sistema inmune y sus características (Hoffman T y cols., 1985).
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2.1.2. Aplicaciones de los AcMs en el cáncer.
La tecnología de hibridomas ha posibilitado la identificación de un gran número de antígenos tumor-
asociados, y la obtención de diferentes AcMs contra determinantes antigénicos específicos. Sin embargo,
ninguno de los antígenos hasta hoy detectados es estrictamente específico de un tumor (tumor específico).
La mayoría de los antígenos identificados por los AcMs aparecen con una expresión incrementada en
determinadas enfermedades y frecuentemente estos anticuerpos reconocen una amplia gama de variedades
histológicas tumorales. A pesar de esto, se encuentran numerosas aplicaciones en el cáncer. Como los más
conocidos tenemos el antígeno específico del colon SCA (Gold DV y cols., 1990), el CEA (Gold P and
Freedman SO., 1965), el CA 19-9 (Koprowski H y cols., 1979), el TAG-72 (Johnson VG y cols., 1986).
2.1.3. Anticuerpos monoclonales en el radioinmunodiagnóstico (RAID).
El uso de los AcM para el diagnóstico in vivo por medio de la InGG fue una de las primeras aplicaciones
que encontró en la medicina esta tecnología de avanzada siguiendo los trabajos pioneros de Pressman D,
1980 y Goldemberg DM 1980, quienes previamente habían demostrado la utilidad práctica de los
anticuerpos policlonales con los mismos fines.
Los AcMs o sus fragmentos pueden ser utilizados con el objetivo de dirigir drogas, radioisótopos o toxinas
hacia una diana específica. Cuando se marca con un isótopo radioactivo y se inyecta vía intravenosa en el
organismo humano, el AcM "busca” el antígeno contra el cual está generado y al reconocerlo mantiene una
interacción de identificación del AcM por su antígeno que puede durar desde algunas horas hasta días,
dependiendo del mecanismo de acción que se establezca en este reconocimiento. Al estar marcado con un
isótopo radioactivo, el órgano o
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lesión donde está sobre expresado el antígeno se convierte en un órgano "emisor” de radioactividad, una
vez que se establece la interacción antígeno-anticuerpo. Al colocar al paciente frente a un detector de la
emisión específica (gamma, beta, etc), la emisión de la radioactividad puede ser cuantificada y grabada en
forma de imagen. El uso del diagnóstico por imágenes ha encontrado aplicaciones muy valiosas en el
cáncer, en la radiolocalización de trombos de sangre, y el diagnóstico de infarto del miocardio (Rhodes BA
and Martinez-Dunker, 1990), entre otras.
Precisamente la mayor aplicación que se le encontró desde sus inicios a los AcM fue la evaluación de
tumores (Baum RP y cols, 1989, Goldember DM, 1989, Siccardi AG y cols, 1986, Amato R y cols., 2000),
por las propiedades de identificación del antígeno en el tumor y a la rápida disminución de la
concentración plasmática del AcM en exceso.
Su empleo en el diagnóstico "in vivo" requiere de tres etapas fundamentales: a. Obtención y producción de
un AcM específico contra el antígeno deseado, b. Establecimiento de un procedimiento de mareaje simple,
rápido y efectivo que permita la unión del isótopo con el AcM, y c. administración del radiofármaco al
paciente seguido de un estudio en la Cámara Gamma, equipo capaz de captar las emisiones tipo gamma del
isótopo radioactivo, para la interpretación posterior de las imágenes (el isótopo puede variar de acuerdo al
propósito del estudio)
Muchos han sido los AcMs que han cumplimentado de manera satisfactoria estas tres etapas para el
radioinmunodiagnóstico y han encontrado una aplicación efectiva en la detección preoperatoria del estadio
y la extensión de la enfermedad, la evaluación postoperatoria de la posibilidad de patología residual,
confirmación de lesiones malignas que son sospechadas al aplicar otras tecnología, seguimiento o
localización de tumores y la confirmación de la presencia
14
de receptores para determinado anticuerpo previo a su uso en la terapia.
Sin embargo la selección y la aplicación de los AcM han encontrado diferentes problemas aún por resolver
que han limitado su aplicación general. La biodistribución de los AcMs y por lo tanto su efectividad en el
diagnóstico de tumores, está determinada por diferentes aspectos, entre los que se encuentran primero, la
afinidad del anticuerpo por el tumor; segundo, la posibilidad de unión con el antígeno circulante o en la
superficie de las células sanguíneas, formando un complejo antígeno-anticuerpo que disminuye las
disponibilidades de anticuerpo para señalizar los tumores; tercero, la respuesta humana contra el AcM
murino (Human Antimouse Antibody: HAMA) desarrollada por el organismo ante la presencia de
anticuerpos de ratón y por último la diversidad antigénica existente, la accesibilidad para el antígeno y la
composición celular, la vascularización y la permeabilidad del tumor.
A pesar de estas limitaciones, los AcMs para el diagnóstico por imágenes siguen en desarrollo,
considerándose una poderosa herramienta en el diagnóstico por medicina nuclear debido a:
♦ La seguridad de los mismos, ya que se han utilizado en una gran diversidad de enfermedades, en un
gran número de pacientes y no se han reportado efectos adversos severos o muy severos en ninguno de
los casos.
♦ Los resultados que se encuentran luego de una InGG no sólo son de tipo morfológico (como las
imágenes que se obtienen por rayos X (rX), ultrasonido (US), tomografia axial computarizada (TAC) o
resonancia magnética nuclear (RMN) sino de tipo funcional al relacionar la especificidad de
reconocimiento de los AcM a su antígeno con la imagen obtenida, que al ser comparada con una
imagen convencional, permite dilucidar si la lesión es maligna o no.
15
♦ Se pueden adquirir imágenes de cuerpo entero, el paciente es la fuente emisora durante un tiempo
determinado (dependiendo del tiempo de vida media del isótopo radioactivo), al tener circulante en el
organismo el isótopo enlazado al AcM. La dosis de radiación que recibe el paciente es minima,
localizándose de una vez no sólo la lesión primaria, sino también lesiones metastásicas a distancia.
♦ La sensibilidad obtenida en el diagnóstico de diferentes tumores, en diferentes localizaciones varia ente
70 y 90 % al igual que la especificidad y le precisión, esto depende de la especificidad y afinidad del
AcM utilizado con el antígeno tumor asociado, pero siempre dan una idea más real de la malignidad.
♦ La detección de tumores muy pequeños y de metástasis con tamaños de 0.4-0.5 cm con AcMs
marcados con 99mTc, sin diagnóstico previo con otras técnicas.
♦ El diagnóstico de tumores ocultos que por medio de otras técnicas no ha sido posible, sin embargo ante
una sospecha clínica estas lesiones han sido encontradas por la InGG.
♦ A pesar de la presencia de determinados antígenos en el suero y la formación de complejos con los
mismos, se han logrado diagnósticos positivos en la lesión tumoral.
♦ Imágenes de cuerpo entero (whole body) que permite de una vez, rastrear todo el cuerpo e identificar
en las regiones más comunes para ese tipo de cáncer, la aparición de metástasis ocultas o incipientes no
identificadas por otros métodos imagenológicos, así como el estudio de la faramacocinética,
biodistribución y dosimetría interna por órganos para un posible tratamiento con radioinmunoterapia,
lográndose una predicción de la dosis de radiación que
16
recibirá el paciente frente a un isótopo de emisión beta acoplado al mismo AcM con que se realizó la
InGG.
♦ Se ha encontrado que la mayoría de las aplicaciones de los AcMs de origen murino, provocan la
aparición de respuesta humana contra el AcM murino (respuesta HAMA del inglés Human Anti Mouse
Antibody), cuando se emplea a dosis repetidas, la cual disminuye su potencialidad en el diagnóstico
reiterado. Este problema puede ser evitado con el uso de fragmentos de anticuerpos o anticuerpos
humanizados, los cuales tienen una inmunogenicidad disminuida respecto a sus variantes de
anticuerpos completos o anticuerpos murinos, respectivamente (Wegener WA y cols., 2000,).
♦ La aparición de tecnologías de imágenes más avanzadas (cámaras gammas de dos o tres cabezales),
con mayor sensibilidad de captación del isótopo radioactivo extiende su aplicación, pues es capaz de
detectar microlesiones metastásicas ocultas para la clínica y otros métodos imagenológicos.
2.1.4. Anticuerpos monoclonales humanizados.
Los primeros reportes referentes a la clonación de secuencias génicas de anticuerpos a partir de ADN
obtenido de linfocitos, hibridomas y linfomas, y sobre la manipulación de los genes de las regiones
variables de las inmunoglobulinas para la creación de moléculas con nuevas propiedades, datan de los
inicios de la década de los años 80 (Morrison SL y cois, 1985). La necesidad de mejorar la eficacia
terapéutica de los AcMs murinos, las limitaciones tecnológicas para obtener AcMs humanos y el desarrollo
de la Biología Molecular, le imprimen un impulso potencial a la Ingienería Genética, de donde se han
logrado infinidad de AcMs humanizados, fragmentos de AcM y hasta péptidos que reconocen
específicamente a estos antígenos.
17
Si bien es cierto que las técnicas para el diagnóstico inmunogammagráfico con AcMs requieren pequeñas
cantidades de Igs, al intentar combinar esta tecnología con el tratamiento, utilizando altas dosis y esquemas
repetidos de AcM, provoca la aparición de respuesta HAMA, la cual puede limitar la efectividad del
tratamiento (Haller DG y cois., 2001). Esta respuesta está dirigida fundamentalmente a la región constante
del anticuerpo, aunque se ha detectado también una cierta respuesta anti-idiotípica contra la región
variable, lo que puede disminuir la eficacia del tratamiento, eliminando los AcMs circulantes, alterando sus
propiedades farmacocinéticas y/o causando hipersensibilidad a los inmunocomplejos o reacciones alérgicas
que son dañinas a los pacientes. A ello se suma que los anticuerpos pueden ser poco eficientes en la
promoción de funciones efectoras por las células humanas, y que su patrón de glicosilación es diferente al
de los anticuerpos humanos, hecho este que parece afectar su biodistribución y transporte (Nose M and
Wigzell H, 1983).
Las primeras modificaciones hechas a los AcMs de ratón mediante la ingeniería genética se dirigieron
principalmente a la creación de inmunoglobulinas quiméricas, donde las regiones variables de anticuerpos
murinos con potencial terapéutico se asociaron a regiones constantes humanas, en el afán de eliminar la
respuesta HAMA y mejorar sus funciones efectoras, conservando la especificidad original (Blanco 1 y
cois., 1997).
2.2. Radiomarcaje de anticuerpos monoclonales.
Uno de los aspectos a los que se les ha prestado mayor interés en el transcurso de los años, es la calidad y
los requisitos que deben reunir los AcM para ser utilizados como radiofármacos en el diagnóstico por
(InGG). Las exigencias, cada vez mayores, han establecido los parámetros generales a tener en
consideración para la selección de un radiofármaco para un fin determinado.
18
Entre los parámetros más importantes tenemos:
> El espectro de emisión radioactiva y el tiempo de vida media del radioisótopo utilizado.
> El aclaramiento sanguíneo y la biodistribución de la molécula en ensayo.
> La captación y la retención en el tiempo del radiofármaco por cada órgano.
> La estabilidad in vitro e in vivo del radiofármaco.
> El aclaramiento, la biodistribución y la excreción de metabolitos en la eliminación del radiofármaco.
Los radiofármacos marcados con iodo han jugado un papel muy importante en la química
radiofarmacéutica desde su utilización en el estudio del metabolismo de la tiroides y en técnicas in vitro de
radioinmunoensayos. Los métodos de mareaje para los anticuerpos con los isótopos del iodo (1231, 1251,
1311) han brindado enlaces covalentes fuertes con los AcM, una química de enlace bien conocida y
definida, reacciones simples de mareaje y conjugados con elevadas actividades específicas. Entre los
métodos más utilizados para la iodación tenemos el método de la cloramina-T (Bocci V, 1964) y el método
del iodogen (Salacinki PRP y cols., 1981). Sin embargo, ningún isótopo del Iodo tiene las características
del 99mTc en cuanto a propiedades nucleares y disponibilidad, por lo que en la mayoría de los
radiofármacos que utilizan el Iodo como isótopo radioactivo, este ha sido sustituido por el 99mTc.
2.2.1. Tecnecio 99-metaestable (99mTc) como isótopo para el diagnóstico.
El descubrimiento del Tecnecio-99m por Emilio Segre en 1938 (Segre E and Seaborg GT, 1938) constituyó
un hecho de gran importancia en las técnicas nucleares. Sin embargo no fue hasta
19
Junio de 1958 en la Sociedad Nuclear Americana, cuando el Laboratorio Nacional de Brookhaven reportó
el primer generador 99mMo/99mTc, el cual significó un cambio definitivo en el campo de la Medicina
Nuclear. De esta manera el 99mTc se ha convertido en el isótopo por elección y en la década actual más
del 90 % de todas las determinaciones en Medicina Nuclear lo utilizan (Hjelstuen OK, 1995, Dewanjee
MK, 1990).
Generador 99mMo/99mTc: consiste en una columna de trióxido de molibdeno (99mMo03) con un tiempo
de vida media 66 h y que decae con 87,5 % de productividad de 99mTc, que instantáneamente se oxida a
su forma soluble pertecnetato (Tc04). Este generador hace posible la disponibilidad de 99mTc para
hospitales e investigadores a un bajo costo, en una elusión con solución salina fisiológica óptima, para el
uso en humanos.
Propiedades físicas ideales: emite fotón mono energético de energía 140 KeV, técnicamente ideal para
detectarse mediante una cámara captación de rayos gamma, por las propiedades de absorción del cristal de
Nal presente en las mismas. Posee además un tiempo de vida media de 6 h que implica rápido aclaramiento
y por lo tanto baja dosis de radiación al paciente.
2.2.2. Métodos de mareaje de anticuerpos monoclonales.
Para el análisis de un método de mareaje de AcM con 99mTc, al igual que con otros isótopos radioactivos,
es necesario tener en consideración un conjunto de parámetros que garanticen la calidad y la utilidad
práctica de los mismos. Entre estos parámetros vale destacar, la posibilidad de obtener eficiencias de
mareaje elevadas (mayores de un 90 %), que el método seleccionado sea simple, reproducible y de bajo
costo, que el anticuerpo marcado no pierda su inmunorreactividad ni su capacidad de reconocer células
tumorales, y que el conjugado obtenido mantenga buena estabilidad tanto in vitro como in vivo.
20
De manera general, los métodos de mareaje de AeM con 99mTc se clasifican en métodos directos e
indirectos, teniendo en cuenta la unión directa o no del isótopo radioactivo al AcM. Los métodos directos,
como su nombre lo indican, implican un enlace directo del isótopo al AcM sin mediar otra sustancia entre
ambos compuestos en el enlace. Los métodos indirectos implican un tercer componente que funciona de
puente enlazador entre el AcM y el isótopo radioactivo y se dividen a su vez en dos grupos fundamentales.
2.2.2.1 Métodos Directos de Mareaje
La mayoría de estos métodos directos son el resultado y la continuidad de un método inicial establecido
por Pettit y colaboradores en 1980 quienes marcaron AcMs mediante incubaciones con SnC12 en medio
ácido y reportaron eficiencias de mareaje superiores al 98 % para los mismos.
Entre los agentes reductores más utilizados y reportados para obtener grupos -SH en los anticuerpos
tenemos el SnC12 (Rhodes BA y cois., 1982), el 2-mercaptoetanol (Schwarz A and Steinstrasser A, 1997),
el glutatión (Hnatowich DJ y cois., 1993), el ácido ascórbico (Thakur ML, 1991, Hnatowich DJ, 1994) y el
ditiotreitol (Thakur ML and de Fluvio JD, 1991) por sólo citar algunos ejemplos.
Los métodos directos son muy aceptados de manera general, debido a la facilidad y simplicidad de su
ejecución y por todos los reportes en la literatura donde se ha obtenido muy buena eficiencia de mareaje y
utilidad de los anticuerpos marcados. Estos métodos además tienen la ventaja adicional de poder establecer
formulaciones liofilizadas listas para el mareaje. Sin embargo se le adjudican algunas desventajas entre las
mas comunes, baja pureza radioquímica que implica una purificación del anticuerpo marcado adicional;
uniones inespecíficas del isótopo
21
al anticuerpo que resultan inestables (Siccardi AG y cols., 1986); la unión directa a grupos -SH del
anticuerpo provoca una pérdida significativa de la especificidad del mismo (Relly RM, 1993, Hnatowich
DJ y cols., 1993); el uso de agentes reductores, variados pH y diferentes tiempos de incubación pueden
afectar a los AcM modificar su reconocimiento in vivo (John E y cols., 1994) asi como la posibilidad de
fragmentación del AcM por el efecto de los agentes reductores utilizados (John E y cols., 1994).
La metodología establecida por Schwarz A y Steinstrasser a 1987 y modificada por Mather SJ y Ellison D,
1990, ha mostrado resultados de elevada eficiencia de mareaje para los anticuerpos. Este método directo se
basa en la reducción de puentes disulfuros usando como agente reductor el 2-mercaptoetanol (2-ME), que
crea grupos sulfidrilos reactivos en los anticuerpos que son capaces de unirse fuertemente al 99mTc, en
presencia de un agente quelante débil como el metilen-difosfonato (MDP). Es un método que, además de
lograr eficiencias de mareaje elevadas, puede ser adaptado a la preparación de formulaciones liofilizadas.
2.2.2.2. Métodos indirectos.
Entre los métodos indirectos, están aquellos en los que se une un quelato bifuncional a la proteína y luego
se une el 99mTc (Abrams MJ y cols., 1990, Fischman AJ, 1994) han sido los más reportados. Entre los
agentes bifuncionales utilizados con mejores resultados tenemos los ésteres de hidrazinanicotinato
(Shwartz DA y cols., 1991, 1993), los cíclanos (N4) (Franz J y cols., 1987), los derivados del diamido
dimercáptido (N2S2) (98,111,113) y el N,N,N',N' tetra(2- cercaptoetil) etilendiamino (N2S4) (Alauddin
MM y cols., 1992).
Estos métodos tienen como ventajas fundamentales la obtención de conjugados muy estables tanto in vitro
como in vivo. Sin embargo existe un conjunto de desventajas que limita el uso de
22
estos métodos, teniendo en cuenta la complejidad y el costo de los mismos, la falta de disponibilidad de un
ligando bifuncional general para cualquier molécula, la posibilidad de que ocurran uniones inespecífica del
99mTc a la proteina, la necesidad un paso cromatogràfico de purificación posterior a la conjugación para
eliminar el ligando que no reaccionó con el anticuerpo, la posible alteración de la inmunorreactividad del
anticuerpo y el efecto significativo del agente bifuncional sobre la biodistribución del anticuerpo (Paik CH
y cols., 1989, Deshapande SV y cols., 1989, Weber RW y cols, 1990).
2.2.3. Pureza radioquímica para los radiofármacos.
Uno de los parámetros más importantes en la evaluación de un método de mareaje determinado, es la
pureza radioquímica obtenida, que se define como el porciento del total de radioactividad en el
radiofármaco que está presente en la forma química deseada (Hung JC y cols., 1995).
Entre las causas que pueden provocar la presencia de variadas formas químicas dentro de un producto
tenemos, las reacciones químicas de competencia que ocurren durante el proceso de radiomarcaje, la
posibilidad de descomposición del producto final debido al efecto del proceso de radiólisis, la presencia de
agentes oxidantes o reductores en el producto final, los cambios de pH y/o temperatura durante el proceso
de radiomarcaje, la presencia de solventes orgánicos durante la reacción y la exposición a la luz del
producto.
Luego la composición o pureza del radiofármaco juega un papel muy importante para el diagnóstico,
teniendo en cuenta que determinará la biodistribución. Un alto fondo inespecífico de radioactividad puede
provocar una degradación de la calidad de la imagen, una interferencia en la interpretación diagnóstica de
los resultados y una dosis de radiación innecesaria para el paciente.
"
23
Por tales motivos muchos autores ponen especial empeño en seleccionar cada día mejores métodos para la
determinación de la pureza radioquímica y entre los cuales los más utilizados son la cromatografía
instantánea de capa delgada (del inglés Instant Thin Layer Chromatography, ITLC), la cromatografía en
papel (Perera A and Pérez C, 1997), la cromatografía de exclusión molecular (Muddukrishna SN y cols.,
1994) y la electroforesis.
2.3. Modelo EGF/ r-EGF y su relación con el cáncer.
2.3.1. Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF).
El Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) es un polipéptido de 53 aminoácidos con un peso molecular
de 6045 Da, obtenido originalmente de glándulas submaxilares de ratón (Cohen S, 1962) y posteriormente
de orina humana (Cohen S, 1975). El EGF es una molécula ubicua, y al igual que otros factores de
crecimiento y a diferencia de las hormonas clásicas, su producción parece ser sistèmica y su acción
paracrina (Carpenter G y cols., 1979). Contiene 6 residuos conservados de cisteína que forman 3 enlaces
covalentes o puentes disulfuro, lo cual sugiere que es una molécula estable. La secuencia del EGF también
contiene un número relativamente grande de residuos de glicina y tirosina, (Carpenter G y cols., 1979).
El EGF está presente en el plasma en muy bajas concentraciones y generalmente asociado a las plaquetas y
a otros elementos de la coagulación sanguínea (Savage AP y cols., 1996). En humanos se han encontrado
altos niveles de EGF en fluidos prostáticos y seminales. Se plantea además que el hígado puede ser una
fuente de EGF circulante (Laborde NP y cols., 1988). Los niveles de EGF en tejidos y fluidos corporales
de humanos y roedores recién nacidos son bajos, pero se incrementan lentamente hasta alcanzar los niveles
del adulto. En ratones jóvenes el nivel de EGF es dependiente de las hormonas tiroideas (Perheentupa J y
cols., 1984).
24
Aunque no se conocen con exactitud todas las funciones del EGF, se han encontrado una gran variedad de
efectos en mamíferos, tanto en animales experimentales como en cultivos celulares. Esta molécula estimula
el crecimiento in viiro, tanto de células normales como tumorales de origen ectodérmico y mesodérmico
(Carpenter G y cols., 1981).
2.3.2. Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico
2.3.2.1. Estructura y funciones r-EGF.
El r-EGF (erbB) es el prototipo de la subfamilia de receptores de factores de crecimiento tipo I. Esta
familia incluye además tres miembros bien conocidos c-erbB2 (HER2), c-erbB3 (HER3) y c-erbB4
(HER4) (Masón S, 1995). Es una glicoproteína de 170 kDa (1186 aa), transmembranal con actividad
tirosina cinasa y expresada en la mayoría de las células normales. Transmite acción mitogénica e
inhibitoria de ligandos de la familia EGF, TGF alfa, HB-EGF, betacelulina (BTC) (Salomon DS y cols.,
1995, Modjtahedi H y cols., 1998).
Está compuesto por tres regiones: una región extracelular (621 aminoácidos) rica en cisteína con cuatro
dominios siendo el dominio III responsable de la unión de ligandos como el EGF y el TGFalfa, una región
transmembrana (23 aminoácidos) de secuencia simple de cadena hidrofóbica, una región intracelular (542
aa) con tres dominios, uno actividad tirosina cinasa, uno con actividad de regulación dependiente de calcio
y un tercero inhibitorio.
Este carácter bifuncional (propiedad de los receptores de factores de crecimiento), un dominio extracelular
que reconoce al ligando y un dominio intracelular con actividad enzimática, permite la transducción de la
señal mitogénica (Lax I y cols., 1989).
El r-EGF se expresa en una gran variedad de células, y se purificó por primera vez de una línea
25
celular derivada de un carcinoma epidermoide humano (A431) (Cohen S, 1982), que expresa un número
incrementado de receptores de superficie (Fabricant RN y cols., 1977). Posteriormente se comprobó que
esta alta expresión es debido a una amplificación del gen que codifica para el receptor (Cowley G y cols.,
1984, Merlino GT y cols., 1984). El r-EGF se expresa en la mayoría de los tejidos en un rango de 20 000 a
200 000 receptores de superficie por célula (Carpenter G, 1987). El mismo ha sido clonado, y
completamente secuenciado, mostrando una gran homología estructural con el oncogen v-erbB (Downward
J y cols., 1984).
La unión del ligando al receptor tiene como consecuencia la activación de la actividad enzimàtica y la
autofosforilación del receptor en los residuos de tirosina, así como la fosforilación de sustratos
citoplasmáticos específicos. El mecanismo de activación de estos receptores involucra la dimerización del
receptor inducida por el ligando; la interposición de los receptores facilita la fosforilación en trans. Esta
autofosforilación parece tener dos consecuencias una configuración activa para la cinasa, y sitios de unión
para otros componentes del mecanismo de transducción de la señal (Teming HM y cols., 1966, Paul D y
cols., 1971) o sea, que los residuos de tirosina que se encuentran fosforilados en el receptor, funcionan
como sitios de unión de alta afinidad para proteínas celulares que están involucradas en la transducción de
la señal.
2.3.3. Relación r-EGF y Cáncer.
Se ha demostrado que la activación del Receptor del EGF está vinculada con crecimiento y la progresión
tumoral, incluyendo la promoción de la proliferación, la angiogenesis y la invasión y metástasis así, como
la inhibición de la apoptosis (Baselga J y cols., 2000, Wells A, 2000, WoodbumJR, 1999)
Las primeras evidencias de la relación entre los factores de crecimiento y el proceso de
26
transformación maligna, emergen con la observación de que cuando las células normales son transformadas
en células malignas por virus oncogénicos, carcinógenos químicos o espontáneamente, ocurre una
disminución de los requerimientos de suero para el crecimiento in vitro de estas células (Teming HM,
1966, Paul D, 1971, Dulbeco R, 1970). La pérdida de los requerimientos de factores de crecimiento
específicos es una característica común a diferentes tipos de células tumorales (Wharton W y cols., 1983,
O'Keefe y cols, 1983, Aronson SA, 1991) lo cual podría ser explicado por la activación de la síntesis
autóloga de factores de crecimiento o lo que también se ha denominado activación "autocrina". La
producción autóloga de un factor de crecimiento por una célula portadora del receptor para dicho factor,
puede resultar en una ventaja de crecimiento para dicha célula. Se han descrito ejemplos de células
transformadas que expresan una gran cantidad de receptores, o de manera constitutiva mutaciones que son
la forma activa de algunos de los componentes de los mecanismos intracelulares de la respuesta mitogénica
(Aronson SA, 1991).
Se han encontrado numerosas evidencias en tumores humanos, donde algunos factores de crecimiento o
sus receptores son afectados por aberraciones genéticas. El TGF-a se ha detectado frecuentemente en
carcinomas que expresan una gran cantidad de receptores de EGF (Harad K, Spriplakich S, 1999).
El gen del receptor del EGF se encuentra amplificado y/o sobre expresado en los carcinomas epidermoides
humanos (Halaban R y cois., 1998), lo que al parecer ofrece ventajas de crecimiento para estas células.
Por otra parte, estudios bioquímicos e histológicos de biopsias de tumores humanos han demostrado la
sobre-expresión del r-EGF en diferentes neoplasias humanas, incluyendo mama
27
(Pérez R y cols., 1984, Woodburm J, 1999) pulmón (Veale D y cols., 1987, Rush V y cols., 1993), próstata
(Ware JL y cols., 1993), cabeza y cuello (Dassonoville O, 1993), ovario (Janimis J y cols, 1994), tracto
digestivo (1993, Harad K y cols., 1999) y vejiga (Spriplaqkich S y cols., 1999). En algunos casos se ha
demostrado que estos cambios tienen importancia para el pronóstico (Mendelson J y cols, 1996). Por
ejemplo, en 1984, se describió la relación estructural entre el R-EGF y el oncogen v-erbB (Lopez O y cols.,
2000) y trabajos posteriores demostraron además, que la presencia de r-EGF se encuentra inversamente
relacionada con la sobrevida de los pacientes (Ullrich A y cols., 1984) y con la presencia de receptores de
estrògeno (Macias A y cols., 1986), que la expresión de r-EGF es mayor en metástasis que en tumores
primarios (Macias A y cols., 1991), y se encuentra frecuentemente asociada a la expresión de TGF-a
(Anzano MA y cols., 1983). El comportamiento clínico de los tumores papilares del riñón, está relacionado
con el nivel de expresión de este receptor (Spriplakich S y cols., 1999).
De esta manera, aquellos agentes capaces de bloquear la interacción del r-EGF en este sistema, pueden ser
potencialmente útiles para aplicaciones clínicas. Sin embargo, la expresión de receptores en células
normales pudiera constituir un problema para el diagnóstico y terapia, pero se puede aprovechar esta sobre-
expresión del receptor en determinadas enfermedades y/o la presencia del receptor mutado.
2.3.4. Cáncer- Sistema EGF/ r-EGF: Diagnóstico y Terapia.
Teniendo en consideración todos los aspectos señalados anteriormente podemos considerar tres posibles
"moléculas dianas" en el sistema EGF/ r-EGF para el diagnóstico y la terapia del cáncer.
28
• Uso de tactores de crecimiento: tiene como inconvenientes su rápida degradación por su bajo peso
molecular y la competencia que se establece con factores de crecimiento endógenos.
• Uso de anticuerpos anti r-EGF: debido a que el número de receptores para el EGF en células tumorales
puede ser 100 veces mayor que en células normales, el r-EGF ha sido considerado como diana
potencial para la distribución de agentes tumorigénicos usando anticuerpos anti r-EGF o sus
fragmentos.
• Uso de anticuerpos anti-receptor mutado (anti r-EGFvIII): reordenamientos del gen del R- EGF pueden
originar una diana específica de tumores, el receptor mutado R-EGFVIII (145 kDa), que sólo se
expresa en células con transformación maligna pero no en células normales y se convierte en una
molécula de gran valor para el diagnóstico y la terapia del cáncer.
El AcM anti- r-EGF ior egf/r3 es un AcM murino, producido en el CIM, isotipo IgG2a, secretado por el
hibridoma A24/15/128, el cual fue obtenido por la fusión del mieloma murino SP2-Agl4 con linfocitos
esplénicos de ratones Balb c inmunizados con una fracción parcialmente purificada del r-EGF procedente
de placenta humana. Este AcM reconoce el r-EGF con alta afinidad, receptor que se encuentra expresado
en tejido normal, pero que en neoplasias malignas se encuentra sobre-expresado y está asociado al mal
pronóstico de la enfermedad (Ríos MA y cols., 1992). Tiene una constante de disociación Kd=10-9 m y
una constante de afinidad de 0.94 +/- 0.8 xl08. Es capaz de inhibir el enlace del EGF a su receptor y
muestra un patrón de reconocimiento inmunohistoquímico similar al EGF-1 de la Amersham usado como
control (Fernández A y cols., 1989,1992). Por otra parte inhibe el crecimiento de las células tumorales
dependientes de EGF en modelos xenográficos.
29
El AcM humanizado h-R3 fue el resultado de este proceso, lográndose disminuir la inmunoreactividad y la
respuesta HAMA hacia el AcM murino, así como aumentar el tiempo de vida media de la molécula en el
organismo para su posible uso en la terapia de tumores de origen epitelial, a dosis repetidas, utilizando las
cadenas pesadas y ligeras Eu y REI respectivamente como marcos de Ighumana donde se mantienen
solamente los CDR murinos (regiones hipervariables de AcM murino ior egf/r3. El AcM humanizado
resultado de esta transformación AcM h-R3 es una IgG 1 humana, que mantiene tres residuos murinos en
las regiones hipervariables (constituidas por tres aminoácidos: Ser75, Thr76 y Thr93), la cual ha sido
expresada en una línea celular de mieloma NSO. Esta (Ig) ha mostrado una capacidad para inhibir la unión
del EGF marcado a su receptor similar al AcM murino, con una constate de disociación de 10-9 M. Tiene
una constante de afinidad de 1,12 +/- 0.69 10 8 L/mol.
Este AcM humanizado bloquea el enlazamiento del EGF a su receptor. Inhibe el crecimiento de las células
tumorales dependientes de EGF en modelos xenográficos y es capaz de mediar la actividad ADCC y CDC.
2.4. Antígenos Tumor Asociados al Cáncer de Colon.
El cáncer colorrectal representa el 10 % de todos los tipos de cáncer y el 10 % de las muertes por cáncer en
los Estados Unidos con 130 000 nuevos casos diagnosticados anualmente (198). Cada día se avanza más en
la comprensión de la biología y la genética de esta enfermedad, y si el diagnóstico se realiza
tempranamente, se puede afirmar que el cáncer de colon es altamente curable. En pacientes con
clasificación del tumor de Duke A donde solamente el tumor ha invadido al submucosa o Duke B1 con
invasión de la musculari propria son curados típicamente con cirugía, sin requerimiento de otra terapia
adicional (Cohén AM y cois., 1997). Pacientes con clasificación de la enfermedad de Duke B2 o Duke C,
donde hay comprometimiento de nódulos
30
linfáticos, con invasión de la musculari propia y de la serosa pueden ser tratados con ciclos de
quimioterapia y estos aumentar altamente la sobrevida (Moertel C y cols., 1995, Haller DG y cols., 1998)
El diagnóstico temprano de la enfermedad que en ocasiones se hace difícil por no aparecer sintomatología
y el conocimiento de la expresión de los receptores en el tumor, permitirían una combinación de terapia
inmune activa y pasiva que en definitiva provocaran un aumento del tiempo de sobrevida del paciente con
mejor calidad de vida.
El control del crecimiento celular y el comportamiento “social” de las células son aspectos importantes en
el control biológico de la misma, que una vez desregulada, provoca la aparición de lesiones malignas. La
regulación se lleva a cabo a través de moléculas específicas tales como factores de crecimiento, receptores
de membrana, transportadores de membrana, proteínas del cito esqueleto y componentes de la superficie
celular, entre otros. La modificación de estas moléculas ocurre por dos procesos bioquímicos
fundamentalmente: la fosforilación y la glicosilación.
El descontrol en el crecimiento celular, la migración e invasión de estas células fuera de las fronteras de los
tejidos provocando metástasis, es uno de los aspectos claves de la biología del tumor, esta desviación del
control de las relaciones sociales de las células son inducidas por cambios que ocurren en los componentes
de la superficie celular donde los carbohidratos de los glicoconjugados juegan un importante papel.
(Paulson JC y cols., 1989)
Con el uso de AcMs dirigidos contra epítopos sacarídicos y proteicos de las mucinas (glicoproteínas de alto
peso molecular sintetizadas y liberadas a la circulación por la mayoría de los tejidos epiteliales) se ha
podido demostrar que un mismo epítopo sacarídico puede ser portado por diferentes esqueletos proteicos y
algunos de ellos portados por diferentes proteínas
31
dependiendo si están expresados en tejido normal o tejido tumoral
(Hanski MLy cols., 1993)
Los antígenos asociados al cáncer de colon están muy bien caracterizados, los más estudiados son del tipo
glicoproteínas y entre ellos los más empleados son la glicoproteína de peso molecular 40 000 KDa: CD17-
1A contra la cual está dirigida el AcM 17-1A (Muxi P y cols., 1996, Sears HF y cols., 1983, Reithmuller G
y cols., 1998) y el antígeno carcinoembrionario CEA del inglés Carcinoembrionic antigen) contra el cual se
han generado una amplia gama de AcMs ( Thompson J y cols., 1998, Paxton RJ y cols., 1987).
2.4.1. Antígeno Carcinoembriobarío: CEA
El CEA ha sido ampliamente utilizado como marcador tumoral. Ya en la década de los 70, lo clasificaban
como antígeno serológico tumor asociado por ser excretado al suero y elevarse su concentración sérica en
determinadas enfermedades malignas. Sin embargo se vio que no existía una estricta correlación entre
malignidad y elevación de los niveles del CEA. Por otra parte su expresión en los tumores colorrectales lo
hizo blanco de la InGG desde que se generaron los primeros AcM anti CEA. Sin embargo, la molécula del
CEA, con características similares a la de la superfamilia de las inmunoglobulinas, no se veía con un rol
dinámico en la relación social de las células tumorales.
En 1996, Bohem MK y cois, mostraron nuevas características moleculares del CEA, definiéndolo como un
marcador tumoral de superficie, altamente glicosilado (50 % de carbohidratos en su estructura). El
monómero está constituido por siete dominios de la superfamilia de genes de las inmunoglobulinas.
El CEA es un miembro de una familia de glicoproteínas de la superficie celular representando un subset de
la superfamilia de las Igs, se considera el mayor marcador tumoral (Charbonneau J y
32
cols., 1999). Es una molécula de adhesión intercelular de carácter homotípico (interacción CEA - CEA
entre células modulando las funciones de ambas).
Inhibe la diferenciación de muchos tipos de células en el organismo. Constribuye a la tumorigénesis, una
actividad que requiere interacción intercelular CEA-CEA.
Los genes de la superfamilia del CEA están divididos en tres subgrupos (Frangsmyr L y cols., 2000, Izzi L
y cols., 1999). Al ser miembro de una gran súper familia de genes, muestra homologia estructural con otras
familias de moléculas. (Maxwell P, 1999)
A pesar de esta "confusa apariencia", se conoce actualmente que el CEA esta enrolado en múltiples
funciones biológicas, incluida la adhesión intercelular. Fue, precisamente, uno de los primeros antígenos
asociado a tumores que se eligió para la generación de AcMs. Se conocen en la actualidad una amplia
gama de AcMs anti CEA que van desde AcMs murinos, quiméricos y humanizados hasta pequeños
fragmentos, empleados en el diagnóstico de tumores colorrectales, principalmente por InGG. Su utilidad en
el diagnóstico ha cambiado también durante los últimos años, antes era usado en la rutina de la InGG solo
o con un panel de AcM, pero recientes avances en la comprensión de su rol biológico como propiciador de
la adhesión celular CEA-CEA o CEA-Ag relacionados, hace pensar en la selección de AcM anti CEA para
usarlos con ambos Por otra parte, Schumann D y cois, en el 2001, mostraron que la molécula de CEA
estaba insertada en la membrana celular y que a ella se enlazan un número limitado de azúcares, la
posibilidad de modificación de estos ya sea por agentes externos o por interacciones intercelulares es muy
alta, lo que trae aparejado una diferenciación estructural del CEA ya maduro, y esto por supuesto, una
variabilidad en el reconocimineto de esta por otras moléculas.
Desde 1982 se viene trabajando en Cuba con un AcM anti CEA denominado ior cea 1. Este es una
subclase de Ig de ratón IgG 1, que reconoce al antígeno tumor asociado CEA (Gavilondo J,
33
1987). Su eficacia en el diagnóstico de tumores colorrectales ha sido probada en múltiples ensayos clínicos
multicéntricos e incluso multinacionales, mostrando una sensibilidad diagnóstica entre el 82 y el 89 %
(Oliva JP y cois., 1993, 1995, 1998, 1999, Pulliblank AM and Lemoine RN 1992)
2.2AA. Antígeno Tumor asociado IOR C2.
La búsqueda de nuevos marcadores tumorales que favorezcan la inmunoterapia, no se ha detenido. La
presencia de determinados complejos proteicos en líneas celulares tumorales, presente además en tumores
malignos, han propiciado la generación de nuevos AcMs que estén dirigidos específicamente contra estos
antígenos.
IOR C2 es un antígeno tumor asociado reportado por primera vez por Vázquez y colaboradores en 1992, es
un complejo glicoprotéico con al menos dos componentes mayoritarios de 145 y 190 Kd, este antígeno es
sensible a las oxidaciones periódicas y tratamientos alcalinos lo que indica la presencia de carbohidratos en
su epítope. Es resistente a la neuroaminidasa por tanto no hay ácido siálico en su estructura, es sensible a la
digestión con proteasas por lo que se clasifica como una glicoproteína.
Este antígeno tumor asociado es secretado hacia el lumen. Se ha comprobado que en pacientes con cáncer
se expresa menos en heces fecales que en individuos sanos.
La identificación de este antígeno se realizó a través de un panel de AcMs murinos obtenidos por la fusión
de linfocitos de bazos de ratones inmunizados con las células SW1116 con un mieloma "blanco" (no
secretor de lgs). Estos AcMs, denominados ior c5 e ior c2, tienen un patrón de reconocimiento homogéneo
en tejido normal, sin embargo en tejidos tumorales, el mareaje es heterogéneo, acentuado en la superficie
apical de la célula (Vázquez AM y cols., 1993).
En estudios de competencia con otros AcMs, se encontró, que no competía por su antígeno al
34
hacerlo reaccionar junto con el AcM 17-1A ni el AcM GICA 19-2, anticuerpos que reconocen otros
antígenos tumor asociado, la competencia por el CEA fue a nivel de fondo con un valor residual de
reconocimiento menor de 5 %, no reconoce Lewis a ni Lewis b , antígenos asociados también al cáncer
colorectal ( Vázquez AM y cols., 1993, 1992, 1994).
2.4. Estado Actual de la competencia en cuanto a AcMs para Radioinmunodiagnóstico (RAID).
Desde que hace 25 años Goldemberg y colaboradores publicaron el primer artículo sobre InGG con AcMs
radiomarcados y con las ventajas de la tecnología de los hibridomas, la Inmunogammagrafía se ha
convertido en una realidad. En la era de Medicina Nuclear Molecular, los AcMs son las únicas
biomoléculas que ofrecen la respuesta pato-fisiológica al complejo problema del diagnóstico por imágenes
(Perera A y cols C 1997).
La Agencia Regulatoria de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), ha establecido
estrictos controles y requerimientos para aprobar como Medicamento un producto en estudio. Además de
establecer requerimientos en cuanto a calidad del producto, es imprescindible un estudio detallado en
pacientes, que cursen desde Ensayos Clínicos Fase I, donde se evalúa la toxicidad del producto en humano,
hasta los EC Fases III donde se evalúa además de la eficacia terapéutica, el beneficio que aporta esta nueva
droga con respecto a los medicamentos de primera línea en el mercado para la patología que se evalúa.
Hasta el mes de Mayo del 2002 (FDA report, 2002), la Base de Datos de la FDA, donde se registran todos
los medicamentos a los cuales se les ha concedido Registro (Licencia para su comercialización como
medicamento), en la sección de Radiología, aparecen registrados los AcMs que hasta la fecha están
aprobados para su uso en humanos en la técnica de Inmunogammagrafía.
Tabla i Anticuerpos Monoclonales Registrados para Inmunodiagnóstico del Cáncer
35
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Se llevó a cabo un estudio en 301 pacientes, entre los años 1992-1999, con tumores de origen epitelial
localizados en: pulmón, cabeza y cuello, mama, cerebro, tracto gastrointestinal (estomago, esófago,
intestino grueso, recto sigmoides, canal anal y ano), y sistema reproductor ovario, útero, próstata) con
AcMs producidos en Cuba. Se dividieron en dos bloques de evaluación según el AcM empleado para ser
evaluado:
Bloque 1. Pacientes portadores de tumores de Origen Epitelial en diferentes localizaciones, estudiados con
AcMs anti Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (r-EGF).
Bloque 2. Pacientes portadores de tumores de origen epitelial colorrectales estudiados con AcMs dirigidos
contra antigenos asociados al cáncer colorrectal.
A continuación se describe la tecnología utilizada en común para ambos bloques y los resultados serán
presentados y discutidos en Capítulos Independientes.
3.1. Pacientes Evaluados.
Todos los pacientes fueron estudiados en el marco de Ensayos Clínicos prospectivos, revisados y
aprobados por los Comités de Ética para la Investigación Clínica de los Hospitales participantes en el
estudio (Centro de Investigaciones Médico Quirúrgicas, Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología,
Hospital Hermanos Ameijeiras, Centro de Investigaciones Clínicas, Hospital Provincial de Villa Clara
Celestino Hernández). Estos fueron aprobados por la Agencia Regulatoria Cubana CECMED (Centro
Estatal para el Control de Medicamentos).
Todos los pacientes fueron informados acerca de las características de los protocolos de investigación, las
pruebas a las cuales iban a ser sometidos, los riesgos y beneficios del producto a ensayar y la utilidad del
mismo en el diagnóstico del cáncer, con una explicación clara sobre la
36
investigación, sus objetivos, procedimientos y duración, así como las posibles reacciones adversas Se
obtuvo por escrito el consentimiento informado de cada sujeto a estudiar previo a su posterior inclusión en
el ensayo, ante la presencia de un testigo y el investigador clínico principal
Se unificaron los criterios de selección de los sujetos, el método de mareaje, la metodología para realizar la
Inmunogammagráfia, así como una serie de parámetros que serán presentados a continuación como
aspectos comunes.
Toda la información de los ensayos clínicos fue recogida en los Cuadernos de Recogida de Datos (CRD)
del Paciente, documento perteneciente al Protocolo de Investigación Clínica, que junto con el, es aprobado
por las entidades antes mencionadas. Este documento, el cual es llenado por los Investigadores Principales
del Ensayo Clínico, es almacenado por al menos diez años posterior a la inclusión del paciente en la
investigación.
Se estableció un diseño de protocolo clínico diferente para cada AcM estudiado, en dependencia de los
objetivos de cada estudio.
3.1.1 Selección de los Sujetos
3.1.1.1 Criterios de Diagnóstico.
• Pacientes con sospecha clínica y radiológica de tumor.
Pacientes con tumores de origen epitelial con diagnóstico histopatológico previo en las localizaciones a
evaluar, con sospecha o no de metástasis o recidivas.
3.1.1.2. Criterio de confirmación.
La evaluación de la muestra obtenida de la lesión tumoral o la metástasis en el Departamento de Anatomía
Patológica, ya sea por cito o histopatología, antes de la InGG o después, en el acto quirúrgico.
37
En caso de no ser posible realizar el estudio histopatológico, se llevó a cabo un diagnóstico clínico bien
documentado por otras técnicas imagenológicas (rayos X, Tomografía Axial Computarizada, Ultrasonido,
gammagrafias)
3.1.1.3 Criterios de Inclusión.
Fueron incluidos los pacientes que cumplían los siguientes criterios:
• Los que expresaron de forma escrita, mediante el modelo de consentimiento informado, su disposición
de participar en el ensayo clínico.
• Edad no mayor de 85 años ni menor de 18, de cualquier sexo o grupo étnico.
• Los que no fueron tratados con anterioridad con AcMs.
• Los portadores de la enfermedad que se evaluó, con confirmación histopatológica. En el caso de
tumores primarios deberán estar confirmados histopatológicamente, de no ser así, debió hacerse
posterior a la InGG por técnicas de la sistemática diagnóstica para la localización evaluada o durante el
acto quirúrgico (de tener que llevarse a cabo).
• Los que no tuvieron tratamiento oncoespecífico, al menos 30 días antes del estudio.
• Los que en cualquier estadio clínico de la enfermedad, presentaran un estado general, menor
o igual a 2 según los criterios de la OMS (Edwards IR, 1994)
• Los que presentaron valores de hemoglobina mayor que 10 g/1, de leucocitos mayor que 4000g/mm3,
plaquetas 100 x 109 y las transaminasas (TGP) dentro de los valores de referencias normales.
3.1.1.4-Criterios de exclusión del ensayo.
• Mujeres embarazadas o lactando.
38
• Pacientes con estados febriles por enfermedades infecciosas agudas, o de gravedad, o en convalecencia
• Pacientes a los que se les haya administrado previamente el AcM y presenten respuesta HAMA
detectables en el momento de realizarse la prueba diagnóstica.
• Que no cumplan los criterios de inclusión.
3.1.1.54-Criterios de salida del ensayo después de la inclusión:
• Por solicitud del paciente
• Cuando la actividad en el punto de inyección sea mayor del 10 % de la dosis inyectada 30 minutos
posterior a la administración del radiofármaco (criterio de extravasación).
3.2 Método de Mareaje y control de la pureza radioquímica.
Los AcMs empleados para el estudio son glicoproteinas, y a pesar de no ser todos de la misma especie
animal, son Igs del tipo IgG (aunque de diferentes subclases). Por este motivo se llevó a cabo el mareaje
por una técnica radioquímica común para los cuatro AcM estudiados.
El Centro de Inmunología Molecular, es un centro de Investigación- Producción, donde se lleva a cabo el
desarrollo de un fármaco desde su generación hasta la producción y liberación del producto final. La
Dirección de Control de la Calidad donde se lleva a cabo la liberación del fármaco imbrica en estas
funciones al Departamento de Control e la Calidad, la Oficina de Asuntos Regulatorios y el Departamento
de liberación de lotes, todos ellos trabajan con Procedimientos Normalizados de Operación (PNO), que se
actualizan según el Plan de Documentación aprobado anualmente por en CIM según las Normas de
Calidad de las ISO 9000 y 2000, así como las Normas de Estandarización Internacionales. Cada PNO
finalmente es aprobado para su uso por el CEDMED.
Los lotes empleados para los estudios referidos en el presente trabajo, fueron liberados por este
39
departamento. Los parámetros que son exigidos que cumpla cada lote son los siguientes:
• Ausencia de Pirógenos. Esta prueba se realiza en el Centro Nacional de Biopreparados (BIOCEN)
según PNO 07-02.
• Ensayo de seguridad general (BIOCEN) PN007-001.
• Esterilidad. Esta prueba se realiza en el CIDEM según PNO (T/07)-029 (COI)
A continuación referimos todos los parámetros que son evaluados en los Laboratorios del Departamento
de Control de la Calidad el CIM para llevar a cabo la liberación de los lotes de AcMs para
radioinmunodiagnóstico.
Cantidad de DNA menor de 10 pg/dosis PNO 5082-04
Concentración de Proteínas PNO 5014
Grado de Pureza determinada por cromatografía por exclusión PNO 5111-03
molecular HPLC
Grado de Pureza por electroforesis en Geles de Poliacrilamida. PNO 5008-02
Punto Isoeléctrico, (Prueba de identidad Molecular) PNO 5009-02
Grado de Pureza por electroforesis Nativa PNO 5010 -02
Reconocimiento específico en cortes de tejido (Inmunohistoquímica) PNO 5004 -02
Determinación de la actividad biológica por Citometría de Flujo PNO 5042-00
Concentración de albúmina bobina por la técnica del Dot Blot PNO 5112-01
Otro de los aspectos a liberar es la eficiencia de mareaje del AcM reducido con el isótopo radioactivo y
la cantidad de radiocoloides presente en la preparación. Estas dos evaluaciones se describen brevemente
a continuación.
Luego de elaborar certificados de liberación de cada uno de los parámetros evaluados, se emite un
certificado de liberación del lote
3.2.1. Método de Mareaje.
40
Los AcMs fueron marcados acorde al método de Schwarz y Steinstrasser, 1987, descrito por Iztiaga-
Escobar y cois. 1996 y modificado por Morales A y cois., 1980. El anticuerpo, a una concentración de 5
mg/mL en tampón fosfato salino neutral (PBS), se redujo con 2 mercaptoetanol (2-ME) en una proporción
1:2000 mol/L, a temperatura ambiente por 30 minutos. El anticuerpo reducido, se purificó, para eliminar el
exceso de 2-ME, a través de una columna de tamizaje molecular en Sephadex G-25 (columnas PD10
Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweeden) utilizando como tampón de la fase móvil Tampón Fosfato Salino
(pH 7.4) previamente nitrogenado. Se colectaron 2 mL de la elusión, determinándose la concentración de
proteínas por lectura de la densidad óptica de la solución a 280 nm en un espectrofotómetro de luz
ultravioleta visible.
Cada miligramo del AcM reducido y purificado se mezcló con 50 uL de methylen difosfonato: MDP (bone
scanning kit Amerscan Medronate II, Amersham, UK) previamente reconstituido con 5 mL de solución
salina 0.9 % nitrogenada y con 40-50 mCi (14.8-1.85 GBq) de 99mTc pertecnetado procedente de la
elución de un generador de 99o/99mTc (Amertec II, Amesham UK). El procedimiento de radiomarcaje se
llevó a cabo bajo estrictas condiciones de esterilidad en Flujo Laminar destinado al efecto, todos los
implementos utilizados son estériles y libre de pirógeno (Iznaga N y cois., 1996, Morales A y cols., 1980,
Quesada CW y cols., 1998, Zayas F y cols., 1995).
3.2.2. Control de la pureza radioquímica
3.2.2.1. Cromatografía en papel ascendente. Eficiencia de Mareaje. PNO 5021-01
Sistemas de solvente como fase móvil
- Acetona
- Solución salina 0.9 %.
41
- papel absorbente Whatman 3mm
Se determinó por cromatografía en papel ascendente Whatman 3 MM, en tiras de 0.5 x 8.0 cm. Se aplicó
una gota, con una aguja, a 1.5 cm del borde inferior y las tiras de papel se colocaron en las cámaras
cromatográficas conteniendo solución salina al 0.9 % y acetona o metil etil cetona respectivamente como
tampón de corrida. En el primer sistema migran con un Rf = 1 la glucosa marcada con 99mTc, el MDP
marcado y el pertecnetato, mientras que el AcM marcado y el radiocoloide permanecen en el punto de
aplicación. En el segundo sistema sólo se mueve con el frente el pertecnetato. A partir de los resultados de
estos dos sistemas se puede determinar la cantidad de 99mTc libre y la cantidad de glucosa y MDP
marcados.
El cálculo se hará según la formula:
CPM 99mTc-AcM
% = ---------------------------------- x 100
CPM 99mTc-AcM + CPM 99mTc-Impurezas
3.2.2.2. Cromatografía en placas finas de Silica GEL (ITLC). Determinación de Radiocoloides. PNO
5112-01.
Se utilizó Cromatografía en placa fina de sílica gel (ITLC) impregnada en 1 % de albúmina de suero
humano (Gelman Science Inc. Ann Arbor, MI). Se utilizó como fase móvil etanol: amoníco: agua: 2:1:5
v/v.
Una vez comprobada la pureza radioquímica del radiofármaco (mayor del 98 % de eficiencia de mareaje),
este se administró en una vena anticubital, en forma de bolo endovenoso.
3.3. Inmunogammagrafía.
Se administró a cada paciente 40 mCi -50 mCi (1480-1850 Mbq) de 99Mtc enlazado a la dosis
42
de AcM seleccionada.
Las imágenes fueron tomadas en dos modelos de Cámaras Gammas: ZLC 3700 (Siemens, Hoffman
Estates, 1LI) y Shopy DS-7 (SMVi, Eiuc. France), según el servicio de medicina Nuclear donde se llevo a
cabo el estudio. La interfase para la toma y procesamiento de las imágenes fue el mismo para ambas:
Imagamma, software desarrollado por investigadores del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
y aprobado por la OIEA (Organización Internacional de Energía Atómica) para ser empleado en todas las
cámaras gammas que se encuentran en los Proyectos Regionales Cooperativos de Desarrollo (Sánchez
Catazus C y cols., 1995).
Se utilizó un colimador de baja energía, multipropósito, con cabezal paralelo y una cámara Gamma
monocabezal
3.3.1. Evaluación del la toxicidad.
Se tuvieron en cuenta los siguientes criterios para evaluar la toxicidad del AcM al ser administrado en el
paciente: Valores de hemoglobina mayor que 10 g/1, de leucocitos mayor que 4000g/mm3, plaquetas 100 x
109 y las transaminasas (TGP) dentro de los valores de referencias normales.
Estas determinaciones se realizaban con no menos de una semana de diferencia antes de ser administrado
el AcM.
Una semana posterior al tratamiento, se indicaron pruebas similares para evaluar posible toxicidad de la
administración de una dosis única del AcM en el paciente.
Si la variación entre el valor del parámetro evaluado (Hemoglobina, plaquetas, leucocitos, y TGP) previo a
la administración del AcM y una semana post tratamiento era mayor de un 20 %
43
se considera como efecto tóxico en ese paciente.
Por otra parte, previo a la administración del AcM y a las 4 y 24 horas post tratamiento se le midieron los
signos vitales: presión arterial, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y temperatura corporal
Cualquier variación relevante en estos parámetros seria considerado con toxicidad
3.3.2. Imágenes Planas.
Las imágenes planas se tomaron en vistas anteriores y posteriores de acuerdo con la localización de la
lesión, empleando una matriz de 128 x 128, con el fotopico centrado en 140 keV y una ventana de ± 20%
(amplitud de adquisición de la emisión gamma). Se tomaron imágenes equivalentes a 500 kiloconteos a las
2, 4 y 24 h posterior a la administración del inmunoradiofármaco.
Previo a la administración del AcM marcado, se realizó una imagen en la cámara gamma durante
1 minuto (control del fondo ambiental), de la jeringuilla en la cual se encontraba cargado el AcM marcado:
antes (actividad total) y posterior a la administración del radiofármaco (jeringuilla vacía), la diferencia de
radioactividad entre ambas imágenes se consideró como el total de conteos que se le administró al
paciente.
A los 30 minutos post administrado el AcM, se tomó una imagen del paciente en el sitio de inyección
durante 1 minuto con el objetivo de evaluar extravasación en la administración.
3.3.3. Imágenes SPECT ( Single Foton Emission Computer Tomography)
De 4 a 6 h posterior a la administración del radiofármaco se realizaron las imágenes tomográficas en 64
proyecciones, cada 30 segundos, con una matriz de 64 x 64, zoom 1, empleando una órbita de contorno de
360°.
Estas imágenes una vez reconstruidas con un filtro Hamming-Hann, dan idea de la dimensión del
44
tumor (tridimensional). A las lesiones inmunogammagráficas consideradas de interés clínico en las
imágenes planas, se le hicieron cortes sagitales, coronales y transversales cada 5 mm, con matriz 64x64 en
las imágenes tomográficas, que permitieron observar la dimensión y extensión de la lesión.
Tanto las imágenes de SPECT como las planas se realizaron empleando un colimador de propósitos
generales de baja energía y alta resolución.
En todos los casos los pacientes se colocaron en posición decúbito supino.
3.3.4. Interpretación de las imágenes.
Una vez procesadas las adquisiciones gammagráflcas y llevadas al formato digital (fotos), estas fueron
evaluadas por un equipo especializado compuesto por no menos de tres especialistas en medicina Nuclear
El diagnóstico final se elaboró por consenso, al menos dos de los criterios debían ser coincidentes.
La retención de la radioactividad en la zona definida como positiva, debió perdurar hasta las imágenes de
las 24 horas (retensión de la actividad en imágenes tardías). Esta zona se delimita con el software de
procesamiento como Región de Interés Orbital (ROI). La relación entre los conteos del ROI y los conteos
del fondo ambiental debe ser superior a 1.5 para que sea considerada como una imagen positiva.
Los resultados se clasificaron de la siguiente manera:
Verdaderos Positivos: Cuando existió captación del radiofármaco en el tumor o en las metástasis, o en
ambos, coincidiendo con el resultado reportado por Anatomía Patológica (cito o histología) Verdadero
Negativo. Cuando al no existir tumor, no existe captación.
Falso Positivo: Cuando apareció captación en sitios no identificados previamente, como posible zona de
hipercaptación, y se comprobó por otros métodos imagenológicos la ausencia de tumor.
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Falsos negativos: Cuando se reportó la existencia de tumor por otros métodos imagenológicos y por
anatomía patológica, no se encontró hipercaptación del radiofármaco en la zona evaluada.
La información de cada paciente fue recogida en los (CRD) del protocolo de investigación clinica
correspondiente.
3.3.5. Procedimientos para controlar la calidad de los métodos de evaluación.
A la cámara gamma se le práctica un estricto control de calidad según los protocolos técnicos establecidos
por la Organización Internacional de Energía Atómica, establecidos desde 1991(TEC-DOC 602).
Los aspectos más importantes a controlar son:
• Uniformidad Intrínseca y del Sistema, para caracterizar la variabilidad en la densidad de las cuentas
observadas, a través de todo el detector ante un flujo de radiación uniforme.
• Control del centro de rotación: para evaluar la capacidad del sistema tomográfíco de identificar
correctamente el centro de rotación durante el proceso de adquisición de las imágenes gammagráficas.
• Sensibilidad del Sistema: para evaluar la capacidad de la cámara de detectar y registrar la radiación
gamma incidente.
• Chequeo de funcionamiento total del sistema SPECT: para evaluar el funcionamiento total del sistema
tomográfíco, empl4eando un fantoma ( o maniquí) que permita caracterizar parámetros tales como
uniformidad topográfica, linealidad, resolución y contraste.
• La valoración de las imágenes se hizo de forma independiente por tres observadores al menos, el
diagnóstico final se determinará por la coincidencia de criterios independientes.
46
3.4. Respuesta humana contra el AcM mu riño (HAMA) o Contra la Porción llipervariable (Fab')
del AcM HUMANIZADO.
Para cada AcM estudiado por InGG se desarrolló un sistema ELISA especifico de reconocimiento, este fue
estandarizado y validado en los laboratorios del Centro de Inmunología Molecular.
Básicamente la respuesta humana contra el AcM murino fue evaluada de forma semicuantitativa,
correlacionando el reconocimiento del suero del paciente antes de ser tratado y posterior a la
administración del AcM marcado, en similares diluciones.
• Se obtuvo muestras de los pacientes evaluados previo tratamiento y 1, 2, 4, 8 y 12 semanas posterior a
la administración del radiofármaco.
• Se utilizaron placas de poliestireno de alta capacidad de enlazamiento para ELISA (enzime link
immunosorbent assay) (Placas ELISA 96 pozos fondo plano, Maxisorb: Costar, Cambridge, MA),
previamente recubiertas con el AcM (ior c5, ior cea 1, ior egf/r3 y hR3, este último fue fragmentado
con pepsina para obtener el Fab' a una concentración de 10 ug/mL), 50 uL por pozo en tampón
carbonato-bicarbonato pH 9.6. El recubrimiento se realizó durante toda la noche en cámara húmeda a 4
0C. El AcM hR3 se fragmentó con pepsina antes de su uso en la sensibilización de la fase sólida.
Para el caso de los pacientes tratados con hR3, se determinó la respuesta HAMA y la respuesta anti
idiotípica anti Fab' (utilizando como recubrimiento el fragmento Fab' del h-R3 humanizado con el
objetivo de encontrar una posible respuesta frente a la región hipervariable de este AcM, donde se
encuentran los residuos aminoacídicos murinos)
47
• Una vez lavadas por tres veces las placas con PBS/Tween 20, al 0.5%, se adicionaron 50 microlitos de
los sueros de los pacientes, pre y post tratamiento, en diluciones desde 1:100 hasta 1:2000. Se incubó
durante 1 hora a 37 0C, en cámara húmeda
• Luego de tres lavados con PBS/Tween 20, al 0.5 %, se añadió un conjugado anti IgG (especifico de
cadena gamma) y anti IgM (específico de cadena Mu) marcado con la Enzima Fosfatasa Alcalina
(Sigma Chemical Co. St Louis MO). La incubación se realizó similar al paso anterior. Las dilución
empleada para ambos conjugados fue 1/5000.
• Para revelar esta reacción se añadió sustrato de la enzima fosfatasa alcalina: paranitrofenil fosfato (1
mg/mL de tampón dietanolamina ph 9.8), durante 30 min. Se detuvo la reacción con NaOH 1 M, y se
leyó DO a 405 nm en un lector de placas ELISA (Organon Tecnican).
• Se utilizaron como controles negativos sueros de voluntarios sanos no tratados con AcMs y tampón
fosfato salino. Se utilizó como control positivo del estudio, suero de pacientes tratados con AcM que
habían levantado respuesta HAMA contra los mismos en otros ensayos clínicos. (Neninger E y cols.,
1995. Oliva JP y cols., 1995).
• El ensayo de respuesta HAMA se consideró positivo si la relación que se estableció entre la D O post
tratamiento con respecto a la del pre tratamiento (Indice HAMA) fue mayor o igual que 2. Indice
HAMA= DO post/ DO pre
3.5 Anticuerpos Monoclonales.
3.5.1 AcMs contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (anti r-EGF).
3.5.1.1. ior egf/r3 (IgG2a) : AcM murino, que reconoce el r-EGF con una constante de disociación Kd =
10-9 m y una constante de afinidad de 0.94+/- 0.8 xl08. (Fernández A y cols., 1989)
3.5.1.2. AcM h-R3 (IgGl) : AcM humanizado con capacidad para inhibir la unión del EGF a su
48
receptor similar al AcM murino, con una constante de disociación de 10-9 M. Tiene una constante de
afinidad de 1,12+/- 0.69 10 8 L/mol (Mateo C y cols., 1997).
3.5.2 AcMs contra antígenos asociados al cáncer de colon.
3.5.2.1. ior c5 (IgGl): AcM murino que reconoce al antígeno IORC2 asociado al cáncer colon (Vázquez
AM y cols., 1993, 1994)
3.5.2.2. ior ceal (IgGl): AcM murino que reconoce al antígeno tumor asociado CEA (antígeno
carcinoembrionario) altamente expresado en algunos tipos de neoplasias malignas fundamentalmente
colorrectales, ováricas y de mama
3.6. Administración del radiofármaco y diseño clínico del estudio.
3.6.1. Administración del Radiofármaco.
La administración del AcM marcado con 99mTc se realizó en forma de bolo endovenoso, dosis única, en la
vena antecubital Previa a la administración, y a las 4 y a las 24 horas posteriores a la administración del
AcM marcado se comprobaron los siguientes signos vitales del paciente, con el objetivo de evaluar la
toxicidad del producto:
Frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, tensión arterial y temperatura.
Las dosis administradas de 99mTc fueron similares para todos los AcM estudiados 40-50 mCi (14.8-1.85
GBq). Las dosis de AcMs empleadas variaron según el estudio clínico y el AcM estudiado.
De esta manera se emplearon las siguientes dosis del AcM:
ior egf/r3: 3 mg hR3: 6 mg ior c5: 1 mg ior ceal: lmg.
3.6.2. Diseño Clínico del Estudio.
Todos los estudios se realizaron de forma prospectiva. Se evaluaron 4 grupos de pacientes (Se dividirán
para su mejor comprensión en: 1. aquellos pacientes que se evaluaron con los AcM
49
• AcM muríno ior egf/r3: 148 pacientes estudiados con el AcM murino ior egí7r3, portadores de
tumores de origen epitelial de la cabeza y cuello, cerebro, tracto gastro intestinal (esófago, estómago,
intestino grueso en toda su extensión, recto sigmoides, canal anal y ano), sistema reproductor (ovario,
cuello de útero), pulmón, mama, fundamentalmente. Un grupo de pacientes presentó sintomatología
similar a la relacionada con el cáncer, sin embargo se comprobó por otros métodos imageneológicos que
no presentaban tumor), confirmados por anatomía patológica de la presencia de la enfermedad. Este
estudio se hizo abierto, prospectivo y no controlado. Un total de 109 pacientes estaban clasificados en
estadios III y IV (avanzados) de su enfermedad.
En la tabla II se muestra la clasificación histopatológica de los tumores estudiados. Los tumores más
frecuentes en esta población fueron los carcinomas epidermoides (75 pacientes) y los adenocarcinomas
(25 pacientes).
Tabla II. Clasificación Histopatológica del tumor Variedad Histológica Número de casos
Carcinoma Epidermoide 75
Adenocarcinoma 25
Carcinoma Ductal 12
Carcinoma Lobular 2
Astrocitoma 3
Glioma 5
Otros tipos de tumores epiteliales 6
Negativos* 22
Total 148
*1 Linfoma Iiodgking
50
En la tabla III se muestra la distribución de tumores por sexo y por de acuerdo a los resultados de la
biopsia.
En este estudio, a los 64 primeros pacientes evaluados se le realizó ensayos de hipersensibilidad con el
AcM marcado administrándose por vía subcutánea 0.1 ug del mismo, 30 minutos antes del ensayo
gammagráfico
• AcM humanizado hR3.:14 pacientes estudiados con el AcM humanizado hR3 portadores de
tumores de origen epitelial en las localizaciones Sistema Digestivo y Sistema Reproductor
fundamentalmente. Este estudio se hizo abierto, no controlado.
2. AcM dirigidos contra antígenos asociados al cáncer colorrectal.
• AcM ior c5: 59 pacientes estudiados con el AcM ior c5 con la dosis de 1 mg, portadores de tumores
colorrectales. Este estudio se hizo abierto, no controlado.
Resultados clínicos preliminares (Oliva JP y cois., 1994, 1993, 1995, 1998) mostraron la
Tabla III. Distribución de! tumor primario por sexo y órgano de acuerdo con la biopsia. Organo Femenino Masculino Total
+ - + - + -
Pulmón 13 2 49 8 62 10
Cabeza y cuello 0 0 23 1 23 1
Mama 17 3 1 0 18 3
Cerebro 7 4 1 2 8 6
Tracto Gastrointestinal 2 0 9 0 11 0
Otros órganos 3 0 1 2 4 2
Total 42 9 84 13 126 22
51
efectividad diagnóstica del AcM ior cea 1, esto le confirió el Registro de Medicamento en Cuba en el Año
1994 (ERM 763/94 No. 0729). Según diseños experimentales descritos en la literatura internacional (Behr
TM y cols., 1995) la combinación de AcMs en el diagnóstico de estos tipos de tumores podria hacer más
eficiente el diagnóstico final. Por esta razón, y conociendo el comportamiento del AcM ior cea 1 (Oliva JP
y cols., 1995, 1998) se desarrolló el siguiente ensayo clínico:
• Estudio Comparativo de los AcMs ior c5 e ior ceal en el mismo paciente: 80 pacientes en los
cuales se llevó a cabo un estudio a triple ciegas, aleatorizado, con la administración de los AcMs murinos
ior c5 e ior cea 1 con la dosis de 1 mg en ambos casos, administrados en el mismo paciente con una
semana de aclaramiento entre ambas InGG. En este caso el estudio se dividió en dos Grupos:
- Grupo A. Aquellos pacientes que recibieron el AcM ior c5 como primer AcM y el ior cea 1 como
segundo (43 pacientes).
- Grupo B: Aquellos pacientes que recibieron como primer AcM el ior ceal y como segundo el ior c5 (37
pacientes).
En este caso se evaluó el posible efecto en la eficiencia diagnóstica del orden de aplicación de los AcM en
el mismo paciente.
3.7. Evaluación de la eficacia y Estadística.
3.7.1. Criterio de Evaluación.
Para calcular los parámetros establecidos de sensibilidad, precisión, especificidad, valor predictivo positivo
y negativo, se utilizó como “patrón de oro” la biopsia de los tumores estudiados, ya sea de la lesión
primaria o de la metástasis.
Se utilizó para estos cálculos el paquete estadístico programa Stat Xact 3. para Windows 2000.
52
La sensibilidad, definida como la fracción de sujetos enfermos con resultados de InGG positiva (Luigi
Buraggi G, 1985), que nos demuestra la habilidad de la prueba de detectar casos positivos fue calculada:
S = _______ Verdaderos Positivos __________ x 100
Verdaderos positivos + Falsos negativos La exactitud diagnóstica (comúnmente denominada en
imagenología como Precisión), definida como la capacidad que tiene la InGG de evaluar correctamente al
sujeto en positivo o negativo, o relación entre los resultados concordantes ( Luigi Buraggi G , 1985), fue
calculada.
P = Verdaderos Positivos + Verdaderos Negativos x 100
Total de pacientes
La Especificidad, definida como la fracción de sujetos no enfermos con resultados de InGG negativa
(Luigi Buraggi G, 1985), fue calculada:
E = _________ Verdaderos Negativos x 100
Verdaderos Negativos + Falsos Positivos
El Valor Predictivo Positivo, definido como la fracción de InGG positivas que representan la enfermedad
(Luigi Buraggi G, 1985), fué calculado:
VPP = ________ Verdaderos Positivos x 100
Verdaderos Positivos + Falsos Positivos
El Valor Predictivo Negativo, definido como la relación entre todas las InGG negativas que representan la
ausencia de enfermedad (Luigi Buraggi G, 1985), fué calculado:
( Luigi Buraggi G, 1985)
VPN = _______ _ Verdaderos Negativos _________ x 100
Verdaderos Negativos + Falsos Negativos
53
Objetivo y variable principal: Diagnóstico Inmunogammagráfico (definido como captación relevante en
la zona de la lesión con respecto al fondo circulante).
Criterio de eficacia
Principal variable ("end point"): Se estimó teniendo en cuenta la relación que existió entre el numero de
conteos en la zona de la lesión y el número de conteos del fondo; para las imágenes planas, en los casos en
que no haya superposición, esta relación debió ser mayor que 1.5.
Se realizó el calculo de los parámetros no sólo teniendo en cuenta el total de pacientes estudiados, sino
también teniendo en cuenta las principales localizaciones estudiadas, por ejemplo: pacientes estudiados con
tumores de mama, de la cabeza y el cuello, de pulmón, y así sucesivamente
3.7.2. Estadístico
Plan de análisis estadístico: Para llevar a cabo el análisis de los resultados obtenidos, de forma tal que
permitiera la evaluación del cumplimiento de los objetivos específicos, se procedió como sigue:
1. Se comparó el resultado del diagnóstico inmunogammagráfico con el AcM con el obtenido a partir
del diagnóstico bien documentado y el “patrón de oro”. Con este fin se empleó la prueba exacta de
Fisher con un 90 % de intervalo de confianza.
2 Cuando se comparó el "patrón de oro" con la InGG, o el diagnóstico de dos AcMs en el mismo
paciente con la biopsia y entre si mismos se utilizó el Coeficiente de correlación Kappa Se
consideró que existía correlación entre ambas pruebas a partir de Kappa > 0.6. En todos los casos se
utilizó para la evaluación estadística el programa Stat Xact 3. para Windows. 3. Se compararon
entre sí los valores de la relación de actividad lesión tumoral /fondo circulante, obtenidos a partir de
las imágenes planas de medías geométricas adquiridas
54
a diferentes intervalos de tiempo, determinando el tiempo en que pudo visualizarse la imagen de mayor
calidad diagnóstica (mayor contraste). Con este fin se utilizará la prueba de análisis de varianza para
medidas repetidas y la t-student pareada de dos colas para comparar los pacientes con la variable
observada o transformada.
Para establecer la comparación entre la eficiencia diagnóstica entre los AcM ior cea 1 e ior c5 en el
grupo 4 de estudio asi como para establecer las diferencias significativas entre los carcinomas
epidermoides y los adenocarcinomas en el grupo donde se evaluaron los pacientes con el AcM ior
egf/r3 (grupo 1) se utilizó la Prueba Exacta de Fisher con un 90 % de intervalo de confianza utilizando
el programa Stat Xact 3 versión para Office 2000.
55
La InGG identificó 106 de 126 pacientes
portadores de tumores de origen epitelial y 22
de 22 negativos fueron diagnosticados como
Verdaderos Negativos (VN). La sensibilidad,
especificidad, precisión, valor predictivo
Figura 1. Resultados de la sensibilidad y la precisión
diagnóstica del AcM ior egf'r3 por localización
inmoral
4. RESULTADOS
4.1. Anticuerpos Monoclonales anti receptor del factor de crecimiento epidérmico.
4.1.1. Estudio por Inmunogammagrafía con el AcM Murino ¡or egf/r3 maracdo con 99mTc.
Radiomarcaje.
El AcM murino ior egf7r3 marcado a través de la reducción de sus puentes disulfuros por el método de
Schwarts tuvo una eficiencia de mareaje de 98.5 +/- 2.1 % según los controles de calidad realizados
previa a la administración en pacientes. Cuando la cromatografía fue desarrollada en solución salina, más
del 98.8 % de la actividad permaneció en el punto de aplicación. La formación de coloides (posibles
impurezas) determinada a través de ITLC fue menos del 1.5 % en todas las preparaciones.
Pacientes Estudiados.
Los resultados de las biopsias mostraron que 126 de 148 pacientes incluidos en este estudio presentaron
tumores de origen epitelial (85.1%), 22 fueron negativos a la presencia de tumores
(14.9%).
56
positivo y negativo de las imágenes.
inmunogammagráficas frieron: 84.1 %, 100 %, 86.5%, 100 % y 52.4 % respectivamente. Estos valores
fueron calculados a partir de los datos resumidos en la tabla IV.
En ninguno de los casos estudiados se encontraron falsos positivos, es decir, lesiones no coincidentes
con los resultados de la biopsia. Los resultados de sensibilidad y Precisión
Diagnóstica se resumen en la figura 1. En la tabla V se presentan los resultados de la eficacia
diagnóstica del ior egf7r3 marcado con 99mTc en cuanto a Especificidad y valores predictivos
(negativo y positivo), al ser empleado en InGG. Si se analizan por separado los resultados de las
inmunogammagrafias de los 109 pacientes en estadios avanzados de la enfermedad III y IV y las
localizaciones de pulmón y mama (tabla VI), las sensibilidades diagnósticas se incrementan
ligeramente pero este incremento no es estadísticamente significativo para una p< 0.05.
La expresión del r-EGF no es igual en la superficie celular de los distintos tipos de tumores epiteliales
(Morales A y cois., 2000). Por este motivo se calculó la sensibilidad y la precisión
Tabla IV Correlación entre los resultados del diagnóstico por histopatologia y los resultados encontrados por InGG con AcM 99mTc- ior e g f r S .
Localización Verdaderos (+) Falsos (-) Verdaderos (+) Falsos (-) Total
Pulmón 52 0 10 10 72
Mama 16 0 3 2 21
Cerebro 8 0 6 0 14
Cabeza y Cuello 17 0 1 6 24
Tracto
Gastrointestinal
10 0 0 1 11
Otros 3 0 2 1 6
Total 106 0 22 20 148
57
de la InGG con el ior egf7r3 marcado con 99mTc dependiendo de la clasificación histopatológica. La
sensibilidad y precisión para el diagnóstico de adenocarcinomas disminuye con respecto a los
carcinomas epidermoides para todas las localizaciones estudiadas, al igual que para mama y pulmón
por separado, con una significación estadística P< 0.05 % con la
prueba exacta de Fisher ( Figura 2).
Como se puede observar en la tabla 4 la probabilidad de que un paciente con resultado positivo sea
realmente positivo (VPP) fue, para todos los casos analizados, del 100 %, y Figura 2. Sensibilidad y
Precisión Diagnóstica del AcM ior egf7r3 según clasificación histopatológica.
teniendo en cuenta que no se detectan lesiones falsas positivas la especificidad de la prueba
Tabla I'. Eficacia diagnóstica del AcM ior cg f r 3 marcado con 99mTc en imágenes
inmunogammagráficas por las diferentes localizaciones estudiadas Localización tumor (coeficiente correlación Kappa)
Valor Predictivo (+)
Valor Predictivo (-) Especificidad
Pulmón 100 50 100.0 (0.6) (52/52) (10/20) (10/10) Mama 100 60 100 (0.1) (16/16) (3/5) (3/3) Cerebro 100 100 100.0 0 00) (8/8) (6/6) Sistema Digestivo 100
(10/10)
Cabeza y Cuello 100 14.3 100.0 (0.2) (17/17) (1/7 (1/1) Otros Sitios 100 66.7 100.0 (0.67) (3/3) (2/5) (2/2) Total 100 52.4 100.0
(0.61) (106/106) (22/42) (22/22)
58
Figura 2: Sensibilidad y Precisión Diagnóstica del AcM ior/r3 entre Adenocarcinoma y Carcinoma Epidermoide
inmunogammagráfica fue del 100 % para todas las localizaciones evaluadas.
Sin embargo el VPN es esta población alcanzó porcentajes bajos, ya que la probabilidad de que un
individuo con resultado negativo sea realmente negativo, no sólo va a depender de la predicción de la
InGG sino de la prevalencia . Tabla 17 Sensibilidad Diagnóstica del AcM 99mTc-ior eg f r 3 en 109 pacientes en estadios
De todos los órganos fuentes evaluados el hígado fue el de mayor captación, esto es debido a dos razones
fundamentales: 1. el alto número de receptores EGF presentes en la superficie de estas células (Iznaga-
Escobar N y cols., 1998), 2. El hígado es el órgano principal de catabolismo y metabolismo de las
proteínas radiomarcadas (Morales A y cols., 2000). Este es inmediatamente visualizado una vez
administrado el AcM y permanece visible 24 horas post
avanzados de la enfermedad.. Estadios III-IV VP del Total Sensibilidad (%)
Total de pacientes (93/109) 85.3 Pulmón (43/49) 87.8 Mama (14/16) 87.5
59
inyección (Morales A y cois., 1999). No se encontró acumulación selectiva en otro órgano o tejido,
excepto en la vía de excreción renal.
En la figura 3 se muestran imágenes planas
obtenidas a las 24 horas posterior a la
administración del radiofármaco de un
paciente con carcinoma epidermoide de
pulmón. En el puede observarse la captación
del AcM marcado en la lesión del pulmón
derecho comparado con el pulmón
contralateral.
Las figuras 4 y 5 muestran una metástasis
hepática, hipocaptante, no
identificada por otros métodos imagenológicos
con anterioridad
(lesión "fría”), procedente de un adenocarcinoma de
pulmón, inicialmente diagnosticado por InGG y una
acumulación del radiofármaco en un tumor cerebral
con alta expresión del r-EGF (glioblastoma grado II)
respectivamente.
En imágenes planas tardías fue posible realizar
Figura 4 Vistas anterior y posterior de una lesión hepática, metastásica, hipocaptante (lesión fría) pert ene-ci ente a un pacientes con tumor primario de Adenocarcinoma, no detectada previamente por la clínica
60
mejores diagnósticos, pero como se pudo observar en la tabla 4 , el coeficiente de correlación Kappa al
comparar la InGG con respecto a la Biopsia es muy bajo al igual que la sensibilidad
y la precisión. Sin embargo, se encontraron en las
imágenes de rastreo de lesiones no identificadas en
estos mismos pacientes, ganglios metastásicos,
hipercaptantes, que, al ser comprobada su histología,
coincidía con la malignidad.
Las lesiones metastásicas cerebrales fueron también
detectadas, procedentes fundamentalmente de tumores
de pulmón y de mama.
En los 106 pacientes diagnosticados como
verdaderos positivos (de un total de 126 pacientes
portadores de tumores), encontramos lesiones
metastásicas en 70 (75.26 %) con lesiones metastásicas (en algunos casos metástasis múltiples), 46 de
las cuales (65.7%) se identificaron antes de que
aparecieran síntomas clínicos o fueran reveladas
por otros métodos imagenológicos.
La figura 6 muestra la imagen de 24 horas
post administrado el radiofármaco, de una
paciente previamente operada de un
Figura 6. Vistas anteriores a las 24 hr post administración del radiofármaco de un Carcinoma Ductal de Mama Recidivante (izquierda), con un nuevo tumor en ¡a mama contralaíeral (derecha) .
61
Figura 7. Vista anterior de ¡a captación de1 AcM J J M T c ior e g fr3 en un carcinoma de ovario.
carcinoma ductal de la mama izquierda, con lesiones recurrentes en el sitio de la operación. En la otra
mama se observó un área de hipercaptación, comprobándose posterior-mente que existía una lesión
procedente de otro tumor primario del tipo carcinoma epidermoide.
Las imágenes SPECT de las lesiones aumentan la resolución de la misma y la calidad del diagnóstico,
los mejores resultados se encontraron en lesiones cerebrales, pulmonares y
hepáticas, donde se aprecia la extensión de
la lesión.
La figura 7 muestra un Carcinoma
Epidermoide moderadamente
diferenciado de Ovario, se manifiesta una
elevada hipercaptación en la región
abdominal. Este tumor estuvo previamente
confirmado por biopsia y clasificado como
infiltrante, etapa III.
Toxicidad y Reacciones Adversas.
No se encontraron eventos adversos frente a la administración del AcM ior egí7r3 marcado. No se
modificaron los signos vitales en los pacientes evaluados (frecuencia respiratoria, frecuencia cardiaca,
temperatura y presión arterial). No hubo cambios relevantes en la función de la médula ósea, el hígado o
el riñón posterior a la administración del radiofármaco. Respuesta Humana contra el AcM murino ior
egf/r3 (HAMA)
62
Se determinó la respuesta HAMA en los pacientes estudiados. En 30 de los 148 pacientes evaluados en
el estudio fue posible llevar a cabo el seguimiento por 12 semanas posterior a la administración del AcM
El 20 % de estos (6/30) desarrolló respuesta HAMA, uno de ellos mantuvo la respuesta, detectable con
anticuerpos, hasta 12 semanas después de la administración del AcM pero, el resto volvió a los niveles
pre tratamiento antes de las 8 semanas.
4.1.1. Estudio por ¡ n ni unoga mina grafía con el AcM humanizado hr3 marcado con
99MTC.
Luego de haber estudiado 148 pacientes con el AcM murino ior egf7r3, demostrándose su alta capacidad
de reconocimiento al r-EGF humano y conociendo de estudios pre clínicos previos que este es capaz de
reconocer un epitope localizado en el dominio extracelular del Receptor del EGF, bloquear el
enlazamiento del EGF a su receptor e inhibir la activación del receptor asociado a la enzima tirosina
cinasa (Fernández A y cois., 1989,1992), además la capacidad de inhibición de la proliferación de una
amplia variedad de líneas celulares en cultivo que sobre expresaban el receptor (Baum RP, 1994 ), se
decidió comenzar un estudio con fines terapéuticos.
Se llevó a cabo un esquema de tratamiento para un estudio de toxicidad según el esquema de Fibonace
modificado. Cada paciente recibió de tres a 4 dosis, nunca menos de 40 mg (según el ensayo clínico y el
esquema de tratamiento) en no menos de tres ocasiones hasta una dosis acumulativa final de 2000 mg
(Crombet T, 2000)
En ambos ensayos clínicos independientemente de la respuesta clínica, se observó desarrollo de la
respuesta HAMA en el 80 % de los casos estudiados.
Todo esto, y conociendo la posibilidad terapéutica que ofrecía este AcM, llevó a la
63
de humanizarlo, lo cual se hizo por trasplante de Regiones Determinantes Complementarias (CDR) del
AcM murino a un marco humano (molécula de IgG humana tipo IgGl), el AcM humanizado obtenido fue
al menos 16 veces menos inmunogénico que su versión murina por lo que se esperaría que la respuesta
en pacientes, luego de aplicarse en dosis reiteradas sería también menor. (Mateo C y cois., 1997).
La prueba de concepto de que el nuevo AcM humanizado reconocía tumores de origen epitelial en
pacientes portadores de los mismo sería a través de la InGG.
Radiomarcaje.
Para el AcM humanizado hR3 se empleó una metodología similar a la utilizada para el AcM murino ior
eg£/r3. Se logró una eficiencia de mareaje superior al 98 %, en este caso se marcaron 6 mg de AcM con
50-60 mCi de 99mTc. La formación de coloides fue menor del
1.5 %, determinada por cromatografía en ITLC impregnada en albúmina. Luego de probar la eficiencia
de mareaje se comprobó que este AcM mantenía su actividad biológica.
Pacientes Estudiados .
Se incluyeron 14 pacientes en el estudio, todos clasificados por histopatología como pacientes portadores
de tumores de origen epitelial. En todos los casos se analizó la toxicidad, efectos adversos y respuesta
HAMA.
En la tabla VII se muestra la diversidad de pacientes estudiados según localización de la lesión tumoral.
La Sensibilidad Diagnóstica del estudio en general fue del 83.3 %, con una precisión del 85.7 %. El VPP
fue del 100%, ya que no se encontraron casos falsos positivos en la muestra estudiada. Sin embargo el
VPN fue del 50 %.
De todos los órganos fuentes evaluados el hígado fue el de mayor captación. Este es inmediatamente
visualizado una vez administrado el AcM y permanece visible 24 horas post inyección. El hígado, bazo y
corazón fueron los órganos "fuentes" identificados como los más hipercaptantes.
64
Inmunogainmagrafía
En la figura 8 se muestran los resultados de sensibilidad y la precisión diagnóstica de del AcM
humanizado hR3 marcado con 99mTc, separado por las localizaciones estudiadas más representativas.
Si separamos los datos numéricamente, para una muestra pequeña de 14 pacientes a evaluar por InGG,
sólo se encontraron 2 casos FN, ambos en la localización del Tracto Gastrointestinal, más
específicamente recto, lo que representa un 14.2 %. Uno de estos casos estaba operado seis meses antes
de la InGG y se estaba buscando una posible lesión metastásica.
Tabla VIL Inclusión de pacientes en el estudio con el AcM humanizado hR3 según la localización del tumor primario.
Localización del tumor Pacientes
Incluidos
VP VN FP FN
Tracto gastrointestinal 9 5/7 2/2 - 2
Sistema reproductor 3 2/2 1/1 - -
Cabeza y Cuello - 1/1 - - -
Pulmón 1 1/1 - - -
Cerebro 1 - -
Total 14 - -
65
Figura 8. Sensibilidad y Precisión del AcM humanizado h-R3
En la figura 9 se muestra imágenes planas de un corte de cráneo (anterior, posterior y tomográfícas
SPECT de tórax) obtenidas a las 24 horas posterior a la administración del radiofármaco de un paciente
con carcinoma epidermoide de pulmón izquierdo como lesión primaria. Esta muestra la captación del
AcM marcado en la lesión del pulmón izquierdo comparado con el pulmón contralateral (figura 9 A ).
En este mismo paciente, se encontró un nuevo hallazgo: la imagen hipercaptante que se encuentra en la
imagen plana anterior de cerebro (figura 9 B) corresponde a una lesión metastásica no identificada
previamente en la clínica.
66
(a) (b)
Figura 9. Imagen de gammagrafica Je un paciente con carcinoma epidermoide de pulmón izquierdo (a), cón detección de una metástasis cerebral no identificada previa a la InGG (b).
Este paciente estaba refiriendo perdida de la memoria y trastornos en la conducta que se atribuía al
estado avanzado de la enfermedad maligna del pulmón y la edad (75 años). Luego de la InGG esta
lesión fue confirmada por TAC, corroborándose la extensión de la misma
En la figura 10 se presenta la acumulación del radiofármaco en un tumor del recto sigmoides con alta
expresión del receptor.
De los 10 pacientes evaluados como verdaderos positivos por coincidir los resultados de la biopsia con
la InGG, 7 presentaban lesiones metastásicas a distancia, 4 de ellas no identificadas previamente.
Figura 10. Paciente con adenocarcinoma de recto sigmoidel.
67
Toxicidad y Reacciones Adversas.
No se encontraron efectos adversos frente a la administración del AcM hR3 marcado con 50-60 mCi en
ninguno de los 14 pacientes estudiados. No se modificaron los signos vitales. No hubo cambios
significativos en la función de la médula ósea ni el hígado, posterior a la administración del
radiofármaco según los resultados del laboratorio clínico.
Respuesta HAMA y Respuesta Anti idiotípica frente a la administración del AcM humanizado hR3.
Se determinó la respuesta HAMA en los pacientes estudiados utilizando como anticuerpo de
recubrimiento en el sistema ELISA el ior egf/r3 (del cual quedan tres residuos aminoacídicos en la
molécula del humanizado hR3). En ninguno de los 14 pacientes que fueron inyectados con el AcM hR3
se encontró aparición de señal positiva anti IgM o anti IgG doce semanas después de la administración,
aun utilizando diluciones del suero 1/200.
No se encontró respuesta positiva en ninguno de los pacientes estudiados ni anti IgG ni anti IgM frente al
AcM murino intacto (Respuesta HAMA), ni frente al fragmento Fab' del hR3 humanizado), determinado
a través del método ELISA.
4.2. AcMs contra antígenos asociados al cáncer de colon.
4.2.1. Estudio por Inmunogammagrafía con el AcM Murino ior c5 marcado con 99mTc.
Radiomarcaje.
El AcM murino ior C5 marcado a través de la reducción de puentes disulfuros por el método de
Schwarst, tuvo una eficiencia de mareaje del 98.7 % ± 1.3 % según los controles de calidad realizados
previa a la administración del mismo en los pacientes. La formación de radiocoloides determinada por
ITLC fue menor del 1% y en la cromatografía en papel
68
(salina), indicativo de una translocación del isótopo al AcM a través del MDP(agente quelante).
Pacientes Estudiados.
Se evaluaron en el estudio 59 pacientes con los criterios de inclusión previamente establecidos, 48 de
ellos portadores de tumores de origen epitelial (adenocarcinomas y carcinomas epidermoides) en
diferentes localizaciones del colon (desde colon proximal hasta el distal, recto y ano). Se incluyeron 11
pacientes en el estudio, que aunque fueron portadores de tumores de colon, estaban libres de la
enfermedad en el momento de la InGG (ya fuera por cirugía previa o radioterapia en los casos del ano),
corroborados por otros métodos diagnósticos.
Inmunogammagrafía
En ninguno de los pacientes estudiados se encontraron resultados falsos negativos Los órganos fuentes
principales en los cuales se encontró hipercaptación del radiofármaco desde los primeros minutos
posteriores a la administración del ior c5 fueron: corazón (área cardíaca), hígado, bazo y macizo
maxilofacial.
La correlación entre los resultados de anatomía patológica y la InGG se muestran en la tabla VIII, la
sensibilidad final del ensayo fue de un 93.75 % y la precisión del 94.91 %. El VPP fue del 100% y el
VPN del 78.5 %. En tres pacientes con clasificación histopatológica positiva del tumor no fue posible el
diagnóstico por imágenes, ya que no se encontró hipercaptación en la zona de la lesión, estos
presentaban tumores en la localización de recto sigmoide bajo (2 pacientes) y ano (1 paciente) por lo que
fueron clasificados como falsos negativos.
69
El análisis de los datos de la localización del colon, sin tener en cuenta el recto sigmoides, canal anal
y ano, arrojó una sensibilidad de un 100 % al igual que la precisión, la especificidad y el valor
predictivo. En la figura 11 se observa esta diferencia, sobre todo para los tumores de origen epitelial
del ano.
Aunque la muestra de pacientes con carcinomas epidermoides evaluados fue muy baja (6 pacientes) 1
de ellos resultó falso negativo, presentando un tumor apreciable aún al examen físico. Al apreciar la
efectividad diagnóstica del ior c5 frente a los adenocarcinomas y los carcinomas epidermoides se
observa una diferencia estadística con un nivel de significación de p< 0.05 y un coeficiente Kappa de
concordancia de 0.57 (0.12;1.0), con una diferencia mayor del 10 % entre ambos (Figura 12):
En los 45 pacientes diagnosticados como VP, se apreciaron imágenes nítidas y precisas de la lesión
tumoral. Es interesante señalar que las lesiones de colon ascendentes, que por su localización tan
lejana en el colon proximal son difíciles de diagnosticar por otros métodos
Tabla VIII. Pacientes tratados con el AcM ior c5. Correlación entre los resultados de histopatologíay la InGG.
Localización del tumor. (Coef. Kappa)
VP FP VN FN Tota 1
S. %
P %
VVP %
VPN %
Colon ascendente (k= 1. 0)
5 5 10 100 100 100 100
Colon transverso (K= 1.0)
2 2 100 100 100 100
Colon descentende (K= 1 0)
4 1 5 100 100 100 100
Recto-sigmoide (K=0.72.36;1.0)
31 3 2 36 93.93 94.4 100 60
Ano (K= 0.66 0.10; 1.0)
3 2 1 6 75 83.3 100 66.6
Total (K= 0.84 1.68;1.0)
45 11 3 59 93.75 94.91 100 78.5
70
70
(recto-sigmoidoscopia, por ejemplo) ílieron "develadas" ante la cámara gamma con elevada precisión
diagnóstica En la figura 13 se pueden apreciar dos imágenes de adenocarcinomas
de colon ascendente ( tumor primario) como imágenes focales hipercaptantes. En la figura 13 B. se
puede observar además lesiones metastásicas a distancia a nivel de la zona inguinal, que se asociaron
con ganglios metastásicos y se comprobó por estudios inmunohistoqímicos.
Se encontraron lesiones metastásicas y recidivantes en 30 de los 45 pacientes diagnosticados como
positivos (66.6 %), en algunos de ellos más de una lesión metástasis.
Empleando la InGG, se observan lesiones que no habían sido diagnosticadas previamente por otros
métodos convencionales, tanto recidivantes como metastásicas (53 nuevas lesiones metastásicas, en
algunos, el hallazgo fue de más de una por paciente).
Fig 14A. Diagnóstico de lesiones metastásicas con el AcM ior c5. . Metástasis óseas.
Figura 14B. Metástasis cerebral no identificada previamente por otros métodos imagenológicos
en un paciente portador de cáncer de colon.
71
En la figura 14 se muestran las imágenes de un paciente previamente operado de un adenocarcinoma
moderadamente diferenciado de colon descendente, del cual se conocía que presentaba una metástasis
ósea relacionada con el tumor de origen (14-A), a nivel supraclavicular, sin embargo al hacer un rastreo
de todo el cuerpo con imágenes planas anteriores y posteriores, se pudo observar la presencia no sólo de
esta lesión, sino de otra a nivel de L-5 en columna lumbosacra y una cerebral (14-B), que se
correspondía con cambios de la conducta del paciente ( esta imagen fue comprobada por gammagrafia
ósea con MDP y TAC respectivamente).
En la figura 15 se puede observar una lesión metastásica hepática, clasificada como fría, que por su
carácter de lesión "fría”, se pudiera pensar en ausencia de irrigación sanguínea o presencia de una
cavidad necrosante dentro de la masa tumoral. Esta lesión fue catalogada como quirúrgica y se le pudo
realizar una hepatolobeptomía al paciente.
Las mejores imágenes por InGG con el AcM ior c5 fueron obtenidas entre las 4 y las 24 horas post
administrado el radiofármaco.
Figura 15. Lesión hipocaptante "firia" o nivel del hígado, encontrada con el AcM ior c5 en un paciente con un tumor primario del tipo adenocarcinoma.
72
Toxicidad y Reacciones Adversas.
No se encontraron efectos adversos en la administración del ior c5 marcado con 99mTc. Los signos
vitales de los pacientes incluidos en el estudio no sufrieron modificación antes de ser tratados y
posterior a la InGG. No hubo cambios significativos en la función de la médula ósea, higado o el riñón
una semana posterior a la administración de este anticuerpo. Respuesta Humana contra el AcM murino
ior c5 (HAMA).
En ninguno de los 59 casos estudiados la respuesta HAMA fue positiva, utilizando diluciones de los
sueros hasta 1: 2000, durante los tres primeros meses posteriores al tratamiento.
4.2.2. Estudio por inmunogammagrafía con los AcMs ior ce e ior cea 1 marcados con 99MTc.
Radiomarcaje.
El AcM murino ior C5, mostró similares características de mareaje en cuanto a eficiencia que para el
estudio anterior en cuanto a a estabilidad del enlace con el isótopo y pureza radioquímica, la eficiencia
de mareaje del 98.5 % ± 0.7 % según los controles de calidad realizados previa a la administración del
mismo en los pacientes. La formación de radiocoloides determinada por ITLC fue menor del 1% y en la
cromatografía en papel ascendente se vio que más del 99 % de la actividad permanecía en el punto de
aplicación (salina).
Para el caso del AcM ior cea 1, la eficiencia de mareaje fue similar con un 98.3 % ± 1.9 % y la
formación de radiocoloides determinada por ITLC menor del 1%. La cromatografía en papel ascendente
mostró más del 99 % de la actividad en el punto de aplicación (salina)
73
radiolocalizador, sin embargo su comportamiento como AcM fue similar a lo reportado para ellos
en estudios previos cuando eran administrados como primer AcM.
Los resultados se muestran en las tablas IX y la figura 16.
Las imágenes detectadas por ambos AcM fueron similares, aunque a través de observaciones de los
expertos en imágenes inmunoganmagráficas se definió una ligera diferencia entre el ior cea 1 y el ior
c5. Las imágenes del ior cea 1 presentaban en la mayoría de los casos estudiados un "fondo" de ligera
captación en médula ósea que no se encontraba en el ior c5.
En la mayoría de las lesiones evaluadas se encontró coincidencia diagnóstica para ambos AcM
evaluado (con ambos se reportaron diagnósticos similares), tanto para lesiones primarias como para las
metástasis y las recidivas Para el caso en que el ior c5 fue administrado como primer anticuerpo, se
encontró que no existió coincidencia diagnóstica entre este y el ior cea 1, siendo este último, capaz de
reconocer un tumor primario del tipo carcinoma epidermoide y dos lesiones metastásicas de la zona del
recto y canal anal, que no fue capaz de reconocer el ior c5 (Tabla X).
Toxicidad y Reacciones Adversas.
En ninguno de los pacientes estudiados por ambos métodos inmunogammagráficos se encontró
aparición de eventos adversos, frente a ambos AcMs. Los signos vitales de los pacientes incluidos en el
estudio no manifestaron cambios antes de ser tratados y posterior a las InGGs. No hubo cambios
significativos en la función de la médula ósea, hígado o el riñón una semana posterior a la
administración de ambos anticuerpos.
74
Grupo A (Kappa)
VP% VN % FN % FP % Tota1 S (%) P(%) VPP %
VPN %
ior c5 (K=0.86) (0.67; 1.0)
33 (76.74)
8 (18.6)
2 (4.65)
0 43 94.28 95.34 100 80
ior ceal (K=0.926) (0.78; 1.0)
34 (79.06)
8 (18 6)
1 (2.32)
0 43 97.14 97.67 100 88.8
Grupo B
ior ceal (K=0.67) (0.42;0.92)
24 (66.6)
8 (20.51)
5 (12.8)
0 37 82.75 86.48 100 61.5
ior c5 (K=0.67) (0.42;0.92)
24 (66.6)
8 (20.51)
5 (12.8)
0 37 82.75 86.48 100 61.5
Total 80
75
Respuesta Humana Contra los AcM murios ior c5 e ior ceal. (HAMA)
En ninguno de los pacientes estudiados se detectó respuesta de anticuerpos frente a los anticuerpos ior
c5 e ior cea 1 en ELISA. A cada paciente se le determino la respuesta frente ambos AcM, anti IgM y
anti IgG previo a la segunda InGG. En ningún paciente se detecto respuesta HAMA ni a los 7 días
posteriores a la primera InGG, ni durante los tres primeros meses posteriores al estudio
inmunogammagráfico.
Tobia X, Lesiones detectadas par InGG con los AcM ior cea ¡ e ior c5 en ambos grupos de estudio. TIPOS DE TUMORES
GRUPO A (ior c5 primero) GRUPO B primero)
(ior ceal
ior c5 ior cea 1 ior cea 1 ior c5 T. Primario coincidente
8 8 5 5
T. primario no coincidente
- 1 (C.Epidermoide)
- -
Matástasis coincidente
14 14 2 1 21
Metástasis 2 2 1 3 no coincidentes (ADC recto
sigmoide) (ADC recto, C.Epidermoide canal anal)
(ADC colon ascendente)
(ADC colon descendente )
Recidivas coincidentes
11 11 7 7
Recidivas no coincidentes
2 (ADC recto recto sigmoide)
Lesiones nuevas no diagnosticadas previamente
23 23 23 25
76
5. DISCUSIÓN
5.1. ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI RECEPTOR DEL EGF
5.1.1 Estudio por Innitinoganiniagrafia con el AcM Minino ior egf/r3 maracdo con 99mTc
El cáncer de origen epitelial es el más común en todo el mundo. Este tipo de tumor es el que liderea la
causa de muerte por cáncer en Cuba según los datos ofrecidos por el Registro NAcional de Cáncer en
Cuba en el 2001 y en el mundo (Parker SL, 1996, Sheryl L, 1996. Diagnósticos tempranos y
estadiamientos precisos previo a la terapia, así como la rápida detección de recurrencias pueden mejorar
el pronóstico y la sobrevida del paciente. El reconocimiento de las anormalidades moleculares que
participan en el desarrollo y progresión de los tumores provee una nueva oportunidad de mejorar los
procedimientos diagnósticos y terapéuticos.
Es conocido que la expresión aberrante del sistema r-EGF es particularmente importante en el desarrollo
de las enfermedades malignas de origen epitelial. Este hecho está asociado con baja sobrevida y mal
pronóstico de la enfermedad (Modjtahedi H, 1996, 1998). El desarrollo de AcMs contra elr-EGF
humano abrió nuevos horizontes para el diagnóstico y la terapia de las neoplasias de origen epitelial
(Fenger C. 1988, Faillot T, 1996, Brady LK, 1993).
Los resultados de este ensayo clínico demostraron la ausencia de reacciones adversas. A pesar de la
elevada captación del radiofármaco a nivel del hígado, los resultados del laboratorio clínico mostraron
no evidencias de daño hepático. En todos los casos el test de hipersensibilidad cutánea resultó negativo.
Resultados similares fueron obtenidos por Abdel -Nabi en 1990, quien consideró que esta prueba no era
saludable en los pacientes pues podía significar una dosis adicional por una vía diferente y motivar al
sistema inmune a desencadenar respuesta contra el
77
AcM posterior a la administración del radiofármaco, por estas razones, el resto de los pacientes
evaluados no fueron sometidos a la misma
En los 148 pacientes estudiados obtuvimos resultados similares a los del primer estudio fase I con el ior
egf/r3 (Rodriguez N, 1993). Se obtuvo un rápido aclaramiento plasmático donde solamente el 2.9 % de
la dosis inyectada permanecía en circulación una hora posterior a la administración del AcM (Iznaga-
Escobar, 1998). A este mismo tiempo, se observó una elevada concentración en bazo e hígado, órganos
fuentes principales en la biodistribución de este radiofármaco. La presencia de elevadas
concentraciones de receptores del EGF en estos órganos (hígado y bazo), además de la presencia en las
células tumorales es lo que favorece la rápida remoción de este anticuerpo de la circulación sanguínea
La respuesta HAMA fue detectada en 6 de los 30 pacientes estudiados. Esta respuesta fue transitoria y
desapareció antes de las 8 semanas post tratamiento. Sólo un paciente desarrolló títulos elevados aun a
las 12 semanas siguientes. Otros autores que han empleado estudios con AcM murinos anti han
reportado repuesta HAMA (Faillot T, 1996, Brady LK, 1991), con títulos altos y sostenidos. Esta baja
respuesta puede estar relacionada con las bajas dosis empleadas por paciente (sólo 3 mg de AcM) , el
rápido aclaramiento plasmático (Iznaga Escobar N, 1998), además de la inmunosupresión y terapias
previas a que estuvieron sometidos los pacientes evaluados (efecto secundario presente en pacientes en
estadios avanzados de la enfermedad)(Homer AF, 1999).
Divgi y cois demostraron que para el C225 marcado con In 111, dosis menores de 20 mg de anticuerpo
eran inefectivas en la localización tumoral. Este autor sugirió el uso de una cantidad adicional de AcM
"frío" para aumentar la sensibilidad de la InGG para saturar los receptores hepáticos y que el AcM
marcado llegara mejor al tumor.
78
Por otra parte, Modjtahedi y cois en 1996 (Modjtahedi H, 1996), reportó una interrelación entre la
cantidad libre de AcM en suero y la cantidad de AcM administrada para el AcM ICR 62. Nuestro
estudio demostró la capacidad del AcM ior egf/r3 marcado con 99mTc de detectar tumores primarios de
origen epitelial, sus metástasis y recidivas (Sensibilidad del 84.1 %). En los 148 pacientes evaluados, no
se encontraron falsos positivos, por lo que la especificidad fue del 100 %. El valor predictivo positivo
fue del 100 %, aun con la administración de dosis tan bajas como 3 mg de AcM, esto puede estar
relacionado con la alta afinidad del AcM por su receptor (Ka=0.94 ± 0.12 x 10 8 L/mol) (Fernández A,
1989), lo que propicia una elevada estabilidad del complejo anticuerpo-receptor en la superficie celular,
lo cual se manifiesta al observar imágenes hipercaptantes de la lesión tumoral no sólo en las primeras
horas posterior a la administración del producto, sino 24 horas post tratamiento.
La sobre expresión del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico ha sido reportada como una
característica frecuente en los tumores de mama (Hakomori S. 1985), tracto digestivo (McKensie IFC.
(1990), colorrectales (Levine DS, 1989, Stochi L, 1998), cabeza y cuello (Brunivels DJ.(1994), pulmón
(Suárez E, 1998) y otros tipos de cáncer. El incremento de este receptor en la superficie de la célula se
ha visto relacionado con un mayor grado de malignidad de la enfermedad, pobre diferenciación, mayor
grado de invasión y por consiguiente un mal pronóstico y menos sobrevida (Stochi L, 1998). También
hay reportes en estudios anatomopatológicos (Macias A, 1991) de una mayor expresión delr-EGF en
metástasis que en tumores primarios.
Por otra parte Fontanini y col en 1995, describió variabilidad de la presencia del receptor en la
superficie de las células acorde con la clasificación histológica de la malignidad y la variedad
histológica en estudios inmunohistoquímicos, demostrando que los Carcinomas Epidermoide
79
expresan mayor cantidad del R-EGF que los Adenocarcinomas. Nuestros resultados confirman estos
hechos, que hasta ahora sólo había sido demostrados en estudios anatomopatológicos (Yamamoto T,
1983, Rios MA, 1988, Fontanini, 1995, Chakrabarty, 1997), acercándonos a la biología del tumor "in
vivo", en el propio paciente, quedando demostrado con este ensayo clínico estudio al encontrar
diferencia significativa entre ambas variedades histológicas en el diagnóstico inmunogammagráfico
(figura 2). Los adenocarcinomas proceden de un epitelio simple glandular que en estado normal tiene
menor recambio celular y por tanto necesitaría menor expresión del receptor del factor de crecimiento
epidérmico, sin embargo los tumores de tipo carcinoma epidermoide proceden de un epitelio plano
estratificado, epitelio que tiene un recambio constante por su función y por consiguiente necesita una
mayor cantidad de receptores en su superficie celular (Fontanini F, 1995).
Por otra parte Rios y Cois 1985, 1992, Mantjtahedi y cois 1994, Lupu R, 1995 y Zhang L, 1995,
demostraron la expresión del r-EGF estaba significativamente elevada en carcinoma de mama y se
asociaba con el mal pronóstico de la enfermedad, la progresión tumoral y la resistencia a drogas. Estos
estudios fueron llevados en líneas celulares y en estudios anatomopatológicos. En 70 pacientes
evaluados por InGG con el ior egf/r3, se encontraron lesiones metastásicas (75.26 %), índice que apunta
a un mal pronóstico de la enfermedad. De estas, 46 de ellas (65.7%) fueron hallazgos de la InGG, pues
no habían sido previamente identificadas por la clínica, y algunas de ellas sin sintomatología clínica.
Estos hallazgos permiten al oncólogo reevaluar la conducta clínica a seguir frente al enfermo, en
ocasiones incluso, se hace necesaria una cirugía inmediata, la aplicación de un esquema diferente de
citostáticos o la administración de radioterapia en la nueva lesión, que podría alargar la vida del
paciente.
80
En este estudio se reportaron 20 pacientes falsos negativos, 10 de ellos tenían tumores de pulmón y 6
tumores de cabeza y cuello. Algunos autores (McKensie IF, 1990, Holmer AF, 1999, Hakomori S,
1985) han reportado una importante heterogeneidad en la expresión de r-EGF en los tumores de origen
epitelial a través de estudios inmunohistoquímicos, la presencia del receptor también depende de la
etapa de la enfermedad y del tipo histológico como se discutió previamente. Adicionalmente el tejido
normal de algunos órganos (hígado, bazo, corazón, riñón y otros) cercanos a la lesión pueden tener
elevada emisión de radioactividad por la biodistribución del AcM y esto dificultar la detección de la
lesión por interposición de imágenes, tal es el caso del area cardiaca, macizo maxilofacial, hígado etc.
Desafortunadamente no fue posible demostrar la expresión del por inmunohistoquímica en los pacientes
que resultaron falsos negativos. La biodistribución normal en macizo maxilofacial del ior egf7r3
(Iznaga-Escobar N, 1998), debido a la irrigación sanguínea presente en esta zona hace difícil el
diagnóstico de los tumores de cabeza y cuello en las primeras horas post administrado el producto, esta
puede ser además la causa por la cual la sensibilidad y precisión diagnóstica para esta localización fuera
tan baja (75.4 % y 83.3 % respectivamente). La elevada irrigación sanguínea de la región facial,
favorece un marcado fondo radioactivo en esta área, que enmascara las lesiones de esta zona cuando se
toman imágenes planas anteriores y posteriores. Las imágenes tomográficas para la cabeza y el cuello,
mejoraron la resolución en aquellos casos que presentaban lesiones metastásicas en ganglios
adyacentes, claviculares, supraclaviculares, axilares entre otros, pero de igual manera, las lesiones
primarias de lengua, base de lengua, paladar duro, entre otras presentes en esta zona, no pudieron
detectarse. Estas localizaciones son fácilmente diagnosticadas por examen físico y estudios
anatomopatológicos. El valor diagnóstico de la InGG para estos tumores, esta en la detección de
metástasis a distancia. También resultaría útil al ser empleada para demostrar el
81
reconocimiento del AcM por los receptores del tumor con vista a la Inmunoterapia (Crombet T, 2000),
pero reiteramos que para el cáncer de la cabeza y el cuello, seria posible la toma de muestra y la
determinación de la expresión del receptor del EGF por inmunohistoquímica y no por InGG
Este aspecto técnico, pudo ser una de las razones por lo que el Valor Predictivo Negativo de la InGG
para este AcM resultara tan bajo (52,4 %), ya que 6 de los 20 casos falsos negativos diagnosticados en
el estudio pertenecian a esta localización, lo que significo un VPN del 14.3 % para estos tumores.
En esta misma situación se encuentran los tumores de pulmón. Técnicamente, todos aquellos tumores
pulmonares cercanos al área cardiaca o que se superponen con esta, no pueden ser diagnosticados, pues
la intensidad de la emisión en la zona del corazón es muy alta y enmascara la posible emisión de la
lesión tumoral (en esta área se concentra la sangre, en la que está presente el AcM marcado circulante
en sangre periférica, (Iznaga-Escobar N, 1998). El VPN para esta localización fue del 50 % con 10
casos falsos negativos. Las imágenes tomográficas mejoran la resolución al ser tridimensionmales, al
hacer los cortes longitudinales, sagitales y coronales se aprecia la extensión del tumor, pero de igual
manera, los tumores cercanos al corazón pueden dar lugar a diagnósticos imprecisos
Por último, analizando las dificultades técnicas de la InGG en el presente estudio, encontramos que los
tumores de la mama deben estudiarse no sólo con imágenes planas anteriores y posteriores e imágenes
tomográficas. Se constató, que la posición de cubito supino provoca superposición de estructuras
orgánicas funcionales, encontrándose similares deficiencias a las que se detectaron para el pulmón.
Aquí constatamos, que la posición más adecuada para la toma de las imágenes de mama, es de cubito
prono, con las mamas colgantes (sin apoyo), haciéndose
82
tomas laterales y oblicuas e imágenes tomográficas (SPECT) en similar posición Esta sugerencia queda
para próximos estudios de InGG. Los datos que se reportan en este trabajo se tuvieron con imágenes
planas anteriores y posteriores en posición de cubito supino y aunque fue posible lograr el diagnóstico
certero de los casos diagnosticados como verdaderos negativo y verdaderos positivos, no se encontró
tumor en 2 de las 18 pacientes portadoras.
Trabajos previos han demostrado que algunas líneas celulares de tumores de origen epitelial muestran
un comportamiento altamente agresivo (Huang H, 1992), produciendo y secretando ambos factores de
crecimiento EGF y TGF, y algunas de estas lo utilizan de forma autocrina vía de la superficie de esta
propia célula (el mismo receptor susceptible a ser bloqueado por AcM anti), esta podría ser una
explicación para el hecho de no encontrar pues podría estar bloqueado por su ligando. Existen otras
células que utilizan el vía intracrina porque existe expresión intracelular de secuencia de RNA para el
mismo y sin embargo, este no esta presente en la superficie celular (Chakrabarty S., 1995, Rajagopal S.,
1995). Esta podría ser una de las causas por la cual algunos tumores de origen epitelial evaluados en
este estudio clínico, no tengan reconocimiento del AcM ior egí7r3 y en la evaluación
inmunogammagráfica resulten pacientes falsos negativos.
Los resultados muestran una correlación satisfactoria entre la sensibilidad de la InGG con ior egf/r3 y el
diagnóstico anatomopatológico de los tumores evaliados (gliomas y astrocitomas) en los que se reporta
una elevada expresión del (Libermann TA, 1984, Feldkamp MM, 1997)
La sensibilidad diagnóstica para la InGG en los tumores cerebrales fue del 100 % en los 14 pacientes
estudiados. La alta expresión del R-EGF en tumores cerebrales de origen epitelial han convertido a esta
molécula en un blanco selectivo para la radioinmunoterapia con AcM (Snelling L, 1995). Todos los
tumores evaluados por InGG con el AcM ior egf/r3 fueron
83
correctamente identificados, mostrando imágenes focales nítidas y precisas que permitieron, con las
imágenes tomográficas, mostrar la extensión y profundidad de la lesión. Si bien es cierto que existen
otros métodos imagenológicos muy sensibles para el diagnóstico de los tumores cerebrales como la
Tomogratla Axial Computarizada, Gammagrafias con compuestos Marcados como el 99mTc MIBI y
99mTc-DTPA (Koranda P, 1998), la InGG avala el criterio no sólo de la extensión de la lesión, sino
también de sus características funcionales en cuanto a la expresión del receptor, que por demás, se
relaciona progresión tumoral (Baselga J, 2000), angiogenesis (Wells A, 2000, Kerbel RS, 1998)) e
inhibición de la apoptosis (Woodbum JR, 1999). El reconocimiento del AcM ior egf/r3 marcado con
99mTc a su receptor, en los tumores cerebrales estudiados (glioblastomas y astrocitomas), constituye
una evidencia previa para el diseño de ensayos clínicos de radioinmunoterapia localizada, previendo
que el AcM marcado con isótopos radioactivos de emisión beta, como el 90Y y el 188Re, sean
administrados localmente y se enlacen específicamente a su receptor (R-EGF), ejerciendo el isótopo su
acción radiolítica y el AcM su acción inhibitoria del crecimiento celular.
Por otra parte la detección por InGG con el ior egf/r3 de metástasis cerebrales, procedentes de tumores
de pulmón y mama, son herramientas útiles en la conducta clínica a seguir frente al paciente Estas,
generalmente, fueron encontradas, antes que el paciente presentara sintomatología clínica.
Se encontraron lesiones hepáticas metastásicas , en algunos caso, como se muestra en la figura 4, de
tipo hipocaptante (lesiones frías). El hecho de que no se encuentre captación en algunas imágenes puede
estar dado, entre otros factores: por la no expresión del receptor del EGF en este tipo de tumor ya sea
por estar muy indiferenciado o ser una metástasis procedente de un adenocarcinoma (los cuales
expresan menos el r-EGF). Por otra parte, al ser el hígado una zona
84
tan irrigada, el hecho de presentar un tumor, el cual tiene un patrón de irrigación diferente al órgano,
podría repercutir en la hipocaptación del área tumoral en relación al tejido normal que lo rodea Por
último, en ocasiones, el tamaño de la lesión es tan grande, que la zona central podría encontrarse
necròtica por la ausencia de irrigación sanguínea (no siempre los procesos de angiogénesis ocurren a la
velocidad necesaria para ir a la par con el crecimiento de la masa tumoral, el alto grado de hipoxia en
los tejidos, provoca muerte celular), al no presentar una red vascular por donde circule el AcM, ni
receptores donde enlazarse, esta zona queda “fría”, sin radioactividad
El hecho de contar con un AcM que reconozca específicamente un receptor asociado al crecimiento y
progresión tumoral no sólo desierta interés para el diagnóstico, sino también la terapia, ya sea por
radioinmunoterapia o terapia pasiva. Sin embargo, este AcM es de origen murino, la respuesta HAMA
desarrollada en el 20 % de los pacientes estudiados (aunque de corta duración) y la aparecida en
ensayos clínicos terapéuticos posteriores (Crombet T, 2000), donde se desarrollaron altos niveles de
anticuerpos humanos contra el AcM ior egf7r3 al ser administrado en dosis repetidas (Solassol L,
2001), hizo necesario la humanización del mismo.
5.1.2. Estudio por inmunogammagraiia con el AcM humanizado hr3 marcado con 99mTc.
Los resultados clínicos presentados en el acápite anterior mostraban la alta capacidad de
reconocimiento del AcM murino ior egf7r3 a su receptor, sin embargo la aparición de respuesta
HAMA, no ya en los estudios realizados por InGG, sino en los primeros estudios fase l ejecutados en la
clínica (Crombet T, 2000), donde si bien es cierto que el AcM proporciono respuestas parciales
curativas y un mayor tiempo de sobrevida de los pacientes estudiados, la respuesta HAMA se desarrolló
en el 80 % de los pacientes estudiados, con niveles elevados
85
desde la primera semana posterior a administrado el producto e incluso, se constató además un shock
anafiláctico en una paciente con un glioblastoma multiforme, a la cual, además de administrársele 3 mg,
en dos ocasiones para realizar InGG se le suministraron dos dosis de 40 mg del AcM murino. Esta
paciente presentaba niveles elevados de respuesta HAMA anti IgG.
En 1997, Mateo y cois, lograron la humanización del AcM murino ior egf/r3. Este AcM, que conserva
tres residuos aminoacidicos en su región hipervariable dentro de un marco humano, mantenía similares
características de reconocimiento al Receptor de EGF humano, en ratones atímicos (Morales A, 1999)
trasplantados con la línea celular H125 de adenocarcinoma de pulmón. La eficiencia de mareaje de este
AcM humanizado fue similar que para el murino, manteniendo una estabilidad de enlazamiento al
99mTc superior a las 24 h con una eficiencia de mareaje superior al 98 % (morales A, 1999).
Con estos resultados se decidió aplicar este AcM en los pacientes con tumores de origen epitelial en
diferentes localizaciones, la dosis propuesta fue de 6 mg de AcM, doble a la utilizada con el AcM
murino ior egf/r3 debido a que este AcM es una molécula humana, por lo que el sistema inmune la
’’rechazaría" menos que a una molécula de ratón, por lo que al aumentar la dosis, se lograría una
efectividad diagnóstica mayor sin afectar la toxicidad en el paciente.
Es importante señalar que el número de casos estudiados es muy pequeño y que estos estudios pudieran
continuar, pero hay que considerar que la idea principal para éste trabajo, era evaluar, como criterio de
reconocimiento biológico del tumor (Prueba de concepto) si el AcM humanizado hR3 era capaz de
reconocer tumores de origen epitelial "in vivo" para ser empleado posteriormente en la práctica clínica
terapéutica.
En ninguno de los casos se apreció toxicidad.
86
La biodistribución normal en macizo maxilofacial del hR3 debido a la irrigación intensa sanguínea
presente en esta zona hace difícil el diagnóstico de los tumores de cabeza y cuello al igual que el ior
egf/r3, en las primeras horas post administrado el producto La localización mas estudiada fue la del
Tracto Gastrointestinal, donde se estudiaron 11 casos: 1 esófago, 2 estomago, 1 páncreas, 1 ano y 6 de
recto. Los dos casos falsos negativos que se encontraron en el estudio fueron en recto. La variedad
histológica de estos dos pacientes fue carcinoma epidermoide de recto, sin embargo, Fenger y
colaboradores en 1988, publicaron un estudio donde demostraron que en el recto y el recto sígmoide,
existe un epitelio de transición que va de un cambio abrupto de un epitelio simple a un epitelio
estratificado, transitando por diferentes características morfológicas hasta la zona transicional anal, la
cual presenta en su parte superior una mucosa similar a la colorectal y en su parte inferior un epitelio
escamoso ininterrumpido, hasta llegar al epitelio plano estratificado no queratinizante que esta en el
borde anal En esta zona pueden encontrarse muchas variantes epiteliales, que a su vez pueden tener
modificada la expresión de los receptores, en alguna de ellas la superproducción de mucus, favorece la
excreción de mucinas y carbohidratos. Aquí los tejidos secretores no son de células caliciformes sino de
células glandulares, las cuales tampoco tienen una sobre expresión del r- EGF. Con toda esta diversidad
de expresión en la zona transicional del recto-canal anal, pensamos que se puede afectar la efectividad
diagnóstica del AcM, ya que es posible encontrar tumores con variedad histológica de carcinomas
epidermoides en que la expresión del EGF este modificada.
Por otra parte la posición de cubito supino dificulta la observación de las lesiones en el ano y canal anal
por superposición de las imágenes planas, principalmente las de la vejiga, que por ser el órgano
fundamental de excreción de los productos del metabolismo, (incluyendo la
87
radioactividad) es un órgano fuente hipercaptante. Estas lesiones pueden ser diagnosticadas con mayor
facilidad por otros métodos diagnósticos como la recto-sigmoidoscopia, colonoscopía y el tacto rectal,
facilitándose además con estas técnicas, la toma de muestras para la biopsia y futura confirmación
anatomopatológica.
Si bien es cierto que la sobre-expresión del R-EGF esta bien demostrada en tumores gástricos y
colorrectales (Yasui W, 1988, Kaklamanis L, 1992), el diagnóstico por InGG se hace más útil para el
oncólogo, cuando se evalúan lesiones del colon derecho y transverso, localizaciones de mas difícil
acceso por las técnicas habituales empleadas en el estudio del cáncer colorrectal. Por otra parte, la
detección en estadios muy incipientes de lesiones metastásicas a distancia o recidivas locoregionales,
son los aspectos más estimulantes a tener en cuenta al indicarle a un paciente con cáncer colorrectal una
InGG con anticuerpos anti R-EGF, si tenemos en cuenta que este rceptor esta muy relacionado con los
procesos de metastización a distancia y proliferación celular.
Si en la evaluación de nuestros resultados, prescindimos de la localización de recto, la sensibilidad y
precisión del estudio sería del 100 %.
Se pudo constatar en este estudio la capacidad de AcM de detectar metástasis a distancia, relacionando
la sobre expresión del a la malignidad del tumor. Así, de los 10 pacientes verdaderos positivo, 7 de ellos
presentaban metástasis, 4 de ellas no identificadas previamente. Como se observa en la figura 11, las
metástasis cerebrales son claramente identificadas, aun cuando la barrera hematoencefálica y la barrera
del propio tumor son obstáculos para el libre acceso del AcM a sus receptores antigénicos. Estos
resultados también han sido reportados por otros autores (Faillot T, 1996, Brady LK, 1991)
Con el AcM humanizado se constata al igual que con el ior egf/r3, que la expresión aberrante del
88
esta asociada al mal pronóstico de la enfermedad (Ríos MA, 1992, Modjtahedi H, 1994) siendo este un
marcador biológico "in vivo" de la actividad funcional del tumor con respecto a su pronóstico posterior.
Se ha visto que todos aquellos casos en etapas avanzadas en los que se han encontrado lesiones
metastásicas a distancia, tienen una expectativa de vida estimada por los clínicos muy corta
5.1.3. Consideraciones finales del estudio por Inmunogammagrafia con AcMs anti Receptor del
Factor de Crecimiento Epidérmico en el diagnóstico de tumores de origen epitelial.
La técnica de InGG con AcMs está siendo empleada en el mundo unos pocos anos después que Köhler
y Milstein desarrollaron el primer AcM en 1975.
La sobre-expresión del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano esta asociado con
pobre sobrevida y mal pronóstico debido a las ventajas de sobre crecimiento e incremento de la
invasividad de estos tumores (Feldkamp M, 1999, López O, 2000)
El ha devenido en blanco para la terapia de los tumores de origen epitelial desde que se han obtenido
AcMs con alta capacidad de enlazamiento y bloqueo del receptor, encontrándose en diferentes ensayos
clínicos en el mundo remisiones parciales y completas de estos tipos de tumores con un aumento de la
sobrevida.
Nuestros resultados tanto con el AcM murino ior egf/r3 como con el AcM humanizado h-R3
demuestran que contamos con dos AcM útiles para radioimmunolocalizar tumores de origen epitelial de
diferentes localizaciones con alta sensibilidad, especificidad y precisión.
El alto valor predictivo positivo de estos AcM, por el hecho de no reportarse en ninguno de los 166
pacientes estudiados con estos AcM anti r-EGF un caso falso positivo, le confieren un lugar importante
como posible inmunoradiofármaco para tumores de origen epitelial en la sistemática
89
diagnóstica, con la posibilidad de detectar, en una sola técnica, no sólo el tumor primario, sino, sus
posibles metástasis a distancias (Akslen LA, 1993, Brady LK, 1991 y recidivas locorregionales en un
rastreo de cuerpo entero, con la cámara gamma
Todos aquellos pacientes que sean positivos a la InGG, podrían ser tributarios de una terapia pasiva,
neutralizante con el AcM h -R3, versión humanizada y menos inmunogénica que ha demostrado su
eficacia de reconocimiento de tumores de origen epitelial.
El CECMED, luego de evaluar los resultados de los estudios clínicos efectuados con el ior egf/r3 le
otorgó el Registro de Medicamentos como radiodiagnósticador a la formulación en solución del mismo
en 1994 y a la formulación liofilizada en 1999.
En estos momentos se llevan a cabo varios ensayos clínicos Fases II Terapéuticos con este AcM (h-R3)
en pacientes con tumores de cabeza y cuello y cervix.
El 15 de Febrero del 2002 el CECMED, agencia regulatoria cubana de medicamentos, otorgó por
primera vez en Cuba, un Registro temporal al AcM anti r-EGF humanizado h-R3 para ser utilizado
como medicamento en pacientes portadores de tumores de cabeza y cuello.
5.2. AcMs CONTRA ANTIGENOS ASOCIADOS LA CANCER DE COLON.
5.2.1. Estudio por Inmunogammagrafía con el AcM Murino ior c5 marcado con 99mTc.
Según las estadísticas del Registro Nacional de Cáncer en Cuba, 2001, el colon es la tercera causa de
muerte por cáncer en el país y la segunda causa en los Estados Unidos con 54 900 casos de muerte en
1998 (Holmer AM, 1999). La distribución de las neoplasias de colon ha cambiado de principios del
siglo XX (neoplasias colon proximal o colon descendente) hasta la fecha (neoplasias de colon distal o
colon ascendente), lo que trae consigo dificultades en el diagnóstico, debido a que las técnicas
empleadas como la rectosigmoidoscopia y la
90
colonoscopia, son muy invasivas para el pacientes y en ocasiones no es posible llegar a la lesión. Según
la Sociedad Americana de Cáncer en 1996 la supervivencia a los 5 años de estos pacientes fije del 7%
(Sheryl SL, 1996),
Numerosos estudios han sido reportados con AcMs murinos contra antígenos asociados al cáncer de
colon (Oliva JP 1994, 1995, Krause BJ, 1997, Baum RP, 1989), marcados con diferentes isótopos
radioactivos para el diagnóstico temprano de lesiones malignas, metástasis o recidivas post quirúrgicas,
sin embargo se va a la búsqueda de nuevos antígenos asociados a esta localización, con el objetivo, no
sólo de encontrar una herramienta diagnóstica sino también terapéutica para esta patología.
Durante muchos anos las investigaciones han estado encaminadas a la búsqueda de un Antígeno Tumor
Especifico, esto no ha sido posible, debido a que la mayoría de las moléculas que se identifican como
marcadores en un tipo específico de tumor, juegan un determinado papel biológico, ya sea en ese u otro
tejido, en la etapa adulta o en la etapa fetal, por lo que se trabaja básicamente en conocer, no ya la
especificidad única de la molécula, sino en la identificación del "rol biológico" que esta desempeña en
el tejido.
El IOR C2 es un antígeno asociado al cáncer de colon que aunque no se ha logrado identificar su
función en la célula, se conoce que su sobre-expresión apical en las células tumorales, así como la
disminución en la excreción luminar en los pacientes portadores de tumores con respecto a individuos
sanos, hace pensar en una posible relación funcional entre este y la malignidad de la célula. Este
antígeno se ha visto asociado al 83 % de los adenocarcinomas de colon estudiados. (Vázquez 1992,
1994).
Estas características del IOR C2 fueron posibles identificarlas con el uso de un panel de AcM dirigidos
contra el mismo, entre los que se encuentra el ior C5, subclase de InGG 1 de ratón,
91
capaz de identificar este antigeno tanto en estudios inmunohistoquimicos como en cultivos celulares y
fluidos biológicos (Vázquez, 1992).
El AcM ior c5, el cual reconoce el antigeno tumor asociado IOR C2, con un intenso mareaje
inmunohistoquimico, se convirtió en un blanco de estudio para la InGG en tumores colorrectales. Con
estos resultados se decidió hacer un estudio por InGG con el AcM marcado con 99mTc en pacientes
portadores de tumores colorrectales, confirmados histopatológicamente, para comprobar la capacidad de
reconocimiento del ior c5 a su antigeno tumor asociado "in vivo”.
La estabilidad de mareaje de este AcM con el isótopo radioactivo 99mTc permitió estudiar los 59
pacientes portadores de tumores colorrectales presentados en este estudio. Se utilizó la dosis de 1 mg de
AcM debido a que este antigeno esta restringido sólo a determinados tejidos por lo que su
biodistribución estaría dirigida sólo a aquellos sitios donde este sobre expresado. Los órganos blancos
hipercaptantes fueron fundamentalmente el hígado, el área cardiaca y el bazo. Otros autores han
reportado similar distribución de los AcM asociados al cáncer de colon, debido a la permanecía de una
parte del mismo en circulación sanguínea al menos durante las primeras 12 horas, luego de aclararse por
vía hepatobiliar y renal (Oliva J, 1994, Goldenberg D, 1989, Willkomm P, 2000, Hller DG, 2001).
Pudiera pensarse que dosis tan pequeñas no permitirían un diagnóstico adecuado, pero como se conoce
que este antigeno, expresado en las células tumorales, se ubica en la superficie celular, la reacción Ag-
AcM marcado, se mantiene en la membrana de la célula y esto proporciona un "mareaje "in vivo del
contorno del tumor a través de las membranas de las células que lo conforman. El tiempo de vida media
alfa de 0.207 horas +/- 0.059 horas (vida plasmática), demuestra que rápidamente el AcM ior c5 va a un
segundo compartimiento para radiolocalizar su antigeno, por lo que no hay interacción inespecífica con
92
otros antigenos en el organismo.( lznaga-Escobar N, manuscrito en preparación)
Vázquez y cols en 1994, en un estudio de reconocimiento inmunohistoquímico de este AcM en tejidos
normales mostraron que este era capaz de reconocer toda la mucosa del colon con un mareaje
citoplasmàtico homogéneo fuerte, de igual manera que sucede en la mucosa adyacente a los tumores, en
contraste con el mareaje heterogéneo de los tejidos de adenocarcinomas de colon, con un intenso
mareaje apical. Esto se asoció con una posible glicosilación aberrante que ocurre durante la
transformación maligna de las cadenas de carbohidratos de las glicoproteínas (Hakomori S, 1985,
MacKensies, 1990). Se tuvo temor, por este reconocimiento en tejidos normales, que la InGG no
resultara eficiente por la posibilidad de que se detectaran lesiones falsas positivas o que no se
encontraran diferencias entre las lesiones tumorales y el tejido normal
La sensibilidad diagnóstica de este AcM, si no tuviéramos en cuenta las localizaciones bajas del sistema
digestivo (recto-ano) fue del 100 %, todos los pacientes incluidos con tumores de colon fueron
diagnosticados como verdaderos positivos. No se encontraron lesiones falsas positivas y por otra parte
fueron diagnosticadas 53 nuevas lesiones metastásicas, no previamente encontradas por otros métodos y
sin sintomatologia clínica. Schumann en el año 2001, habló de la posibilidad real de los AcM de
diagnosticar micrometástasis, debido a que ellos actúan independientemente al ciclo celular, sólo
dirigido su reconocimiento por la identificación e interacción con su antígeno, presente en la mayoría de
los casos en la superficie celular, además de que las células de las micro metástasis pueden estar en
estado "silente" o de "hibernación" y son resistentes a los agentes quimioterapéuticos o metabólicos.
Esto, asociado con la distribución apical de este antígeno en las células de los adenocarcinoma
(Vázquez AM, 1994), favorece la detección de lesiones micrometastásicas aun en etapas muy
tempranas. Esto le ofrece un
93
importante papel como diagnosticador a este AcM debido a que el cáncer de colon, en muchas
ocasiones es operable, pero, la mortalidad se asocia fundamentalmente con la aparición de metástasis a
distancia, las que en la mayoría de los casos son detectadas en etapas muy avanzadas e invasivas donde
no se puede tomar una conducta terapéutica curativa, sino paliativa
En 16 de los 59 pacientes evaluados con el AcM ior c5, donde se encontraron lesiones metastásicas
nuevas, se cambió la conducta terapéutica que se estaba aplicando hasta ese momento. Se encontraron
lesiones ocultas a la clínica, se detectaron lesiones tan diferentes como óseas y cerebrales lo que
demuestra la alta especificidad de reconocimiento del ior c5 a su antígeno, pues a pesar de que las
metástasis óseas no son metabólicamente muy activas y que las lesiones cerebrales tienen la barrera
hematoencefálica que pudiera retardar la llegada de anticuerpos a esta zona, las imágenes con ior c5 en
estos casos fueron muy precisas desde las 4 horas posteriores a la administración del mismo.
No sugerimos que la InGG con el ior c5 sea utilizada para el diagnóstico del borde anal y ano, lesiones
que pueden ser identificadas por el examen clínico, ya que la posición en la cámara gamma bien sea
decúbito supino o decúbito prono, hacen que la superposición de órganos dificulte el diagnóstico. Otro
inconveniente es que de acuerdo con las características inmunohistoquímicas de la interacción de este
AcM con los antígenos en los tejidos del colon, reconoce intensamente el tejido de la mucosa del colon,
fundamentalmente la de tipo glandular, pero en el tejido netamente epitelial el reconocimiento es pobre.
El IOR C2 está expresado en células maduras de todo el epitelio del colon, sin embargo en el borde
anal, los tejidos secretores no son de células caliciformes sino glándulas subyacentes al epitelio (Levine
DS, 1989, Fenger C, 1988), cuyas células no expresan IOR C2, por lo que se puede asociar también a
esto los
94
diagnósticos falsos negativos encontrados en esta localización, Esto también se demuestra en la
diferencia de sensibilidad y precisión diagnóstica entre los carcinomas epidermoides evaluados y los
adenocarcinomas 80 % y 95.34 % y 83.3 % y 96.07 % respectivamente.
Con estos resultados podemos concluir que el ior c5, AcM que reconoce como blanco el IOR C2 en los
tumores colorrectales, es un AcM útil para el diagnóstico por InGG de estas neoplasias sus metástasis y
recidivas post quirúrgicas con alta sensibilidad diagnóstica y precisión. Existe una elevada correlación
entre la InGG y los adenocarcinomas de colón.
En ninguno de los 59 pacientes evaluados se encontró la aparición de respuesta HAMA. Hay que tener
en cuenta que el tiempo de distribución alfa o aclaramiento plasmático es extremadamente corto para
este AcM, además, la dosis es pequeña y única (1 mg) lo que dificulta al sistema inmune responder
frente al AcM murino. Resultados similares han sido encontrados por otros autores (Brunivels DJ,
1994), sin embargo al reiterar las dosis con InGG, con el objetivo de seguimiento del paciente, han
provocado elevadas respuestas HAMA, lo que lejos de ser una desventaja ha sido aprovechado como
efecto terapéutico ( vacunas anti idiotípicas) en terapias adyuvantes, por ejemplo con el AcM 17-1A
contra cáncer de colon (Stochil L, 1994, Pulliblank AM, 2001)) y los AcM OC125 y B43-3 para el
cáncer de ovario (Baum RP, 1993, 1994 )
5.2.2. Estudio por ¡nmunogammagrafía con los acms ior c5 e ior cea 1 marcados con 99mTc.
Muchos anticuerpos han sido reportados en la literatura contra antígenos tumor asociados al cáncer de
colon, siendo el más frecuente el antígeno carcinoembrionario. Ensayos clínicos realizados en el mundo
contra este, con AcMs anti CEA, han mostrado una sensibilidad diagnósticas de los mismos entre el 75-
89 % (Avital S, 2000, Baum RP, 1989, Muxi P, 1996, Sanders DSA, 1999, Behr TM, 1995). En Cuba
contamos con un AcM anti CEA, registrado
95
como medicamento en Cuba en 1994 (anexo 4) para el diagnóstico en tumores colorrectales: AcM ior
cea 1 Los resultados con este AcM arrojaron una sensibilidad diagnóstica en estos tipos de tumores del
89 % (Oliva JP, 1999, 1994, 1993, 1995, 1998, Sirisriro, 2000). La posibilidad de realizar en un mismo
paciente la InGG con ambos AcM: ior c5 e ior cea 1 para ver si la eficiencia diagnóstica de ambos se
complementaba, se lograba la detección de mayor cantidad de lesiones y se pudieran combinar en una
mezcla ("coctel") de AcM para la InGG de tumores en esta localizacion, fue un proyecto que se llevó a
la práctica en este trabajo.
No se encontraron efectos adversos por la administración de los AcM en ninguno de los 80 pacientes a
los que se les realizó Inmunogammagrafia con los AcM ior c5 e ior cea No se encontró, ni a la semana
post administrado el primer AcM ni durante el seguimiento realizado por 12 semanas, aparición de
respuesta HAMA a pesar de haber administrado en dos ocasiones un AcM de origen murino. Esto está
asociado a que la dosis de proteina empleada en ambos estudios es muy pequeña (1 mg), con similar
subclase de Ig (IgG 1) y el tiempo de separación entre ambos estudios también es corto, sólo de 1
semana. La vía de administración: endovenosa, es la menos inmunogénica y ambos antígenos están
bastante restringidos al colon, sumando que estos pacientes son portadores de tumores y metástasis a los
cuales se une el AcM con alta especificidad permaneciendo poco tiempo en circulación sistèmica, y que
se encuentran en etapas muy avanzadas de su enfermedad por lo que una inmunodepresión
inmunológica es muy frecuente. Todos estos aspectos son la causa por la cual, frente a dos
administraciones de AcM murino en el mismo paciente, no se haya levantado una respuesta HAMA
frente a ninguno de los AcM empleados.
Las imágenes inmunogammagráficas para ambos productos en cuanto a biodistribución en órganos
normales y tumorales fue similar, en las primeras horas se ve una elevada captación en
96
el higado que disminuye pero se mantiene detectable aún a las 24 horas, en general, una de las ventajas
más comunmente reportada por especialistas que utilizan los AcM para el radioinmunodiagnóstico, es la
detección de lesiones hepáticas debido a la unión intensa e inespecífica de los radioisótopos al
parénquima hepático (Stochi L, 1999). Este órgano es el centro de al actividad metabòlica del
organismo, la degradación de proteínas a nivel de estas células hace que no sólo permanezca aquellas
que están marcadas radioactivamente y que se mantienen intactas sino también, aquellos fragmentos
que producto de la degradación también permanecen marcados, estos a su vez pueden tener una
circulación entero hepática transitoria lo que aumenta el nivel de residencia del 99mTc en el hígado
(Stochi L, 1999).
Se puso en evidencia que las imágenes del ior cea 1 y el ior c5 en imágenes de cuerpo entero eran algo
diferentes, una vez levantado el cegamiento del estudio se llegó a la conclusión que el ior cea 1 daba
imágenes de fondo vascular a nivel de médula ósea que no la daba el ior c5, este puede estar dado
porque el CEA puede estar expresado en una amplia gama de células normales epiteliales. Al ser
miembro de una gran súper familia de genes muestra HOMOLOGIA ESTRUCTURAL con otras
familias de moléculas (Maxwell P, 1999 ), no ocurriendo así con el IOR C2, por lo que con el ior c5 se
obtienen imágenes más "limpias”, pues solo está presente en las células secretoras fundamentalmente
del colon (Vázquez, 1993). Este ligero fondo no afecta la hipercaptación que ocurre en los verdaderos
órganos fuentes (hígado, bazo y pool cardiaco,) ni en las lesiones tumorales, sencillamente caracteriza a
cada monoclonal.
Esta diferencia en la localización de los antígenos, también puede explicar la diferencia en cuanto a la
coincidencia diagnóstica de las imágenes de ambos AcM en un mismo paciente, aunque en un pequeño
número de casos, se observó, que el ior cea 1 detectó 2 lesiones metastásicas procedentes de carcinomas
epidermoide, en la región del recto y el ano (zona del
97
tracto gastrointestinal donde se minimiza la producción de mucus por las células secretoras y seria
menos probable encontrar altas cantidades del receptor IOR C2) que no fueron vistas por el ior c5. esto
mismo ocurrió con un tumor primario de la misma variedad histológica.
La sensibilidad diagnóstica del ior c5 cuando fue administrado como primer AcM fue similar al estudió
clinico presentado en el capitulo anterior con 59 pacientes (93.75), en este caso 94.28 %, no siendo así
cuando se aplica como segundo AcM donde la sensibilidad baja a un 82.75 %.
Por otra parte los resultados obtenidos con el ior cea 1 cuando se utiliza como primer anticuerpo
radioinmunodiagnósticador son similares a los reportados previamente en la literatura de un 82 %
(Avital S, 2000, Sanders DSA, 1999,), en este caso obtuvimos un 82.75 %. Sin embargo al aplicar este
AcM como segunda prueba, previo a la administración del c5 la sensibilidad aumenta un 15 % con una
significación estadística de p=0.08 %.
AJ ser administrado el ior cea 1 como primer anticuerpo, la sensibilidad diagnóstica del ior c5
disminuye ostensiblemente a un 82.75 % comparado con un 94.28 % cuando es administrado como
primer anticuerpo.
Aquí tenemos dos fenómenos aparentemente diferentes, pero ambos asociados a una posible
modificación antígénica ya sea en expresión o estructural, de ambos antígenos colon asociado, cuando
estas células se ponen en contacto con un AcM específico a ellos previamente.
?Qué puede estar sucediendo con la expresión del CEA cuando la célula se pone en contacto
previamente con un AcM que reconozca un antígeno en su superficie que hace que la sensibilidad
diagnóstica del ior cea 1 aumente significativamente?.
El CEA es un marcador tumoral de superficie, altamente glicosilado (PM 180 000 Kd)
(50 % de carbohidratos), miembro de la súper familia de las Igs. Consiste en un grupo de proteínas
relacionadas estructuralmente pero su configuración espacial es altamente modificable:
98
el monómero está construido por seis dominios de la súper familia de genes de las Igs, presenta un
dominio N terminal extracelular, una zona transmembranal y una cola o región citoplasmática con
residuos para la fosforilación de la Tirosina cinasa, esta estructura hace pensar en que juega un
importante papel en la transducción de señales hacia el interior de la célula (Neil L., 2002).
Es una molécula de adhesión homotípica que al interactuar con una homologa, puede favorecer
diferentes funciones en la célula tumoral (Charbonneau J, 1999) incluyendo el aumento de la expresión
de otras moléculas de CEA para favorecer la interacción intercelular. El CEA, aunque presente en
niveles bajos en las glándulas sub-adyacentes al epitelio del colon y en las células indiferenciadas de la
cripta en la región apical, esta asociado a procesos de malignización una vez que su expresión sale de
los marcos del control celular. Inhibe la muerte celular inducida y perdida de anclaje a la matrix celular,
coopera en la transformación celular con muchos proto- oncogenes tales como BCL 2 y C-Myc,
promueve entrar al estado GO "like" del ciclo celular y favoreciendo la acumulación de eventos
oncogénicos adicionales. (Thaeri M, 2000, Ordonez C., 2000).
Pudiera suceder que al interactuar el ior c5 con su antígeno en membrana (IOR C2) ocurran los
siguientes fenómenos:
1ro. Que la formación del complejo IOR C2- ior c5 favorezca la expresión del CEA ya sea por envío de
alguna señal al núcleo o por modificación estructural en la membrana que por contigüidad se favorezcan
cambios que activen la expresión del CEA.
2do. Que el IOR C2, al reconocer a su anticuerpo quede modificado estructuralmente y al ser re
expresado en membrana este tenga homología estructural con el CEA por algún epitope y el AcM ior
cea 1 lo pueda reconocer (aunque sea con menor afinidad que al propio CEA).
3ro Que el antígeno IOR C2 tenga algún epítopo compartido con el CEA y cuando este entra en
99
contacto con el ior c5 se favorezca su sobre expresión la cual es reconocida también por el ior cea 1 una
semana posterior a la primera administración.
EL CEA tiene 28 tipos de complejos de cadenas oligosacarídicas, en conformación extendida, además
de que se modifica la orientación de 6 de los 7 superdominios totales, resultando en 4056 posibles
modelos de CEA, el más favorecido es el modelo en forma de zig-zag, con una estructura de proteina en
forma de hoja plegada en las regiones vecinas al CEA alternando entre las caras de este antígeno, este
modelo tiene implicación en las interacciones de adhesión entre las moléculas de CEA de la células
adyacentes o para los anticuerpos que reconocen al CEA (Charbonneau J, 1999), provocando cambios
en la funciones de ambas.
Schumann D, 2001, demostró que el CEA es una molécula de adhesión que esta directamente asociada
al citoesqueleto celular, en el proceso de transcripción del RNA. Esta molécula de adhesión
(CEACAM1), está “down regulated” (silenciada) en tejido tumoral de colon humano, próstata y mama.
Una señal activadora pudiera provocar la sobre expresión antigénica del mismo, esta señal podría estar
dada por interacción propiamente dicha con otra célula que presente CEA (interacción homotípica) o
por un agente que "toque" este antígeno de forma similar, por ejemplo un AcM anti CEA.
Digamos que el ior c5, que sólo tiene reconocimiento por el CEA a nivel de señales de fondo según
experimentos realizados por Vázquez y col en tejidos y ELISAS (Vázquez AM, 1994), es capaz no sólo
de reconocer el antígeno IOR C2, sino también de activar el CEA por alguno de sus determinantes
antigénicos. Este, incluso, sin unirse al AcM ior c5, podría activar alguna señal al núcleo a través del
cito esqueleto y propiciar la producción de otras moléculas de CEA que irían a la superficie para
favorecer la interacción CEA-CEA.
Hay que tener en cuenta que esta es una señal de malignización tumoral, se ha visto que en
100
tumores en etapas avanzadas estas interacciones CEA-CEA están favorecidas (Frangmyr L, 2000)
Existe cooperación celular entre los diferentes antígenos tipo CEA. Haciendo un mapeo de homología
de estas proteínas, encontraron que los sitios (locaciones) de las secuencias críticas para la adhesión
del CEACAM6 a si mismo y al CEACAM8 son altamente similares pero no idénticos. Diferencias
sutiles en la secuencia del dominio N terminal (extracelular) determina la especificidad de estos
antígenos (Maxwell P, 1999).
Solassol I, en el 2002 (Solassol 1, 2001) demostró molecularmente que existen 5 dominios
mayoritarios de epitopes no sobrelapados, que han sido agrupados por dominios Gold 1-5, aunque no
existe una localización precisa de estos, a nivel de la secuencia, ninguno de estos epitopes pueden ser
mimificados por péptidos secuencias, pero se logró identificar con suero anti CEA en diferentes
especies, seis diferentes regiones antigénicas continuas, todos ellos incluidos en el dominio IgG like
de la molécula del CEA, dos en le dominio Al, uno entre A2 y A3, uno en la unión entre A3 y B3 y
otro en el dominio B3. Al, 2, 3 y B3 son las partes más antigénicas del CEA.
El AcM ior cea 1 está clasificado en el grupo de anticuerpos que reconocen al dominio GOLD Al (Gold
1) (Gavilondo J, 1987), que por ser una de las partes más antigénicas, puede ser una región, además, con
alta frecuencia de reacciones cruzadas con anticuerpos con características de reconocimiento específico
a antígenos similares estructuralmente a ella. Si el IOR C2 presentara un sitio similar a este, y a su vez,
al haber sido reconocido una semana antes por su anticuerpo este se sobre expresara en la superficie
celular, el ior cea 1 pudiera reconocer no sólo el CEA por la región Al sino también aquella región
estructuralmente homologa que se encuentre en el antígeno IOR C2.
101
Por otra parte, Schumann D, 2001, mostrò que la molécula de CEA estaba insertada en la membrana
celular y que a el se enlazan un número limitado de azúcares, la posibilidad de modificación de estos ya
sea por agentes externos o por interacciones intercelulares es muy alta, lo que trae aparejado una
diferenciación estructural del CEA ya maduro, y esto por supuesto una variabilidad en el
reconocimiento de esta molécula por otras moléculas. Existe un grupo de proteínas llamadas NCA (del
ingles non speciphic crossreacting antigen) que reaccionan inespecíficamente con el CEA.
?Cabria pensar que el IOR C2 pudiera ser uno de estos antígenos NCA pero que no se había
identificado con anterioridad9.
Se ha visto un gran número de problemas como cross reactividad por células no deseadas, e
immunogenisidad por anticuerpos heterólogos administrados, la expresión del CEA puede ser
manipulada por la administración de anticuerpos bloqueadores o por la regulación del CEA en la
superficie de las células.
Poco conocido hasta la fecha es el papel que desempeña el antígeno IOR C2 en la superficie de las
células tumorales, si bien es cierto que este se encuentra presente en la mayoría de las células del colon,
su distribución es preferentemente citoplasmàtica y heterogénea (Vázquez AM, 1994), sin embargo, en
la célula tumoral el mareaje se polariza hacia la membrana citoplasmàtica, netamente apical, esto lleva a
pensar que la función biológica de este antígeno, cambia en los procesos de malignización y comienza a
desempeñar alguna función en la membrana citoplasmàtica, ya sea en la trasmisión de alguna señal al
núcleo o en la posibilidad de reconocimiento de otros antígenos externos.
Cada día son más los reportes en la literatura mundial acerca de los fenómenos de transmodulación
intermembrana de determinados antígenos asociados a la malignización. Un
102
ejemplo clasico es la relación de "cross talk" entre el TGF alfa (del inglés transforming growth factor )
el receptor de la Fibrnectina y el antígeno carcinoembrionario. (C'hakrabarty S., 1997). La estimulación
del r-TGF alfa provoca estimulación de la actividad fosfotransferasa que induce la expresión de
fibronectina (FN) y esta a su vez la expresión del receptor de la fibronectina (r- FN), señal que a su vez
induce la expresión del CEA ( Tang D.G, 1997)., que como molécula de adhesión favorece el proceso
de malignización (Chakrabarty, 1888,1989, 1997).
Por esta vía tendríamos dos posibles explicaciones para nuestro fenómeno de sobre expresión del CEA
en los pacientes tratados previamente con el AcM ior C5:
1. ?Sera que el AcM ior c5 reconoce de forma inespecífica el receptor del TGF alfa y este estimula la
expresión de moléculas de adhesión como la fibronectina y esta a su vez estimula la sobre expresión del
CEA en la superficie de la membrana citoplasmática de la célula tumoral9,
2. ? el antígeno IOR C2 tiene regiones complementarias u homologas con el receptor del TGF alfa que
sean reconocidas por el AcM ior c5 y estimule la cascada de señales que favorezcan la sobre expresión
del CEA por transmodulación.?
3. 9Será que el IOR C2 es un antígeno similar al r-FN (o tiene algún epítopo común con este) y al ser
reconocido por el AcM ior c5 induzca la sobre expresión del CEA?
Por otra parte existen reportes recientes acerca de la función que desempeñan ciertos agentes químicos
en la inducción de algunas funciones de malignización en las células de cáncer colorectal, entre ellas la
regulación positiva de la expresión de la fibronectina y del CEA debido a la heterogeneidad fenotípica
de estas células (Reynols, S., 1997). Alguno de estos agentes son: ácido retinoico, difluorometilomitina,
dimetilformaldehído, butirato de sodio y suramina sódica. Como se describió en el capítulo de
Materiales y Métodos, el método de mareaje de los AcM empleados para acoplarlos al 99mTc es a
través de la reducción con 2- mercaptoetanol (agente
103
reductor de puentes disulfuros), y una vez eliminado el exceso del mismo se le añade metilen
difosfonato (MDP) (agente quelante) y el 99mTc pertecnetato procedente de la elusión de un generador
de 99Mo/99mTc. El mareaje se considera eficiente si la pureza del radiocoloide es superior al 90 %, las
especies contaminantes pueden ser:
- 2 mercapto etanol.
- MDP marcado con 99mTc
- pertecnetato.
La eficiencia de mareaje para el AcM ior c5, que se administró previo al ior cea 1 fue de 98.5 % ± 0.7
%, aunque el porciento de contaminación es solamente del 1.5 % entre las diferentes especies, 9Serán
estas concentraciones contaminantes suficientes para propiciar la inducción de la FN y del CEA en las
células del tumor y esta respuesta ser mantenida una semana posterior al tratamiento diagnóstico inicial
con el ior c5 marcado, de forma que los niveles de CEA sean superiores y se favorezca un mejor
reconocimiento por parte del AcM ior cea 1 marcado con 99mTc en los tumores de colon?. No siendo
así para el caso de que el ior cea 1 es administrado como primer anticuerpo debido a que la sobre
expresión no es inmediata, requiere de un tiempo mínimo y las imágenes son evaluadas entre las 4 y las
24 horas post administrado el producto. Todas estas posibles teorías podrían explicar el aumento de
sensibilidad diagnóstica cuando se administra previamente el ior c5 en un paciente y se diagnóstica una
semana posterior con el ior cea 1.
Sin embargo ?Por que la sensibilidad diagnóstica del ior c5, que quedó demostrada en el primer ensayo
clínico de 59 pacientes y en el grupo A de este estudio con 43 pacientes de ser superior al 90 %,
disminuye a valores cercanos al 80 % (82.75 %) cuando se administra como segundo anticuerpo?
104
El IOR C2, antigeno que reconoce el ior c5, es una glicoproteina, y como tal, debe ser sintetizada en el
Reticulo Endoplasmático y glicosilada entre este y el Aparato de Golgi (Bruce A, 1994). Estas células
están especializadas en la secreción de mucus y pensamos que esta glicoproteina, junto a
proteoglicanos, sean liberadas por exocitosis por la pared apical (función normal). Pensamos además,
que en el proceso de malignización, esta glicoproteina pudiera quedar anclada en la membrana de las
vesículas del Retículo y no quede como proteína en solución, por lo que se favorece la expresión en la
pared apical de las células del intestino, demostrado en tinción inmunohistoquímica (Vázquez AM,
1993).
Cuando se administra como primer AcM el ior cea 1, pensamos que también pueda existir un fenómeno
de transmodulación o regulación intramembranal entre antígenos pero en sentido inverso, o sea:
Que el reconocimiento CEA- ior cea 1 una semana previo a la administración del ior c5 module la
expresión en membrana del antígeno IOR C2 y este disminuya en concentración a en la
misma, ya sea:
a: porque se vea favorecida nuevamente su excreción luminal. Este antígeno es excretado en individuos
normales en heces fecales en mayor proporción que en pacientes con tumores (Vázquez AM, 1993).
tanto se podría pensar que la función normal de excreción se ve bloqueada cuando la célula se convierte
en célula tumoral y, que la interacción CEA- ior cea 1 propicie "activar esta función excretora,
silenciada en células tumorales"
b: porque disminuya la concentración membranal a costa de aumentar la citoplasmática c: porque
disminuya por metabolización del mismo ya que la señal CEA-ior ceal propicie el funcionamiento de la
célula a un estado tal donde no sea necesario el IOR C2.
Podría pensarse además que la interacción ior ceal- CEA active la expresión del CEA en
105
membrana a niveles tan elevados que cuando el ior c5 tratara de reconocer su antígeno no lo lograra por
impedimentos estéricos.
No conocemos el tiempo de residencia del complejo que se establece entre el ior cea 1 y el CEA de
membrana, si este no se internaliza y mantiene su acción bloqueadora del antígeno CEA, es posible que
este perdure por más de una semana, y cuando el AcM ior c5 es administrado, no llega a su receptor por
impedimentos estéricos del complejo anterior. Realmente no conocemos si al cabo de la semana este
reconocimiento se mantiene por la vida media del isótopo que se esta empleando que el de 6.03 horas
por lo que las imágenes a las 36-48 horas son ya muy difusas, sin embargo se conoce que en otros
estudios de InGG con AcM empleando isótopos como el 188Re, 186Re, l l l l n o 131 I (Sutter-Bihl,
ML, 1994, Bouchet LG, 1996) se obtienen imágenes hasta a la semana post InGG utilizando dosis de
AcM similares a las nuestras. Esta podría ser una de las causas de que algunas lesiones que pudieron ser
observadas con el AcM ior ceal no se pudieran ver con el ior c5, quizás la afinidad y densidad de
receptores CEA en estos tumores sea mucho mayor que la del IOR C2 y ocurra el fenómeno
anteriormente explicado.
Seria muy interesante en futuros trabajos conocer el papel biológico que juega el antigeno tumor
asociado IOR C2 en la célula normal y tumoral.
5.2.3. Consideraciones Generales de la Inmunogammagrafía con AcMs anti Antigenos Asociados
al Cáncer de Colon en el diagnóstico de tumores colorrectales de origen epitelial.
La búsqueda de nuevos antigenos asociados al cáncer de colon es una de las tareas en las que no se cede
terreno en la inmunología actual con la esperanza de encontrar un marcador tumoral mas específico que
conlleve a la solución de la inmunoterapia del cáncer colorectal.
Contamos con un AcM, el ior c5, que reconoce un antígeno presente en la superficie apical de las
106
células tumorales de colon, el IOR C2. Si bien es cierto que los estudios de reconocimiento antigénico
habían sido reportados por Vázquez y Cois desde 1994, no es hasta el presente trabajo que se obtiene
confirmación del reconocimiento específico "in vivo " de este AcM, mostrando una sensibilidad frente a
la InGG de un 93.75 %, lo que demuestra la existencia de este antígeno. El mecanismo de acción del
IOR C2 aun se desconoce, es posible que participe directamente en la trasmisión de alguna señal al
núcleo para la diferenciación celular porque por estudios preclinicos se conoce que en individuos
normales este se excreta al lumen y esta en el citoplasma de la célula sin embargo en pacientes con
cáncer este se reubica en la membrana citoplasmática y deja de excretarse al medio, que está por
dilucidar. Se constató al hacer un estudio cruzado con los AcM ior c5 e ior cea 1 de origen murino
ambos, en el mismo paciente, que existe una diferencia significativa de acuerdo al orden de aplicación
de ambos AcM, lo que conlleva a pensar en la posibilidad de una transmodulación entre ambos
antígenos. La sensibilidad diagnóstica del ior ceal se ve incrementa cuando se administra como segundo
anticuerpo y la del ior c5 disminuida. Este fenómeno podría ser empleado en la clínica, aprovechando la
capacidad de aumentar la expresión del CEA para una posible terapia pasiva de bloqueo del receptor
con AcM anti cea (ior cea), teniendo en cuenta las funciones biológicas de este antígeno en la adhesión
intercelular, la tumorigénesis y su estrecha relación en la trasmisión de señales a través del cito
esqueleto.
La capacidad de detectar nuevas lesiones metastásicas, no reportadas previamente por otros métodos
imageneológicos, hacen pensar en utilizar esta tecnología en la sistemática diagnóstica del cáncer
colorectal, ya no para detectar el tumor primario, sino para "descubrir” antes que otros métodos clínicos
o imageneológicos las nuevas micrometástasis incipientes, que traería un cambio en la conducta
terapéutica al paciente.
107
6. CONCLUSIONES GENERALES
1. Los AcMs ior c5, ior egf/r3 y hR3 son capaces de reconocer in vivo los tumores de origen epiteliales
con una sensibilidad del 93.75 %, 84.1 % y 83.3% respectivamente y una especificidad del 100 %
mediante la técnica diagnóstica de InGG
2 No apareció toxicidad como consecuencia de la administración de los AcM marcados con 99mTc,
en ninguno de los pacientes que fueron sometidos a la InGG, lo que hace esta técnica además de
sensible y especifica también segura.
3. No apareció respuesta HAMA significativa que impida el tratamiento con estos AcM, Sólo se
observó respuesta HAMA de corta duración en el 20 % de los pacientes evaluados luego de ser
tratados con el AcM murino ior egf/r3 (6/30), sólo en una la respuesta tuvo una más de 8 semanas
4. El AcM murino ior egf/r3 es útil para el diagnóstico por InGG en tumores de origen epitelial de las
localizaciones: cabeza y cuello, cerebro, mama, pulmón, sistema reproductor y sistema digestivo,
con elevadas sensibilidad diagnóstica general del 84.1%, precisión diagnóstica 86.6%, especificidad
y valor predictivo positivo del 100%.
5. Se comprobó “in vivo” la sobre expresión del receptor para el factor de crecimiento epidérmico en
metástasis de los tumores estudiados lo cual reafirma que es un marcador de mal pronóstico. El
67.5% de las lesiones metastásicas visualizadas no habian sido reportadas previamente por otro
método imageneológico. La InGG podría convertirse en una herramienta de la sistemática
diagnóstica de los tumores de origen epitelial en estas localizaciones en la detección de nuevas
lesiones metastásicas.
108
6. Se comprobó "in vivo" la existencia de una diferencia significativa en cuanto a expresión del
receptor del factor de crecimiento epidérmico entre las variedades histológicas Adenocarcinomas y
Carcinomas Epidermoides, siendo superior la expresión en los Carcinomas con respecto a los
adenocarcinomas atendiendo a la sensibilidad diagnóstica por InGG con el ior egf/r3
7. El anticuerpos monoclonal ior c5 es un buen marcador de los tumores de colon, por ser capaz de
reconocer “in vivo”, tanto el tumor primario como las metástasis a distancia no detectada por otros
métodos diagnósticos por imágenes^ con adecuadas sensibilidad diagnóstica, precisión,
especificidad y valor predictivo positivo.
8. Se comprobó “in vivo” la diferencia diagnóstica entre los AcM ior c5 e ior cea 1 en tumores
colorrectales cuando son administrados en un mismo paciente con una semana de diferencia.
Cuando el ior cea 1 es administrado como segundo AcM su sensibilidad diagnóstica se ve
incrementada cuando es administrado como primer AcM, lo que podría esta asociado con un
proceso de transmodulación entre este antígeno y el IOR C2 presente también en los tumores
colorrectales.
9. Se pudo constatar que la InGG resulta una técnica efectiva para demostrar como "prueba de
concepto" que un AcM pueda o no ser utilizado con fines terapéuticos, una v^z que estos reconozca
"in vivo" el antígeno tumor asociado contra el cual están dirigidos.
109
7. RECOMENDACIONES.
1. Utilizar los AcMs ior c5, ior egf/r3 y hR3 como una prueba diagnóstica más en la sistemática de los
tumores de origen epitelial.
2. Por su alta especificidad y capacidad de detectar lesiones metastásicas a distancia, estas molécula
podrían ser utilizadas como blanco de la radioimmunoterapia con isótopos radioactivos de emisión beta
3. Realizar ensayos clínicos terapéuticos con el AcM humanizado hR3 en pacientes con tumores de
origen epitelial.
4. Estudiar el mecanismo de acción del antígeno tumor asociado IOR C2.
5. Demostrar que existe un mecanismo de transmodulación entre el antígeno tumor asociado IOR C2 y
el CEA en las células tumorales de colon.
110
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M., Torres F., Figueredo R., Veitia I., Iznaga N.., Perez R and Lage A. Phase I
Clinical Evaluation of a Neutralizing Monoclonal Antibody against R-EGF in
advanced brain tumours patients: Preliminary Study. Short Communication.
Hybridoma. 2001. 20(2) 131-136.
16. Crombet T., Torres O., Neninger E, Catala M., Rodríguez N., Ramos-Suzarte M.,
Fernández E., Iznaga N., Pérez R and Lage A. . Phase I Clinical Trial Evaluation of
a Neutralizing Monoclonal Antibody against R-EGF. Cancer Therapy and
Radiopharmaceuticals. 2001. 16(1).
17. KA Vallis, RM Reilly, P Chen, A Oza, A Hendler, R Cameron, M Hershokop, N
Iznaga Escobar, M Ramos-Suzarte and P Keane. A Phase I Study of 99mTc-hR3
(DIACIM ), a humanized immunoconjugate directed towards the epidermal growth
factor receptor. Nuclear Medicine Communications, 2002, 23, 1155-1164.
146
18. Solano ME, Perera A, Batista JF, Candebal Z, Jacomino F, Hierro M, Pinon E, Gomez
J, Mera A, Neninger E, Hernández A, Sánchez E, Perez MG, Ramos M, Cedeno M.
Immunoscintigraphic diagnosis of ovarian cancer with Tc 99m labeled Mab ior c5:
First Clinical results. World Journal of Nuclear Medicine, Vol 2, Number 1, January 2003.
19. Mayra Ramos Suzarte, Nelson Rodriguez Mesa, Juan Perfecto Oliva, Normando Iznaga
Escobar, Alejandro Perera Pintado, Leonel Torres Aroche, Juan Batista Cuellar, Elia
Neninger, Nery Gonzalez, Teresita Rodriguez y Rolando Perez. Estudio del
Reconocimiento in Vivo por los Anticuerpos Monoclonales ior c5, ior egf/r3 y hR3
humanizado, mediante la técnica de inmunogammagrafía. Nucleus, No 33, 2003 54-63.
ANEXO 1. PRESENTACION EN EVENTOS CIENTIFICOS NACIONALES E
INTERNACIONALES.
1. XIII Congreso de la Asociación Latino Americana de Sociedades de Biología y Medicina Nuclear,
ALASB1MN,'93. Cartagena de India, Colombia, 1993.
2 XII Seminario Científico del Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CENIC).Cuba, 1995.
3. Vil Congreso Nacional de Oncología. V Congreso de la Asociación de Estados del Caribe. Ill
Meeting de Oncología Cuba-México. I Congreso Nacional de Enfermería Oncológica. Cuba,
1995.
4. XIV Congreso de Sociedad Latino Americana de Biología y Medicina Nuclear. ALASBIMN^.
Brasil, 1995.
5. VI Congreso de la Sociedad Cubana de Ciencias Farmacéuticas. Cuba, 1995.
6. III Congreso Nacional y V Congreso Latinoamericano de Hematología e Inmunología. Cuba,
1997.
7. Workshop Good Clinical Practice. York Medical Inc. and National Coordinator Center of Clinical
Trials. Cuba, 1996.
8. Biotecnología ‘97. Aplicaciones Médicas de la Biotecnología. Havana, Cuba, 1996.First
International Symposium on Nuclear and Related Techniques in Agriculture, Industry, Health and
Environment. Third Workshop on Nuclear Physics. Ciudad de la Habana del 28 al 30 de Octubre
1997.
9. II Encuentro Iberoamericano sobre las Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias. Instituto de
Farmacia y Alimentos. Cuba, del 22 al 25 de Julio de 1996.
10 111 Congreso Nacional y V Jornada Latinoamericana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia,
Palacio de Convenciones de la Habana, Cuba, del 22 al 25 de Abril de 1997.
11. XV Congreso de la Asociación Latinoamericana de Sociedades de Biología y Medicina Nuclear
(ALASBIMN 97). Lima, Perú. 26-30 Octubre de 1997.
12. II Jornada Nacional de Inmunología. Sociedad Cubana de Inmunología, Ciudad de la Habana, del 8
al 10 de Diciembre de 1997.
13. Biotecnología Habana' 97. Aplicaciones Médicas de la Biotecnología. Centro de Ingeniería Genética
y Biotecnología. (CIGB) Diciembre 1997.
14. 7th Join EANM and WFNM and B World Congress on Nuclear Medicine and Biology. Berlin,
Germany August 30-September 4, 1998.
15. The Society of Nuclear Medicine 45th Annual Meeting. Metro Toronto Conventional Center. Canada.
June 7- June 11, 1998.
16. ler Congreso Internacional de la Sociedad Cubana de Farmacología. Farmacología^. Cuba, 1998.
17. Meeting Immunotherapy in the Nines III. Habana Abril 20-24, 1998.
18. VI Congreso Nacional de Nefrologia. Cuba. May 1998.
19. XIII Congresos Integrados Latinoamericanos de Cancerología. Cuba, 20 al 24 de Septiembre 1999.
20 11th International Symposium on Radiopharmacology. June 24-27, 1999. St Louis, MO,
USA.
2 1 . 8 th C ongreso Mundial Medicina Nuclear organizado por la Federación Mundial de Medicina
Nuclear y Biologia (WFNMB) y 18 th Congreso ALASBIMN. Santiago de Chile Octubre 2002.
22. IV Congreso Nacional de Farmacología y Terapéutica. Habana 15-18 Octubre 2002.
23. Convención de Ciencias Básicas Médicas. Girón 2002. La Habana, Cuba, 14-18 Octubre.
2002.
24. 6to Congreso Latinoamaericano de Inmunología. 3er Congreso Cubano Inmunología. ALAI. C
Habana Diciembre 9-13. 2002.
25. Second International Seminar and Second National Workshop. Use and Development of Health
related industrial isotope products. CENTIS, La Habana, Cuba, 10-12 Diciembre
2002.
26. 15th International Symposium on Radiopharmaceutical Chemestry. Sydney 10-14 August 2003.
Australia
27. Biotecnología Habana 2003. Aplicaciones Medicas de la Biotecnología
28. 15 Congreso Nacional de Oncología. Habana Octubre 2003.
ANEXO 2. PREMIOS OBTENIDOS POR LAS INVESTIGACIONES RELACIONADAS
CON LA INMUNOGAMMAGRAFIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES
PRODUCIDOS EN EL CENTRO DE INMUNOLOGIA MOLECULAR
1. Resultado Científico Técnico Destacado Nacional del Quinquenio 1986-1990: "Anticuerpos para
uso en Oncología e Inmunología. Res. No. 43-91.
2. Resultado Científico Relevante a Nivel Nacional otorgado por la Academia de Ciencias de Cuba
en 1995. "ior-egf/r3: anticuerpo monoclonal para el diagnóstico in vivo de tumores por
inmunogammagrafia". Res. No 53-95.
3. Resultado Científico Relevante a nivel Nacional: "Generación de Anticuerpos contra un nuevo
antígeno asociado al cáncer de colon". Res. No. PCN 13/96.
4. Categoría Relevante. XI Forum de Ciencia y Técnica: "ior c5, un nuevo anticuerpo monoclonal
para la detección de tumores colorrectales, sus metástasis y recidivas". CIM 00-005.
5. Premio Nacional en la 8va Exposición Nacional Forjadores del Futuro en 1997. "Producción del
inyectable ior-egf/r3 liofilizado para inmunogammagrafia".
6. Mención Central en el XXII Concurso Premio Anual de la Salud otorgado por el Consejo
Nacional de Sociedades Científicas de la Salud en 1998, en su Instancia Central: "Desarrollo en
Cuba de la inmunogammagrafia con anticuerpos monoclonales cubanos".
7. Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba en 1999. "Humanización de epitopos-T en las
regiones variables murinas de un anticuerpo que reconoce al receptor del factor de crecimiento
epidérmico: Obtención de inmunoglobulinas de menor inmunogenicidad”.
8. Premio Julio Kieffer de la Associacao Latino Americana de Sociedades de Biología e Medicina
Nuclear, al trabajo Phase I Clinical Trial of the humanized anti EGF-R antibody hR3 labelled with
99mTc in patients with tumor of Epithelial Origen” Presentado en el Congreso Mundial de Medicina
Nuclear 2002, en Santiago de Chile.