centro de inmunología molecular dirección de...
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Centro de Inmunología Molecular Dirección de
Investigaciones
Inmunoterapia de cáncer con el AcM anti-EGFR h-R3
Estudios experimentales y clínicos
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Médicas
Autora: Dra. Tania Crombet Ramos
Tutor: DrC. Agustín Lage Dávila
Ciudad de La Habana
2004
Agradecimientos
Estos serán agradecimientos cortos y sencillos..., pues en los momentos finales de las tesis
el tiempo siempre escasea. Realmente, necesitaría al menos 30 cuartillas para expresar mi
gratitud y aún serían insuficientes.
Agradezco, en primer lugar, a Agustín y a Rolando, que me introdujeron en este fascinante
mundo de la inmunoterapia del cáncer y de cuya pasión, rigor, entrega y verticalidad,
aprendo cada día. Son y serán siempre de los imprescindibles....
A Mayra y a Olga, quienes me recibieron en la buhardilla del INOR en 1994, cuando ya
formaban el entonces pequeño grupo de ensayos clínicos del CIM y quienes me hablaron
por primera vez de anticuerpos y de ensayos en pacientes. Tuve el privilegio de asistir con
ellas a las inyecciones inaugurales del ior egf/r3, de disfrutar de las primeras imágenes
positivas de inmunogammagrafía y de pasar también los primeros sustos con las
reacciones anafilácticas, que afortunadamente ya no volverán...
A mis inseparables compañeros de la cofradía del h-R3. a Gisela, Normando y Suhamy,
quienes se han empeñado en estos años en correr “los cuellos de botellas del proyecto”,
parafraseando a Agustín.
A mis colegas del laboratorio de Canadá, especialmente a Bob, a Alicia y a Janush,
quienes me adentraron en el universo apasionante de la angiogénesis.
A los colegas del Centro de Investigaciones Clínicas, del Amejeiras y del CIMEQ, quienes
trabajaron a brazo partido por terminar en tiempo record el ensayo fase I. Catalá y Elia
merecen mención especial por ser los pioneros del bloqueo del EGFR en pacientes en
Cuba. Ambos siguen siendo fervientes enamorados del h-R3.
A los especialistas del INOR, especialmente a Marta y a Teresa, quienes acogieron al h -
R3 como un hijo e hicieron posible su evaluación en pacientes con neoplasias avanzadas
de cabeza y cuello.
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A todos o más bien, a todas mis muchachas del Departamento, quienes han tenido que
sobrellevar a una jefa en tesis, con los consecuentes estados anímicos asociados.
Agradezco especialmente el acopio de paciencia de Giselle, Rosa María y Mayra para con
mis regueros de resúmenes, copias y uso privativo de las impresoras y la fotocopiadora.
A la Idri, a Tere, y una vez más, a Mayra. que formaron un excelente equipo de laboratorio
para el h-R3, en los años de esta tesis.
A los veteranos de investigaciones, a Luis Enrique. Maruchi, Cristina, Amparo, Adolfo,
Adriana, Ernesto, Enrique, Fifi, José, Eduardo, en fin, a todos aquellos que tanto me han
enseñado en estos años...
A los más jóvenes de Investigaciones, por su entusiasmo y su dedicación, por ser un
estímulo permanente para las casi “viejas generaciones”, entre las que me incluyo.
A Loly y a Cora, quienes nos demuestran cada día que no hay problema sin solución.
A Báez, amigo entrañable, cuya ayuda ha sido inestimable en estos casi 10 años.
A mis oponentes de la predefensa, Gavilondo y Silvio, quienes se emplea ron a fondo en
criticar cada detalle de esta tesis. De ellos aprendí muchísimo...
A todos mis profesores, desde la primaria hasta la especialidad. Especialmente a Sautié, a
Corbelle y a González Griego, quienes sembraron en mí el amor infinito por la Quími ca, la
Bioquímica y la Inmunología, respectivamente.
A todos mis amigos, los nuevos y los viejos, que sabrán perdonarme que no los mencione
por su nombre, pues harían interminable estos agradecimientos.
Por último, gracias a mi preciosa familia por su amor, su ejemplo, su apoyo, su estímulo
permanente y su comprensión ante todas las horas a ellos robadas...
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Tabla de contenidos
Abreviaturas.................................................................................................................. 8
Síntesis ........................................................................................................................11
Introducción .................................................................................................................12
Novedad científica .................................................................................................... 20
Consideraciones finales ............................................................................................. 22
Revisión bibliográfica .................................................................................................. 24
Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) ............................................. 24
Rol del EGFR en la transformación y en la progresión tumoral ................................... 27
Rol del EGFR en la señalización intracelular ............................................................. 29
Proliferación .......................................................................................................... 29
Angiogénesis ......................................................................................................... 30
Migración y motilidad ............................................................................................ 30
Adhesión ............................................................................................................... 31
Diferenciación ....................................................................................................... 31
Funciones de sobrevida y apoptosis ........................................................................ 31
Expresión de EGFR en tumores ................................................................................. 32
Estrategias para bloquear al EGFR ............................................................................. 33
AcM c225 (erbitux ó cetuximab) ............................................................................ 34
ZD1938 (Iressa, Gefitinib) ..................................................................................... 37
OSI774 (Tarceva, Erlotinib) ................................................................................... 39
Herceptin (Trastuzumab) ........................................................................................ 39
Ior egf/r3 ............................................................................................................... 40
AcM h-R3 ............................................................................................................. 42
Angiogénesis ............................................................................................................ 43
Metodología de ensayos clínicos ................................................................................ 44
Materiales y métodos ................................................................................................... 47
Estudios preclínicos .................................................................................................. 47
Líneas celulares y condiciones de cultivo ............................................................... 47
Ensayo de inhibición de la proliferación ................................................................. 47
Medición del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) .......................... 48
7
Análisis de VEGF a nivel de ARN ......................................................................... 49
Análisis de ciclo celular ........................................................................................ 49
Determinación de apoptosis in vitro ....................................................................... 50
Experimentos en ratones SCID .............................................................................. 50
Inmunohistoquímica .............................................................................................. 51
Obtención de las variantes celulares de la línea A431 resistentes ............................. 52
Análisis del ADN .................................................................................................. 53
Western Blot ......................................................................................................... 53
Obtención de transfectantes estables que sobre -expresan VEGF .............................. 54
Estudios Clínicos ..................................................................................................... 55
Ensayo Clínico Fase 1 ............................................................................................ 55
Selección de sujetos ............................................................................................... 55
Criterios de inclusión ............................................................................................. 55
Criterios de exclusión ............................................................................................ 56
Criterios de salida .................................................................................................. 56
Composición completa del producto ......................................................................... 57
Esquema de tratamiento ......................................................................................... 57
Evaluación de la toxicidad ..................................................................................... 58
Estudio de farmacocinética .................................................................................... 58
Estudio de biodistribución ..................................................................................... 59
Evaluación de la inmunogenicidad ......................................................................... 60
Ensayo Clínico Fase I/II ........................................................................................... 60
Selección de sujetos ............................................................................................... 61
Criterios de inclusión ............................................................................................. 61
Criterios de exclusión ............................................................................................ 61
Criterios de salida del ensayo ................................................................................. 62
Esquema de tratamiento ......................................................................................... 62
Evaluación de la toxicidad ..................................................................................... 63
Evaluación de la respuesta antitumoral ................................................................... 63
Inmunohistoquímica .............................................................................................. 63
Evaluación de la respuesta inmune ......................................................................... 64
Estadística ............................................................................................................ 65
Resultados y Discusión ................................................................................................ 66
8
Evaluación de la actividad antitumoral del AcM h-R3 ................................................ 66
Evaluación de la actividad anti-angiogénica del AcM h-R3 ......................................... 68
Evaluación del efecto pro-apoptótico del AcM h-R3 ................................................... 72
Evaluación de la aparición de resistencia ................................................................... 77
Ensayo Clínico Fase 1 ............................................................................................... 87
Ensayo clínico Fase I/II ............................................................................................. 94
Discusión General ...................................................................................................... 103
Conclusiones .............................................................................................................. 108
Recomendaciones ....................................................................................................... 109
Referencias ................................................................................................................ 110
Autobibliografía ......................................................................................................... 139
9
Abreviaturas
(Flk-l/KDR): Proteína quinasa fetal de hígado/ receptor con dominio con actividad quinasa
32P: Fósforo 32
99Mo/"mTc: Molibdeno-tecnecio
"mTc: Tecnecio 99 metaestable
AcM: Anticuerpo Monoclonal
ADCC: Citotoxicidad dependiente de anticuerpos
ADN: Ácido Desoxirribonucleico
AEV: Virus de eritoblastosis aviario
ARN: Ácido Ribonucleico
ASCO: American Society of Clinical Oncoiogy
ATP: Adenosin trifosfato
AUC: Área bajo la curva
b-FGF: Factor básico de crecimiento de fibroblastos CIM: Centro de Inmunología Molecula r
CIMEQ: Centro de Investigaciones Médico Quirúrgicas CMV: Citomegalovirus
CTC: Citotoxicidad dependiente de complemento CTC: Criterios Comunes de Toxicidad
DMEM: Medio modificado de Dulbecco ECOG: Grupo Cooperativo del Este EGF: Factor de
Crecimiento Epidérmico EGFR: Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico.
ELISA: Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.
EUA: Estados Unidos de América FDA: Food and Drug Administraron Flt -1: Tirosina
quinasa semejante a fms
HACA: Human Anti-chimeric Antibodies HAMA: Human Anti -Mouse Antibodies Hb:
Hemoglobina Hrs: horas
HUVEC: Células endoteliales de vena humana umbilical IL 8: Interleucina 8
INOR: Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
IP: Inyección intraperitoneal
JNK: Quinsa amino terminal C Jun
MAPK: Tirosina quinsa activada por mitógeno
MEK: Quinasa regulada por señales extracelulares
M1P-1: Proteína inflamatoria de macrófagos
MMP: Matriz-metaloproteasas
MVD: Densidad de microvasos
mVEGF: Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular murino
NCI: Instituto Nacional de Cáncer de Estados Unidos
OMS: Organización Mundial de la Salud
PAK: Proteína quinsa activada por p21
PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas
PF-4: Factor plaquetario 4
PI3K: Fosfatidil-inositol 3 quinasa
PLC-yl: Fosfolipasa C gamma 1
REC1ST: Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos
SCID: Inmunodeficiencia severa combinada
SFB: Suero Fetal Bovino
SPECT: Tomografía simple de emisión de fotones
STAT: Transductores de señales y activadores de la transcripción
STF: Solución tampón fosfato
STKI: Pequeños inhibidores de tirosina quinasa
SWOG: Grupo de Oncología del Sudoeste
11/2 p: Tiempo de vida media de eliminación
TAC: Tomografía Axial Computarizada
TBST: Solución tampón Tris-Tween 20
TGF alfa: Factor Transformante del Crecimiento alfa
TGO: Transaminasa glutámico-oxalacética
TGP: Transaminasa glutámico-pirúvica
TSP-I: Trombospondina
VEGF: Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular
10
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VEGFR: Receptor de Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular
VEGFR-3: Receptor de Factor de Crecimiento del Endotelio Vascuelar tipo III
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Síntesis
El cáncer representa un gran problema de salud. La expresión del receptor de factor de
crecimiento epidérmico (EGFR) se encuentra aumentada en un tercio de todos los tumores
epiteliales y se ha asociado, a alteraciones del ciclo celular, incremento de la c apacidad
invasiva y de metastización, aumento de la angiogénesis y decrecimiento de la apoptosis de las
células neoplásicas. El AcM h-R3 es un anticuerpo humanizado que reconoce el dominio
externo del EGFR, capaz de inhibir la unión del EGF y la autofosfor ilación del receptor. Para
caracterizar los efectos farmacológicos y la posible actividad antitumoral de esta molécula se
realizaron experimentos a nivel preclínico y clínico. El AcM evidenció una potente actividad
antitumoral in vitro e in vivo en la línea celular de carcinoma vulvar humano A431 por
mecanismos anti-proliterativos, anti-angiogénicos y pro-apoptóticos. En experimentos de
exposición repetida al h-R3 en ratones xenotransplantados con la línea tumoral A431, se
demostró que se induce resistencia al h-R3 tras un largo período de latencia, la que estuvo
mayormente relacionada con la selección de subpoblaciones con elevado potencial
angiogénico. En los ensayos clínicos se demostró que el h -R3 fue muy bien tolerado en dosis
simple o múltiple. Los datos preliminares de farmacocinética y biodistribución demostraron
que el AcM exhibe una cinética no lineal y que se distribuye mayoritariamente en 5 órganos.
El hígado fue el órgano normal que evidenció la mayor captación específica del anticuerpo,
aunque existió una acumulación preferencial en los tumores. Tras el uso combinado con
radioterapia en 24 pacientes portadores de tumores avanzados de cabeza y cuello se
incrementó significativamente la sobrevida y el índice de respuestas completas. Los estudios
de ¡nmunohistoquímica en biopsias de pacientes, demostraron que el efecto antitumoral que
produce el h-R3 puede atribuirse a la inhibición de la proliferación y la angiogénesis tumoral.
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Introducción
El cáncer constituye un problema de salud en Cuba y a nive l internacional. De acuerdo a las
estadísticas mundiales más recientes, en el año 2000 se diagnosticaron 5 317 905 casos nuevos
de cáncer en el sexo masculino y 4 737 646 en el sexo femenino. En total, en ese año la
incidencia global del cáncer fue de 10 055 551 pacientes. Por otra parte, en el año 2000 se
produjeron 3 522 366 defunciones como consecuencia de una neoplasia maligna en el sexo
masculino, mientras que en el sexo femenino ocurrieron 2 686 313 muertes. En total,
fallecieron 6 208 679 pacientes de cáncer en el año 2000 (Globocan 2000, 2001).
En Cuba, la incidencia del cáncer muestra una tendencia creciente en el tiempo. Los cambios
ocurridos en nuestro país en algunos indicadores demográficos, sociales y de niveles de salud,
han provocado un incremento del riesgo de enfermar por neoplasias malignas y se estima que en
el año 2010 serán diagnosticados 30 000 nuevos casos. El cáncer es la segunda causa de muerte
en Cuba para todos los grupos de edad desde el año 1958 y la primera en los grupos de edad es
entre 15 y 64 años. El cáncer representa el 21,4 % del total de todas las causas de muerte en
Cuba y la primera causa de años de vida potencialmente perdidos. En los últimos 20 años, la
mortalidad por enfermedades cardiovasculares ha disminuido en un 23 ,3 %, mientras que por
tumores malignos, ha aumentado en un 4 %. El 63 % de las muertes por cáncer y el 53 % de los
casos nuevos ocurren en el grupo etáreo de 65 años y más. En el año
2000 se diagnosticaron 13 162 nuevos casos en el sexo femenino, para una tasa de 176,2 por
100 000 habitantes y 14 112 en el sexo masculino, para una tasa 252,1 por 100 000 personas.
En total, se diagnosticaron en Cuba 27 274 nuevos enfermos de algún tumor maligno en el año
2000 (tasa ajustada 243,8 por 100 000). Excluyendo al cáncer de piel (no melanoina), las
mayores incidencias para ambos sexos corresponden a las neoplasias de pulmón, mama,
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próstata, colon y cuello de útero. En cuanto a la mortalidad por cáncer en Cuba, en el año
ocurrieron 7 362 defunciones en el sexo femenino ( tasa ajustada 95,9 por 100 000), mientras
que en el sexo masculino se produjeron 9 443 muertes (tasa ajustada 168,1 por 100 000). En
total, en el 2001, 16 805 pacientes murieron como consecuencia de una neoplasia maligna, lo
que representa una tasa de 149.7 por 100 000 habitantes. Las primeras causas de defunción por
cáncer correspondieron a los tumores de pulmón, próstata, colon, mama, estómago y páncreas
(Registro Nacional de Cáncer 2000, 2001).
A pesar de los progresos en la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, solo se han logrado
avances discretos en la terapia de los tumores malignos en las últimas 2 décadas (Morrow CH y
cois., 2001). Según Morrow y colaboradores las neoplasias pueden c lasificarse en 3 grandes
grupos de acuerdo a la respuesta a las terapias cito -reductoras (Morrow CH y cols. 2001) El
primer grupo incluye a aquellos tumores que alcanzan altos índices de reducción o incluso
curación tras el tratamiento oncoespecífico (tumores intrínsecamente sensibles) y entre los
cuales se encuentran la leucemia linfoblástica aguda, el linfoma de Hodgkin y el cáncer
testicular. El segundo grupo incluye a aquellos tumores como el cáncer de mama, el cáncer de
pulmón de células pequeñas y el cáncer de ovario, que son usualmente respondedores a las
terapias iniciales, pero refractarios a los ciclos subsecuentes de quimio ó radioterapia. 'Las
recurrencias en ambos grupos, particularmente durante o poco tiempo después del tratamiento,
generalmente implican la emergencia de variantes celulares que son resistentes a los agentes
antineoplásicos inicialmente usados o incluso a nuevas drogas frente a las cuales no ha existido
exposición previa. En este estado refractario, las terapias de salvamento o r escate han tenido
poco éxito. Finalmente, existe un tercer patrón de respuesta a los agentes antitumorales que se
encuentra en aquellos tumores que son intrínsecamente resistentes a la mayoría de los
tratamientos. En este grupo se encuentran neoplasias tales como el cáncer de pulmón de células
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no pequeñas, el melanoma maligno y el cáncer de colon (Morrow CH y cols., 2001).
El fenómeno de la resistencia a los agentes antineoplásicos clásicos ha sido extensamente
estudiado. Entre los factores que median la resistencia se han propuesto mecanismos
farmacológicos, anatómicos y de interacción droga -huésped. Entre estos mecanismos se han
formulado los siguientes: disminución de la acumulación de la droga (reducción del influjo,
aumento del eflujo), disminución de la activación de la droga, aumento de los mecanismos de
inactivación, incremento de la reparación del daño al ácido desoxirribonucleico (ADN) o a
proteínas y alteraciones genéticas tales como mutaciones en el ADN, alteraciones en la
transcripción o en la traducción y alteración en la estabilidad de las macromoléculas (Morrow
CH y cols., 2001).
El inicio y progresión de una neoplasia es un proceso que implica la acumulación de cambios
genéticos en las células somáticas. De los múltiples eventos que están inv olucrados en el
desarrollo, progresión tumoral y resistencia a la terapia, los oncogenes revisten una importancia
especial (Loda M, 1994). Los oncogenes constituyen versiones alteradas de genes designados
como proto-oncogenes. Pueden ser clasificados en 5 grupos teniendo en cuenta las propiedades
bioquímicas y funcionales de las contrapartes no modificadas: (I) factores de crecimiento, (II)
receptores de factores de crecimiento, (III) transductores de señales, (IV) factores de
transcripción y (V) reguladores de la apoptosis. El objetivo principal de emplear los oncogenes
como blanco del tratamiento anti -neoplásico consiste en interferir los circuitos de señalización
intracelular derivados de su activación, que conduzca a la detención del ciclo celular o a la
apoptosis (Golub TR y cols., 1999).
El crecimiento tumoral depende del reclutamiento permanente de vasos sanguíneos. Este
proceso conocido como angiogénesis también ocurre como consecuencia de alteraciones
genéticas tales como activación de oncogenes o inactivación de genes supresores tumorales
(Rale J y cols., 2000).
Varios oncogenes son capaces de desregular la expresión de moléculas estimuladoras o
inhibidoras de la angiogénesis. Por ejemplo, la expresión de la proteína ras mutada se asocia
con la producción incrementada de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y la
regulación negativa de la producción de la proteína trombospondina 1 (TSP -1), inhibidora de la
angiogénesis. La regulación positiva del VEGF y de la angiogénesis también puede ocurrir
como consecuencia de la activación de otras proteínas oncogénicas tales como EGFR, Raf,
MEK (quinasa regulada por señales extracelulares) y PI3K (fosfatidil -inositol 3 quinasa). La
extensión de este efecto pro-angiogénico puede estar significativamente influida por el tipo
celular, por fenómenos epigenéticos tales como la hipoxia y la densidad celular y/o por la
presencia de alteraciones genéticas adicionales tales como la pérdida de genes supresores
tumorales como p 16 y p53 (Rak J y cols., 2002).
El receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) es una glicoproteína de membrana de
170 KDa. Su dominio intracelular está asociado a actividad proteína quinasa tirosina específica
y presenta homología estructural con el producto del oncogen v-erbB, evidencia que sugiere su
relación con el proceso de transformación maligna (Mendelsohn J y cols.
La sobre-expresión de EGFR se ha asociado a alteraciones en el ciclo cel ular, incremento de la
capacidad invasiva y de metastización, actividad angiogénica aumentada y decrecimiento en la
apoptosis de las células tumorales.
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La expresión del EGFR se encuentra aumentada en un tercio de todos los tumores de origen
epitelial, incluyendo neoplasias de pulmón, próstata, mama, colon, cabeza y cuello, ovario,
cuello de útero, esófago, estómago, páncreas, riñón y tumores astrocíticos (Mendelsohn J y
cols., 2002).
Se han usado diferentes estrategias para bloquear la señalización asociada al EGFR. Entre las
drogas más usadas se encuentran anticuerpos monoclonales (AcM) (c225, ABX -EGF, EMD 72
000) (Herbst RS y cois., 2002), pequeñas moléculas inhibidoras de la actividad quinasa (Iressa,
Tarceva), oligonucleótidos antisentido y vacunas de cáncer (Mendelsohn J y cols., 2003).
A pesar de los resultados promisorios obtenidos a nivel preclínico con las diferentes clases de
moléculas antagonistas del EGFR, usadas como monoterapia o en combinación con otras
terapias oncoespecíficas, solamente se han alcanzado resultados discretos en los ensayos
clínicos (Mendelsohn J y cols., 2003). En el año 2002 se registró la droga Iressa (ZD1839,
Gefítinib) en Japón, como tercera línea de tratamiento del cáncer de pulmón de células no
pequeñas, sobre la base del incremento de 10 % de la respuesta antitumoral (Ohe Y. y cols.,
2002) . Posteriormente, Iressa también se registró para la misma indicación en Australia
(Febrero 2003) y Estados Unidos (Marzo 2003) (Cohén MH y cols., 2003). Previamente, en el
año 1998, la agencia regulatoria FDA (Food and Drug Administration) había otorgado el
registro al AcM Herceptin (Trastuzumab) en combinación con quimioterapia como tratamiento
a pacientes aquejadas de tumores avanzados de mama, sobre la base del incremento en 3 meses
del tiempo a la progresión (Slamon DJ y cois., 2001).
El uso de medicamentos bloqueadores del EGFR también se ha asociado a reacciones tóxicas.
Los eventos adversos más comunes luego del uso de pequeñas moléculas inhibidoras de la
actividad tirosina-quinasa asociadas al EGFR, tales como Iressa o Tarceva, han sido erupciones
de la piel y diarreas (Meric JB y cols., 2000; Ciardiello F y cois., 2002). Se ha reportado la
aparición de muertes tóxicas por neumonitis intersticial en el 1 % de los 20 000 enfermos
tratados con Iressa en Japón (Schultz J y cols., 2003).
Luego del uso del AcM c225 (erbitux, cetuximab) en más de 800 pacientes, se halló que el 77%
de los sujetos experimentó erupciones acneiformes y el 2% manifestó reacciones a nafilácticas
(Mendelsohn J y cols., 2002). Estas reacciones alérgicas severas se asociaron al desarrollo de
respuesta inmune contra la fracción murina de este anticuerpo quimérico (respuesta HACA;
human anti-chimeric antibodies) tras administradores repetidas ( Mendelsohn J y cols; 20 02).
A pesar del registro de los primeros fármacos inhibidores de la actividad tirosina quinasa
asociada al EGFR y a Her2, y de los múltiples estudios realizados en materia de resistencia a las
drogas citotóxicas y a la radioterapia, existe muy poca información acerca de la aparición de
resistencia a las drogas que inhiben la señalización asociada a oncogenes.
En el Centro de Inmunología Molecular. Habana. Cuba, se generó un hibridoma productor de
un AcM murino que reconoce a un epítope localizado en el dominio externo del EGFR. El
anticuerpo ior egf/r3 reconoce al EGFR con alta afinidad y es capaz de inhibir la unión del
EGF a su receptor en un ensayo de competencia, ejerciendo un efecto antagonista que inhibe la
autofosforilación del receptor (Fernández A y cols., 1989; 1992).
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Con el anticuerpo ior egf/r3 se realizaron varios ensayos clínicos diagnósticos o terapéuticos.
En total, 58 pacientes portadores de neoplasias de pulmón, mama o gliomas malignos recibieron
dosis repetidas del AcM en los ensayos diseñados con intención ter apéutica (Crombet T y cols.,
2001 a. b) y se incluyeron 148 pacientes en los ensayos del anticuerpo como diagnosticador
(Ramos M. y cols., 1999).
Tras estos estudios se constataron evidencias de estabilización de la enfermedad y aume nto de
sobrevida en los pacientes portadores de tumores avanzados de pulmón y g liomas malignos
(Crombet T y cols., 2001 a, b). Con relación al perfil de seguridad, se reportaron reacciones
alérgicas severas y muy severas, asociadas a la aparición de respuesta inmune contra la proteína
murina (respuesta HAMA; human anti-mouse antibodies). Los eventos adversos severos
consistieron en vómitos, bronco-espasmo, fiebre y disnea al reposo. Las reacciones adversas
muy severas consistieron en anafilaxia, fiebre con hipotensión y relajación de esfínteres
(Crombet T y cols., 2001a. b).
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Con el objetivo de incrementar la eficacia terapéutica y disminuir la toxicidad se realizó la humanización del anticuerpo
murino ior egf/r3. El anticuerpo humanizado (h-R3) se generó mediante transplante de las regiones determinantes de la
complementaridad o regiones hipervariables del anticuerpo murino ior egf/r3, en un marco de soporte de una inmunoglobulina
humana. El anticuerpo humanizado es capaz de reconocer al receptor con afinidad similar a sus ligandos (Kd=10 M) (Mateo C
y cois., 1997).
Para caracterizar los efectos farmacológicos del AcM humanizado h -R3 a nivel preclínico y clínico, así como para evaluar la
emergencia de resistencia adquirida a esta molécula, nos propusimos la si guiente hipótesis de trabajo:
El AcM humanizado h-R3, que posee actividad antagonista del EGFR, produce un efecto anti - tumoral tanto en modelos
experimentales como en pacientes, que involucra mecanismos citostàtico y anti-angiogénico.
De esta hipótesis se derivaron los siguientes objetivos:
1. Evaluar in vitro e in vivo la actividad anti-proliferativa, pro-apoptótica y anti-angiogénica del AcM h-R3 en la linea de
carcinoma vulvar A431.
2. Evaluar in vivo la aparición de resistencia adquirida al tratamiento prolongado con anticuerpos anti-EGFR en ratones
xenotransplantados con la línea de carcinoma vulvar A431 y caracterizar el fenotipo de las variantes celulares resistentes.
3. Evaluar y caracterizar la seguridad, farmacocinética y biodistribución d el AcM h-R3 en pacientes portadores de cáncer
avanzado.
4. Evaluar la actividad anti-tumoral, anti-proliferativa y anti-angiogénica del AcM h-R3 en pacientes portadores de
neoplasias avanzadas de cabeza y cuello.
Para cumplimentar estos objetivos nos propusimos las siguientes tareas:
• Evaluar in vitro la actividad anti-proliferativa del AcM h-R3 en la línea de carcinoma vulvar A431 a través de un ensayo de
incorporación de timidina tritiada, en 2 condiciones de cultivo.
• Evaluar el efecto antitumoral del AcM h-R3 en ratones inmunodeficientes xenotransplantados con la línea de carcinoma
vulvar A431.
• Evaluar la capacidad del AcM h-R3 de inhibir la producción de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) a nivel
proteico mediante un sistema inmunoenzimático (ELISA) y a nivel de ácido ribonucleico (ARN), por técnica de northern blot.
• Evaluar el efecto del AcM h-R3 en el ciclo celular por técnicas de citometría de flujo.
• Evaluar in vitro la actividad pro-apoptótica del AcM h-R3 en la línea de carcinoma vulvar A431, a través de un ensayo de
detección de mono y oligonucleosomas, en 2 condiciones de cultivo.
• Evaluar el efecto anti-proliferativo, anti-angiogénico y pro-apotótico del AcM h-R3 en las muestras de los tumores
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xenotransplantados, mediante técnicas de inmunohistoquímica.
• Evaluar la aparición de resistencia tras el tratamiento prolongado con los AcMs anti - EGFR ior egf/r3 y h-R3 en ratones
xenotransplantados con la línea de carcinoma vulvar A431.
• Evaluar los posibles mecanismos de aparición de resistencia in vivo a los anticuerpos anti-EGFR ior egf/r3 y h-R3, mediante
técnicas de western blot, northern blot y de transfección de genes.
• Evaluar la seguridad e inmunogenicidad del AcM h-R3 administrado en dosis simple a pacientes portadores de tumores
epiteliales avanzados.
• Caracterizar la biodistribución del h-R3 en pacientes portadores de tumores epiteliales tras una administración única del AcM.
mediante técnica de ¡nmumogammagrafía ser iada de cuerpo entero.
• Caracterizar la farmacocinética del h-R3 en pacientes portadores de tumores epiteliales tras una administración única,
mediante la cuantificación de los niveles séricos del AcM a través de un sistema ELISA.
• Evaluar la seguridad del AcM h-R3 administrado en dosis múltiples a pacientes portadores de carcinomas epidermoides de
cabeza y cuello en etapas avanzadas.
• Evaluar la eficacia preliminar del AcM h-R3 administrado en dosis múltiples y en combinación con radioterapia en pacientes
portadores de carcinomas avanzados de cabeza y cuello.
• Evaluar el efecto anti-proliferativo y anti-angiogénico del AcM h-R3 en biopsias de pacientes portadores de neoplasias
avanzadas de cabeza y cuello, mediante técnicas de inmunohistoquímica.
Novedad científica
La selección de nuevos blancos para la terapia de cáncer es la tendencia principal de las investigaciones en este campo. El E GFR
se encuentra entre los blancos terapéuticos más estudiados en nuestros días y el AcM h -R3 es uno de los 4 anticuerpos
antagonistas del EGFR que se están evaluando en ensayos clínicos, a nivel mundial.
En pacientes portadores de tumores avanzados de cabeza y cuello, este nuevo medicamento incrementa significativamente la
respuesta objetiva antitumoral y la sobrevida en comparación con la radioterapia, que constituye el tratamiento convencional para
este estadio de la enfermedad.
El AcM h-R3 pudiera además mejorar los tratamientos actuales de aquellos pacientes portadores de otras neoplasias epiteliales
caracterizadas por la alta expresión de EGFR, entre las que se encuentran las principales localizaciones tumorales como el cáncer
de pulmón, de colon, de próstata, el cáncer cérvico-uterino, de mama, los carcinomas renal, pancreático, de vejiga así como los
tumores astrocíticos.
22
El AcM h-R3 es el primer producto biotecnológico cubano con propiedad industrial registrado en nuestro país para el tratamiento
del cáncer y constituye el segundo anticuerpo monoclonal registrado en algún país para el tratamiento de tumores sólidos.
El uso del h-R3 produce resultados terapéuticos semejantes a otros inhibidores del EGFR, pero con menor efecto tóxico, lo cual
pudiera conferirle ventajas terapéuticas y comerciales. La diferencia fundamental en el perfil de seguridad, radica en que el h-R3
no provoca reacciones adversas en piel tales como foliculitis o rash cutáneo ni reacci ones alérgicas severas.
Otro aspecto novedoso de esta tesis radica en la evaluación de inducción de resistencia a los anticuerpos bloqueadores del EG FR
tras el tratamiento prolongado y la investigación de sus posibles mecanismos, siendo el primer estudio r ealizado para este tipo de
drogas. Se describe por primera vez que las bases de la resistencia pueden tener algún vínculo con la angiogénesis tumoral, l o
cual refuerza la relación entre los oncogenes y la formación de vasos sanguíneos. La tesis también dis cute la relación entre la
inhibición de la angiogénesis y la inducción de apoptosis. También se abordan de forma novedosa la evaluación de mecanismos
efectores en la clínica y se demuestra los efectos anti -proliferativo y anti- angiogénico del h-R3 en biopsias de pacientes.
Consideraciones finales
Esta tesis consta de los siguientes acápites: Síntesis, Introducción, Revisión Bibliográfica, Materiales y Métodos, Resultado s y
Discusión, Discusión General, Conclusiones, Recomendaciones, Referencias, Autobibli ografía y Anexos.
La caracterización preclínica y clínica del AcM ha dado lugar a 6 publicaciones aparecidas en revistas de alto índice de impa cto.
La séptima publicación ha sido recientemente aceptada en la revista Journal of Clinical Oncology (Febrero, 2 004).
Dos trabajos que resumen la caracterización preclínica y clínica del AcM h -R3, se presentaron en la reunión anual de la Sociedad
Americana de Oncología Clínica (ASCO; America Society of Clinical Oncology), en sus ediciones de los años 2001 (presentac ión
oral) y 2002 (poster). Esta conferencia científica, a la cual asisten anualmente más de 25 000 especialistas, constituye el c ongreso
de Oncología más importante a escala mundial.
Este trabajo además se ha presentado en 12 congresos o simposios internac ionales de Oncología e Inmunología (Ver Anexo 1).
En el año 2002, la ponencia titulada: “AcM h -R3: Un nuevo concepto terapéutico para el tratamiento del cáncer avanzado”, de los
autores Crombet T, Lage A, Pérez R, Osorio M y Cruz T, obtuvo premio anual de la Academia de Ciencias de Cuba. Este trabajo
fue además seleccionado como el trabajo de mayor relevancia científica del año 2002.
En la XIV Edición del Forum de Ciencia y Técnica, la ponencia denominada AcM h -R3: “Un nuevo medicamento para el
tratamiento del cáncer avanzado” de los autores Pérez R, Mateo C, Crombet T, Iznaga N. y colaboradores obtuvo premio
relevante de la comisión de Biotecnología y Farmacia. La novedad científica del h-R3 a escala mundial se encuentra además
avalada por las patentes concedidas en 17 países, incluyendo EUA, Canadá, China y la Oficina Europea de Patentes. La patente de
obtención del AcM h-R3, denominada "Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de
23
crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico” de los autores Mateo C, Moreno E y
Pérez R. recibió en el año 2002
la medalla de oro que confiere la Organización Mundial de la Propiedad Industrial. Esta ponencia
recibió además el Premio Anual
de la Academia de Ciencias de Cuba en el año 1998
Revisión bibliográfica
Las células cancerosas exhiben un conjunto de anormalidades fenotípicas que incluyen la
autonomía en cuanto a señales de crecimiento, insensibilidad a las señales anti - proliferativas,
resistencia a la apoptosis, actividad angiogénica, así como la capacidad de invasi ón y
metástasis (Hanahan D y cols., 2000).
Los genes implicados en la carcinogénesis (conocidos como proto-oncogenes en su estado
estructural y funcional normal) pueden convertirse en oncogenes por varios mecanismos que
incluyen mutaciones puntuales, translocaciones cromósomicas, mutagénesis insercional o
amplificación (Hanahan D y cois., 2000). Esto conlleva a la activación del oncogen, lo cual se
traduce en disrupción de los procesos normales de crecimiento, diferenciación celular y
apoptosis. El proceso de transformación maligna también puede estar favorecido por la
inactivación de genes supresores de tumores, debido a mutaciones o a pérdida de
heterocigocidad (Salomon DS y cols., 1995).
Se han identificado varios oncogenes que codifican para proteínas con actividad tirosina -
quinasa los cuales incluyen receptores transmembrana que poseen a ctividad tirosina quinasa en
su dominio intra-citoplasmático (Susa M y cois., 2000; Sattler M y cois., 2003).
Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR)
La familia del EGFR está compuesta por 4 glicoproteínas estrechamente relacionadas: EGFR
(erbBl, HERI), erbB2 (HER2/neu), erbB3 (HER 3) y erbB4 (HER 4) (Salomon DS y cois.,
1995). Cada una de estas proteínas está formada por un dominio extracelular, amino - terminal,
que contiene el sitio de unión al ligando, una región transmembrana hidrofóbica y una “cola”
citoplasmàtica, que en su región yuxtamembrana contiene un dominio con actividad tirosina
quinasa y en la región carboxiterminal incluye residuos de tirosina y motivos regulatorios
(Salomon DS y cois., 1995). A su vez, la región extracelular puede dividirse en 4 dominios,
donde el dominio III es el responsable de unión al ligando.
24
Los 4 miembros de la familia del EGFR comparten una estructura común, sin embargo HER 3
no posee actividad tirosina quinasa específica y no se han encontrado ligandos e specíficos para
HER 2. Se ha propuesto que está proteína funciona solamente como un co -receptor, carente de
ligando. HER 2 es el receptor preferido para la dimerización con otros miembros de la fa milia
del EGFR (Klapper LN y cols., 2000). Los complejos heterodiméricos que poseen HER 2
exhiben un alto índice de reciclaje, estabilidad y potencia en la señalización en comparación
con otros dímeros (Graus-Porta D y cois., 1997; Lenferink AE y cois., 1998). Hasta la fecha, se
han identificado 6 ligandos del EGFR. que contienen un motivo EGF-like (semejante al EGF)
de 50-55 residuos de aminoácidos, que incluyen 6 residuos de cisteína. Los ligandos
identificados incluyen al factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor transformante del
crecimiento alfa (TGF alfa), epigen, epiregulina. betacelulina y el factor de crecimiento
epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Olayioye MA y cois., 2000). El EGF fue
identificado en 1962 por Stanley Cohén (Cohén S y cois., 1962), mientras que el receptor fue
purificado y caracterizado por el mismo autor en 1980 (Cohén S y cols., 1980).
Se han identificado un gran número de deleciones en las porciones extracelular e intracelular
del EGFR. Sin embargo, no se han encontrado deleciones en las regiones transmembrana o en el
dominio con actividad tirosina-quinasa. Para el EGFR se han reportado 3 deleciones del
dominio extracelular que conducen a la definición de los tipos I. II y III (EGFRvI, EGFR vII y
EGFvIII) (Arteaga CL y cols., 2002).
La variante I (EGFRvI) implica la deieción de todo el dominio extracelular, lo cual le confiere
gran semejanza con el oncogen v-erbB (Harte MT y cois., 1995). El receptor es
constitutivamente activo y no puede ser regulado por el ligando (Kris RM y cols., 1985;
Gilmore T y cols., 1988). Esta deieción solo se ha identificado en una línea celular en cultivo
derivada de un glioma maligno humano (Humphrey PA y cols., 1988).
La variante II (EGFRvlI), se ha encontrado en gliomas e implica la deleción de 83 aminoácidos
del dominio IV (rico en cisternas) de la porción extracelular del receptor (Humphrey PA y
cois., 1988). Esta deleción representa el 7 % de todo el esqueleto de la proteína. El EGFRvlI si
es capaz de transmitir señales de activación in vitro tras la unión al ligando, teniendo un
comportamiento muy similar al receptor salvaje (no truncado). Esta mutante parece no tener
influencia en el fenotipo maligno de los gliomas, que puede resultar de la amplificación del gen
del EGFR. Debido a la rigidez estructural del dominio IV de l a porción externa del receptor, la
conformación del dominio puede no afectarse por esta pequeña deleción, dejando intacto el
sitio de unión al ligando (Humphrey PA y cois., 1988). La mutación más común (EGFRvIII)
involucra la deleción de los exones 2 al 7 y la consecuente pérdida de los residuos 6 al 273 en
el dominio extracelular, lo cual conduce a un receptor constitutivamente activo, que no se
regula negativamente por endocitosis (Wong AJ y cois., 1992). Estas mutaciones pueden
producirse como consecuencia de re-arreglos de genes y también de empalme (splicing)
alternativo del ARN mensajero, que puede conducir a la inserción de un residuo de glicina en el
sitio de la deleción, sin alterar los marcos de lectura. El EGFRvIII carece de los dominios I y II
de la fracción extracelular del EGFR. La sobre-expresión del EGFRvIII no excluye la sobre-
expresión del receptor salvaje (Wikstrand CJ y cois., 1995). Esta mutación se ha reportado en
el 50 % de los gliomas de bajo y alto grado (Humphrey PA y cois., 1990), e n meduloblastomas
(Moscatello DK y cols., 1995), en tumores de mama (Wikstrand CJ y cols., 1995; Moscatello
DK y cois., 1995), de ovario (Moscatello DK y cois., 1995) y en tumores de pulmón de célul as
pequeñas (Moscatello DK y cols., 1995).
La unión de algún ligando al dominio extracelular de la proteína monomérica activa las
funciones catalíticas citoplasmáticas, promoviendo la homodimerización o la
25
26
heterodimerización del receptor y la autofosforilación o fosforilación cruzada de los resid uos de tirosina
(Sweeney C y cols., 2000).
Las tirosinas fosforiladas sirven de sitio de unión a un grupo de transductores de señales y de moléculas
adaptadoras que activan diferentes vías de señalización que resultan en proliferación, migración, adhesión,
inhibición de la apoptosis y promoción de la angiogénesis (Mendelsohn J y cols., 2002). Los residuos
específicos de tirosina que son fosforilados dependen de los ligandos y de la pareja de dimerización (Sweeney
C y cols., 2000).
Las vías de señalización intracitoplasmáticas que son activadas por el EGFR incluyen a la fosfolipasa C gamma
1 (PLC-yl), Ras-Raf-MEK-MAPKs, PI3K y Akt, las proteínas quinasas activadas por el estrés (SAPKs), PAK -
JNKK-JNK y los transductores de señales y activadores de la transcripción (STATs) (Yarden Y y cois., 2001;
Hackell PO y cois., 1999). De los miembros de la familia, el EGFR es el único que puede interactuar
directamente con la proteína c-Cbl, una ligasa a ubiquitina, que conduce a la degradación lisosomal del EGFR
tras la internalización del receptor inducida por el ligando (Lefkowitz G y cols., 1998).
Rol del EGFR en la transformación y en la progresión tumoral.
La señalización a través del EGFR es crucial en el desarrollo epitelial, la proliferación y la organogénesis, lo
cual ha quedado claramente demostrado tras la generación de ratones en los cuales el gen del EGFR ha sido
suprimido. Aunque el fenotipo de estos ratones es variable en dependencia de su base genética, todos exhiben
severas deficiencias en el desarrollo de los epitelios de muchos órganos y sistemas tales como el tracto
gastrointestinal, los pulmones, los riñones, el cerebro, el hígado, la piel y los ojos, que pueden condu cir a la
letalidad de los embriones (Threadgill DW y cois., 1995; Miettinen PJ y cols., 1995; Sibilia M y col s., 1998).
Por el contrario, aquellos ratones con deleción homocigótica del gen del TGF alfa si son viables, pero muestran
un fenotipo con limitaciones en la piel y los ojos (Mann G y cols., 1993).
27
Al igual, los ratones en los que se inactiva el gen de la anfiregulina son normales con excepción de la
aparición de un fallo severo en el desarrollo de la glá ndula mamaria (Luetteke NC y cols., 1999). Estos
hallazgos sugieren que los ligandos del EGFR poseen roles diferentes y especificidad tisular.
La primera evidencia acerca del rol del EGFR en la transformación neoplásica provino de la
demostración de que el EGFR era el homólogo estructural del oncogen v-erbB AEV (virus de
eritoblastosis aviario). AEV codifica para una forma truncada en la porción c -terminal del erbBl (v-
erbB 1), que carece de dominio extracelular y muestra varias mutaciones intracelulares que resultan en
la dimerización independiente del ligando y consecuente fosforilación (Downward J y col., 1984).
Otros virus transformantes pueden activar constitutivamente al EGFR o prevenir la regulación negativa
del receptor. Por ejemplo, E5, un producto del virus del papiloma humano, es capaz de suprimir la
degradación endosomal del EGFR, conduciendo a la reexpresión del EGFR y a la señalización
prolongada (Straight SW y cois., 1995). El retrovirus de ratón Cas NS -1, que induce linfoma pre-B y
leucemia mieloide, codifica una forma mutante de c -Cbl, la ligasa a ubiquitina que promueve la
degradación del EGFR (Lefkowitz G y cols., 1998). De esta forma, al igual que E5, la proteína mutante
Cbl favorece la reexpresión del EGFR y el aumento de potencia en la señalización. En adición,
diferentes cepas de retrovirus codifican mutantes de moléculas adaptadoras o de factores de
transcripción asociados al EGFR tales como v-Ras, v-Crk, v-Akt, v-Raf, v-Src, v-Jun y v-Fos (Arteaga
CL y cois., 2002). Finalmente el virus de la hepatitis C y el virus de Epstein Barr, que se asocian al
carcinoma hepatocelular y nasofaríngeo respectivamente, regulan positivamente la transcripción del
promotor del gen del EGFR (Menzo S y cols., 1993; Miller WE y cols., 1995).
Otras evidencias sostienen el rol del EGFR en la tumorigénesis. La transfección del gen del EGFR y
su ligando TGF alfa conduce a la transformación maligna in vitro de fibroblastos. Estos estudios
demostraron que la sobre-expresión del receptor salvaje conduce a la transformación maligna
solamente en presencia del ligando (Yarden Y y cois., 2001). La sobre -expresión de TGF alfa en el
epitelio mamario bajo el control de un promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV),
resulta en hiperplasia y carcinoma mamario (Sandgreen EP y cols., 1990). Los estudios en fibroblastos
y en ratones transgénicos mostraron que la transformación inducida por la sobre -expresión del EGFR
puede ser acelerada por la co-expresión de neu, el homólogo murino de HER2 (Kokai Y y cols., 1987;
28
Muller WJ y cols., 1996). El 50 % de los ratones bi-transgénicos que expresan MMTV/TGF alfa y
MMTV/neu en el epitelio mamario desarrolla tumores mamarios metastásicos en los p rimeros 6 meses
(Muller WJ y cols., 1996).
Rol del EGFR en la señalización intracelular
Proliferación
El EGFR actúa sobre el ciclo celular, promoviendo la proliferación descontrolada. La unión de un
ligando al EGFR, activa a la proteína Ras, que inicia la cascada de fosfori lación y activación de las
proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Se ha propuesto que la activación del EGFR
resulta en inducción de la ciclina DI, factor que promueve la progresión del ciclo celular desde la fase
G1 a la fase S, favoreciendo un rápido crecimiento y división (Perry JE y cols., 1998). El bloqueo del
EGFR disminuye los niveles de ciclina D, lo cual resulta en un incremento del inhibidor de cdk
(quinasa dependiente de ciclina) p27 (Mendelsohn J y cols., 2001).
Angiogénesis
La angiogénesis es crucial para el crecimiento tumoral, la sobrevida de las células y la metastización.
La señalización a través del EGFR incrementa la producción de factores pro - angiogénicos tales como
el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), la interleucina 8 y el factor básico de
crecimiento de fibroblastos (b-FGF) (Viloria A y cols., 1997; O-charoenrat P y cois., 1999;
Ravindranath N y cols., 2001). Se ha propuesto que las vías de señalización Ras -MAPK y PI3K. están
involucradas en la regulación positiva del VEGF (Bancroft CC y cois., 2002; Maity A y cols., 2000).
La co-expresión de EGFR y TGF alfa se ha correlacionado con la densidad de microvasos sanguíneos
en un estudio realizado en carcinomas ductales infiltrantes de la mama (De Jong JS y cois., 1998). El
bloqueo del EGFR también puede inhibir la migración de las células endoteliales de vena humana
umbilical (HUVEC) co-cultivadas con células neoplásicas estimuladas con EGF (Hirata A y cols.,
2002), disminuir la migración de las células endoteliales en tumores experimentales (Riedel F y cols.,
2002) e inducir apoptosis de las células endoteliales vasculares (Karashima T y cols., 2002; Bruns CJ
y cols., 2002).
Migración y motilidad
La señalización a través del EGFR incrementa la motilidad ce lular, lo cual favorece el proceso de
metastización (Turner T y cois., 1996). Algunos de estos efectos pueden estar mediados por la
modulación de matriz-metaloproteasas (MMP) (Kondapaka SB y cois., 1997). La activación del
EGFR regula no solo la migración celular sino también las interacciones célula -célula y célula-
sustrato. Se ha demostrado que la activación del EGFR induce el desprendimiento de las células de la
matriz extracelular (anoikis) e induce la síntesis de MMP 9, que favorece la invasión celular y la
degradación de la membrana basal (Ellerbroek SM y cols., 2001).
Adhesión
La expresión de moléculas de adhesión puede estar parcialmente mediada por la señalización a través
del EGFR. Las moléculas de adhesión promueven la unión de las células tumora les a la matriz
29
30
extracelular y la penetración a los tejidos circundantes (Hazan RB y cols., 1998; Adelsman MA y
cols., 1999).
Diferenciación
La activación del EGFR controla no solo la transcripción de genes importantes para la proliferación y
sobrevida, sino también para la diferenciación. Las mutantes del EGFR inhiben la diferenciación
tisular y se ha demostrado que la sobre-expresión del EGFR es mayor en tejidos pobremente
diferenciados en comparación con los bien diferenciados (Wu JX y cois., 1996). El b loqueo del EGFR
es capaz de inducir la diferenciación terminal de las células en cultivo (Bancroft CC y cols., 2002).
Funciones de sobrevida y apoptosis
Los experimentos a nivel preclínico sugieren que el EGFR puede regular la sobrevida de la célula
neoplásica, ya que muchos tumores que sobre-expresan este antígeno dependen de la estimulación del
EGF o TGF alfa (por vía autocrina o paracrina) y la activación siguiente de la señalización para la
supervivencia (Rodeck U y cois., 1997). La activación del EGFR tiene efecto anti-apoptótico, lo cual
permite la sobrevida de las células tumorales tras la quimio o la radioterapia. Se ha propuesto que la
activación del receptor induce la expresión de Bcl2, una proteína anti -apoptótica que bloquea la acción
de BAX, un promotor de la apoptosis (Jost M y cols., 1999). Distintas vías de la apoptosis se pueden
activar tras la unión de algún ligando al EGFR, que pueden variar de acuerdo al tipo celular. Por
ejemplo, se ha demostrado que el EGF puede inducir apoptosis, a través de la caspasa I en la línea de
carcinoma vulvar A431 pero no en la línea de cáncer cervical HeLa (Chin YE y cols., 1997).
Expresión de EGFR en tumores
Otras evidencias sugieren el rol del EGFR en la transformación maligna. Varios tipos de
neoplasias humanas incluyendo tumores del tracto aerodigestivo, colon, páncreas, mama,
ovario, vejiga, riñones y tumores astrocíticos exhiben sobre -expresión del EGFR (Mendelsohn
J y cols., 2002). El EGFR se expresa en células normales en niveles que van desde 2 x 104 a 2 x
lO5 receptores por célula (Ennis BW y cois., 1991). Sin embargo, en células tumorales esta
31
expresión puede ser mayor, de hasta 2 x 10^ receptores por célula (Ennis BW y cois., 1991).
También se ha descrito que existe heterogeneidad en la expresión del EGFR entre tumores de la
misma histología y estadio, e incluso intratumoral, debido a que algunas células pueden
evidenciar una alta expresión, mientras que otras tienen expresión baja dentro de la misma
neoplasia (Arteaga CL y cois., 2002).
Los tumores positivos al EGFR y que además co-expresan algún ligando exhiben mayor proliferación
y peor sobrevida que aquellas neoplasias que expresan el receptor en ausenc ia de ligandos (Yamanaka
Y y cols., 1993; Tateishi M y cois., 1990). En tumores mamarios, la co -expresión de EGFR y HER2 se
asocia a resistencia a la terapia endocrina (Pérez R y cois., 1984; Harris AL y cols., 1988). Los
tumores prostáticos hormono-resistentes adquieren sobre-expresión de TGF alfa y EGFR, lo cual
sugiere regulación positiva de este lazo autocrino, con la progresión tumoral (Scher HI y cois., 1995).
La siguiente tabla ilustra los porcentajes de expresión del EGFR en diferentes tumores:
Tumor Porcentaje de expresión de EGFR Referenda
Colo-rectales 25-77 % Salomon DS y cols., 1995 Goldstein
NS y cols., 2001 Cabeza y cuello 95-100 % Salomon DS y cols., 1995 Ford AC
y cols., 2003 Próstata 65 % Di Lorenzo G y cols., 2002
Páncreas 3-89% Salomon DS y cols., 1995 Uegaki K
y cols., 1997 Pulmón 40-80 % Salomon DS y cols., 1995 Fontanini
G y cols., 1998 Rusch V y cols.,
1997 Riñón 50-90% Salomon DS y cols., 1995 Yoshida
K y cols., 1997
Mama 14-91% Beckmann MW y cols., 1996 Klijn
JG y cols., 1992 Esófago 43-89% Okano J y cols., 2003
Ovario 35-70 % Salomon DS y cols., 1995 Bartlett
JM y cols., 1996 Fischer-Colbrie J y
cols., 1997 Cuello de útero 90% Lee CM y cols., 2003
Glioma 40-63% Salomon DS y cols., 1995 Rieske P
y cols., 1998 Watanabe K y cols.,
1996
Vejiga 31-48% Salomon DS y cols., 1995 Chow NH
y cols., 1997
32
En general, la sobre-expresión de EGFR y de algunos ligandos se ha asociado a un comportamiento
tumoral más agresivo, a peor pronóstico y sobrevida (Bartlett JM y cois., 1996; Veale D y cois., 1993;
Klijn JG y cois., 1994).
Estrategias para bloquear al EGFR
Teniendo en cuenta el rol biológico del EGFR en la tumorigénesis y su alta expresión en neoplasias de
origen epitelial, se han ensayado varias estrategias para interrumpir esta cascada de señalización. Las
aproximaciones más importantes incluyen el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
dominio externo del EGFR (Mendelsohn J y cois., 2000; Kim ES y cois., 2001) y pequeñas moléculas
que inhiben la actividad tirosina quinasa y actúan interfiriendo la unión del nucleósido adenosin
trifosfato (ATP) al dominio intracelular del receptor (Ciardiello F y cols., 2001).
Se han usado varios anticuerpos monoclonales que bloquean el EGFR. Entre estos se encuentran el
anticuerpo quimérico c225, erbitux ó cetuximab (ImClone Systems -Bristol- Myers Squibb, EUA) y los
anticuerpos humanizados ABX-EGF (Abgenix Inc. EUA) y EMD 72 000 (Merck KGaA; Alemania)
(Mendelsohn J y cols,2002). También se han ensayado otros anticuerpos biespecíficos como el AcM
MDX-447 (Medarex, EUA) que reconocen por un lado al EGFR y por el otro al receptor de
¡nmunoglobulinas de monocitos o macrófagos.
33
con el objetivo de atraer a células del sistema inmune (Negri DR y cols., 1995; Wallace PK y cols.,
2000).
También se ha desarrollado un grupo de drogas de bajo peso molecular, conocidas como pequeños
inhibidores de tirosinas quinasas (STKI) que se pueden clasificar en 4 categorías: (I) inhibidores
específicos del EGFR y de acción reversible: ZD1839, iressa o gefitinib (AstraZeneca, Inglaterra),
OSI774, tarceva ó erlotinib (OSI-Pharmaceutica-Genentech- Roche, EUA), PKI-166 (Novartis,
Suiza); (II) inhibidores específicos del EGFR y de acción irreversible: EKI -569 (Wyeth-Ayerst,
EUA); (III) drogas no específicas del EGFR, de acción reversible: GW-2016 (GlaxoSmithKline,
Inglaterra) ó (IV) inhibidores no específicos del EGFR de acción irreversible: CI -1033 (Pfizer, EUA)
(Mendelsohn J y cols., 2003).
AcM c225 (erbitux ó cetuximab)
El AcM c225 se une al EGFR con alta afinidad y bloquea la fosforilación del EGFR en líneas
celulares en cultivo (Goldstein N y cols., 1995; Prewett M y col s., 1996). Los estudios in vitro han
demostrado que el c225 induce la dimerización e internalización del EGFR (Fan Z y cois., 1994). El
anticuerpo también altera el ciclo celular, e induce detención en la fase Gl, tras provocar un
incremento de la proteína p27 (inhibidora de CDK) (Wu X y cois., 1996; Peng D y cols., 1996). El
c225 fue capaz de inhibir in vivo el crecimiento de líneas de cabeza y cuello, próstata, riñón, colon,
efecto que se acompañó de incremento en la sobrevida de los ratones (Ciardiello F y cols., 1996;
1999; Prewett M y cols., 1998). También se ha demostrado que el c225 regula negativamente la
angiogénesis, efecto que puede atribuirse a la reducción de la expresión de un grupo de factores pro -
angiogénicos tales como VEGF. IL 8, bFGF (Perrotte P y cols., 1999). Adicionalmente, se ha
encontrado potenciación del efecto cuando se usó el c225 con algunas drogas citotóxicas como
gemcitabine, irinotecan, cisplatino o taxol (Ciardiello F y cols.. 1999). Otros experimentos in vivo han
evidenciado un incremento de ia respuesta a la radioterapia, cuando se usa de conjunto con el
anticuerpo (Inoue K y cols., 2000).
34
Se han llevado a cabo varios ensayos clínicos con este anticuerpo. En 3 ensayos consecutivos, el c225
se ha usado en combinación con cisplatino en dosis simple o múltiple, y se han realizado ensayos de
escalado dosis entre 5 y 400 mg/m2, donde la dosis máxima tolerable no se alcanzó (Baselga J y cols.,
2000; Shin D y cols., 2001; Rubin M. S., y cols.
2000) .Los principales eventos adversos reportados han consistido en reacciones en piel (rash
acneiforme y foliculitis), fiebre, escalofríos, astenia, elevaciones transitorias de t ransaminasas y
náuseas. En estos ensayos, se demostró que el c225 evidencia una farmacocinética no lineal y que las
dosis entre 200 y 400 mg/m2 se asocian con saturación completa de la aclaración sistèmica del
monoclonal. Posteriormente se ejecutó un ensayo Fase Ib, donde 12 pacientes portadores de tumores
recurrentes de cabeza y cuello recibieron tratamiento con cisplatino en combinación con c225 (Shin D
y cols., 2001). En este estudio 6 de 9 pacientes alcanzaron respuestas mayores, incluyendo 2
remisiones completas (Shin D y cols., 2001). Otro estudio en neoplasias avanzadas de cabeza y cuello,
donde se usó el AcM en combinación con radioterapia demostró que 13 de los 15 pacientes tratados
alcanzaron respuesta completa. La duración media de la respuesta fue de 17 meses (Robert F y cols.
. También se ejecutó un ensayo Fase II en pacientes portadores de tumores colo - rectales refractarios
a las terapias oncoespecíficas. en los cuales se combinó el anticuerpo con irinotecan. En este estudio,
27 de 120 sujetos (22,5%) alcanzaron remisión parcial, con una duración promedio de 186 días (Saltz
L y cois., 2001). Con estos datos, en el año 2001, Imclone Inc. solicitó a la agencia regulatoria
norteamericana, FDA (Food and Drug Administration), la aprobación del AcM c 225 como tratamiento
a pacientes aquejados de tumores de colon no respondedores a la terapia con irinotecan, la cual fue
rechazada por problemas en el diseño en el ensayo y de selección de los pacientes.
En la reunión 39 de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) en el año 2003, se
presentaron los datos de nuevos ensayos clínicos con el AcM c225. En un estudio europeo realizado en
327 pacientes portadores de tumores de colon y recto resistentes a 1 ó 2 ciclos de quimioterapia, se
encontró que el 22,9 % de los pacientes que recibieron c225 más irinotecan lograron respuesta parcial,
mientras que el 10,8 % de los sujetos tratados solamente con c225 alcanzó esta respuesta. La mediana
35
de sobrevida para los enfermos que recibieron la terapia combinada f ue de 8,6 meses, mientras que los
tratados con monoterapia vivieron como promedio 6,9 meses (Cunningham D y cols., 2003). Tras estos
resultados, en octubre del 2003, la PDA aceptó revisar el expediente de solicitud de registro del AcM
c225 en combinación con irinotecan como terapia a pacientes portadores de neoplasias de colon
refractarias a las terapias oncoespecíficas.
En la referida reunión científica, se presentaron los datos de 4 ensayos realizados en sujetos
portadores de cáncer de pulmón de células no pequeñas, donde el AcM se utilizó en combinación
con la primera o la segunda línea de quimioterapia (Gatzemeier U y cois., 2003; Robert F y cols.,
2003; Kelly K y cols., 2003 y cols.y Kim ES y cois., 2003). En el ensayo aleatorizado donde se
compararon los esquemas de cisplatino-vinorelbina vs. C225- cisplatino-vinorelbina, se encontró
que tras la tri-terapia se obtuvo 53,3 % de respuesta global, mientras que con los citostáticos
convencionales el 32,2 % de los sujetos alcanzó alguna respue sta objetiva (Gatzemeier U y cols.,
2003). Tras el uso del anticuerpo en ensayos lineales en combinación con los regímenes de
gemcitabine-carboplatino o taxol- carboplatino se alcanzó respuesta antitumoral en el 28,6 y el 29 %
de los pacientes, respectivamente (Robert F y cois., 2003; Kelly K y cois., 2003). Finalmente tras la
combinación del c225 con el citostàtico docetaxel (taxotere) en pacientes no respondedores a la
primera línea de terapia, se logró 22,2 % de respuesta (Kim ES y cols., 2003).
ZD1938 (Iressa, Gefitinib)
Iressa es una anilino-quinazolina sintética, que constituye un inhibidor selectivo y reversible del
EGFR. Iressa fue capaz de inhibir la fosforilación de la línea de carcinoma vulvar A431, mostrando
actividad mínima contra otras proteínas con actividad tirosina-quinasa o serina- treonina quinasa
(Woodburn J y cols., 1996). Tras el uso de esta molécula, se ha encontrado un efecto citostàtico en un
amplio rango de líneas tumorales en cultivo, incluyendo líneas de próstata, mama, ovario, colon,
pulmón y cabeza y cuello (Ciardiello F. y cols., 2000; Sirotnak F y col s., 2000). También se demostró
que la droga inducía detención del ciclo celular en la fase Gl, a través de la regulación positiva de la
proteina p27 (Vicentini C y cols., 2003). En ratones atímicos xenotransplantados con líneas de
36
próstata, ovario, de mama, colon, vulva y pulmón se ha demostrado un potente efecto antitumoral
(Sewell JM y cois., 2002; Kurokawa H y cois., 2001; Williams KJ y cois., 2002; Solomon B y cols.,
2003; Bianco C y cols., 2002). Tras el uso combinado de Iressa con cisplatino, carboplatino,
oxaliplatino, taxol, taxotere, doxorubicina, etopósido y topotecan se ha encontrado una potenciación
del efecto antitumoral (Ciardiello F y cols., 2000; Sirotnak F y col s., 2000). Otros datos preliminares
sustentan que la adición de Iressa a la radioterapia tiene un efecto aditivo o sinèrgico en líneas de
pulmón (Ciardiello F y cols., 2001). Otros experimentos han evidenciado que Iressa es capaz de
bloquear la angiogénesis, mediante la supresión de la síntesis de VEGF, bFGF y TGF alfa en varias
líneas tumorales in vitro e in vivo (LoRusso PM y cols., 2003).
Se han llevado cabo múltiples ensayos clínicos con la droga Iressa, principalmente en la indic ación de
pulmón (Fukuoka M y cols., 2002; Kris M y cols., 2002; Cohen MH y cols.,
2003) . Como resultado del uso de la droga, se han constatado eventos adversos de l tipo de diarrea y
reacciones en piel, que han sido reversibles al descontinuar el tratamiento. En los ensayos conocidos
como IDEAL 1 e IDEAL 2, conducidos entre los años 2001 y 2002, se
evaluó la eficacia de Iressa como tercera línea de terapia en pacie ntes portadores de tumores de
pulmón de células no pequeñas (Kris M y cols., 2002; Cohén MH y col s., 2003). En el estudio IDEAL
1 conducido en Japón se incluyeron 208 pacientes (Kris M y cols., 2002) mientras que en el ensayo
IDEAL 2 ejecutado en Norteamérica se trataron 216 pacientes (Cohén MH y cols., 2003). En ambos
casos se realizó una comparación de 2 dosis: 250 ó 500 mg/día. En el primer ensayo, los porcientos de
respuesta objetiva para las dosis de 250 y 500 fueron de 18,4 y 19 %, respectivamente, mi entras que la
sobrevida tras el fracaso de las 2 líneas previas de tratamiento fue de 7,6 y 8,1 meses (Kris M y cols.,
2002). En el estudio IDEAL 2, 11,8 % de los sujetos que recibieron la dosis de 250 mg alcanzaron
algún tipo de respuesta, mientras que el 8,8 % de los casos alcanzó reducción de al menos 50 % de la
lesión inicial con la dosis de 500 mg (Cohén MH y cols., 2003). Para ambos estudios se reportó un
incremento de la calidad de vida de los pacientes. Los datos obtenidos en los ensayos descritos
condujeron al registro del medicamento Iressa en Japón en el año 2002 (Ohe Y y cols., 2002), así
como en Australia (Febrero 2003) y Estados Unidos (Marzo 2003) (Cohén MH y cols., 2003).
Entre los años 2001 y 2002, se realizaron 2 grandes ensayos (INTACT 1 e INTACT 2) para evaluar la
eficacia de la droga Iressa en combinación con 2 esquemas de quimioterapia empleados habitualmente
como primera línea en el tratamiento de neoplasias irresecables de pulmón: gemcitabine -cisplatino o
carboplatino-taxol. En 2 ensayos que reclutaron 1093 y 1037 pacientes cada uno, los pacientes fueron
incluidos al azar en 3 grupos de tratamiento (250 mg, 500 mg o placebo). Al finalizar los 2 ensayos no
se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los porcientos de re spuesta objetiva o en
la sobrevida global de los pacientes tratados con placebo o con la droga inhibidora de la actividad
tirosina-quinasa del EGFR (Johnson DH y cols., 2003).
OSI774 (Tarceva, Erlotinib)
Tarceva es un derivado de quinazolina que inhibe reversiblemente la actividad tirosina quinasa del
EGFR. La droga fue capaz de inhibir la proliferación de la línea tumoral de colon Difi, donde también
se evidenció la detención del ciclo celular en la fase G1 (Moyer J. y cols., 1997). Tarceva fue capaz de
inducir apoptosis in vitro e in vivo en varias líneas tumorales (Pollack V y cols., 1999; Lavelle F y
37
38
cols., 1997; Miller P y cols., 1998). Esta droga también se ha usado en varios ensayos clínicos, donde
se ha encontrado un perfil de toxicidad muy semejante al de Iressa, caracterizado por la aparición de
diarrea y eventos del tipo de rash cutáneo (Grunwald V y cols., 2003). En ensayos no aleatorizados
Fase II en tumores avanzados de cabeza y cuello, pulmón y ovario se han encontrado algunas
evidencias de estabilización de la enfermedad y mejoría en la calidad de vida (Herbst RS y cols.,
2003; Kim TE y cols., 2002). Se encuentran en curso 2 ensayos aleatorizados de más de 1000
pacientes cada uno, donde se evalúa la eficacia del Tarceva en combinación con 2 esquemas de
primera línea de quimioterapia (Bonomi P y cols., 2003).
Herceptin (Trastuzumab)
El Herceptin fue el primer AcM registrado por la FDA para el tratamiento de tumores sólidos en 1997.
Es un anticuerpo humanizado que reconoce selectivamente al dominio extracelular de la proteína Her
2. Pertenece a la subclase IgGl y contiene las regiones determinantes de la complementaridad del AcM
murino 4D5 insertados en un marco de inmunoglobulina humana (Tokuda Y y cols., 2003).
El proto-oncogen HER2 codifica para una proteína transmembranal de 185 kDa (Atalay G y cols.,
2003), que se sobre-expresa en el 25-30 % de los tumores primarios de mama. El Herceptin es capaz
de inhibir in vitro la proliferación de células tumorales que sobre- expresan el HER2 (Tokuda Y y
cois., 2003; Atalay G y cols., 2003).
La seguridad y eficacia de esta droga se ha estudiado en varios ensayos multicéntricos. En el año
1997, en un ensayo controlado en 469 pacientes se evaluó la eficacia del Herceptin más quimioterapia
en comparación con la quimioterapia sola en pacientes portadoras de tumores de mama metastáticos
que no habían recibido previamente quimioterapia para la enfe rmedad metástasica (Slamon y cols.,
2001). En otro ensayo de 222 pacientes el Herceptin se usó como agente único. E n ambos ensayos se
utilizó una dosis inicial de 4 mg/kg seguida por dosis semana les de 2 mg/kg (Moulder SI y cols.,
2003). En el primer ensayo, la combinación de Herceptin y quimioterapia evidenció un aumento
significativo en el tiempo a la progresión de las pacientes portadoras de tumores metastásicos de la
39
mama (7,2 meses vs. 4,5 meses), en la respuesta terapéutica global (45 % vs. 29 %) y en la duración
de la respuesta (8.3 meses vs. 5.8 meses). La combinación de Herceptin y paclitaxel resultó mejor que
la combinación con antraciclinas y ciclofosfamida (Slamon y cois., 2001). En el segundo ensayo, el
Herceptin se administró a pacientes que habían recaído después de 1 ó 2 ciclos de quimioterapia. En
este ensayo se obtuvo 16 % de respuesta objetiva (Moulder SI y cols.
2003).
Tras el tratamiento con Herceptin se constataron reacciones adversas en el sistema cardiovascular tales
como insuficiencia cardíaca, disnea paroxística nocturna y edema periférico, fundamentalmente tras la
combinación con adriamicina. También han aparecido reacciones alérgicas tales como anafilaxia,
urticaria, broncoespasmo y reacciones infusionales consistentes en fiebre, escalofríos, náuseas,
vómitos, cefalea, mareos, hipotensión, rash y astenia (Slamon y cois., 2001, Fischer OM y cois. ,
2003).
Ior egf/r3
En el Centro de Inmunología Molecular se generó un hibridoma productor de un AcM murino,
utilizando una fracción purificada de placenta humana como inmunógeno. Este anticuerpo que
reconoce al EGFR con alta afinidad, fue denominado ior egf/r3 (Fernández A y cois., 1989; 1992).
El AcM ior egf/r3 inhibió la proliferación de líneas tumorales con alta expresión de EGFR en cultivo y
en ratones xenotrasplantados, constatándose evidencias de actividad antitumoral (Suárez E y cois.,
1997).
El AcM ior egf/r3 fue utilizado en 6 ensayos clínicos. En 2 de estos ensayos, el AcM se empleó en el
diagnóstico inmunogammagráfico de tumores de origen epitelial (15), mientras que se realizaron 4
ensayos clínicos terapéuticos. En los ensayos con fines terapéut icos se incluyeron 58 pacientes con
enfermedad neoplásica en las siguientes localizaciones: pulmón, cerebro, mama y sistema digestivo
(Crombet T y cois., 2001 a, b).
En el ensayo clínico terapéutico Fase I se trataron 18 pacientes y se establecieron 6 niveles de dosis
40
desde 200 mg hasta 2.0 g, no presentándose ninguna reacción adversa severa ni muy severa según los
criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) . En el 83,3% de los pacientes se detectó
respuesta inmune contra la proteína murina (respuesta HAMA). En este ensayo se obtuvieron los
siguientes datos de farmacocinética: tiempo de vida medio (t y2) t/2=38,49 hrs, aclaramiento (CI) C1
=1,2 ml/hkg y volumen de distribución (Vd) Vd =0,05 L/Kg (Crombet T y cols., 2001a).
En otro ensayo Fase I en pacientes portadores de tumores astrocíticos avanzados se constató una
reacción alérgica muy severa asociada a la sensibilización previa del paciente al AcM y a la a parición
de respuesta FIAMA (Crombet T y cols., 2001b).
En los ensayos Fase II en que se administraron varios ciclos del AcM ior egf/r3 a pacientes con
tumores de pulmón o mama, se reportaron reacciones adversas severas y muy severas, relacionadas
con la aparición de respuesta HAMA. Las reacciones adversas severas consistieron en vómitos,
bronco-espasmo, fiebre y disnea al reposo. Las reacciones adversas muy severas consistieron en
anafilaxia (4 pacientes) y fiebre con hipotensión (1 paciente). En todos los casos las reacciones
aparecidas se controlaron tras la interrupción de la administración del anticuerpo y con tratamiento
médico.
AcM h-R3
Con el objetivo de incrementar la eficacia terapéutica y disminuir la toxicidad se procedió a la
humanización del anticuerpo murino ior egf/r3 (Mateo C y cols., 1997).
La humanización de anticuerpos permite combinar las regiones hipervariables de un anticuerpo murino
con el marco de soporte de una inmunoglobulina humana y de esta forma fusionar las regiones de
origen murino que reconocen con alta especificidad al antígeno con las cadenas pesadas de un
anticuerpo humano necesarias para su efectividad biológica (O'Brien S y cols., 2003).
El anticuerpo humanizado (h-R3) se obtuvo mediante clonaje a partir de la región variable del ADN
obtenido del hibridoma murino productor del AcM ior egf/r3. El AcM h -R3 contiene las regiones
hipervariables de origen murino y los marcos de las regiones variables y de las regiones constantes de
41
las cadenas pesada y ligera de origen humano (REI y Eu, respectivamente). Los vectores de expresión
que contenían las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se transfectaron en la línea de
mieloma NSO. El anticuerpo humanizado se une al EGFR con similar afinidad que su parental murino
(Kd=10 '9 M) (Mateo C y cols., 1997).
El reconocimiento del AcM se evaluó por técnicas de inmunohistoquímica en muestras de tumores
humanos. La tinción se clasificó como intensamente positiva en el 75 % de los tumores de pulmón
evaluados, en el 60 % de los tumores de mama estudiados y en el 100 % de las muestras procedentes
de lesiones neoplásicas de cabeza y cuello (Cedeño M y cois., 1999).
Para evaluar la inmunogenicidad del AcM humanizado en comparación con el parental murino, 2
monos verdes (cercopithecus aethiops) se inmunizaron con los AcMs ior egf/r3 y h-R3
respectivamente. El anticuerpo humanizado resultó 8 veces menos inmunogén ico que el murino
(Mateo C y cols., 1997).
Angiogénesis
La angiogénesis o formación de vasos de sanguíneos es un paso determi nante para el continuo
crecimiento, invasión y metastización de un tumor. El proceso de angiogénesis comienza con la
degradación de la membrana basal que rodea a los capilares y continúa con la invasión del estroma por
las células endoteliales, que migran en la dirección del estímulo angiogénico. Las células endoteliales
además proliferan y se organizan en estructuras tridimensionales que se unen a estructuras semejantes
hasta formar la red de nuevos vasos (Folkman J, 2003).
La angiogénesis se regula por el balance entre los factores pro-angiogénicos y anti- angiogénicos.
Entre los factores pro-angiogénicos más importantes se encuentran el factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF), la familia de angiopoyetinas, el factor de crecimiento de fibroblas tos
(ácido y básico), el factor transformante del crecimiento alfa (TGF alfa), el factor de crecimiento
epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), la interleucina 8 (IL 8). La
proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1) y el factor plaquetario 4 (PF-4) (Tonini T y cols., 2003).
42
La familia de factores anti-angiogénicos endógenos es estructuralemente diversa y en ella se
encuentran la trombospondina 1 (TSP-1), los interferones alfa, beta y gamma, la angiostatina, la
endostatina, el inhibidor del factor de crecimiento del endotelio vascular, la vasostatina y la
antitrombina III (Tonini T y cols., 2003).
Se ha postulado que además del efecto directo de los oncogenes o genes supresores tumorales en el
control de la proliferación celular, la diferenciación y la sobrevida, controlan indirectamente el
crecimiento tumoral a través de la regulación de la angiogénesis, pues pueden estimular la producción
de factores pro-angiogénicos o inhibir la síntesis de antagonistas de la angiogénesis ( Kerbel R y cols.,
1998). El VEGF en un factor determinante en la proliferación, permeabilización y sobrevida de las
células endoteliales. Es una glicoproteína que existe en al menos 4 isoformas debido al empalme
alternativo del ARN mensajero. Las isoformas mejor caracterizadas se designan como VEGF (121),
VEGF (165), VEGF (189) y VEGF (205), de acuerdo al número de aminoácidos que contiene cada
proteína. Por otra parte, los receptores de VEGF (VEGFR) se encuentran casi exclusivamente en las
células endoteliales. En ocasiones se ha detectado la expresión de receptores de VEGF en células de
origen neural de sarcoma de Kaposi y en células precursoras hematopoyéticas. Se han identificado 3
receptores de VEGF: (I) la tirosina quinasa semejante a fms (Flt -1), (II) la proteína quinasa fetal de
hígado/ receptor con dominio con actividad quinasa (Flk -l/KDR) y (III) VEGFR-3 (Flt-4). Los
receptores Flt-1 y Flk-l/KDR se consideran de alta afinidad y Flk-1 posee 85 % de similitud con su
homólogo humano KDR (Andre T y cols., 2000).
En la actualidad se ensayan diversos compuestos con actividad anti -angiogénica en la clínica que se
pueden clasificar en 3 grupos. El primer grupo está formado por inhibidores de metaloproteasas que
bloquean la degradación de la membrana basal. E l segundo grupo está integrado por agentes que
inhiben la función de las células endoteliales y entre estos se encuentran el TNP -40, la talidomida y la
endostatina. El tercer grupo lo constituyen aquellas drogas que actúan sobre los factores pro -
angiogénicos o anti-angiogénicos y sus receptores, incluyendo anticuerpos monoclonales y vacunas de
cáncer (Eliis LM; 2003).
43
Metodología de ensayos clínicos
Un ensayo clínico es cualquier investigación en seres humanos dirigida a descubrir o verificar los
efectos clínicos y farmacológicos de un producto en investigación, con el objeto de determinar su
seguridad y eficacia (Englev E y cols., 2003).
Los ensayos clínicos Fase I son estudios que implican la administración de una nueva droga a los seres
humanos. El objetivo principal es la estimación de la seguridad y tolerabiIidad. La
44
determinación de los parámetros farmacocinéticos, de parámetros farmacodinámicos (efectos
farmacológicos) y la detección de evidencias tempranas de actividad terapéutica. Se pueden llevar a
cabo en voluntarios sanos o en pacientes (Parulekar WR y cols., 2002).
Los ensayos clínicos Fase II son estudios en los que el objetivo primario es explorar el ef ecto
terapéutico del producto en investigación en los pacientes. Tienen diseños muy variados que
generalmente son aleatorizados y controlados. Un objetivo importante consiste en la determinación de
las dosis y régimen posológico para la Fase III y evaluar la eficacia y seguridad para una indicación
terapéutica específica. Se incorporan en esta fase los estudios para evaluar el uso de medicación
concomitante y efecto en poblaciones especiales. Se llevan a cabo en pacientes con criterios de
selección bien definidos y bajo un estricto monitoreo clínico (Parulekar WR y cols., 2002).
Los ensayos Fase 111 se realizan después de establecerse una probabilidad razonable de eficacia del
medicamento y tienen como objetivo obtener información adicional de su eficacia para aplicaciones
específicas y una definición más precisa de los efectos adversos asociados al medicamento. Esta fase
incluye estudios controlados y no controlados (Farrington P y cols., 2003).
Los ensayos de la Fase IV se realizan después de que el organismo nacional de reg istro de
medicamentos haya aprobado un medicamento para su distribución o comercialización. Estos
ensayos pueden incluir la investigación destinada a explorar un efecto farmacológico específico, a
establecer la frecuencia de reacciones adversas o a determinar los efectos de la administración a
largo plazo de un medicamento. Los ensayos de la Fase IV pueden también estar diseñados para
evaluar un medicamento en una población que no se ha estudiado adecuadamente en las fases de
pre-comercialización (como los niños o los ancianos) o para establecer una nueva indicación
clínica para un medicamento. Este tipo de investigación debe distinguirse de la que se realiza con
fines de comercialización, de los estudios para la promoción de las ventas y de la vigilancia
epidemiológica rutinaria para detectar reacciones adversas a los medicamentos; la diferencia es
que estas últimas categorías por regla general no necesitan ser evaluadas por comités de ética
(Montastruc JL y cols., 1999).
Materiales y métodos
Estudios preclínicos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
La línea tumorai de carcinoma vulvar A431 se obtuvo de la Colección Americana de Cultivo
Celular (ATCC. Rockville, EUA). Las células se cultivaron en monocapa o en esferoi des en medio
modificado de Dulbecco (DMEM, Life technoiogies, EUA), suplementado con 10 % de suero fetal
bovino (SFB; Gibco-BRL, Grand Island, EUA), a 37 °C en atmósfera húmeda y 5% de CO2. El
cultivo en esferoides (multicelular) se preparó utilizando la t ecnología de recubrimiento líquido
(Padrón JM y col., 2000). Las placas de cultivo de 96 pocilios (Nalge Nunc Inc., Naperville, EUA)
se recubrieron con agarosa al 1% (BMA, Rockland, EUA) y se colocaron en un agitador orbital, a
una velocidad de 250 rpm durante 5 minutos.
Las células HUVECs (células de vena humana umbilical) se obtuvieron de la Colección Americana
de Cultivo Celular (ATCC, Rockville. EUA) y se cultivaron en medio modificado de Dulbecco
(DMEM, Life technoiogies, EUA), suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB; Gibco-
BRL, Grand Island, EUA), a 37 °C en atmósfera húmeda y 5% de CO2, en placas cubiertas de
gelatina (Tran J y cois., 1999).
Ensayo de inhibición de la proliferación
La proliferación celular se midió a través de un ensayo de incorporación de timidina tritiada. Se
cultivaron 104 células en placas de 96 pocilios en esferoides o en monocapa, durante 24 hrs. y
luego se expusieron a diferentes concentraciones del AcM h-R3, durante 48 hrs. en medio
modificado de Dulbecco (DMEM. Life technoiogies, EUA), suplementado con 1 % de suero fetal
bovino (SFB; Gibco-BRL. Grand Island, EUA). Las células se incubaron en presencia de la
timidina tritiada (Amersham, Inglaterra) durante 6 hrs. y la radiactividad incorporada en el ADN se
45
contó en un contador de centelleo (3 (Pharmacia, Turku, Finlandia).
El mismo ensayo se utilizó para comparar la proliferación de las células parentales A431 y las variantes
resistentes a los anticuerpos ior egf/r3 y h-R3 (ver más adelante) en condiciones de cultivo en monocapa. Las
placas se incubaron con el AcM anti-EGFR c225 a la concentración de 50 pg/ml o TGF alfa (100 ng/ml) en
medio DMEM/SFB al 1 %.
Se evaluó la proliferación de las células HUVECs, a través del ensayo descrito de incorporación de timidina, en
presencia de los medios condionados de cultivo procedentes de las variantes resistentes (ver más adelante) y de
la línea no modificada A431.
Medición del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)
Se utilizó un sistema inmunoenzimático comercial (R&D System, Minneapolis, EUA) para cuantificar los
niveles de VEGF humano en el medio condicionado de las células tumorales cultivadas en presencia del AcM
h-R3. Las células de la línea A431 se sembraron a una densidad de 105 células por pocilio en el medio de
cultivo DMEM/SFB al 10 %. Tras 48 hrs. de incubación, el medio se reemplazó por medio DMEM/SFB al 1
%, que contenía diferentes concentraciones del AcM h-R3. El medio condicionado se colectó tras 24 hrs. de
incubación y se conservó a - 70 °C, hasta la cuantificación de VEGF. El número de células se determinó
utilizando un contador de células (Coulter Electronics, Luton, Inglaterra) y este dato se empleó para la
normalización. La concentración de VEGF se expresó en pg/ml por cada 10^ células.
Se utilizó el mismo kit comercial para evaluar la producción de VEGF humano, en el medio de cultivo
procedente de la línea celular de carcinoma vulvar A431, en las variantes resistentes R1 y R5 (ver más
adelante) y en las líneas transfectadas establemente con VEGF murino (ver más adelante), cultivados en
presencia o ausencia del AcM c225, a la concentración de 50 |¿g/ml, durante 48 hrs. Se utilizó otro sistema
ELISA comercial (R&D
46
47
System, Minneapolis, EUA) para cuantificar los niveles de VEGF murino producidos por los clones
transfectados con VEGF murino (ver más adelante), cultivados con o sin el AcM c225, en las condiciones
antes descritas.
Análisis de VEGF a nivel de ARJN.
El análisis se realizó utilizando células en cultivo o células tumorales conservadas en nitrógeno líquido
obtenidas tras exéresis a los ratones xenotransplantados y tratados con el AcM h-R3. Se extrajo el ARN total
utilizando el reactivo Trizol (Gibco BRL, Grand Island, EUA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Las muestras se disolvieron en gel de formaldehído-agarosa al 1 % y se verificó que se había añadido la misma
cantidad de muestra realizando una tinción con bromuro de etidio. Luego, el ARN se transfirió a una
membrana Hybond N + (Amershan Pharmacia Biotech, Pisscataway, EUA) y la hibridación se realizó
utilizando una sonda de ADN marcada con Fósforo 32 (j2P), que reconocía todas las isoformas del VEGF. Las
membranas se auto-radiografiaron y se evaluó la intensidad de las bandas de 3,7 a 4,5 kb.
En un experimento independiente, se realizó la cuantificación de VEGF y TSP-1, en las variantes resistentes
R1 y R5 (ver más adelante), utilizando la metodología antes descrita.
Análisis de ciclo celular
Se realizó el cultivo en monocapa de la línea A431, en presencia del AcM h-R3 a la concentración de 100 M-
g/ml. Luego de 48 hrs. de incubación, las células se tripsinizaron, se lavaron, se fijaron en para-formaldehído I
% y se permeabilizaron con etanol frío al 70 %. Posteriormente, se procedió al lavado, resuspensión e
incubación de las células durante 1 hora en una solución que contenía 50 (J.g/ml de yoduro de propidio y 400
|ig/ml de ARNasa A. El análisis del perfil del ADN y el análisis de ciclo celular se realizó empleando la
citometría de flujo (Becton Dickinson. San Jose, EUA). Los datos se analizaron empleando el software
CellQuest (Becton Dickinson, EUA).
Determinación de apoptosis in vitro
Se utilizó un sistema ELISA comercial de detección de muerte celular (Celi death detection ELISA plu\ Roche
48
Diagnostics GMBH, Alemania) para evaluar el efecto pro-apoptótico del AcM h-R3 en la línea A431. El
sistema permite la detección de mono y oligonucleosomas en la fracción citoplasmàtica de los lisados
celulares. Las células se trataron con concentraciones crecientes del AcM h-R3, a diferentes intervalos de
tiempo (6, 24 y 48 hrs) y posteriormente se obtuvieron los lisados celulares, de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. El enriquecimiento específico en mono-oligonucleosomas se calculó utilizando la siguiente
fórmula:
Factor de enriquecimiento = Absorbancia de las muestras tratadas/ Absorbancia del control.
Experimentos en ratones SCID
Doce ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, EUA) portadores de una inmunodepresión
severa combinada (SCID). se inyectaron subcutáneamente con la línea celular A43I (5 x 10° células/ratón).
Los tumores se midieron cada 48 hrs. y los volúmenes se calcularon empleando la siguiente fórmula: Z2
diámetro mayor x (diámetro menor)2. Cuando los tumores alcanzaron un volumen equivalente a 200-300 mm3,
los animales se separaron aleatoriamente en los siguientes grupos: (I) grupo control, tratado con una solución
tampón fosfato (STF), (II) grupo de tratamiento con el AcM h-R3 o (III) grupo de tratamiento con el AcM ior
egf/r3. Cada grupo recibió 4 inyecciones intraperitoneales (IP) de STF o de los AcMs h-R3 o ior egf/r3 (1
mg/dosis), cada 48 hrs. Los tumores se resecaron transcurridos 8 días del experimento para estudios de
inmunohistoquímica (ver más adelante) o para la realización de los estudios de cuantificación de VEGF.
En un experimento independiente, 25 ratones SCID de fondo genético Balb/c (Charles River Laboratories,
Wilmington, EUA), distribuidos en 5 grupos de tratamiento se inocularon por la vía subcutánea con 7,7 x 106
células A431 en 0,2 mi de STF. El tratamiento de los ratones comenzó cuando los tumores alcanzaron un
volumen entre 200-300 mm3 y consistió en 8 inyecciones IP de 1 mg (grupo de alta dosis) o de 0,25 mg (grupo
de baja dosis) de los AcMs h-R3 o ior egf/r3 cada 48 hrs.
En un tercer experimento, 15 ratones SCID de fondo genético Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington,
EUA) se inocularon con 10(1 células procedentes de la línea parental A431 y de las variantes resistentes Rl y
49
R5 (ver más adelante). Se evaluó el prendimiento y el crecimiento tumoral cada 4 días. Cuando los tumores
alcanzaron un volumen equivalente a 200-300 mm3, se comenzó el tratamiento con el AcM c225. Todos los
ratones recibieron 8 administraciones IP del AcM c225 a la dosis de 0,25 mg, cada 48 hrs.
En un cuarto experimento, 25 ratones Balb/c severamente inmunocomprometidos (Charles River Laboratories,
Wilmington, EUA) se inocularon con 106 células procedentes de la línea parental A431 y de los 3 clones
transfectados con VEGF (ver más adelante). Se realizó el tratamiento con el AcM c225 (8 administraciones IP
cada 48 hrs. a la dosis de 0,25 mg) cuando los tumores alcanzaron un volumen entre 200-300 mm3.
Todos los experimentos en animales se aprobaron por el Comité de ética para los animales de laboratorio del
Instituto Sunnybrook de Ciencias de la Salud, en Toronto, Canadá, donde se llevaron a cabo.
Inmunohistoquímica
Los tumores resecados en el experimento de curso corto con los AcM ior egf/r3 y h-R3, se fijaron en formalina
o en la solución de Carnoy. Las muestras se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 4 |am de
grosor. Las tinciones se revelaron utilizando el kit Vecstatin ABC (Vector Laboratories, Burlingame. EUA), o
el kit HistoStain-SP (Zimed)
Laboratories, San Francisco, EUA). La actividad anti-proliferativa se evaluó a través de la tinción del antígeno
nuclear Ki67, con el anticuerpo policlonal NCLki67p (Novocastra Laboratories, New Castle, Inglaterra),
dilución 1:1000 en una solución tampón Tris 0.05 M (Research Organics, San Francisco, EUA). La actividad
apoptótica se evaluó a través del método TUNEL empleando el kit comercial de detección de muerte celular in
situ 1684795 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las
muestras en las cuales la enzima transferasa desoxinucleotidil terminal no se añadió, sirvieron como control
negativo. Los cortes se evaluaron en un microscopio óptico a una magnificación correspondiente a 40x. El
índice apoptótico se definió como el porcentaje de células positivas en 100 núcleos, contados en 10 campos
seleccionados al azar. La tinción de vasos sanguíneos se llevó a cabo en las secciones fijadas en la solución de
Carnoy, utilizando un anticuerpo policlonal de conejo contra el Factor VIII (Factor de von Willebrand) A0082
50
(DAKO. Carpintería, EUA), dilución 1:500 en una solución tampón Tris 0,05 M (Research Organics, San
Francisco, EUA). Las células endoteliales se cuantificaron en 10 campos seleccionados al azar en todas las
muestras, empleando una magnificación de 40x. Adicionalmente se preparó una lámina control para cada
muestra que se tiñó con hematoxilina y eosina para examinar la morfología tisular.
Obtención de las variantes celulares de la línea A431 resistentes a los AcMs ior egf/r3 y h-R3.
En el experimento de curso largo en ratones transplantados con la línea A431 y tratados con 2 dosis de los
AcMs ior egf/r3 ó h-R3, los animales continuaron bajo observación para detectar la aparición de recurrencias
tumorales. Cuando los tumores alcanzaron un volumen similar al que tenían al momento del inicio del
tratamiento (200-300 mm3), se comenzó una segunda ronda de tratamiento utilizando el mismo AcM. dosis y
esquema. Aquellos tumores que no respondieron durante la primera semana de tratamiento con la dosis de 0,25
mg se trataron con la dosis de 1 mg, siguiendo el mismo esquema, durante las 2 semanas siguientes. Los
ratones que recibieron la dosis de 1 mg inicialmente, se trataron con el mismo esquema terapéutico. Los
tumores que no respondieron durante la segunda etapa del tratamiento se consideraron variantes resistentes.
Estos ratones se sacrificaron y las células tumorales se recuperaron in vitro, por tratamiento enzimàtico (Bani
MR y cois., 1996) bajo condiciones asépticas, se crecieron en medio de cultivo y se establecieron 6 variantes
resistentes: R1-R6. Las células de las variantes resistentes se pasaron al menos 3 veces en cultivo, antes de
cualquier medición. En todos los casos, las líneas parentales y las variantes resistentes se cultivaron en medio
DMEM (Life Technologies, Grand Island. EUA) suplementado con SFB al 5 % (Gibco-BRL, Grand Island,
EUA).
Análisis del ADN
Se extrajo el ADN de la célula parental A431 y de las variantes resistentes (R1-R6), utilizando una solución
tampón de lisis seguida de precipitación (Laird PW y cois., 1999). El ADN (10 ng) se digirió con Hinfl (New
England Biolabs Inc. Mississauga, Canadá) y se disolvió en gel de agarosa al 0,6 %. El patrón de bandas se
evaluó tras hibridación con una sonda multilocus 33,15 marcada con NICE (Cellmark Diagnostic, Inglaterra),
51
que se usó en combinación con un sustrato quimioluminiscente (Tropic Inc. Bedford, EUA), de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
Western Blot
Para detectar la expresión de EGFR y de HER2 en las variantes resistentes en comparación con la línea A431
no modificada, se obtuvieron lisados de las líneas celulares, según lo descrito previamente (Tran J y cois.,
1999). Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida y las proteínas se transfirieron a una membrana
Immobilon-P (Millipore, Bedford, EUA). Luego del bloqueo con caseína al 1 % (Gibco BRL. Grand Island,
EUA) en una solución tampón Tris-Tween 20 (TBST) (Research Organics, San Francisco, EUA), la membrana
se incubó con un AcM anti-EGFR SC-003 o con el AcM anti-HER2 SC-284 (Santa Cruz Biotechnologies, San
Francisco, EUA) a una concentración de 0,2 ng/ml. Posteriormente, la membrana se lavó y se incubó con un
anticuerpo de carnero anti-conejo conjugado a peroxidasa (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West
Grove, EUA), dilución 1:1000 en una solución tampón Tris 0,05 M (Research Organics, San Francisco, EUA).
La fosforilación del EGFR se determinó en los lisados de las células estimuladas con TGF alfa, usando el
anticuerpo murino anti-pEGFR no.324864 (Calbiochem, San Diego, EUA) a una concentración 0,1 (ig/ml. Se
utilizó un anticuerpo anti-ratón W402B conjugado a peroxidasa (Promega, Madison, EUA) a la concentración
0,2 ng/ml, como anticuerpo secundario para detectar el anticuerpo murino primario. Las manchas se
visualizaron usando el kit ECL de luminiscencia (Amersham Corp. Arlington Heights, EUA).
Obtención de transfectantes estables que sobre-expresan VEGF
Se utilizó un plásmido que codificaba mVEGF164 (981 pb), regulado por un promotor de citomegalovirus
(CMV), para transfectar a células A431 usando el reactivo SuperFect (Qiagen Inc, Valencia, EUA) de acuerdo
a las instrucciones del fabricante. Los clones controles resultaron producto de la transfección de un vector
vacío. Los clones positivos se seleccionaron con concentraciones crecientes (500-800 |ig/ml) de Geneticin
(Life Technologies Inc, Grand Island, EUA) y se mantuvieron en presencia de 800 ng/ml de la droga. Tres de
los clones (mVEGF.Sl, mVEGF.S2 y ni VEGF.S3) se seleccionaron para la evaluación de resistencia al
52
anticuerpo in vivo.
Estadística
El análisis estadístico se llevó a cabo empleando el software GraphPAD InStat, versión 1.14 (GraphPAD Inc.,
San Diego, EUA). Los experimentos in vivo se analizaron empleando el test de ANOVA acoplado al test de
Bonferroni para comparaciones múltiples.
Estudios Clínicos Ensayo
Clínico Fase I
El ensayo clínico fase I se realizó en 12 pacientes reclutados en los servicios de Oncología del Centro de
Investigaciones Médico Quirúrgicas (CIMEQ) y del Hospital Hermanos Ameijeiras. Todos los sujetos del
ensayo habían concluido el tratamiento oncoespecífico al menos 4 semanas antes de la inclusión.
El anticuerpo monoclonal h-R3 se administró a todos los pacientes en el Centro de Investigaciones Clínicas.
Selección de sujetos
Se seleccionaron pacientes con diagnóstico citológico o histológico de cáncer de origen epitelial, en estadios III
o IV, que cumplieran los siguientes criterios de selección:
Criterios de inclusión
• Pacientes que habían concluido el tratamiento oncoespecífico al menos 4 semanas antes de la inclusión en
el ensayo y que no eran susceptibles de recibir otra terapia con intención curativa.
• Edad desde 18 hasta 75 años, de ambos sexos.
• Pacientes con estado general menor o igual que 2 según OMS.
• Lesiones medibles en los diámetros perpendiculares mayores, por Tomografía Axial Computarizada
(TAC), Rayos X o Ultrasonido.
• Parámetros de laboratorio clínico: Hemoglobina (Hb) >10 g/L; leucocitos totales > 4 x 10^/L; plaquetas
>100 x 10^/L., funcionamiento hepático dentro de límites normales y/o sin antecedentes de alguna afección
hepática demostrada por la evaluación de la
transaminasa glutámico-pirúvica (TGP), la transaminasa glutámico-oxalacética (TGO) ó la fosfatasa
alcalina, función renal, creatinina sérica < 132 mmol/L.
Criterios de exclusión
• No cumplimiento de algún criterio de inclusión.
• Embarazo o lactancia.
• Presentar una enfermedad crónica asociada en fase de descompensación, por ejemplo: cardiopatía,
diabetes, hipertensión arterial.
• Estados febriles.
• Procesos sépticos severos.
• Compromiso mediastinal.
• Estados alérgicos agudos o de gravedad
• Tratamiento previo con otros AcM anti-EGFR (murino o humanizado).
Criterios de salida del ensayo
• A solicitud del paciente.
• Reacciones adversas muy severas (según la Tabla de la Organización Mundial de la Salud, OMS)
(Edwards IR y cois., 2000)
• Progresión de la enfermedad antes de concluir la evaluación prevista.
• Pérdida de seguimiento del paciente y desconocimiento de la evolución.
La ejecución de este ensayo clínico fue aprobada y seguida por el Comité de ética para la investigación
clínica del CIMEQ, del Hospital Hermanos Ameijeiras y del Centro de Investigaciones Clínicas. Todos los
pacientes firmaron el acta de consentimiento informado antes de la inclusión en el protocolo.
53
Composición completa del producto incluyendo sustancias auxiliares, expresadas por unidad
posológica
Nombre del componente
AcM h-R3 Fosfato de sodio
dibásico (Na2HP04)
Fosfato de sodio monobá sicc
(NaH2P04).
Cloruro de Sodio Polisorbato 80
Agua para inyección
Cantidad 10 mL
50 mg 4,5
mg
18.0 mg
86,9 mg 2.0 mg
Cantidad suficiente para
completar 50 ml
Referencia de Calidad
Especificaciones del fabrica
USP XXIII
USP XXIII
USP XXIII USP XXIII
USP XXIII
Esquema de tratamiento
El AcM h-R3 se administró por vía endovenosa (vena antecubital), en 250 mi de solución salina en
infusión rápida (30 minutos).
Se realizó un escalado algebraico de dosis, empleando un esquema de Fibonacci modificado (Eisenhauer
EA y cols., 2000) hasta completar 4 grupos de tratamiento.
Se administraron las siguientes dosis del AcM h-R3:
Primer Nivel: 50 mg
Segundo Nivel: lOOmg
Tercer Nivel: 200 mg
Cuarto Nivel: 400 mg
Para facilitar los estudios de biodistribución, en cada inyección se administraron 3 mg del AcM h-R3,
conjugado a 40-50 mCi (14.8-1.85 GBq) de Tecnecio 99 metaestable ("mTc), procedente de la elución de
un generador de molibdeno-tecnecio (99Mo/"mTc) (Amertec II, Amersham, Inglaterra). El AcM h-R3 se
conjugó directamente al "mTc, según el método de Schwartz y Steinstraber (Schwarz A y cols., 1987). Esta
fracción del AcM marcado (fracción caliente) constituyó parte de la dosis total a administrar para todos los
niveles de dosis estudiados. La administración del producto se llevó a cabo en el Centro de Investigaciones
54
55
Clínicas y posteriormente los pacientes permanecieron ingresados en el hospital de procedencia. Se
incluyeron 3 pacientes por cada nivel de dosis.
Evaluación de la toxicidad
Se realizó un exámen físico exhaustivo a cada paciente antes de la administración del producto y luego cada 6
hrs. durante las primeras 24 hrs. post-tratamiento. A continuación, se practicó el exámen diariamente durante
el periodo de hospitalización de los pacientes, que fue de al menos 72 hrs. después de la administración del
AcM.
Adicionalmente se realizaron exámenes complementarios de hematología y bioquímica sanguínea en los
siguientes tiempos: pre-inclusión en el protocolo, una semana después y luego cada mes durante el tiempo de
seguimiento de los pacientes.
Se realizaron los siguientes exámenes complementarios: hemoglobina, conteo de leucocitos, plaquetas,
proteínas totales, glucosa, albúmina, TGP, TGO, fosfatasa alcalina, bilirrubina, creatinina y urea.
Estudio de farmacocinética
Se colectaron muestras de sangre del brazo contralateral al de la inyección. Las extracciones se realizaron a
los 5, 10, 20, 30 minutos y 1, 3, 5, 8, 18, 24, 36, 48, 72, 168 y 720 hrs. posttratamiento. Las muestras se
dispensaron en viales secos para obtener suero.
Se realizó la determinación de la concentración sérica del h-R3 utilizando un sistema ¡nmunoenzimático, que
contenía a la línea celular A431 pegada a la fase sólida. Las células de la línea A431 (104 células/pocilio) se
cultivaron en medio modificado de Dulbecco (DMEM, Life technologies, EUA), suplementado con 10 % de
suero fetal bovino (SFB; Gibco-BRL, Grand Island, EUA), a 37 °C en atmósfera húmeda y 5% de C02 y se
sembraron en placas de cultivo de 96 pocilios. Las células se mantuvieron en cultivo a 37 °C hasta alcanzar la
confluencia, momento en el cual se añadió formaldehído al 1 % (50 pl/pocillo)
56
para fijar las células a la fase sólida. A continuación se añadió el AcM h-R3 en diluciones seriadas 1:2 para
obtener una curva de concentración, entre 500 y 7.8 ng/ml. En este paso, se añadieron también las muestras
de suero. Cada muestra se evaluó por triplicado. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C, y tras el
lavado se añadió el conjugado anti-IgG humano acoplado a fosfatasa alcalina (Sigma Chemical, EUA) a
37°C durante 1 hora. Las placas se revelaron tras la adición de paranitrofenilfosfato (1 tng/ml) disuelto en
una solución tampón de dietanolamina. La absorbancia se leyó a 405 nm en un lector automático de placas
de ELISA (Organon Teknika, Holanda).
Estudio de biodistribución
Este estudio se realizó en el Centro de Investigaciones Clínicas. Para estimar la biodistribución del h-R3,
los datos gammagráficos se colectaron en una cámara gamma (SOPHYCAMMERA DS7, Francia). Se
adquirieron imágenes a los 5 min, 1, 3, 5 y 24 hrs. post-inyección del AcM h-R3 (mezcla de anticuerpo
marcado y frío), empleando un colimador de agujeros paralelos-divergente para ampliar el campo de visión
del detector. El tiempo promedio de duración de cada estudio fue de 20 min, en dependencia de la estatura
del paciente, con una velocidad de traslación del soporte del detector de 20 cm/seg. Se empleó una ventana
energética centrada en 140 kev con un ancho de 20 %. Cada adquisición se realizó en 2 matrices de
formato 2048 x 512 correspondientes a las vistas anterior y posterior de cuerpo entero y se realizaron
empleando la técnica de definición de contornos de este sistema.
Se determinaron los órganos fuentes de ese radiofármaco y los porcientos de acumulo del "mTc h-R3 en los
mismos, a través del análisis visual de las imágenes y empleando una estación de procesamiento de
SOPHY 20P y el software Biodose versión 1, desarrollado en el Centro de Investigaciones Clínicas.
Evaluación de la inmunogenicidad
Se colectaron muestras de sangre de todos los pacientes antes de la administración del AcM a los 7 días y
luego mensualmente hasta 6 meses post-tratamiento, para detectar anticuerpos contra la fracción murina del
AcM h-R3. La respuesta inmune se midió a través de un sistema ELISA cualitativo, donde las placas
(Maxisorb Costar, Cambridge, EUA) se recubrieron con el AcM murino ior egf/r3 (10 |ag/ml), a 4°C durante
la noche. Las placas se lavaron y se añadieron las muestras de cada paciente (dilución 1:100) por duplicado.
Luego se incubaron durante 1 hora, a 37°C y se añadió el conjugado anti-IgG humano acoplado a fosfatasa
alcalina (Sigma Chemical, EUA). Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron y se añadió el
57
sustrato paranitrofeni 1 fosfato (1 mg/ml) disuelto en una solución tampón de dietanolamina. Se leyó la
absorbancia a 405 nm en un lector automático de placas de ELISA (Organon Teknika, Holanda). Se obtuvo el
promedio de densidad óptica por cada muestra paciente. Se calculó la relación (razón) entre la muestra de
cada tiempo y el valor de densidad óptica pre-tratamiento. Se consideró la respuesta positiva, cuando el valor
de esta razón fue mayor que 2.
Ensayo Clínico Fase I/II
El ensayo clínico Fase I/II fue abierto, no controlado y monocéntrico. En el estudio se incluyeron 14 pacientes atendidos en el
servicio de cabeza y cuello del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología (INOR).
Se definieron 4 grupos de tratamiento de 3 pacientes cada uno, con dosis de 50, 100, 200 y 400 mg del AcM h-R3. Cada paciente
recibió 6 veces la dosis correspondiente del AcM h- R3. La inclusión de los pacientes fue lineal, de acuerdo al nivel de dosis.
Al terminar el reclutamiento, el protocolo se modificó para incluir 10 nuevos pacientes en los
2 últimos niveles de tratamiento (200 y 400 mg), con el fin de evaluar mejor la respuesta antitumoral y definir la dosis para el
ensayo fase II controlado.
Adicionalmente, los sujetos del ensayo recibieron la radioterapia convencional, de acuerdo al tipo y localización del tumor. La
cobaltoterapia se realizó en 30 sesiones, por 5 días durante 6 ó 7 semanas.
Se incluyeron pacientes con diagnóstico de carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, confirmado por técnicas
histopatológicas, que fueran tributarios de tratamiento radiante al diagnóstico.
Criterios de selección de sujetos
Criterios de inclusión
• Pacientes con tumores epiteliales de cavidad bucal y mesofaringe, no susceptibles de tratamiento quirúrgico, que al
momento de la inclusión fueran tributarios de tratamiento con radiaciones.
• Confirmación de la expresión de EGFR por ¡nmunohistoquímica en más del 80 % de las células tumorales.
• Edad de 18 hasta 80 años, de ambos sexos.
• Pacientes con un estado general menor o igual que 2 según OMS.
• Expectativa de vida de 6 meses.
• Parámetros de laboratorio clínico. Hb>10 g/L, leucocitos totales > 4 x 10^/L,
9
Plaquetas>de 10 células/L
58
• Funcionamiento hepático dentro de límites normales y/o sin antecedentes de alguna afección hepática demostrada por
TGP. TGO o Fosfatasa alcalina.
• Función renal: creatinina sérica < 132 mmol/L.
Criterios de exclusión
No cumplimiento de algún criterio de inclusión.
Embarazo o lactancia.
Presentar una enfermedad crónica asociada en fase de descompensación, por ejemplo: cardiopatía, diabetes, hipertensión
arterial.
Estados febriles.
Procesos sépticos severos.
Estados alérgicos agudos o de gravedad.
Tratamiento previos con otros AcMs anti-EGFR (murino o humanizado)
Criterios de salida del ensayo
A solicitud del paciente.
Reacciones adversas muy severas (según la Tabla de la Organización Mundial de la Salud, OMS) (Edwards IR y cols.,
2000)
Pérdida de seguimiento del paciente (durante las 6 semanas que debe recibir la radioterapia) y desconocimiento de la
evolución.
Estados alérgicos agudos o de gravedad.
59
El protocolo fue aprobado por el Comité de ética para la investigación clínica del Instituto Nacional de Oncología y
Radiobiología y todos los pacientes firmaron el consentimiento informado de participación en el ensayo, antes de la realización
de cualquier proceder relacionado con el estudio. La modificación del ensayo también se aprobó por el Comité de ética del
INOR y por el CECMED.
Esquema de tratamiento
El h-R3 se administró por vía endovenosa (vena antecubital), en 250 mi de solución salina en infusión rápida (30 min) y se
realizó una administración semanal durante las 6 semanas de la terapia radiante. Se realizó un escalado algebraico de dosis,
empleando un esquema de Fibonacci modificado (Eisenhauer EA y cols., 2000), hasta completar 4 grupos de tratamiento.
Evaluación de la toxicidad
Para la evaluación de toxicidad se recogieron todas las evidencias de reacciones adversas ocurridas en el ensayo, a través del
exámen físico de los pacientes y de los exámenes de laboratorio que se realizaron previo al tratamiento y cada 15 días hasta
concluir las 6 semanas del tratamiento. A continuación los exámenes de laboratorio se realizaron mensualmente, hasta concluir
1 año post tratamiento.
Laboratorio Clínico. Se realizaron los siguientes exámenes de laboratorio clínico, para evaluar la aparición de toxicidad:
hemoglobina, conteo total y diferencial de leucocitos, plaquetas, proteínas totales, glicemia, TGP, TGO, fosfatasa alcalina,
bilirrubina, cratinina, urea, proteinuria, hematuria, hematocrito, parcial de orina.
La clasificación de la intensidad de los eventos adversos se realizó de acuerdo a la escala de de Criterios Comunes de Toxicidad
del Instituto Nacional de Cáncer de Estados Unidos (NCI-CTC), versión 3 (Trotti A y cois., 2003).
Evaluación de la respuesta antitumoral
Se clasificó la respuesta clínica según los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) (Duffaud F y cois.,
2000).
De acuerdo a estos criterios, solamente se consideraron los cambios en los diámetros mayores de los tumores (medición
unidimensional) para la evaluación de la actividad antitumoral.
Inmunohistoquímica
Se obtuvieron biopsias de las lesiones primarias antes del tratamiento de todos los pacientes incluidos en el ensayo, con el
objetivo de evaluar la expresión EGFR como criterio de inclusión. Adicionalmente se tomó una segunda biopsia en 9 de los 12
60
sujetos agrupados en la primera serie de pacientes en la semana 3 para evaluar la actividad proliferativa y la angiogénesis en
comparación con las muestras pre-tratamiento. En los 3 pacientes restantes no había tumor accesible en el sitio primario luego
de 3 semanas de tratamiento. Las muestras se congelaron y tiñeron con hematoxilina y eosina para confirmar la presencia de
tejido tumoral.
Se realizó la tinción inmunohistoquímica utilizando el kit Vecstatin ABC (Vector Laboratories, Burlingame, EUA). La expresión
de EGFR se determinó utilizando el AcM ior egf/r3 murino, como anticuerpo primario, dilución 1:200 en una solución tampón
Tris 0.05 M (Research Organics, San Francisco, EUA). La actividad anti-proliferativa se evaluó a través de la tinción del
antígeno nuclear Ki67, con el anticuerpo policlonal NCLki67p (Novocastra Laboratories, New Castle, Inglaterra), dilución
1:1000 en una solución tampón Tris 0.05 M (Research Organics, San Francisco, EUA). Los porcientos de las células positivas
Ki-67 se calcularon mediante el conteo del número de los núcleos tumorales teñidos de carmelita del número total de células en
las áreas más densamente manchadas de cada placa del campo visual del microscopio a 20X. La tinción de los vasos sanguíneos
se desarrolló utilizando el anticuerpo anti-factor de von Willebrand de conejo (vWF) (A0082, DAK.O, Carpintería, EUA)
diluido 1:500 en una solución tampón Tris 0.05 M. Se identificaron 2 ó3 campos en cada lámina y se definió la densidad de
microvasos sanguíneos como el número promedio de vasos en un campo de 20X.
Evaluación de la respuesta inmune
Se obtuvieron muestras para el estudio de la respuesta inmune frente al h-R3 con una frecuencia quincenal durante las primeras 6
semanas del tratamiento, haciendo coincidir las extracciones con las correspondientes al laboratorio clínico y luego 1 vez al mes
hasta concluir el tiempo de seguimiento previsto (1 año). Para la determinación de la respuesta immune se utilizó el sistema
ELISA indirecto descrito para en el ensayo fase I (ver antes).
Estadística
Para evaluar las reacciones adversas al AcM en diferentes dosis y la radioterapia se comparó la distribución de frecuencia de
eventos adversos según la severidad de los mismos mediante la prueba de Kruskal-Wallis (Sokal R y cols., 1995).
La aparición de los eventos adversos se comparó mediante el análisis de varianza de efecto fijo. La respuesta antitumoral por
cada grupo de dosis se comparó mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba exacta generalizada de Fisher (Sokal R y
cols., 1995).
Se evaluó la actividad proliferativa, la angiogénesis y la expresión de EGFR en 11 pacientes. Para el análisis de
estos indicadores de inmunohistoquímica se utilizó la estadística descriptiva, debido a una distribución no
61
homogénea de la cantidad de pacientes entre los grupos de dosis. Todas las pruebas estadísticas se evaluaron con
un 95% de confianza.
El tiempo de supervivencia se calculó a partir de la fecha del primer tratamiento, hasta el momento de la muerte.
Los datos de supervivencia se analizaron utilizando el método Kaplan-Meier y la prueba de log-rank (Sokal R y
cols., 1995).
Resultados y Discusión
Evaluación de la actividad antitumoral del AcM h-R3.
El AcM inhibe la proliferación de la línea celular A431 en cultivo.
Se evaluó la actividad anti-proliferativa in vitro del AcM h-R3 en monocapa (cultivo bidimensional) y en
condiciones de cultivo tridimensional (esferoides), en la línea de carcinoma vulvar A431 que presenta una
alta expresión de EGFR. El modelo tridimensional es el más relevante ya que refleja mejor la estructura
espacial de las neoplasias y las complejas interacciones célula-célula de un tumor en crecimiento (Sgouros
G y cois., 2003).
El AcM h-R3 mostró un máximo de inhibición de la proliferación de la línea tumoral A431
correspondiente a 40 %. El efecto máximo fue equivalente en las 2 condiciones de cultivo (monocapa y
esferoides), aunque se alcanzó a dosis más bajas en condiciones de cultivo tridimensional (Figura 1).
Figura 1: Actividad anti-proliferativa del AcM h-R3 a concentraciones crecientes sobre la línea A431 en 2
condiciones de cultivo: monocapa (cultivo bidimensional) y en esferoides (cultivo tridimensional).
La magnitud de este efecto inhibitorio se encuentra en concordancia con lo reportado para otros
Concentración del AcM h-R3 (ng/ml)
62
anticuerpos en condiciones de cultivo en monocapa (Viloria A y cois., 1997; Goldstein NI y cols., 1995).
La saturación del efecto anti-proliferativo se alcanzó a concentraciones más bajas en esferoides, lo cual
puede estar en relación con el incremento en la expresión de TGF alfa en la línea A431 en estas
condiciones de cultivo (Laderoute KR y cols., 1992).
El AcM h-R3 posee un efecto antitumoral en ratones xenotransplantados con la línea A431.
Se realizaron 2 experimentos independientes para evaluar el efecto antitumoral de los AcMs h-R3 e ior
egf/r3.
En el experimento de curso corto (4 administraciones del AcM) se constató una marcada actividad
antitumoral de los AcMs h-R3 e ior egf/r3. En el día 16, los tumores del grupo control alcanzaron un
volumen promedio de 500 mm', mientras que el volumen promedio de los tumores tratados con el AcM ior
egf/r3 fue de 150 mm y en los ratones tratados con el h- R3 fue de 125 mm3. No se constataron diferencias
estadísticamente significativas entre los anticuerpos ior egf/r3 y h-R3 con relación a la actividad anti-
tumoral (Figura 2).
Figura 2: Actividad antitumoral de los anticuerpos monoclonales ior egf/r3 y h-R3 en ratones
xenotransplantados con la línea A431 (experimento de curso corto). Los ratones tratados recibieron 4
administraciones IP de los AcM ior egf/r3 o h-R3 (l mg/dosis).
63
La evaluación de la actividad antitumoral se estudió nuevamente a 2 dosis de ambos AcMs en el
experimento de curso largo. Tras 8 inyecciones de cada anticuerpo, se alcanzó respuesta completa en
18 de 20 ratones tratados. Todos los ratones (10/10) tratados con la dosis alta (1 mg) de ambos AcMs
alcanzaron regresión tumoral completa en el día 22. En 4 de los 5 ratones tratados con la dosis baja de
cada AcM se obtuvo la remisión completa. En contraste, los tumores del grupo control crecieron
rápidamente, alcanzando un volumen de 1000 mm' a los 22 días de iniciado el experimento, lo cual
representa un incremento equivalente a 5 veces. Se encontraron diferencias estadísticamente
significativas en la actividad anti-tumoral entre los ratones controles y los tratados (p<0.05); en
cambio no se encontraron diferencias significativas en la respuesta antitumoral entre los 2 anticuerpos
o entre las dosis de tratamiento (Figura 3).
Evaluación de la actividad anti-angiogénica del AcM h-R3.
El AcM h-R3 inhibe la síntesis de VEGF a nivel proteico y de ARN mensajero.
Se evaluó la capacidad del AcM h-R3 de inhibir la síntesis de VEGF, uno de los principales factores pro-
angiogénicos. Se demostró que el h-R3 produce una inhibición de la producción de VEGF a nivel proteico
en la línea de carcinoma vulvar A431. A la concentración más alta utilizada (100 M-g/ml), la inhibición de
la síntesis de VEGF correspondió a 40 % (Figura 4).
VEGF (pg/ml/100 000 células
Figura 3: Actividad antitumoral de los anticuerpos monoclonales ior egf/r3 y h-R3 en
ratones xenotransplantados con la línea A431 en el experimento de curso largo. Los ratones
tratados recibieron 8 administraciones 1P de los AcM ior egf/r3 o h-R3 (1 mg/dosis ó 0,25
mg/dosis)
64
65
Figura 4: Cuantificación de VEGF por ELISA en el medio condicionado de la línea A431 cultivada
en DMEM/SFB 1% o en presencia de concentraciones crecientes del AcM h-R3.
A nivel de ARN mensajero, se alcanzó un efecto inhibitorio máximo en la producción de VEGF
equivalente a 56 % (datos cuantificados por Phospholmager), en las mismas condiciones
experimentales (Figura 5).
Figura 5: Cuantificación de VEGF por Northern Blot en la línea A431 cultivada en
DMEM/SFB 1% o en presencia de 2 concentraciones diferentes del AcM h-R3. Las bandas de
28 S y 18 S del ARN ribosomal se usaron como control.
El AcM h-R3 inhibe in vivo la producción de VEGF a nivel de ARN mensajero
Al finalizar el experimento de curso corto se realizó exéresis de los tumores residuales de los
3 grupos de tratamiento con el objetivo de evaluar la actividad anti-angiogénica.
El análisis de ARN mensajero tumoral procedente de los ratones tratados con ambos anticuerpos reveló
un decrecimiento equivalente a 50 % en los niveles de VEGF, resultado que se correspondió con los
hallazgos previos in vitro (Figura 6).
Figura 6: Cuantificación de VEGF por Northern Blot en tumores de la línea A431 provenientes de
ratones tratados con el AcM h-R3 o con STF. Las bandas de 28 S y 18 S del ARN ribosomal se usaron
como control.
El AcM posee efecto anti-angiogénico itt vivo.
Se evaluó la actividad anti-angiogénica de los AcM h-R3 e ior egf/r3 en cortes de los tumores resecados en el
experimento de curso corto.
Las secciones tumorales de los ratones controles aparecieron bien vascularizadas, principalmente en la periferia
tumoral. En contraste, los tumores tratados evidenciaron un decrecimiento marcado de la angiogénesis, en términos
de densidad y de calibre de los vasos sanguíneos. Se constató una reducción de la vascularidad equivalente a 3 veces
entre los tumores tratados y controles, que fue estadísticamente significativa (p < 0.05) (Figura 7).
66
67
Figura 7: Evaluación de la actividad anti-angiogénica de los AcMs h-R3 e ior egf/r3 por técnicas de inmunohistoquíniica en cortes
de tumores de ratones tratados en comparación con el grupo control.
A) Tinción de Hematoxilina y eosina (25 x) (B) Tinción de vasos sanguíneos con AcM anti-factor VIII (20 x)
Con relación al efecto anti-angiogénico, concluimos que el h-R3 fue capaz de inhibir la síntesis de VEGF in vitro e in vivo a nivel
proteico y a nivel de ARN mensajero hasta un máximo de 50 %. Si esta regulación negativa de la síntesis de VEGF equivalente a 50
%, puede explicar el efecto anti-angiogénico que se constató in vivo, no se evaluó directamente. Sin embargo, existen evidencias
que sustentan esta hipótesis: una reducción equivalente del VEGF (50 %), obtenida tras la disrupción de un solo alelo del gen de
VEGF en ratones, bloqueó significativamente la vasculogénesis y provocó la muerte de los embriones de entre 11 y 12 días de
gestación (Ferrara N y cois., 1996; Carmeliet P y cols., 1996); la supresión de la expresión de VEGF en el orden de las 3 veces en
una línea de glioblastoma, suprimió completamente su crecimiento en ratones atímicos (Cheng SY y cols., 1996). Adicionalmente,
la línea tumoral A431 es muy dependiente del VEGF para el crecimiento in vivo, lo que ha quedado demostrado tras el uso de
varios antagonistas de la señalización asociada al VEGF (Millauer B y cois., 1996). Por ejemplo, el uso de anticuerpos
neutralizantes de VEGF (Millauer B y cois., 1996), o la generación de una mutante dominante negativa del receptor 2 de VEGF
(Flk-1) (Prewett M y cois., 1999) y el uso de un anticuerpo antagonista del Flk-1 fue capaz de inhibir significativamente el
crecimiento de esta línea de carcinoma vulvar en ratones inmunocomprometidos (Parangi S y cols., 1996).
Evaluación del efecto pro-apoptótico del AcM h-R3.
El AcM h-R3 induce detención del ciclo celular en la Fase Gl/S.
El análisis del ADN por citometría de flujo evidenció detención del ciclo celular en la fase Gl, acompañado de una disminución en la
fase S en las células tratadas con el AcM h-R3 (Figura 8). No se observó acumulación en la zona sub-Gl (pico hipo-diploide)
indicativa de actividad apoptótica. La ausencia de apoptosis en condiciones de cultivo in vitro indica que la actividad del h-R3, en
estas consiciones experimentales, es fundamentalmente citostática y no citotóxica.
a) Control
bi h-R3
CIO/.
Eventos Células %
Total 7833 100
MI (Gl) 5252 67.05
M2 (S) 1242 15.86
M3 (G2) 1356 17.31
M4 (G0) 12 0.15
Eventos Células %
Total 7133 100
M1 (G 1) 6347 88.98
M2 (S) 314 4.40
M3 (G 2) 458 6.42
M4 (G 0) 21 0.29
68
Figura 8: Evaluación de ciclo celular por citometría de flujo en células A431: a) células cultivadas en
DMEM/SFB 1% b) células cultivadas en presencia del AcM h-R3 (100 (ig/ml).
La detención del ciclo celular en la Fase Gl/S concuerda con lo reportado para otras drogas
bloqueadoras del receptor (Salomon DS y cols..1995). Los estudios realizados con el AcM
c225 o con las pequeñas moléculas Iressa o Tarceva evidencian que la detención del ciclo
celular en esta fase es producto de la reducción de la actividad de la protema CDK2, que está
a su vez mediada por el incremento del inhibidor de CDK2, p27 (Tsatsanis C y cols., 2000).
69
Se requieren estudios adicionales para evaluar si la detención del ciclo celular provocada por el h-R3 es
consecuencia de la inducción de p27.
El AcM h-R3 no evidencia un efecto pro-apoptótico potente in vitro en el modelo A431.
Para evaluar el efecto pro-apoptótico del h-R3 se empleó un sistema más sensible que detecta la degradación del
ADN y la formación de mono u oligonucleosomas. En el modelo A431 no se detectó incremento de muerte
celular programada tras la exposición al AcM durante 48 hrs. en condiciones de cultivo en monocapa. Se
detectó un efecto pro-apoptótico “débil” cuando las células se cultivaron en esferoides en presencia de
concentraciones altas del h-R3 durante al menos 24 horas (Tabla 1).
El efecto antitumoral in vivo puede atribuirse a la actividad anti-proliferativa y pro- apoptótica.
Se realizaron tinciones de inmunohistoquímica para evaluar la actividad pro-apoptótica y anti-proliferativa en
los tejidos tumorales provenientes de los ratones tratados con los AcMs ior egf/r3 ó h-R3 en comparación con
los controles (Figura 9).
Las tinciones para la evaluación de la apoptosis (Túnel) revelaron un incremento significativo del índice
apoptótico equivalente a 5 veces [p < 0.05) de las muestras tratadas con los AcMs en comparación con los
controles. Se constató una disminución marcada de la actividad anti-proliferativa en los tumores tratados en
comparación con los controles, a través de la tinción del antígeno nuclear Ki67.
Tabla 1: Evaluación del efecto pro-apoptótico in vitro del AcM h-R3 a concentraciones crecientes, en 3
intervalos de tiempo. Se reportan los valores de los factores de enriquecimiento en mono-
oligonucleosomas con respecto al control. [h-R3]
Mg/ml
6 hrs. 24 hrs. 48 hrs.
monocapa esferoides monocapa esferoides monocapa esferoides
50 1,2 U 1 2,4 1 2,6
12,5 1 1,1 1 1,5 1 1,6
1,25 1 1 1 1,1 1 1,2
70
Figura 9: Evaluación por técnicas inmunohistoquimicas de la actividad anti-proliferativa y pro-
apoptólica de los AcMs h-R3 e ior egf/r3 en tumores de ratones tratados en comparación con el
grupo control. A) Tinción de hematoxilina y eosina (25 x) B) Tinción de núcleos en proliferación
con AcM anti-ki67 (20 x) C) Tinción de oligonueleosomas y detección de apoptosis (10 x)
71
A pesar de que existen múltiples evidencias de que la activación del EGFR propaga señales de sobrevida que
previenen la apoptosis de la célula tumoral (Garber K, 2000), no se constató una actividad pro-apoptótica
significativa in vilro tras el uso del h-R3 en el modelo A431. Previamente, Moyer, Wu y colaboradores habían
reportado la inducción de apoptosis en la línea de carcinoma de colon DiFi después del tratamiento con c225 o
con Tarceva (Wu X y cois., 1995; Moyer y cois. 1997). Sin embargo, no se ha reportado la inducción de
apoptosis en la línea A431, al menos en condiciones de cultivo en monocapa. Los resultados obtenidos por
citometría de flujo, también evidencian que la apoptosis no contribuye mayoritariamente a la actividad
antitumoral encontrada in vitro en este modelo tumoral.
Por el contrario, se constató una marcada actividad antitumoral en los experimentos en ratones
xenotransplantados con la línea A431, acompañado de un incremento del índice apoptótico en 5 veces. Teniendo
en cuenta la aparición de esta “disociación in vitro-in vivo” consideramos que es posible que la muerte celular
constatada tras el uso del AcM h-R3 se deba no solo a su efecto anti-apoptótico directo. Se han reportado
resultados semejantes que pueden ser atribuidos a mecanismos que operan in vivo pero no en condiciones de
cultivo tales como la angiogénesis y las funciones efectoras inmunológicas (Fan Z y cols., 1997; Clarke K y
cols., 2001). La activación de las funciones inmunológicas tales como la citotoxicidad dependiente de
anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente de complemento (CTC), constituye una posible explicación
a la toxicidad selectiva evidenciada en los experimentos en ratones. Sin embargo, no se constató un mayor efecto
citotóxico in vivo en los experimentos donde se usó el AcM murino ior egf/r3. Teniendo en cuenta la naturaleza
especie-específica de la respuesta inmune, la capacidad de la subclase lgG2a (subclase del AcM ior egf/r3) para
interactuar con las células efectoras inmunológicas del ratón huésped (células asesinas naturales y macrófagos) y
de activar el complemento, nuestra predicción fue que el AcM murino exhibiría mayor efecto antitumoral. Sin
embargo, los anticuerpos ior egfr/r3 y h-R3 tuvieron un efecto citotóxico equivalente in vivo. En
correspondencia con estos resultados, Fan y colaboradores han reportado que el fragmento bivalente del
anticuerpo murino 225, parental del anticuerpo quimérico c225, inducía una actividad antitumoral significativa y
dosis-dependiente en ratones atímicos transplantados con la línea tumoral A431, comparable al encontrado tras
usar la molécula completa (Fan Z y cols., 1997). De igual forma, la actividad antitumoral del anticuerpo anti-
HER2 (Herceptin), no se afectó sensiblemente después de depletar de complemento y macrófagos los animales
72
xenoinjertados con tumores de mama (Shak S y cols., 1999). Para ambos anticuerpos, se atribuye un efecto
menor al dominio Fe y al consecuente reclutamiento de efectores inmunológicos (Fan Z y cols., 1997; Shak S y
cols., 1999).
En cambio, el incremento de la apoptosis in vivo pudiera estar relacionado con el efecto del AcM en la
angiogénesis. La respuesta anti-angiogénica puede traer como consecuencia no solo la disminución de la
densidad de los vasos, sino también la inducción de apoptosis (Benjamín LE, 2000). Además, se ha postulado
que los factores de crecimiento del endotelio vascular como el VEGF proveen señales de sobrevida a las células
endoteliales y por tanto la deprivación de estos factores puede conducir a la muerte celular programada en
condiciones fisiológicas (Viloria A y cols., 1997).
Evaluación de la aparición de resistencia.
Se induce resistencia tras el tratamiento prolongado con anticuerpos anti-EGFR.
Para evaluar la aparición de resistencia adquirida tras la administración prolongada de anticuerpos anti-EGFR,
los ratones del experimento de curso largo se mantuvieron en observación con el fin de detectar la recurrencia
tumoral. En este experimento se había alcanzado un índice de respuestas completas macroscópicas equivalente a
90 %. La recidiva tumoral ocurrió en todos los grupos de tratamiento tras un período de latencia entre 1,5 y 4,5
meses. La frecuencia de recurrencia tumoral para los AcMs h-R3 e ior egf/r3 fue de 40 y 80
73
% para los ratones tratados con la dosis más baja de cada anticuerpo (0,25 mg) y de 25 % y 80 %
respectivamente, para el grupo de ratones que recibió la dosis alta de tratamiento (1 mg) (Tabla 2).
Los ratones con recurrencias tumorales se trataron con la misma dosis y el mismo anticuerpo que habían
recibido previamente y en caso de no respuesta en el grupo de dosis baja, recibieron la dosis más alta de los
AcMs (1 mg). En general se observó que los tumores no respondieron en la misma magnitud que lo hicieron
inicialmente y se establecieron 6 variantes resistentes derivadas de la línea parental A431 (R1-R6) (Tabla 2).
Tabla 2: Generación de variantes resistentes tras el segundo ciclo de tratamiento
Las variantes resistentes y la línea parental no se diferencian en la expresión y capacidad de activación
del EGFR. La resistencia se evidencia in vivo y no in vitro.
Para corroborar el origen común de las variantes resistentes y la línea A431 se realizó el análisis del ADN,
demostrándose un patrón de bandas idéntico, lo que evidenció que las variantes resistentes no contenían células
contaminantes. Se seleccionaron 2 de las variantes resistentes, R1 y R5, para continuar el resto de los
experimentos (Figura 10A).
Grupo AcM
(Dosis)
No.animales por grupo
No. y % de animales con recurrencia tumoral
Identificación del tumor recurrente
Segundo ciclo de tratamiento No. inyecciones y dosis del AcM
Obtención de variante resistente
I ior egf/r3
(0,25 mg)
5 4 (80 %) T2 5 x 0,25 mg No
T3 8 x 0,25 mg R1 y R2
T4 8 x 0,25 mg + 8 x
1 mg
No
T5 7 x 0,25 mg No
II ior egf/r3
(0,25 mg)
5 4 (80 %) TI 1 x 1 mg No
T3 7 x 1 mg R6
T4 7 x 1 mg No
T5 8 x 1 mg No
III h-R3
(0,25 mg)
5 2 (40 %) T2 8 x 0,25 mg + 8 x
1 mg
R3
T5 8 x 0,25 mg + 8 x
1 mg
R4
IV h-R3 (0.25
mg)
5 1(25 %) T3 8 x 1 mg R5
74
Para evaluar la resistencia in vivo al tratamiento se xenotransplantaron las 2 líneas resistentes y la línea de
carcinoma vulvar A431 en ratones SC1D. El experimento comenzó cuando los tumores tenían un volumen de
200-300 mm'. Ambas variantes resistentes mostraron un crecimiento acelerado in vivo con relación a las células
no modificadas, que se hizo evidente tras 18 días y significativo a ios 22 días de la inoculación del tumor (Figura
10B). Cuando se evaluó la sensibilidad de las variantes resistentes R1 y R5 al AcM anti-EGFR c225, ambos
tumores mostraron una respuesta “retardada”. En el día 45, todos los ratones xenotransplantados con la línea
A431 y tratados con el AcM c225, habían alcanzado la remisión tumoral completa, mientras que solamente 1
ratón transplantado con la línea R1 y 2 ratones transplantados con la línea R5 habían alcanzado la regresión
completa macroscópica. La mejor respuesta para los ratones xenotransplantados con las variantes resistentes se
alcanzó en el día 45 (Figura 10C). Los restantes tumores no habían regresado en el día 86, tiempo al cabo del
cual el experimento se terminó, pues al menos 2 ratones habían alcanzado el volumen tumoral máximo permitido
(1700 mm3) por el comité de ética de los animales. Se obtuvieron resultados semejantes cuando las variantes
resistentes se trataron con el AcM h- R3.
Para caracterizar las variantes resistentes se realizó la evaluación de la expresión de
EGFR y HER 2 en las líneas resistentes en comparación con la parental. Para demostrar
la funcionalidad del EGFR, se realizó la estimulación de las variantes resistentes y la
Figura 10 A) Análisis del ADN de las variantes resistentes y de la línea A43l B) Evaluación del
crecimiento in vivo de las variantes resistentes Rl y R5 en comparación con la línea parental A43l C)
Evaluación de la actividad antitumoral del AcM c225 sobre las variantes resistentes Rl y R5 en
comparación con la línea parental A431.
75
76
parental con TGF alfa, uno de los principales ligandos del EGFR. La no-expresión de EGFR y HER2
o la no-funcionalidad del receptor, podrían explicar la aparición de resistencia a nuevas rondas de
terapia. En estos ensayos se demostró que no había pérdida de la expresión de EGFR en las variantes
resistentes y que mantenían intacta su capacidad de activación (Figura 11 A). El patrón de expresión
similar del EGFR y su activación tras el estímulo con el ligando, demostraron que los cambios en el
estado del EGFR no eran los responsables del fenotipo resistente. Este resultado se reforzó tras el
hallazgo de que las líneas resistentes, mantuvieron in vitro la misma sensibilidad que la parental al
tratamiento con c225 o con TGF alfa en concentraciones no fisiológicas, inhibitorias (Tabla 3).
Tabla 3: Propiedades de crecimiento in vitro de las células resistentes en comparación con la línea parental A431.
Tiempo de Inhibición tras tto Inhibición tras tto Tipo
duplicación con c225 con TGF alfa celular (h ± SD)_______ (% ± SD)
____________________________ (% ± SD)
Al constatarse resultados contradictorios in vitro e in vivo, en cuanto a la sensibilidad al tratamiento con el
AcM anti-EGFR, se evaluó la capacidad angiogénica de las variantes resistentes en comparación con la
línea original. Una capacidad angiogénica alta de las variantes resistentes, podría explicar las discrepancias
encontradas en cuanto a la sensibilidad in vitro e in vivo.
Las variantes resistentes poseen un alto potencial angiogénico.
Para evaluar la capacidad angiogénica, se midieron los niveles de VEGF a nivel de ARN mensajero y a
nivel proteico en las líneas resistentes en comparación con la línea A431. En este ensayo se demostró que 5
de las 6 variantes resistentes producían al menos 2 veces más VEGF a nivel de ARN mensajero y a nivel
de proteína (Figura 11 B, C), siendo R6 la excepción (datos no mostrados). Las líneas resistentes
mostraron una disminución de la síntesis de VEGF tras el tratamiento con un AcM anti-EGFR, pero aún
A431 30.2 ±2.3 33 ±5.6 91 ±5.2
R1 28.7 ±0.6 41 ± 10.0 80 ±3.2
R3 30.6 ±1.1 43 ±5.3 88 ±7.9
R4 32.4 ± 1.1 33 ± 11.4 85 ±7.5
R5 35.4 ± 1.6 35 ±8.1 84 ± 9.4
77
así producían de 2 a 4 veces más VEGF que las parentales. Además se observó un incremento de la
proliferación de las células HUVECs cultivadas en presencia del medio condicionado de las variantes
resistentes (Rl, R3, R4, R5) en comparación con el medio de las células no modificadas (Figura 11 D). La
no detección de aumento en la producción de VEGF en la variante resistente R6, demuestra que puede
aparecer resistencia por mecanismos alternativos. En contraste con lo observado para el VEGF en las
líneas resistentes, no se apreció un patrón de respuesta común en cuanto a la síntesis de TSP-1, un factor
inhibidor de la angiogénesis (Figura 11 B). Mientras que las células de la línea parental producen muy
poco TSP-1, se constató un incremento de la producción de TSP-1 en las variantes resistentes R2 y R5.
Aunque las causas y relevancia biológica de la sobre-expresión de TSP-1 por estas variantes no están
calaras, este incremento no provocó una desventaja en el crecimiento de la variante R5 (Figura 10B)
78
Figura ll: Caracterización de las líneas tumorales resistentes. A) Evaluación de la expresión de EGFR,
Her 2 y de pEGFR tras la estimulación con TGF alfa en las variantes resistentes y en la línea A43l. B)
Niveles de ARNm de VEGF y TSP-l en las variantes resistentes en comparación con la parental C)
Evaluación de la producción de VEGF a nivel proteico (cuantificación por ELISA) en las variantes
resistentes en relación con la parental y evaluación del efecto del AcM c225 en la inhibición de la
síntesis de VEGF. D) Evaluación de la proliferación de las células HUVECs en presencia del medio de
cultivo colectado de las variantes resistentes y la línea A431.
Las líneas transfectadas con mVEGF exhiben mayor tumorigenicidad y resistencia a los AcM
anti-EGFR.
Tras la demostración de la sobre-expresión de VEGF en las variantes resistentes en comparación con las
células no transformadas, decidimos evaluar si el incremento en la producción de VEGF podía explicar en
parte la resistencia a los agentes anti-EGFR in vivo. De acuerdo a esta hipótesis, un aumento no
dependiente del EGFR podría actuar de fado como un mecanismo de resistencia a los inhibidores del
EGFR. Se realizó una transfección del gen del VEGF en la línea A43l no modificada, utilizando un vector
de expresión que codificaba para la forma murina del VEGFI64. Se obtuvieron 3 transfectantes estables,
que producían entre 800 y 12 000 pg/ml de VEGF murino. Los niveles de producción de VEGF fueron
totalmente refractarios al tratamiento con c225 (Figura 12A), lo cual era de esperar teniendo en cuenta que
la expresión de VEGF|64exógeno está bajo el control del promotor de CMV. En cambio, los clones
mantuvieron la misma sensibilidad in vitro a la inhibición del crecimiento y de la síntesis endógena de
VEGF por el AcM c225 (Figura 12A), mientras que in vivo mostraron un crecimiento acelerado y una
disminución de la respuesta al c225. Los clones transfectados mostraron una resistencia significativa al
tratamiento (Figura 12B). No se detectaron diferencias significativas entre las 3 líneas transfectadas,
aunque se encontró una tendencia al aumento de la resistencia en relación con la producción de VEGF.
Hay que destacar que el clon transfectado que producía la menor cantidad de VEGF, secretaba una
cantidad muy similar a la producida por algunas de las variantes resistentes, lo cual refuerza la hipótesis de
la relación entre resistencia y el incremento de la síntesis de VEGF.
79
Figura 12: A) Evaluación de la producción de mVEGF por los clones transfectados (SI a S3) y evaluación del
efecto in vitro del tratamiento con c225 sobre la producción de hVEGF y mVEGF. La barra oscura
horizontal representa el nivel promedio de hVEGF producido por las líneas transfectadas y la parental en
condicionales normales de cultivo y tras el tratamiento con c225. B) Evaluación del efecto antitumoral in vivo
del AcM c225 en las líneas transfectadas y en la parental. C) Aspecto de los tumores en ratones
xenotrasplantados con la línea A431 y las transfectadas (S1-S3) tras el tratamiento con el AcM c225
80
Los experimentos de transfección de mVEGF en la línea parental A431, corroboraron la importancia del
aumento en la producción de VEGF en la tumorigénesis y en la resistencia in vivo a la terapia con inhibidores
de EGFR. El aumento de la síntesis de VEGF es atribuible al incremento de la relación entre las células que sí
expresan el factor estimulante del endotelio en comparación con las que no lo hacen. El mecanismo responsable
de este cambio no está claro, pero es probable que el tratamiento con inhibidores del EGFR haya inducido la
selección de aquellas subpoblaciones celulares con alto grado de expresión de VEGF y por tanto alto potencial
angiogénico.
Para explicar las vías que conducen a la elevación del VEGF, se han postulado varias hipótesis. En primer lugar
se sabe que algunos oncogenes, entre los que se encuentran ras, src, EGFR y HER2, al activarse regulan
positivamente la producción de VEGF (Zhong H y cois., 2000). También se ha descrito que cuando se produce
la inactivación o la mutación de algunos genes supresores tumorales tales como p53, VHL o PTEN se regula
positivamente la producción de VEGF (Kami R y cols., 2000). Las variantes resistentes pueden sobre- expresar
VEGF como resultado de la selección de aquellas células que posean uno o más de estos cambios genéticos tras
la terapia con anticuerpos anti-EGFR. Alternativamente, puede existir alguna aberración en la señalización de la
cascada del EGFR relacionada con el VEGF. Los cambios pueden estar en la vía del fosfatidil-inositol 3-quinasa
(Kami R y cois., 2000), en la quinasa src (Okada F y cois., 1998; Sato K y cois., 2000) o en la vía del ras
(Shiurba RA y cois., 1988). Cualquiera que sea el mecanismo, la magnitud del incremento en la producción de
VEGF puede aumentar significativamente la angiogénesis de acuerdo a los reportes previos basados en la
transfección de este gen (Cheng S y cols., 1996; Links M y cols, 1999)
Ensayo Clínico Fase I
En el ensayo fase I se evaluó la toxicidad, farmacocinética, biodistribución e inmunogenicidad del anticuerpo
monoclonal h-R3. Se incluyeron 12 pacientes con tumores epiteliales en estadios avanzados (11 mujeres y 1
hombre). La edad promedio fue de 59,33 años (35-74). Los tumores primarios correspondieron a las siguientes
81
82
localizaciones: ovario (4 pacientes), mama (4 pacientes), pulmón (2 pacientes), estómago (1 paciente) y riñón (1
paciente) (Tabla 4).Todos los sujetos del ensayo habían concluido el tratamiento oncoespecífico al menos 4
semanas antes de la inclusión.
El AcM fue muy bien tolerado a las dosis empleadas.
Siete de los 12 pacientes presentaron eventos adversos. En todos los casos, los eventos fueron leves o moderados
de acuerdo a la tabla de toxicidad de la OMS y se clasificaron como reacciones infusionales. No se constataron
reacciones adversas severas o muy severas (Tabla 4). Todos los eventos adversos fueron reversibles.
En varios ensayos clínicos se ha descrito previamente la aparición de reacciones infusionales tales como fiebre,
escalofríos y náuseas, asociadas al uso altas dosis de otros AcMs tales como Herceptin (Trastuzumab) (Slamon
DJ y cois., 2001), Rituxan (Rituximab) (Davis TA y cois., 2000), Campath (Alemtuzumab) (Dearden CE y cois.,
2001) y Mylotarg (Gemtuzumab) (Bross PF y cois., 2001).
Tabla 4: Características demográficas de los pacientes incluidos en el ensayo fase I y eventos adversos tras la
administración del AcM h-R3. No. Dosis Edad /
Género
Diagnóstico Etapa Eventos Adversos (EA' Severidad
del EA
01 50 mg 35/F Carcinoma de ovario IV Náuseas y vómitos. Grado I
02 50 mg 50/F Carcinoma de ovario IV Fiebre, temblores.
Sequedad bucal.
Grado I
03 50 mg 53 Carcinoma epidermoide de
pulmón
III Fiebre. Enrojecimiento
facial
Grado I
04 100 mg 68/F Adenocarcinoma
estómago
IV Temblores Grado II
05 100 mg 58/F Carcinoma ductal infiltrante
de la mama
IV Temblores, Debilidad en
los miembros inferiores
Grado I
06 100 mg 66/F Carcinoma ductal infiltrante
de la mama
IV No No
07 200 mg 65/F Carcinoma de ovario IV No No
08 200 mg 68/F Carcinoma ductal infiltrante
de la mama
IV No No
09 200 mg 55/F Carcinoma epidermoide de
pulmón
IV No No
10 400 mg 74/F Carcinoma de ovario III Temblores Cianosis
peribucal
Grado II
11 400 mg 58/F Carcinoma renal IV Temblores, hipertensiór Grado II
12 400 mg 62/F Carcinoma ductal infiltrante
de la mama
IV No No
El h-R3 exhibe una cinética no lineal. Se alcanza la saturación del aclaramiento sistèmico a la dosis de
200 mg.
Los valores de concentración del h-R3 en suero se relacionaron con los tiempos correspondientes para describir
los perfiles farmcocinéticos concentración vs. tiempo. Estos perfiles se ajustaron a un transcurso biexponencial,
utilizando la aplicación Winnonlin 1997 para estudios de farmacocinética. Tras el procesamiento de los datos se
encontró que el AcM h-R3 tenía un tiempo de vida media de eliminación (tj/2 p) equivalente a 62,91 hrs.; 82,6
hrs.; 302,95 hrs. y 304,51 hrs. para las dosis de 50, 100, 200 y 400 mg, respectivamente. El
área bajo la curva (AUC) fue de 45 458, 145 931, 573 612 y 635 275 ng/mlmin y la máxima concentración
alcanzada fue de 27 790, 36 612, 52 713 y 57 117 ng/ml para los niveles de dosis de 50, 100, 200 y 400 mg,
respectivamente. El volumen de distribución del compartimento central fue de 2321,96; 2823,67; 4279,71 y
7173,99 mi y el aclaramiento fue de 1,08; 0,67; 0,34 y 0,76 ml/hr/kg para los 4 niveles de dosis. No se
encontraron diferencias significativas entre los valores de aclaramiento para los 4 niveles de dosis (p=0,095;
prueba de Kruskal-Wallis).
A pesar de que la caracterización farmacocinética debe ser considerada como preliminar debido al pequeño
número de pacientes estudiado por cada nivel de dosis, los parámetros calculados sugieren una cinética no-lineal
de eliminación del h-R3. El área bajo la curva y el tiempo de vida medio se incrementaron linealmente con la
dosis, mientras que a concentraciones crecientes del anticuerpo, se constató una reducción del aclaramiento
plasmático hasta la dosis de 200 mg. Las concentraciones máximas en suero también fueron dependientes del
nivel de dosis. El tiempo de vida media de eliminación (62,91 a 304,51 hrs.) fue significativamente superior al
tiempo de vida del anticuerpo murino (27,3 a 65,89 hrs.) (Crombet y cois., 2001) y fue semejante a los tiempos
que se han reportado para otros anticuerpos anti-EGFR humanizados o quiméricos (Baselga J y cols., 2000; Bier
H y cols., 2001).
83
84
El AcM se acumula en 5 órganos. El hígado muestra la mayor captación del h-R3.
Para la evaluación de la biodistribución, se inyectó una fracción de la dosis total del AcM marcada con "mTc. El
análisis cualitativo de las imágenes de cuerpo entero evidenció la existencia de 5 órganos fuente para el AcM h-
R3 en las dosis estudiadas: corazón, hígado, riñones, bazo y vejiga urinaria (Figura 13).
Figura 13. Estudio de biodistribución en una paciente portadora de un tumor primario en ovario con metástasis en hígado
en 4 tiempos: 1, 3, 5 y 24 hrs tra la inyección del AcM. En fotografía corrspondiente a cada intervalo de tiempo, se presentan
imágenes de cuerpo entero anterior y posterior.
Los datos de la biodistribución del h-R3 99m Tc se reportan en forma de porcentaje de la dosis inyectada
para cada nivel de dosis en los órganos fuente, 2 de los tiempos estudiados (tabla 5). Para todos los niveles
de dosis, el órgano que mostró la mayor captación del h-R3 fue el hígado. El AcM se acumuló en este órgano,
85
inmediatamente después de la administración, alcanzando la absorción máxima en la primera hora.
El intestino grueso se visualizó en 5 pacientes luego de 24 hrs. de la administración. Los porcentajes de acumulación en
riñones y en la vejiga urinaria, se modificaron ampliamente en dependencia de la evacuación urinaria. En general, la
captación del AcM decreció en el tiempo para todos los órganos, excepto para los riñones, la vejiga y el intestino grueso,
que representan las vías de excreción del AcM.
Tabla 5: Datos de biodistribución. Porcentaje de la dosis inyectada en los 5 órganos fuente tras 1 y 24 hrs. de la
administración del AcM h-R3.
Órgano fuente Tiempo
(hrs.)
50 mg Porcentaje de la dosis inyectada 100 mg
200 mg
400 mg
1 4,76 5.84 3.61 4.07 Corazón
24 1,12 1,98 1,71 1,94
1 24,76 11,79 9.88 10.58 Hígado
24 12,78 10,35 5,57 5,98
1 0,96 1,74 1.58 1.33 Bazo
24 0,27 1,03 0,80 0,69
1 2,66 2.46 2.49 3.04 Riñones
24 11,02 5,94 8,82 8,62
Vejiga 1 1,37 25,211 4,21 3,29
Urinaria 24 0,92 4,34 2,16 3,04
El estudio de biodistribución en pacientes mostró los principales tejidos de unión del h-R3, la distribución en el
compartimento vascular y las vías de eliminación del anticuerpo. El perfil de distribución se correspondió con
los reportes previos para el anticuerpo murino (Iznaga- Escobar N y cols., 1998). Las semejanzas en el patrón de
biodistribución confirmaron que tras el proceso de humanización, el AcM h-R3 mantuvo in vivo el patrón
original de reconocimiento de tejidos y órganos. El alto nivel de captación hepática se relacionó con la alta
expresión de EGFR en los hepatocitos, mientras que la acumulación del AcM en el corazón y en el bazo, pudiera
ser considerada actividad del compartimento vascular. La formación de inmunocomplejos entre el AcM h-R3 y
la fracción soluble del EGFR (secretada por el tumor o tejidos normales) también pudieran explicar la
acumulación específica en el bazo.
Tras la inyección del h-R3-,,mTc se visualizaron las lesiones tumorales en 5 pacientes.
A pesar de que no se adquirieron imágenes planas o de SPECT (tomografía simple de emisión de fotones) se
observó captación positiva en 5 pacientes en los sitios conocidos de la enfermedad. No se demostró correlación
entre la dosis y la visualización de las lesiones, ya que se detectaron imágenes positivas en todos los niveles de
dosis, excepto para el nivel de 100 mg. Los tumores primarios al igual que las metástasis extrahepáticas
mostraron una acumulación de intensa a moderada, mientras que las metástasis hepáticas aparecieron como
lesiones fotopénicas. Las imágenes tumorales positivas correspondieron a diferentes localizaciones e histologías
y se evidenciaron en pacientes portadores de neoplasias de ovario (pacientes 1, 2 y 7), de pulmón (paciente 9) y
de riñón (paciente 11). La no visualización de las lesiones primarias en todos los pacientes pudiera deberse a que
el protocolo utilizado en las adquisiciones escintigráficas era apropiado para evaluar la biodistribución del
anticuerpo en imágenes de cuerpo entero, pero no para el diagnóstico positivo de lesiones. El formato de la
matriz y los tiempos del recorrido establecidos aportaron imágenes con bajos conteos estadísticos. Como
consecuencia, se obtuvieron imágenes con bajo contraste, sin suficiente utilidad para fines diagnósticos.
Además, como el isótopo empleado (99mTc) tenía un corto tiempo de vida media (t)/2= 6,02 h), las últimas
86
imágenes se adquirieron 24 hrs. después de la administración del AcM h-R3, antes de que se alcanzara la
relación óptima tumor/ no-tumor, tomando en consideración que algunos tumores tienen un índice lento de
absorción. Además, las imágenes de las neoplasias pudieron haber sido interferidas por la acumulación positiva
del AcM en órganos adyacentes como el hígado y el compartimento vascular. Otros factores como la expresión
del EGFR y la vascularización del tumor pudieron también influir en la absorción del AcM h-R3.
El porcentaje de la dosis absorbida por gramo de tejido fue significativamente mayor en el tumor que en
los tejidos normales.
El aclaramiento biológico del anticuerpo se comparó entre los tumores y los tejidos normales, utilizando las
imágenes de inmunogammagrafía de cuerpo entero. Se calculó el porcentaje de acumulación de la dosis
inyectada por gramo de tejido en los tumores de todos los pacientes con imágenes positivas en comparación con
el hígado y el corazón, 2 de los órganos fuente con mayor captación del AcM h-R3. El porcentaje de la dosis
inyectada por gramo de tejido fue significativamente más alto en el tumor que en el hígado y en el corazón. Al
igual, el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido decreció tras 24 hrs. para los tejidos normales,
mientras que se mantuvo relativamente constante para los tumores (Figura 14).
Figura 14: Aclaramiento del AcM h-R3 en el tumor, hígado y el corazón, determinado por estudios de
inmunogammagrafía de cuerpo entero. Los resultados se expresan como log % ID/g of tejido. Pesos estimados:
(Tumor = 2 g, Hígado = 1800 g y corazón =330 g).
87
El AcM no es inmunogénico tras una sola administración.
Se evaluó la inmunogenicidad del AcM h-R3 hasta 6 meses después de la administración del AcM. No se
constató respuesta inmune tras una administración del AcM. La ausencia de reacciones alérgicas, en relación
con la baja respuesta inmune, confirma la baja inmunogenicidad del anticuerpo humanizado.
Ensayo clínico Fase I/II
Entre septiembre de 1999 hasta marzo del 2001, se incluyeron 24 pacientes con tumores de cabeza y cuello
histológicamente documentados, localmente avanzados e irresecables. Los tumores primarios se localizaban en
la cavidad oral y la mesofaringe (Tabla 6). En el momento de la inclusión todos los pacientes eran elegibles para
la terapia con radiaciones. Tabla 6: Características demográficas de los pacientes incluidos en el ensayo Fase
I/1I.
88
89
Dos pacientes interrumpieron la terapia radiante y el AcM en la primera semana, imposibilitando la evaluación
de la respuesta antitumoral. Se recolectaron los datos de seguridad del AcM en los 24 pacientes y los datos de
eficacia terapéutica en 22 sujetos.
El AcM h-R3 fue bien tolerado en combinación con radioterapia. No se evidenciaron reacciones
alérgicas ni en piel.
En 18 de 24 pacientes se constataron eventos adversos ligeros (grado 1) o moderados (grado 2), de acuerdo a la
escala de criterios comunes de toxicidad (NCI-CTC). Los eventos adversos más frecuentes consistieron en
fiebre, hipotensión, temblores y cefalea. Un paciente desarrolló un evento adverso grado 3 consistente en
somnolencia luego de la primera dosis. Las reacciones adversas fueron más frecuentes a altas dosis, pero no se
encontró relación entre la severidad de los eventos adversos y la dosis de AcM (Tabla 7).
No se reportaron reacciones inesperadas a la radioterapia. Las toxicidades asociadas a la radiación que
aparecieron con mayor frecuencia consistieron en mucositis, radiodermitis y disfagia. No se detectaron eventos
adversos grado 4. Solamente 7 de 24 pacientes (29 %) desarrollaron eventos adversos grado 3. El índice
histórico de reacciones adversas grado 3 y 4 tras los esquemas de fraccionamiento convencionales de la terapia
radiante es de 30 % (Fu KK y cois., 2000) y por tanto no se constató intensificación de la toxicidad con la
administración del anticuerpo.
Tabla 7: Eventos adversos relacionados con el uso del AcM h-R3, según nivel de dosis
50 mg (n=3) G 1/2
G 3
100 mg (n=3) G
1/2 G 3
200 mg (n=8) G
1/2 G 3
400 mg (n=8 G 1/2
G 3
Fiebre 2 3 3
Hipotensión 2 1 4
Temblores 1 5 4
Mialgia 1 2 2
Cefalea 2 3
Somnolencia 1 1
Desorientación 1 1
Escalofríos
Hematuria 1 1
Vómitos 1
Aumento 1
creatinina
Anemia 2
90
A diferencia de otros antagonistas del EGFR, el AcM h-R3 no provocó reacciones en piel ni alérgicas. Tras el
tratamiento con los AcM c225 (Kd =10'10) (Busam KJ y cois., 2001; Shin DM y cols., 2001) y ABX-EGF (Kd
=10'") (Figlin R y cols., 2001) o los pequeños inhibidores de la actividad quinasa asociada al EGFR, tales como
Iressa (Meric JB y cols., 2001) y Tarceva (Hidalgo M y cols., 2001) se han detectado reacciones acneiformes,
foliculitis, diarrea, reacciones alérgicas y neumonitis intersticial, que pueden llegar a ser severas o muy severas.
Más aún para algunas drogas como el AcM c225 y Tarceva, se ha reportado la existencia de correlación entre la
respuesta anti-tumoral, la sobrevida y la presencia de reacciones en piel; en consecuencia se ha propuesto que la
aparición de rash cutáneo es un marcador subrogado del bloqueo de EGFR (Saltz L y cols., 2003; Clark GM y
cols., 2003).
Nuestra hipótesis es que se puede lograr un bloqueo efectivo del receptor con el h-R3 sin causar reacciones
deletéreas en la piel o en otros tejidos normales, porque la dosis óptima biológica está por debajo de la dosis
tóxica. En el CIM se ha desarrollado un modelo matemático, válido para aquellos anticuerpos que reconocen
antígenos expresados en tejidos normales y tumorales y donde el efecto farmacodinámico depende de la
expresión del blanco antigénico, de la constante de afinidad del anticuerpo, de la dosis administrada y de su
tiempo de vida medio. Según el modelo, existe una ventana de afinidad que puede explotarse terapéuticamente,
donde los anticuerpos con afinidad intermedia (10"8-10'9) para el EGFR muestran una acumulación preferencial
en tejidos tumorales, con alta expresión de la proteína diana, con relación a órganos normales que también
expresan el antígeno en menor proporción (Iznaga N, 2002; resultados no publicados). El modelo predice que la
máxima diferencia de las áreas bajo la curva entre los tejidos normales y tumorales y por tanto el mejor índice
terapéutico se alcanza cuando el anticuerpo posee una afinidad intermedia. Los anticuerpos con afinidades altas
(Kd>10‘10) por el antígeno diana mostrarán gran acumulación en tejidos normales, mientras que aquellos
anticuerpos con afinidades bajas (Kd<10'8) no se acumularán en los tejidos tumorales. Otras diferencias relativas
a la especificidad epitópica de los anticuerpos y los cambios resultantes en la señalización del receptor, no
pueden desestimarse para explicar la ausencia de reacciones dermatológicas tras el uso del h-R3.
91
Se evidenció respuesta inmune en un paciente.
Se constató respuesta inmune en un paciente tratado con dosis repetidas del AcM h-R3. Este paciente había
recibido la dosis más alta del AcM h-R3 (2400 mg, dosis acumulativa), alcanzando una regresión tumoral
completa. No se evidenció exacerbación de la toxicidad en relación con los sujetos en los cuales no se encontró
respuesta positiva. Este resultado confirma la poca inmunogenicidad del AcM humanizado. En el ensayo a dosis
repetidas del AcM ior egf/r3 en pacientes con neoplasias de pulmón, el 83, 3 % de los pacientes desarrolló
respuesta HAMA y se presentaron reacciones alérgicas muy severas del tipo shock anafiláctico (Crombet T y
cols., 2001a).
Se incrementa el porcentaje de respuestas globales y completas tras la combinación de radioterapia y el
AcM h-R3.
Se logró respuesta objetiva (respuesta completa o parcial) en 18 de los 22 pacientes evaluables en los 4 niveles
de dosis (índice de respuesta global 81,8%). Al finalizar el tratamiento combinado con radiaciones y el AcM se
obtuvo respuesta completa en 11 pacientes. Dos pacientes adicionales alcanzaron la respuesta completa tras la
cirugía de rescate de la lesión primaria residual. En total, se lograron respuestas completas en 13 de 22 pacientes
(tasa de respuesta completa: 59%) en los 4 niveles de dosificación: 50 mg (1 de 3 pacientes), 100 mg (1 de 3
pacientes), 200 mg (6 de 8 pacientes y 400 mg (5 de 8 pacientes). Cinco pacientes adicionales alcanzaron una
respuesta parcial. En los niveles correspondientes a las dosis más altas de tratamiento (200 y 400 mg), 11 de 16
pacientes alcanzaron respuesta completa (índice de respuesta completa: 68,75%).
Para analizar el impacto terapéutico los pacientes se agruparon en 2 cohortes de acuerdo al nivel de dosis
recibido: 50 y 100 mg (dosis subóptima) y 200 y 400 mg (dosis óptima), porque de acuerdo a los datos
preliminares de farmacocinética, las dosis por encima de 200 mg se asocian a una cinética de orden cero y
saturación del aclaramiento sistèmico del anticuerpo. En la primera serie de pacientes, la sobrevida global se
incrementó significativamente tras el uso de dosis óptimas biológicas (p<0,05). Con una mediana de seguimiento
de 45,2 meses (rango de 41,5 a 48,1 meses), la mediana de sobrevida de los pacientes tratados con las dosis de
50 y 100 mg fue de 8,6 meses, mientras que la mediana de sobrevida de los pacientes tratados con 200 y 400 mg
92
fue de 44,3 meses. Tras 3 años de seguimiento, la tasa de sobrevida fue de 16,7 % para los sujetos tratados con
los niveles inferiores de dosis y de 66,7 % para los pacientes tratados con las dosis de 200 ó 400 mg. En la
segunda serie de pacientes no se ha alcanzado el tercer año de seguimiento y por tanto no se presentan los datos
de tasas de supervivencia. La media de sobrevida para este grupo es de 17 meses. Al igual, la tasa de remisión
completa lograda luego del tratamiento con dosis de 50 y 100 mg fue de 33 %, mientras que fue del 68 % para
las dosis de 200 y 400 mg.
En Canadá, se obtuvieron resultados semejantes en un ensayo realizado en 5 hospitales utilizando el AcM h-R3
más la terapia radiante (Winquist E y cois., 2002). En esta muestra, el 70% de los pacientes portadores de
tumores de cabeza y cuello localmente avanzados, lograron una remisión completa luego del uso del h-R3 en
dosis de 100 y 200 mg más radioterapia (70 Gy), sin quimioterapia concurrente (Winquist E y cois., 2002).
En un ensayo donde el AcM c225 se usó de conjunto con la radioterapia en pacientes con tumores avanzados de
cabeza y cuello, se alcanzó respuesta completa en 13 de los 15 sujetos tratados. Sin embargo, en 6 de los 13
pacientes la respuesta fue de corta duración y aparecieron recurrencias tumorales con una mediana de tiempo a la
progresión de 8 meses (Robert F y cois., 2001).
En el recién finalizado ensayo Fase III conducido por el Grupo Cooperativo del Este (ECOG) y el Grupo de
Oncología del Sudoeste (SWOG) en pacientes con neoplasias irresecables de cabeza y cuello, se encontró un
índice de respuestas completas de 27,4 % en el grupo de pacientes tratado con radioterapia sola, de 40,2 % en el
grupo que recibió radioterapia y cisplatino y de 49,4 % en la cohorte de pacientes que recibió la radioterapia
fraccionada y ciclos concurrentes de cisplatino y 5 fluorouracilo. En este ensayo aleatorizado de 295 pacientes,
la mediana de sobrevida fue de 12,6 meses para los pacientes que recibieron la radioterapia sola, de 19,1 meses
para los pacientes que recibieron la radioterapia combinada con cisplatino y de 13.8 meses para los pacientes
tratados con el esquema fraccionado junto a 3 ciclos de cisplatino y 5-fluorouracilo (Adelstein DJ y cois., 2003)
Se constata efecto anti-angiogénico y anti-proliferativo en las biopsias de los pacientes tratados con el
AcM h-R3
Se evaluaron comparativamente muestras de los pacientes, antes y durante el tratamiento, para identificar los
93
potenciales mecanismos efectores de la actividad antitumoral. Al inicio del tratamiento, todos los sujetos
incluidos tenían una alta expresión de EGFR en al menos el 80 % de las células neoplásicas. Durante el proceso
de reclutamiento, se rechazó sólo un paciente producto de la baja expresión de EGFR en la lesión primaria.
Antes del tratamiento, el porcentaje de células positivas para la tinción del antígeno de proliferación nuclear
Ki67 fue de 42 - 65% (mediana 57%). Por el contrario, se constató una reducción de la actividad proliferativa en
las biopsias de todos los pacientes en la semana 3 del tratamiento (Figura 15). En la referida semana, la tinción
de Ki67 varió de 0 a 29% (mediana 16%) y 4 muestras resultaron negativas a este antígeno de proliferación.
Con relación a la evaluación de la actividad angiogénica, las secciones tumorales de los pacientes mostraron una
alta densidad de vasos de neoformación antes del tratamiento. La densidad de microvasos (MVD) fue de 4 a 48
vasos por campo (mediana 14). En la tercera semana de tratamiento, 8 de los 9 tumores evaluados se
caracterizaron por una notable disminución de la densidad microvasos por campo, en rango de 3 a 15 microvasos
por campo (mediana 7) (figura 15). En 1 paciente no respondedor no hubo evidencias de disminución de la
actividad angiogénica.
No se encontró correlación significativa entre la expresión EGFR, Ki67 o la densidad de vasos sanguíneos y la
evolución tumoral. Sin embargo, la muestra fue muy pequeña para realizar un análisis multivariado confiable.
95
Figura 15: Evaluación de la actividad anti-proliferativa y anti-angiogénica por técnicas de
inmunohistoquímica en biopsias de 1 paciente tratado con la combinación del AcM y radioterapia. Estudio
comparativo pre y post-tratamiento. A) Tinción de hematoxilina y eosina (20 x) B) Tinción de núcleos en
proliferación con AcM anti-ki67 (25 x) C) Tinción de vasos sanguíneos con AcM anti-Factor VIII (20 x)
Los datos de inmunohistoquímica obtenidos en biopsias de pacientes con neoplasias de cabeza y cuello,
corroboran los datos de la preclínica ya que evidencian que tras la combinación del h-R3 y radioterapia, operan
los mecanismos anti-proliferativo y anti- angiogénico. Cuánto del efecto anti-proliferativo y anti-angiogénico,
puede atribuirse al anticuerpo y cuánto a la terapia radiante, debe determinarse en un estudio comparativo. Se
encuentra en curso un estudio en biopsias de pacientes provenientes del ensayo Fase II, donde se compara el
efecto de la radioterapia más el AcM h-R3 vs. radioterapia y placebo.
96
Discusión General
A pesar de los avances recientes en las terapias oncoespecíficas, el cáncer representa un problema no
resuelto a escala mundial. El cáncer de cabeza y el cuello constituye alrededor del 4% de todos los
cánceres (GLOBOCAN 2000) y presenta una asociación notoria con el consumo prolongado de tabaco y
alcohol. El tratamiento de los tumores de cabeza y de cuello presenta considerables problemas funcionales
y estéticos, sobre todo relacionados con la pérdida de la función de la mandíbula y de la laringe. Durante
los últimos 20 años, la radioterapia ha constituido el tratamiento convencional para el cáncer localmente
avanzado (irresecable) de cabeza y cuello (Pignon JP y cols., 2000). Sin embargo, con esta terapia las
tasas de recurrencias loco-regionales son altas y la supervivencia es baja (Fu KK y cols., 2000). Como
consecuencia se han propuesto nuevas estrategias terapéuticas, consistentes principalmente en la
modificación de los esquemas clásicos de fraccionamiento de la terapia radiante, así como el uso
combinado de quimio-radioterapia (Brizel DM y cois., 1998; Chougule PB y cols., 1999; Adelstein DJ y
cols., 2003).
La aplicación concurrente de la quimioterapia muestra resultados favorables, con incremento del control
local de las neoplasias de cabeza y cuello y en la calidad de vida de los pacientes, pero ha tenido impacto
limitado en la sobrevida (Pignon JP y cols., 2000).
Los tumores más frecuentes de cabeza y cuello son los carcinomas epidermoides, lesiones que se
caracterizan por la sobre-expresión de EGFR (Bonner JA y cols., 2000).
Las propiedades proto-oncogénicas del EGFR se describieron desde principios de la década de los 80,
cuando el receptor fue clonado y se encontró que constituía el homólogo estructural del oncogen v-erbB
(Kris RM y cois., 1985). Estos estudios, además de la observación de que la sobre-expresión del receptor
junto a alguno de sus ligandos específicos permitía la estimulación autocrina de algunos tumores
epiteliales (Salomon DS y cols., 1995; Mendelsohn J y cols., 2000), condujeron a la hipótesis de que el
bloqueo de la unión ligando- receptor podía prevenir la activación del receptor y sus múltiples
consecuencias incluyendo la mitogénesis sobrevida y la producción de factores pro-angiogénicos. En la
97
actualidad existen evidencias de que la señalización asociada al EGFR puede ser eficazmente bloqueada
por anticuerpos neutralizantes del receptor o pequeñas moléculas inhibidoras de la transducción de señales
(Mendelsohn J y cols., 2000).
Este estudio se realizó con el objetivo de determinar si el AcM humanizado h-R3 podía actuar como un
antagonista del EGFR, produciendo un efecto antitumoral sin ocasionar efectos tóxicos severos. También
nos propusimos elucidar los potenciales mecanismos efectores de la actividad antitumoral y la aparición
de resistencia adquirida ante los tratamientos prolongados con el AcM.
El AcM h-R3 fue muy bien tolerado en 36 pacientes con tumores avanzados cuando se administró en dosis
única o a dosis repetidas en combinación con radioterapia. Las principales reacciones fueron clasificadas
como infusionales y no se constataron eventos adversos en piel ni reacciones alérgicas, que constituyen las
reacciones más frecuentes como resultado del uso de otros antagonistas del EGFR. Tampoco se
manifestaron signos de toxicidad hepática, que pudieran esperarse, considerando la alta expresión del
EGFR en los hepatocitos. La no aparición de reacciones alérgicas se atribuyó a la baja inmunogenicidad
de la molécula humanizada.
Las diferencias en el perfil de seguridad pudieran estar relacionadas con las propiedades
farmacodinámicas y farmacocinéticas de las diferentes drogas con actividad bloqueadora del EGFR. Para
cualquier agente anti-neoplásico, la mejor tasa o índice terapéutico se obtiene al lograrse una absorción y
retención máxima en el tumor aparejada de rápida eliminación en el tejido normal (Stroomer JW y cols.,
2000). Nuestros estudios de inmunogammagrafía de cuerpo entero evidencian que el porcentaje de dosis
absorbida por gramo de tejido del h-R3 fue significativamente más alto en las lesiones malignas que en
órganos normales, que también mostraron una eliminación del AcM más acelerada. No se dispone de
datos similares publicados en la literatura para otros fármacos anti-EGFR.
Tras la combinación de radioterapia y h-R3 a dosis por encima de 200 mg en pacientes con neoplasias
avanzadas de cabeza y cuello, se alcanzó un índice de respuestas completas y de sobrevida que se compara
muy favorablemente con las tasas históricas de respuesta y sobrevida para radioterapia sola (Fu KK y
98
cols., 2000) o para los esquemas combinados de quimio-radioterapia (Brizel DM y cols., 1998; Pignon JP
y cols., 2000). En experimentos preclínicos, el anticuerpo también evidenció un potente efecto citotóxico
en ratones transplantados con la línea tumoral A431, caracterizada por la sobre-expresión de EGFR.
Los estudios preclínicos y clínicos demostraron que la respuesta antitumoral puede estar mediada por
mecanismos anti-proliferativos y anti-angiogénicos. Se demostró que el h-R3 es capaz de inducir arresto
del ciclo celular en la Fase Gl/S.
Actualmente se conoce que algunos oncogenes son capaces de regular positivamente la producción de
factores pro-angiogénicos o de regular negativamente la síntesis de inhibidores de la angiogénesis,
promoviendo la neoformación de vasos sanguíneos (Rak J y cois., 2000; Lopez-Ocejo O y cols., 2000).
Uno de los factores pro-angiogénicos más relevantes para la formación y perfusión de los nuevos vasos es
el factor estimulante del crecimiento vascular (VEGF) (Viloria A y cois., 2003). Se ha reportado que
varios oncogenes como ras, src, myc y HER2 son capaces de estimular la producción de VEGF por la
célula tumoral (Kerbel RS y cols., 1998). Nuestros resultados sustentan la hipótesis de que los agentes
bloqueadores del EGFR y en particular el h-R3, exhiben una actividad anti- angiogénica mediada por la
supresión del VEGF. Los resultados in vivo corroboran esta teoría, ya que la regulación negativa del
VEGF estuvo aparejada de decrecimiento de la densidad de los vasos sanguíneos. Además de la reducción
en la vascularidad, los tumores tratados con h-R3 en los ratones xenotransplantados exhibieron un
aumento significativo en la apoptosis. La respuesta anti-angiogénica puede traer como consecuencia la
inducción de apoptosis como resultado de la hipoxia, la deprivación de nutrientes y el estrés metabólico
(Rak J y cols. 2002).
Los datos de inmunohistoquímica obtenidos en biopsias de pacientes con neoplasias de cabeza y cuello,
corroboran los datos de la preclínica ya que evidencian que tras la combinación del h-R3 y radioterapia,
operan los mecanismos anti-proliferativo y anti- angiogénico.
La aprobación de drogas que inhiben la transducción de señales tales como como el Herceptin, anticuerpo
99
que bloquea la señalización asociada a HER 2 y el Gleevec (ST1571), que inhibe específicamente la
quinasa asociada al oncogen bcr-abl, puso en evidencia la ausencia de información acerca de la aparición
de resistencia y sus posibles mecanismos (Shak S y cois., 1999; Stephenson J y cols., 2000).
Los resultados obtenidos tras el uso prolongado de anticuerpos anti-EGFR demuestran que sí puede
aparecer resistencia adquirida. Sin embargo, los hallazgos de este estudio son alentadores. En primer
lugar, la emergencia de las variantes resistentes fue un fenómeno de baja frecuencia, que no ocurrió en
todos los ratones tratados y que se produjo tras un largo tiempo de latencia. En segundo lugar, el único
blanco de los anticuerpos usados en el experimento en ratones es el EGFR expresado por las células
genéticamente inestables de la línea de carcinoma vulvar A431 xenotransplantada. En cambio, en la
clínica, los anticuerpos anti-EGFR podrían bloquear además el receptor que se expresa en las células
endoteliales normales de los vasos de neoformación (genéticamente estables), particularmente en los
tumores que sobre-expresan TGF alfa, factor de crecimiento que a su vez regula positivamente la
expresión de EGFR en las células endoteliales activadas (Shiurba R y cois., 1988; Bohling T y cols.,
1996). Como consecuencia, el uso de antagonistas del EGFR puede no solo bloquear indirectamente la
angiogénesis sino también directamente. En tercer lugar.
La aparición de resistencia puede diferirse tras la continuación del tratamiento en aquellos sujetos que no
hayan alcanzado regresión completa tras el primer ciclo de tratamiento o combinando el uso de los
bloqueadores de la señalización con quimioterapia o terapia radiante (Bruns CJ y cols., 2000).
Uno de los resultados más importantes de estos experimentos consiste en la no detección de alteraciones
en la expresión y activación del EGFR en las variantes resistentes, pero si de aumento en la producción de
VEGF. Este hallazgo puede tener un gran impacto en la clínica, a la hora de proponer terapias
complementarias a los inhibidores del EGFR o en el momento de imponer tratamientos ante la recurrencia
tumoral, que constituye el patrón más común de fracaso en las neoplasias de cabeza y cuello. Sin embargo,
como los mecanismos de aparición de resistencia pueden ser pleiotrópicos (Links M y cois., 1999), es
necesario continuar profundizando en esta línea de investigación.
100
En conclusión, nuestros datos experimentales confirman que el AcM h-R3 es una droga bien tolerada, que
produce una actividad antitumoral que resulta fundamentalmente de la inhibición de la transducción de
señales, que puede directa o indirectamente afectar la proliferación celular, la capacidad de inducción de
angiogénesis y la sobrevida. Nuestros estudios sugieren que las bases de la resistencia pueden tener algún
vínculo con la angiogénesis tumoral.
La determinación de predictores de respuesta que nos permitan identificar las poblaciones de pacientes a
incluir a los ensayos clínicos, así como la evaluación de nuevos esquemas de combinación del h-R3 con
otros agentes antineoplásicos, con drogas anti-angiogénicas o con otras moléculas inhibidoras de las
cascadas de señalización vinculadas con la transformación maliga se imponen como líneas futuras de la
investigación.
101
Conclusiones
1. El AcM humanizado h-R3 produce un efecto anti-tumoral tanto en ratones xenotransplantados con
tumores humanos como en pacientes portadores de tumores de cabeza y cuello, que sobre-
expresan el EGFR.
2. El AcM ejerce un efecto anti-angiogénico in vivo, como consecuencia de la inhibición de la
producción de VEGF por las células tumorales.
3. La aparición de resistencia en células tumorales humanas A431 al tratamiento prolongado con el
AcM hR3 se relaciona principalmente con la selección de sub- poblaciones con elevado potencial
angiogénico.
4. El AcM humanizado h-R3 ejerce un efecto citostàtico in vitro, deteniendo las células en la fase
GO del ciclo celular, mientras que produce un efecto citotóxico in vivo, debido a un incremento
de la apoptosis. La actividad pro-apoptótica in vivo pudiera estar relacionada con la inhibición de
la angiogénesis.
5. El AcM humanizado h-R3 es bien tolerado en pacientes de cáncer avanzado. A diferencia de otros
inhibidores del EGFR. el h-R3 no provoca reacciones alérgicas ni toxicidad en piel, lo que se
pudiera explicar por su acumulación preferencial en los tumores y su baja inmunogenicidad.
6. El AcM humanizado h-R3 muestra una farmacocinética no lineal. La dosis óptima biológica, que
se corresponde con la saturación del aclaramiento sistèmico, se alcanza a dosis por encima de 200
mg.
7. La administración de dosis de 200 y 400 mg del AcM humanizado h-R3 durante 6 semanas,
incrementó significativamente el índice de respuestas completas al tratamiento radiante y la
sobrevida de pacientes portadores de tumores avanzados de cabeza y cuello en comparación con
la respuesta histórica.
102
Recomendaciones
1. Ampliar la evaluación clínica del AcM humanizado h-R3 combinado con radioterapia mediante
ensayos clínicos controlados en pacientes portadores de tumores avanzados de cabeza y cuello, y otras
neoplasias caracterizadas por la sobre-expresión de EGFR.
2. Seleccionar otras variantes resistentes al AcM h-R3 en tumores con diferente expresión de EGFR y
caracterizar el fenotipo resistente.
3. Evaluar si los niveles de expresión de VEGF y de otros factores pro-angiogénicos se relacionan con
la resistencia intrínsica al tratamiento con el AcM humanizado h-R3 en biopsias de pacientes portadores
de tumores de cabeza y cuello.
4. Evaluar si existen diferencias en la inhibición de la cascada de señalización del EGFR en biopsias de
tumores de cabeza y cuello y piel normal, en pacientes tratados con el AcM humanizado h-R3 a la dosis
óptima biológica.
5. Evaluar el infiltrado de monocitos y células NK en biopsias de tumores con diferente expresión de
EGFR, en animales xenotransplantados tratados con ior egf/r3 y en pacientes tratados con el AcM h-
R3.
6. Evaluar la formación del complejo de ataque a la membrana (depósito de C5b-9) en biopsias de
tumores con diferente expresión de EGFR, en animales xenotransplantados tratados con ior egf/r3 y en
pacientes tratados con el AcM h-R3.
103
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Anexo 1
Congresos o eventos científicos donde se han presentado los resultados discutidos en esta tesis:
1. 10th AACR-NCI-EORTC Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Washington, EUA, 1999.
2. UICC Advanced Course on Cell Signaling and Cancer, Tammsvik, Suecia, 1999.
3. Evento Biotecnología 1999, CIGB. Habana, Cuba, 1999.
4. XIII Congresos Integrados Latinoamericanos de Cancerología. Habana, Cuba, 1999.
5. 11th NCI EORTC AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Amsterdam, Holanda, 2000.
6. 3er taller “Immunotherapy in the new century”, CIM. Habana. Cuba, 2000.
7. Evento Biotecnología 2001, CIGB, Habana, Cuba. 2001.
8. 13th NCI EORTC .AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Frankfurt. Alemania, 2002.
9. 6t0 Congreso Latinoamericano de Inmunología y 3er Congreso Cubano de Inmunología. Habana, Cuba, 2002.
10. 9no Congreso cubano de Oncología, 2003. Habana. Cuba
11. 2nd International Symposium on signal transduction modulators for cancer therapy, Amsterdam, Holanda, 2003
12. Evento Biotecnología 2003, CIGB. Habana, Cuba, 2003.