cèl lules mare i parkinson

Cèl·lules mare i Parkinson

Autor: Julián Bobis Camacho

2n Batxillerat, B

Departament de Ciències

Tutora: Rosa Díaz

INS Santa Eulàlia

L’Hospitalet, gener 2015

Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho

2

ÍNDEX

1. Introducció.....................................................................................................p.4

2. Recull documental

2.1. Cèl·lules mare...........................................................................................p.8

2.1.1. Definició de cèl·lula mare.................................................................p.8

2.1.2. Tipus de cèl·lules mare....................................................................p.8

2.1.2.1. Segons la potencialitat..........................................................p.8

2.1.2.1.1. Cèl·lules mare de pluripotència induïda.....................p.9

2.1.2.2. Segons l’origen....................................................................p.11

2.1.3. Descobriment i dècada dels 60......................................................p.11

2.1.4. Investigacions als 80 i 90...............................................................p.13

2.1.5. Segle XXI.......................................................................................p.13

2.1.5.1. Descobriment de les iPSC..................................................p.13

2.1.5.2. Investigacions posteriors al 2006........................................p.14

2.1.6. Medecina regenerativa..................................................................p.16

2.1.7. Legislació, ètica i controvèrsies.....................................................p.17

2.2. Malaltia del Parkinson.............................................................................p.19

2.2.1. Què és el Parkinson?.....................................................................p.19

2.2.2. Història del Parkinson....................................................................p.22

2.2.3. Causes...........................................................................................p.24

2.2.4. Tractaments...................................................................................p.25

2.2.4.1. Fàrmacs..............................................................................p.25

2.2.4.2. Tractaments no farmacològics............................................p.26

2.2.4.3. Altres tractaments...............................................................p.26

2.3. Malaltia del Parkinson i cèl·lules mare....................................................p.28

Objectius e hipòtesis del treball pràctic: Cèl·lules mare i Parkinson..................p. 29


3

3. Treball de camp

3.1. Estada al Centre Medicina Regenerativa de Barcelona (CMRB)............p.31

3.1.1. Conceptes teòrics adquirits............................................................p.32

3.1.1.1. Unitat de cultius. El cultiu in vitro de cèl·lules mare............p.32

3.1.1.2. Unitat de histologia. Caracterització de cèl·lules mare.......p.36

3.1.1.3. Unitat de bioimatge. Microscòpia i tincions.........................p.38

3.1.2. Pràctiques realitzades en la Unitat de Cultius...............................p.39

3.1.2.1. Canvi de medi de cultiu en colònies de iPSC......................p.40

3.1.2.2. Diferenciació de iPSC a NPs...............................................p.43

3.1.3. Pràctiques de la Unitat de Histologia i Bioimatge..........................p.46

3.1.3.1. Immunodetecció de diferenciació d’un teratoma.................p.47

3.1.3.2. Observació de iPSC en un microscopi confocal.................p.55

3.1.3.3. Observació d’EBS en un microscopi confocal.....................p.62

3.2. Entrevistes...............................................................................................p.66

3.2.1. El Parkinson des de la recerca i la situació econòmica de la

investigació: doctora Cristina Malagelada, directora de grup a la

UB.....................................................................................................p.66

3.2.2. El Parkinson segons els afectats: president de l’Associació de

malalts de Parkinson de L’Hospitalet................................................p.72

4. Conclusions.................................................................................................p.78

5. Fonts.............................................................................................................p.82


4

1. Introducció

El Parkinson és la segona malaltia degenerativa en nombre de malalts. Està

present en la societat i afecta a persones del nostre voltant.

Sabem de gent que la pateix o, potser, l’hem sentida dir en alguna notícia o

article, però mai s’aprofundeix suficientment en la malaltia com per conèixer-la i

entendre-la completament.

Per una altra banda, segur que hem sentit parlar de les cèl·lules mare. Aquestes

sí que són protagonistes de molts reportatges, notícies i documentals. Tot i això,

els passa el mateix que a la malaltia del Parkinson: hi ha molt desconeixement.

Semblen eines miraculoses que guareixen qualsevol dolença i que es poden

aplicar a tort i a dret.

D’aquesta certa ignorància en els dos temes, en tenim la culpa una mica tots. Per

aquest motiu vaig escollir aquest tema: les cèl·lules mare i el Parkinson.

El Parkinson perquè és una malaltia que afecta bastanta gent, que la societat

generalment no la coneix, i perquè cada cop més s’avança en la seva

investigació. No tinc cap parent o persona propera que la pateixi però em

semblava interessant pels símptomes que manifesta (notables si més no) i la

incertesa que envolta les seves causes i mecanismes.

Vaig escollir les cèl·lules mare com a tema perquè havia escoltat moltes coses

sobre elles. Tenia una idea molt etèria i volia definir-les en la meva ment.

Aquestes tenen moltes expectatives en diferents camps de la biologia, doncs per

què no investigar-les?

Després de pensar aquests dos temes, vaig arribar a la conclusió d’unir-los:

aplicar les cèl·lules mare al Parkinson.

Els dos temes eren molt interessants, tenia ganes de saber-ne més i també volia

veure si certament hi ha una possible aplicació de les cèl·lules mare al Parkinson

o només era una idea sense futur.

A més, degut al meu interès en la investigació, en les biociències i els nous

avenços que es realitzen en aquest àmbit, vaig establir com a temes una malaltia

(més propera a la societat i palpable) i un element relativament nou en la recerca

biològica (cèl·lules mare).


5

Una vegada escollit el tema vaig plantejar-me una sèrie de preguntes per

desenvolupar el meu Treball de Recerca, en forma d’objectiu.

L’objectiu principal del meu Treball de Recerca és determinar si la medecina

regenerativa, ús de cèl·lules mare, majoritàriament, és una solució per al

Parkinson i esbrinar si la reprogramació (tornar a ser cèl·lules mare) de

cèl·lules d’un malalt de Parkinson pot generar neurones sanes, és a dir,

utilitzant cèl·lules mare i modificant els gens que provoquen el Parkinson amb la

teràpia gènica.

Amb aquest objectiu es vol trobar si aquesta és una possible solució a la

enfermetat del Parkinson i si és viable el seu ús com a tractament en el futur.

Les preguntes que hem vaig fer a l’inici del Treball van ser:

La teràpia cel·lular millora la qualitat de vida de pacients de

Parkinson?

És l’aplicació de la teràpia cel·lular segura per a persones?

Quines són les eines o tècniques que s’utilitzen amb cèl·lules mare?

És Catalunya un lloc on s’investiga amb cèl·lules mare?

Per contestar aquestes preguntes vaig començar a recopilar d’informació sobre

cèl·lules mare i Parkinson:

1) Consulta de pàgines web, generals del tipus enciclopèdiques i especialitzades

(centres de recerca, associacions...), quasi sempre en anglès ja que aquesta és la

llengua majoritària en la investigació i la publicació.

2) Lectura de llibres sobre cèl·lules mare, com per exemple Òrgans a la carta.

Cèl·lules mare, clonatge terapèutic i medicina regenerativa, d’en doctor David

Bueno. La lectura d’aquest llibre em va introduir de ple en les cèl·lules mare i

m’ajudà a tenir una idea més que general de que són i les seves propietats i

avantatges.

3) Recollida de informació de xerrades, lectures i investigacions penjades en la

xarxa amb molta informació valuosa. Vaig cercar les investigacions més important

sobre cèl·lules mare i Parkinson, i les vaig ordenar segons els anys en què es van

realitzar.


6

Les hipòtesis del meu treball, doncs són:

1. La teràpia cel·lular ajuda a millorar la qualitat de vida de les persones

que pateixen Parkinson.

2. Pot ser que la teràpia cel·lular sigui segura per a aplicar a persones

sense efectes secundaris.

3. És difícil tractar amb cèl·lules mare i les seves tècniques.

4. Pot ser que Catalunya, en el conjunt del món, sigui un focus important

d’investigació sobre cèl·lules mare.

5. És necessari continuar la investigació sobre cèl·lules mare i malalties

neurodegeneratives.

Per realitzar el meu treball de camp, vaig cercar i aconseguir per mi mateix entrar

en contacte amb un centre de recerca de Barcelona, el CMRB (Centre de

Medicina Regenerativa de Barcelona) que em va oferir la possibilitat de realitzar

una estada d’uns dies en ell per conèixer millor un laboratori, les cèl·lules mare i

tot el món que les envolta.

Gran part del meu treball de camp correspon a aquestes pràctiques, de les quals

vaig extreure molta informació i m’han ajudat extraordinàriament a respondre a les

preguntes inicials.

Una vegada que vaig recollir tota la informació i tot just després de fer les

pràctiques, vaig començar a redactar la part pràctica perquè tenia molt present

encara en la meva ment els processos que havia fet al centre de recerca.

També, he realitzat dues entrevistes per conèixer els diferents punts de vista

sobre el Parkinson i l’ús de les cèl·lules mare en la malaltia. Les dues entrevistes

van ser efectuades després de l’estiu.

Una de les entrevistes estava dirigida a un pacient de Parkinson i alhora president

de l’Associació de Malalts de Parkinson de L’Hospitalet, per completar el meu

Treball. A més vaig emprendre la feina d’organitzar tota la informació i traspassar-

la.

Finalment, vaig aconseguir una entrevista a una investigadora, la doctora Cristina

Malagelada, que treballa al departament de farmacologia de la Universitat de

Barcelona, i he redactat les conclusions com a resum de la meva investigació i

Treball.


7

Un dels problemes que m’he trobat és la gran quantitat d’informació que hi ha (a

internet i provinent de revistes especialitzades en anglès). Vaig haver de

seleccionar les recerques més importants i resumir-les, per després condensar-les

amb la intenció d’utilitzar-les com a font d’informació.

També, el redactat ha estat una mica dificultós perquè és la primera vegada que

he completat un treball d’aquestes dimensions. La gran quantitat de paraules

noves i concretes el dificultava una mica més.

D’altra banda i en primer lloc, voldria agrair a la meva tutora del Treball de

Recerca Sra. Rosa Díaz per la seva ajuda i orientar-me en la llarga i dificultosa

redacció del Treball. Moltes gràcies per la paciència al corregir, ja que aquest

treball és dens i especialitzat, i per les idees que m’ha donat per millorar-lo.

Voldria donar gràcies a tot al CMRB per oferir-me la possibilitat de fer unes

pràctiques de laboratori en les instal·lacions. No ho oblidaré mai de veritat, m’han

enriquit com a persona i han elevat el meu Treball. Va ser la primera vegada que

visitava un laboratori complert i professional, i la primera vegada que realitzava

pràctiques complexes amb passos complicats, però no deixava mai de ser

emocionant. Vull destacar particularment a la Sra. Mercè Martí, ja que és a qui li

dec l’oportunitat d’haver-hi assistit, i era la meva referència en el CMRB i

m’orientava: moltíssimes gràcies. També vull remarcar la resta de professionals

del Core Facility del CMRB que no només em guiaven a través dels processos i

pràctiques de cada secció, sinó que també em donaven suport i m’explicaven

qualsevol dubte que tingués. Ells són Lola Mulero, Bernd Kuebler, Cristina

Morera, Cristina Pardo i Laia Miquel.

També gràcies a la doctora Cristina Malagelada i al seu equip del departament de

farmacologia de la UB per l’entrevista que em van permetre fer-los i per la visita a

les instal·lacions. Em van rebre cordialment i van respondre a totes les preguntes

que tenia, fins i tot van donar-me més informació en forma de papers i anècdotes.

Cal esmentar també a l’Associació de Malalts de Parkinson de L’Hospitalet, i en

especial al seu president, per deixar que m’apropés i conegués malalts de

Parkinson, a més de realitzar una entrevista i estar present en una sessió de

fisioteràpia.


8

2. Recull documental

2.1 Cèl·lules mare

2.1.1. Definició de cèl·lula mare

Les cèl·lules mare són cèl·lules que tenen la

capacitat d’autorenovar-se, és a dir, de fer

“còpies” d’ella mateixa per generar més cèl·lules

com ella; i poden donar lloc a tipus cel·lulars més

especialitzats (diferenciació), com cèl·lules del cor

o de l’intestí.

Aquestes dues característiques les fan úniques i

les distingeixen de la resta de cèl·lules i, degut a elles, tenen una importància vital

en un organisme ja que renoven les cèl·lules mortes dels teixits o òrgans, fent

possible, així, la regeneració del teixit i el creixement d’aquest.

Hi ha teixits que en tenen en menor mesura, cosa que dificulta la seva

regeneració, com el teixit neuronal, o altres en tenen en quantitats altes, com la

medul·la òssia, on es produeixen les cèl·lules sanguínies.

Des del seu descobriment a la dècada dels 60, han estat subjecte de

investigacions per les seves úniques capacitats i per les seves possibles

aplicacions en biomedicina.

2.1.2 Tipus de cèl·lules mare

Les cèl·lules mare s’acostumen a classificar segons d’on provenen o segons el

grau que tenen de generar cèl·lules diferenciades (potencialitat).

2.1.2.1. Segons la potencialitat

Trobem:

Totipotents: tenen la capacitat d’originar tant l’organisme en si com les

estructures extraembrionàries durant la gestació. La cèl·lula totipotent per

excel·lència és el zigot, la primera cèl·lula de l’organisme després de la unió de

l’espermatozoide i l’òvul. També són totipotents les espores.

Cèl·lules mare humanes


9

Pluripotents: generen tots el tipus cel·lulars de l’individu adult o de l’embrió, però

no les estructures foranies a aquest, com la placenta. Són pluripotents les

cèl·lules embrionàries, ESC, capaces de diferenciar-se en les tres capes

germinals o tipus cel·lulars (endoderm, ectoderm i mesoderm). També ho són les

cèl·lules de pluripotència induïda, iPSC, un tipus especial de cèl·lula mare.

Multipotents: tenen potencial de produir un quants tipus cel·lulars propers en el

seu desenvolupament, però no l’organisme sencer com abans. Es restringeixen

(també es diu que estan compromeses) a cèl·lules d’un teixit o òrgan específic.

L’exemple més utilitzat són les cèl·lules hematopoiètiques, que originen les

cèl·lules sanguínies.

Oligopotents: amb capacitat de donar lloc a un determinat tipus de cèl·lules, més

restringit que en l’anterior cas. Ex: cèl·lules mare vasculars (vasos sanguinis).

Unipotents: d’elles només es deriven un únic tipus cel·lular. Ex: cèl·lules mare

espermatogèniques. Estarien quasi bé especialitzades perquè estan molt

restringides, però mantenen les característiques de les cèl·lules mare.

2.1.2.1.1. Cèl·lules mare de pluripotència induïda

Aquestes cèl·lules, també anomenades iPSC, són cèl·lules produïdes en un

laboratori que tenen característiques similars a les cèl·lules mare embrionàries.

Són cèl·lules pluripotents produïdes a partir d’una cèl·lula especialitzada, que es

converteix en cèl·lula mare a través de la reprogramació fins a arribar a un estadi

pluripotent.

Tenen una forma molt similar a les cèl·lules embrionàries, tenen la mateixa

velocitat de divisió, els gens que transcriuen són semblants i s’ha comprovat que

es diferencien als mateixos tipus cel·lulars.

L’avantatge d’aquestes és que es poden utilitzar com a model d’una malaltia, ja

que han estat generades a partir de cèl·lules que contenen la malaltia o tenen els

gens, cosa que permet l’estudi in vitro de la malaltia. A més, al ser cèl·lules d’una

persona, no provocarien rebuig immunològic en aquesta si s’utilitzessin com a

teràpia cel·lular perquè són cèl·lules del cos, pròpies.


10

També, amb el seu ús, s’estalvia la utilització de cèl·lules d’un embrió amb totes

les controvèrsies ètiques que comporta, i permeten realitzar teràpia gènica, és a

dir, modificar genèticament la cèl·lula per corregir l’alteració i implantar-la de nou

al pacient.

Van ser obtingudes per primera vegada al 2006 per l’equip de Shinya Yamanaka

a partir de fibroblasts de ratolins i al 2007 amb cèl·lules humanes, fet pel qual va

rebre el Nobel de Medicina al 2012. Les van aconseguir gràcies a introduir i

sobreexpressar uns factors de transcripció, induint així a l’expressió de gens de

pluripotència, ja que bloquegen els factors propis de la cèl·lula.

Per generar iPSC, primer es fa una biòpsia per aconseguir cèl·lules de la pell,

fibroblasts, o queratinòcits, del cabell, i es posen en cultiu. S’empren, normalment

no sempre, aquests dos tipus de cèl·lules perquè la seva obtenció és molt fàcil.

Després es reprogramen les cèl·lules activant els gens de pluripotència.

Normalment aquests són l’Oct3, el Sox2, el Klf4 i el c-Myc. Per introduir els factors

de transcripció s’utilitzen virus, que infecten la cèl·lula inserint-hi els factors, amb

mRNA (ARN missatger), proteïnes, molècules o a través de les condicions del

medi, que contindria els factors que ens interessen.

En el cas dels virus, es donen dues possibilitats: si el virus es queda dins la

cèl·lula, manera integrativa (lentivirus i adenovirus), o la forma no integrativa, no

es queda dins.

Les cèl·lules reprogramades amb la primera forma no poden ser utilitzades per a

la teràpia cel·lular perquè podrien causar tumors, infeccions i la enfermetat en el

pacient. En la forma no integrativa, on s’utilitza el virus Sendai, un gen exogen

produeix la proteïna, fent feedback al gen endogen. El gen exogen es degrada en

la divisió cel·lular quan el gen passa al citoplasma ja que és detectat com a no

propi.

Després de cada reprogramació cal realitzar una caracterització a les cèl·lules per

assegurar les seves propietats pluripotents amb una prova de pluripotència.

Uns dels principals problemes de la producció de iPSC i de la reprogramació és

que, sovint, originen cèl·lules cancerígenes que després es divideixen sense

control perquè alguns dels factors que s’introdueixen són oncògens, i es

produeixen mutacions en el material genètic, fets que dificulten el seu ús en

persones.


11

2.1.2.2. Segons l’origen

Segons aquesta classificació trobem dos tipus de cèl·lules mare: adultes i

embrionàries.

Les cèl·lules mare adultes o cèl·lules mare somàtiques són cèl·lules mare

presents en un organisme adult, ja desenvolupat. Aquestes són les responsables

de la regeneració periòdica dels nostres òrgans i teixits.

Poden donar lloc a pocs tipus cel·lulars, són multipotents, normalment del teixit

en el qual es troben i s’utilitzen àmpliament contra malalties, com la leucèmia, on

es fan trasplantaments de cèl·lules mare sanguínies de la medul·la òssia.

Les cèl·lules embrionàries, ESC, són cèl·lules d’embrions procedents de

fecundacions in vitro sobrants. Són les cèl·lules pluripotents per excel·lència

perquè es diferencien en les tres capes germinals i en tots els tipus cel·lulars de

l’organisme adult i s’empren per estudiar el desenvolupament embrionari,

malalties in vitro i per a farmacologia.

Es formen al blastocist, un conjunt de cèl·lules que es forma a partir del tercer o

cinquè dia de desenvolupament. Aquest està format pel trofoblast, que recobreix

les ESC i donarà lloc a la placenta, i la ICM (inner cell mass), massa cel·lular

interna, que són les ESC.

El seu ús es troba envoltat de moltes controvèrsies, ja que en resulten de la

destrucció de l’embrió, un potencial ésser humà.

2.1.3. Descobriment i dècada dels 60

Ja abans del descobriment de les cèl·lules mare, s’havien fet experiments

traspassant nuclis de cèl·lules somàtiques a citoplasmes de cèl·lules

primerenques, com l’experiment d’en John Gurdon que, al 1958, va clonar una

granota utilitzant el nucli d’una de les seves cèl·lules somàtiques diferenciades.

També s’havien realitzat investigacions sobre les cèl·lules tumorals, però sense

saber els motius de la seva producció.


12

Però el vertader punt d’inflexió va ser al 1963, quan Ernest McCulloch i James Till

van descobrir les cèl·lules mare, concretament van aïllar cèl·lules

hematopoiètiques, i van confirmar la seva capacitat de generar altres cèl·lules

mare. Pensaven que aquestes cèl·lules eren les que mantenien el nombre de

cèl·lules especialitzades i les causants de la seva producció.

Provaren la capacitat de dividir-se en models animals (ratolins) i obtingueren

masses cel·lulars que van confirmar les propietats de divisió, especialització i

autorrenovació. Van anomenar-les “cèl·lules formadores de colònies”.

Van injectar “cèl·lules formadores de colònies” a la melsa de ratolins i després

extirparen les masses formades. Trobaren que aquestes masses tenien

naturalesa heterogènia i que s’havien format més “cèl·lules formadores”.

Van observar que al originar-se una colònia a partir d’una “cèl·lula formadora”, al

mateix temps que es formava la colònia, també apareixia una petita quantitat de

“cèl·lules formadores” i un gran nombre de cèl·lules especialitzades. Aquestes

cèl·lules especialitzades perdien la capacitat de produir altres cèl·lules quan

aprofundien en el procés d’especialització.

Al finalitzar la seva investigació, van concloure que les “cèl·lules formadores de

colònies” es dividien o en dues cèl·lules iguals que ella o en una ·cèl·lula

formadora” i en un especialitzada; i que aquest procés es produïa de manera

aleatòria.

Durant la dècada dels 60 es continuà investigant la capacitat d’aquestes cèl·lules

capaces de formar colònies i cèl·lules amb les mateixes propietats que ella.

Sobretot s’utilitzaven ratolins i la melsa d’aquests per realitzar les investigacions,

injectant-hi cèl·lules mare hematopoiètiques i exposant l’animal a radiacions per

modificar el material genètic de les cèl·lules i disminuir la capacitat de divisió de

les pròpies cèl·lules del ratolí.

A les cèl·lules formadores de colònies, van batejar-les com cèl·lules mare, per

la capacitat de “donar vida” a noves cèl·lules.


13

2.1.4. Investigacions als 80 i 90

Durant les dècades de 1980 i 1990, els investigadors ja tenien un coneixement

relativament profund de les propietats de les cèl·lules mare.

Descobriren que aquestes podien formar teratomes en les condicions adequades i

que, per tant, les cèl·lules embrionàries de les quals es partia tenen la capacitat

de formar tots els teixits de l’organisme adult (cèl·lula pluripotent). A més, van

observar que les cèl·lules mare expressaven uns factors determinats, similars a

aquells que expressen les cèl·lules tumorals.

Aquests avenços van ser possibles gràcies a la millora de les tècniques de cultiu

in vitro, però també per l’augment en el coneixement de les cèl·lules i els

processos que les originen.

Aprofundiren en el desenvolupament embrionari amb l’ús de ESC i derivant

cèl·lules mare en cèl·lules especialitzades, com en l’origen del teixit nerviós i la

generació de neurones del cervell.

En aquestes dècades, es va començar a pensar en les seves possibles

aplicacions en malalties que suposen la pèrdua de cèl·lules o la pèrdua de

funcionalitat d’aquestes, a través de reemplaçar aquestes cèl·lules mortes o

danyades per cèl·lules “sanes”.

2.1.5. Segle XXI

2.1.5.1. Descobriment de les iPSC

Ja abans de la primera vegada que es van generar iPSC, s’havien aconseguit

cèl·lules amb un estat similar a les ESC mitjançant la transferència de nuclis de

cèl·lules somàtiques a òvuls (Gurdon als 60 o la clonació de l’ovella Dolly al

1997) o fusionant-les amb ESC.

Però el 2006 va ser la primera vegada que es van generar cèl·lules pluripotents a

partir de cèl·lules especialitzades amb la reprogramació (una mena de “reset” de

la cèl·lula). Aquesta fita va ser duta a terme per Shinya Yamanaka i Kazutoshi

Takahashi de la universitat de Kyoto al Japó.


14

Partint de fibroblasts de ratolí, arribaren a cèl·lules de naturalesa pluripotent

inserint factors propis de ESC i cèl·lules tumorals tals com l’Oct3/4 i el Sox2, el

funcionament dels quals no coneixien amb exactitud.

Van utilitzar retrovirus per introduir aquests factors però obtingueren un nombre

petit de cèl·lules autènticament iPSC, pluripotents, per tant, l’efectivitat del mètode

no era alta.

Aquest mètode es va millorar en investigacions posteriors, sobretot amb el

millorament de les tècniques in vitro per mantenir les cèl·lules pluripotents i es va

aprofundir en el funcionament dels factors, sobretot es van deixar d’utilitzar factors

oncògens.

Aquest mateix equip va realitzar la reprogramació en fibroblasts humans amb

vistes d’utilitzar les iPSC contra malalties.

Va representar un punt d’inflexió en les investigacions de cèl·lules mare perquè

van obrir noves vies de recerca, i les seves possibles aplicacions eren i són

nombroses, sobretot amb vistes de l’ús en persones.

2.1.5.2. Investigacions posteriors al 2006

Després del descobriment de les iPSC, el món de les investigacions amb cèl·lules

mare va viure una petita revolució. Es van començar a utilitzar en gran quantitat

perquè permetien veure el desenvolupament d’una cèl·lula malalta, entre moltes

altres raons.

També es perfeccionà la tècnica d’obtenir iPSC amb mètodes més eficients i es

van produir iPSC de cèl·lules que encara no s’havien reprogramat, com els

queratinòcits, realitzat al 2008 amb participació del CMRB (Centre de Medicina

Regenerativa de Barcelona).

En aquest mètode, partien de queratinòcits humans recollits de la pell i van obtenir

iPSC de manera més eficient i ràpida que amb l’ús de fibroblasts (més facilitat per

reprogramar-se).

Van introduir els mateixos quatre factors que havia utilitzat al 2006 Yamanaka

amb un retrovirus i van provar la seva eficàcia amb una caracterització: les

cèl·lules obtingudes tenien les mateixes característiques que una ESC, o si més

no, similars.


15

Un dels reptes per emprar les iPSC en pacients era corregir els gens mutats o

alterats per aconseguir “sanar” la cèl·lula. Aquesta fita, es va aconseguir al 2009

amb la reprogramació de cèl·lules d’un malalt d’anèmia de Falconi (que afecta a

les cèl·lules de la sang).

A partir de fibroblasts i queratinòcits d’un pacient van arribar fins a un estat

pluripotent en forma de iPSC. Van corregir la mutació en l’ADN mitjançant un

vector viral que introduïa el gen correcte a la cèl·lula i substituïa el defectuós i,

seguidament, van derivar les iPSC obtingudes a cèl·lules mare hematopoiètiques,

que podien formar cèl·lules sanguínies funcionals i correctes, sense la presència

de la malaltia.

El problema d’aquesta investigació és que els factors introduïts pel virus poden

portar a la formació de tumors perquè tenen caràcter oncogen, a més que

afavoreixen la mutació del genoma ja que no es controla acuradament la posició

del nou gen.

Una de les novetats del nou segle és l’estudi d’animals que tenen la capacitat de

regenerar teixits i òrgans sencers (model animal). Un d’aquests animals únics és

el peix zebra, capaç de regenerar una part del cor després d’una amputació.

Aquests models animals, encara que no són mamífers, permeten estudiar com es

produeix la regeneració d’un òrgan, fet clau per esbrinar com funcionen les

cèl·lules mare tissulars i com es podrien utilitzar en el propi ésser humà en el

futur, ja que nosaltres tenim els gens per la regeneració però no s’expressen.

Entre altres avenços, s’ha aconseguit reprogramar cèl·lules especialitzades a un

estat totipotent però in vivo, sobretot en ratolins. S’introdueixen els factors

necessaris per la reprogramació a un teixit concret del ratolí i s’observa la seva

reprogramació. El mètode, tot i ser innovador perquè assegura que es poden

formar cèl·lules mare en l’individu sense emprar tècniques ex vivo, necessita

millores ja que és font de teratomes en el ratolí i és poc eficient perquè genera

poques cèl·lules mare per teixit.

Recentment, s’ha començat a utilitzar les iPSC com a teràpia contra malalties. Es

reprogramen cèl·lules del malalt (normalment queratinòcits i fibroblasts) corregint

l’alteració a l’ADN i es fan especialitzar les iPSC obtingudes al tipus de cèl·lula

desitjada, que s’implantarà de nou en el pacient, aquest cop sense mutació.


16

Amb aquest pas es comencen a emprar cèl·lules pluripotents, més concretament

les iPSC, per a fins clínics en humans.

A inicis del 2014, es va començar a dissenyar proves clíniques en humans al Japó

amb iPSC. En aquest cas es vol utilitzar cèl·lules sanes per substituir-ne a la

màcula de l’ull que pateix una degeneració, normalment a causa de l’edat.

Així, amb el trasplantament de cèl·lules sanes a la retina, els pacients

aconseguirien una visió del detalls normals. Però aquesta investigació es troba

encara en la fase preclínica i falta el beneplàcit del govern del Japó per començar

les proves en humans.

2.1.6. Medicina regenerativa

La medicina regenerativa és una ciència biomèdica que té per objectiu reparar o

reemplaçar teixits o òrgans que han perdut la seva funció habitual, per causa

d’una malaltia, envelliment, una lesió...

No només investiga possibles tractaments, sinó que també estudia l’origen i

desenvolupament del deteriorament de la cèl·lula, teixit o òrgan per poder arribar

més fàcilment a una solució.

Actualment, l’ús de cèl·lules mare ha obert grans expectatives en aquest camp,

però el principal problema que s’oposa és el rebuig immunològic: al ser cèl·lules

d’una altre organisme, el sistema immunològic les detecta com antígens i les

ataca (no compatibilitat).

Per solucionar-lo, s’empren iPSC, que al ser cèl·lules del pacient, no causen

rebuig.

Moltes de les tècniques de la medicina regenerativa no es poden aplicar encara

als éssers humans perquè és necessari que passin un fase preclínica en animals

per provar la seva validesa. Aquest pas pot durar molt de temps fins que les

autoritats sanitàries aprovin el pas a la fase clínica.

Una branca de la medicina regenerativa és la teràpia cel·lular: ús de cèl·lules, tant

mares com especialitzades, per tractar una malaltia. Un exemple molt habitual de

teràpia cel·lular són els trasplantaments de cèl·lules del moll de l’os, de còrnia de

l’ull i pell. Totes aquestes utilitzen o bé cèl·lules mare adultes o ESC, per tant, no

hi ha teràpies amb iPSC, encara que estan en desenvolupament.


17

Cal no confondre la teràpia cel·lular amb la teràpia gènica. Aquesta és l’alteració

del genoma d’una cèl·lula o organisme per corregir una mutació, alterar l’ADN o

aconseguir una substància interessant des del punt de vista biològic. Normalment,

la teràpia cel·lular es combina amb teràpia gènica per emmenar una alteració que

causa una malaltia (sobretot amb l’ús de vectors que introdueixen el nou material

genètic i crear organismes transgènics).

Hi ha, actualment, molts assajos clínics amb vistes d’aplicar teràpia cel·lular a

humans. La majoria, però, estan en vies de desenvolupament perquè moltes

d’aquestes teràpies produeixen rebuig, tumors (per la reprogramació cel·lular) o

una no correcta correcció del genoma.

La teràpia amb iPSC obre moltes esperances en el tractament de malalties

neurodegeneratives, com el Parkinson, càncer, i, sobretot, malalties hereditàries o

causades per mutacions, encara que també s’estan fent investigacions per tractar-

ne malalties infeccioses.

A pesar dels grans avenços que es produeixen en cèl·lules mare i medicina

regenerativa, queda temps per a la seva aplicació total i molts interrogants per

resoldre.

2.1.7. Legislació, ètica i controvèrsies

En aquests moments, hi ha un seguit de lleis estatals i catalanes que regulen la

investigació i ús de cèl·lules mare. La Unió Europea no té una legislació comuna

sinó que cada país té

autonomia per legislar.

Hi ha països bastant

permissius com

Espanya, el Regne

Unit, Suècia, Bèlgica o

Austràlia; i altres que

prohibeixen l’ús i

derivació de ESC com

Alemanya, Itàlia,

Dinamarca o Polònia.


18

A l’Estat espanyol, s’han publicat un seguit de lleis estatals recollides al BOE o

reials decrets que les regulen. Les més importants són:

- Reial Decret del 2011: regula l’autorització i funcionament dels biobancs per a la

investigació biomèdica amb mostres d’origen humà. Es crea el Registro Nacional

de Biobancos. Permet el desenvolupament de línies cel·lulars al país i el seu

emmagatzematge o ús en investigacions amb fins teòrics o terapèutics.

- Llei 14 del 2007: sobre la investigació biomèdica. Reglamenta la creació

d’investigacions amb cèl·lules mare i embrions.

- Llei 45/2003: llei que permet l’ús d’embrions per a investigació, amb prèvia

informació dels progenitors. Aquesta llei va ser modificada al 2006 (Ley 14/2006,

sobre les tècniques de reproducció assistida).

A Catalunya, la Generalitat té competències en matèria d’investigació, per la qual

també hi ha una llei específica que regula les investigacions, mitjançant els

comitès d’ètica d’investigació clínica (Decret 406/2006). Per tant, en el moment

d’iniciar una investigació o fase preclínica i clínica, cal posar-se en contacte amb

un comitè de bioètica.

Però a part de les lleis i decrets dels governs, entra en escena l’ètica de la

societat, majoritàriament amb influència de l’Església.

Des del punt de vista religiós cristià, l’ús d’ESC és moralment incorrecte perquè

constitueix la destrucció d’un ésser humà (ja es considera ésser humà des del

moment de gestació); però no s’oposen a l’ús de cèl·lules mare adultes o del

cordo umbilical com a tractament.

Des del punt de vista jueu, la investigació amb ESC està permesa i encoratjada.

Israel, per exemple, permet les investigacions amb ESC.

A banda de les idees religioses, l’ètica pròpia de la societat és important. Sobretot

influeix en el pensament si la persona considera que l’embrió del qual s’extreuen

les ESC és un ésser humà amb tots els drets d’un adult o només un de potencial.

La clonació també té controvèrsies, perquè es pot considerar que s’utilitza l’humà

com a objecte i per fer clonació reproductiva (fet prohibit a Espanya).


19

2.2. Malaltia del Parkinson

2.2.1. Què és el Parkinson?

El Parkinson és una malaltia neurodegenerativa, és a dir, una malaltia que afecta

a les neurones i que causa en ells una pèrdua progressiva de la seva funció o la

mort.

Afecta les neurones del cervell, concretament de la substància negra, a l’interior

d’aquest, provocant la disminució del neurotransmissor dopamina. Aquest

neurotransmissor és essencial en el moviment del cos, per això, uns dels

símptomes més coneguts del Parkinson és la tremolor i la lentitud, encara que es

manifesten altres símptomes perquè hi ha altres neurotransmissors afectats.

Tant homes com dones la pateixen i, normalment, apareix a partir dels 55 anys,

tot i que hi ha casos de Parkinson abans dels 40.

És la segona malaltia neurodegenerativa en nombre de malalts després de

d’Alzheimer. Es calcula que hi ha uns 150000 malalts de Parkinson a Espanya, i

uns 6,3 milions a tot el món.

El Parkinson s’expressa de manera diferent en cada persona, per això els

tractaments que es fan són personalitzats i segons els transcurs de la malaltia

perquè no hi ha cap factor que ens predigui el seu curs.

Els símptomes del Parkinson són molt nombrosos, però no tots els pacients

desenvolupen tots i sempre amb graus diferents. Els símptomes motors són:

Tremolor: és un dels signes més evidents del Parkinson. És una tremolor de

repòs, en el moment que no es fa cap feina o moviment. Normalment, comença

en una de les extremitats i s’estén a la resta del cos quan avança la malaltia.

Bradicinèsia: és la lentitud alhora de fer moviments. Els malalts de Parkinson

necessiten més temps per fer un gest i és més ampli. Es pot veure reflectit en

l’escriptura, que es fa més petita. També causa el caminar típic parkinsonià: una

marxa lenta, amb passos curts i sense balancejar els braços.

Rigidesa: és una de les conseqüència però al mateix temps causa de la resta. Els

músculs estan tensos tota l’estona. Això produeix l’amplitud dels moviments,

dificultat per fer-los, dolors i menys expressivitat facial.

Inestabilitat en la posició: es manifesta sobretot quan la malaltia ha avançat. Els

malalts tenen una postura encorbada, el que fa més propens el desequilibri.


20

Els símptomes no motors són:

Trastorns del son: és molt freqüent l’insomni i les alteracions del cicle vigília-son.

Pensament i memòria: poden presentar lentitud en el pensament i canvis en la

memòria i la concentració. El deteriorament cognitiu afecta a les àrees del cervell

que controlen les funcions executives i atenció, i no tant la memòria com

l’Alzheimer.

Psiquiatria: es poden manifestar alteracions de l’estat d’ànim, com depressió,

al·lucinacions, no control sobre els impulsos o realitzar una feina una i altra

vegada, entre d’altres.

A vegades, també es pot presentar en el pacient: estrenyiment, sudoració, pèrdua

d’olfacte, fatiga i problemes en la parla i la deglució.

Cal insistir en el fet que tots aquests símptomes no s’expressen ni a la vegada ni

en la mateixa persona. El Parkinson es manifesta de manera diferent i amb

símptomes diferents, apareixent-ne d’uns i no d’altres, i en graus diferents.

El Parkinson es diagnostica de manera clínica, en base a la història clínica i una

exploració neurològica i física, i segons la presència o no de símptomes (han

d’aparèixer tres dels quatre símptomes motors); ja que no existeixen proves

específiques per al Parkinson i que el confirmin al 100%.

Un neuròleg, normalment és ell qui fa la diagnosi, pot demanar proves com

anàlisi, TACs i proves neurològiques, que descarten altres malalties del cervell i

confirmen el Parkinson.

La diagnosi es veu complicada per altres afeccions com la malaltia per cossos de

Lewy, l’atrofia multisistemàtica o només l’envelliment, que també causen

parkinsonismes però no són Parkinson.

Algunes empreses ofereixen la possibilitat de seqüenciar els gens que s’han

descobert relacionats amb el Parkinson però no determinen el desenvolupament

del Parkinson en el futur. La proba més habitual és sotmetre al pacient duran 30

dies a Levodopa (el medicament bàsic per al Parkinson) i, si respon

afirmativament, se l’hi diagnostica.


21

Patologia

La característica cel·lular principal del Parkinson és la mort de neurones en la

pars compacta, una àrea de la substància negra (interior del cervell) on es troben

les neurones dopaminèrgiques (neurones que utilitzen la dopamina com a

neurotransmissor principal).

L’àrea cerebral afectada majoritàriament pel Parkinson és el gangli basal.

El Parkinson es caracteritza per la pèrdua de neuromelanina, un pigment present

a les neurones del gangli basal, i la presència de cossos de Lewy a l’interior de les

neurones que no han mort.

La mort de neurones, a més, va acompanyada de la mort d’astròcits i l’activació

de micròglies, un tipus de cèl·lula glials.

La dopamina, neurotransmissor molt reduït al Parkinson, intervé en el moviment

de forma que té un efecte inhibitori, és a dir, permet o impedeix la realització de

certs moviments segons la voluntat de la persona. Com que en la malaltia del

Parkinson els seus nivells disminueixen, augmenten els moviments involuntaris,

disminueix el control sobre ells i es redueix el moviment voluntari global o costa

més esforç.

La disminució de la dopamina està causada per aquesta mort de les neurones de

la substància negra. A més, la mort de neurones afecta totes les connexions del

gangli basal amb la resta del cervell: el circuit motor, l’oculomotor, l’associatiu, el

límbic i l’orbito frontal.

Aquest fet explica els símptomes del Parkinson, ja que són àrees implicades per

exemple en el moviment, aprenentatge i atenció.

La mort de les neurones es pensa que pot estar relacionada amb l’aparició dels

cossos de Lewy.

Els cossos de Lewy són una acumulació anormal de la proteïna alfa-sinucleïna,

que al ser insoluble i no degradar-se de forma normal, s’acumula dins la neurona.

Aquestes acumulacions, primer, es formen en altres àrees del cervell com la que

regula l’olfacte, per després estendre’s al gangli basal. Però encara no s’ha provat

la relació directa entre el Parkinson, la mort de neurones que succeeix i l’aparició

dels cossos de Lewy.


22

Es pensa que la mort neuronal pot ser conseqüència de un incorrecte

funcionament de les proteases (enzims que degraden les proteïnes innecessàries)

i els lisosomes, i una reducció de l’activitat dels mitocondris, causant així

l’acumulació de substàncies perjudicials per la neurona i disminuint l’energia per

fer les funcions vitals.

També s’ha observat que s’hi manifesta estrès oxidatiu, és a dir, es produeix un

desequilibri en la naturalesa reductora de la cèl·lula. Així, es formen peròxids i

radicals lliures que danyen molts components cel·lulars imprescindibles, com

l’ADN, proteïnes i lípids, que la cèl·lula (en aquest cas neurona) no pot reparar

perquè es produeixen amb molta velocitat. Finalment, la neurona pot morir per

apoptosi o per necrosi, en els casos més greus.

El nucli de les neurones, al estar estressat, desenvolupa formes no usuals i la

membrana nuclear es deforma. Això pot causar problemes en la síntesi de

proteïnes, al material genètic i al pas de substàncies per la membrana. Encara es

desconeixen les raons d’aquesta deformació (mutacions, factors externs...).

Cal esmentar de nou que els mecanismes que causen la mort de les neurones

dopaminèrgiques i l’aparició dels cossos de Lewy no es coneixen i tot això són

possibles explicacions.

2.2.2. Història del Parkinson

Abans de la descripció detallada de James Parkinson al 1817, la malaltia del

Parkinson ja era coneguda. En trobem referències a la Bíblia, a papirs egipcis i a

un tractat mèdic indi de l’any 1000 aC. Galè de Pèrgam ja va distingir entre el

tremor voluntari i el de repòs causat pel Parkinson.

No és fins el segle XVII que es reprèn el Parkinson, amb comentaris sobre els

efectes del Parkinson (sobretot el tremolor en les mans) però mai descrivint-lo

totalment o buscant les causes.

Al 1817, el metge anglès James L. Parkinson va descriure la malaltia del

Parkinson de manera acurada i amb casos particulars en el seu document An

essay on the shacking palsy.


23

Hi va explicar el tremor característica en el repòs, la postura corbada al caminar,

la pèrdua de força muscular i la progressió del pacient al llarg de la malaltia en sis

casos concrets. Pensava que aquesta tremolor estava causada per danys en la

medul·la espinal cervical.

Al segle XIX també va destacar Jean-Martin Charcot, metge els estudis del qual

van diferenciar entre rigidesa, feblesa muscular i la lentitud al fer el moviments

(bradicinèsia), i va canviar el nom de la malaltia per Parkinson en honor de James

Parkinson.

Al 1912, Frederic Lewy va descobrir unes acumulacions patològiques en cervells

de pacients afectats, que un temps després serien anomenades cossos de Lewy i

al 1998 es descobrirà que estan compostos majoritàriament de alfa-sinucleïna,

una proteïna.

A la dècada dels 30, es va trobar que la substància negra del cervell era la part

més afectada en aquest, i a la dècada dels 50, gràcies en part al treball d’Arvid

Carlsson (que va guanyar el Nobel per això), es van descriure els canvis

bioquímics en el Parkinson i en la dopamina.

Al 1995, un grup nord-americà d’investigació va reportar que la primera mutació

que causava Parkinson al gen PARK1 i que afectava a la proteïna alfa-sinucleïna.

Al llarg de la primera dècada del segle XXI es van descriure les diferents

mutacions relacionades amb l’aparició dels cossos de Lewy i la pèrdua neuronal i,

per tant, relacionades amb el desenvolupament del Parkinson. També es

coneixeren més detalls sobre la reducció de les connexions sinàptiques entre

neurones i la neurodegeneració a causa d’agregats minúsculs d’alfa-sinucleïna.

Últimament, s’han realitzat proves clíniques per aplicar la teràpia gènica a malalts

de Parkinson. Tot i ser eficaces en models animals i in vitro, en el moment de

realitzar l’assaig clínic no mostraven ser eficients i no aportaven una millora.

Aquest és un problema que s’ha de sobrepassar si es vol aplicar teràpies

correctives a pacients de Parkinson.


24

2.2.3. Causes

Poc es sap sobre les causes de la malaltia del Parkinson, com ja que he indicat

en l’apartat anterior. Tot i això, múltiples fets han estat descoberts, aportant llum

en el problema.

Es creu que alguns factors genètics (mutacions i gens), l’envelliment, l’estrès

oxidatiu i l’ambient intervenen en el Parkinson. Els pacients no presenten una

causa clara que la produeixi, només en alguns es manifesten o s’hi troben els

gens que la generen en molts casos. És un grau molt petit, però, únicament un 5-

10% dels malalts.

Els gens que es pensa que intervenen en el Parkinson són: SNCA, que codifica

per la alfa-sinucleïna (que forma els cossos de Lewy ja explicats), PKRN, que

codifica per la parkina, i el PARK8, per el LRRK2 o dardarina, un enzim present al

citoplasma i la membrana mitocondrial externa principalment de neurones i que

constitueix la principal causa genètica del Parkinson.

La duplicació o triplicació del locus on es situa el gen SNCA o la modificació d’un

sol nucleòtid poden donar lloc a Parkinson de tipus hereditari. Ha estat trobat en

persones portadores que no han patit Parkinson, per la qual cosa, fa pensar que

la seva relació és incompleta i que no depèn de l’edat. La mutació en el LRRK2

és la major causa de Parkinson genètic i esporàdic (5% i 3%, respectivament).

Les seves modificacions poden causar disfunció del mitocondri i aparició de

Parkinson en el portador.

L’envelliment també és un element a tenir en compte. És un clar factor de risc en

el Parkinson perquè, juntament amb l’augment de l’edat, augmenta la prevalença

de Parkinson.

Els factors ambientals i toxines, com metalls, pesticides i altres elements al medi

poden afavorir el desenvolupament de la malaltia. Hi ha aminoàcids, trobat en

peixos, aigua potable i platges o rius contaminats, i pesticides que podrien ser

factors que predisposen l’aparició, causant una errònia agregació proteica, el que

desembocaria en la formació dels cossos de Lewy, o mutacions en el genoma.

L’origen del Parkinson és encara incert però tot indica cap al camí de la interacció

entre causes genètiques i factors de l’entorn. Aquesta relació complicaria el

diagnosi del Parkinson per la quantitat de proves necessàries.


25

2.2.4. Tractaments

El tractament del Parkinson hauria de ser un tractament neuroprotector i que

evités la pèrdua de neurones millorant la progressió de la malaltia. Fins el

moment, però, cap tractament ha demostrat un efecte neuroprotector, sinó que la

majoria actuen per contrarestar els símptomes.

Les teràpies neuroprotectores no es desenvolupen a causa de la baixa

comprensió del funcionament del Parkinson, la falta de models animals, que no

reprodueixen exactament la malaltia però sí ajuden a entendre el seu

funcionament, i marcadors biològics acurats, i mals resultats en els assajos

clínics, al ser focs sensibles i específics.

2.2.4.1. Fàrmacs

El principal medicament que es subministra als pacients és la levodopa, un fàrmac

que actua contra la rigidesa, el tremor i la lentitud dels moviments. Quan arriba a

les neurones dopaminèrgiques, es transforma en dopamina per a utilitzar-se com

a neurotransmissor.

Els seus efectes secundaris són pocs, per això és un medicament bastant efectiu,

sobretot en les etapes inicials de la malaltia. Quan aquesta ja està més avançada,

la levodopa és contraproductiva: augmenten els moviments involuntaris i els

períodes on-off ( moments on els símptomes milloren però seguidament es passa

a una etapa de símptomes més intensos).Per evitar aquestes fluctuacions la dosi

de levodopa és la més baixa ideal per reduir els símptomes motors.

A vegades es subministra amb la infusió intestinal contínua. És una bomba

d’infusió que introdueix un gel format per levodopa i carbidopa (una altre fàrmac

utilitzat en el Parkinson) directament a l’intestí. Substitueix la medicació oral i

redueix els períodes on-off, i no té límit d’edat per a implantar-se.

Altres fàrmacs importants són:

La amantadina: un antigripal que disminueix els símptomes motors per a etapes

inicials.

Els agonistes dopaminèrgics: fàrmacs que provoquen reaccions similars a les de

la dopamina (substituents de la levodopa) i tenen una vida útil més llarga que

aquesta, tot i que són menys eficaços.


26

Els inhibidors de la MAO-B: incrementen els nivells de dopamina reduint la seva

metabolització, tenen bons resultats i disminueixen la quantitat de levodopa

necessària, però tenen més efectes secundaris i són menys efectius.

2.2.4.2. Tractaments no farmacològics

Principalment són intervencions quirúrgiques, però pocs pacients de Parkinson

són candidats per a aquestes intervencions degut a la seva complicació i els

riscos que comporten.

La estimulació cranial profunda és la implantació d’uns elèctrodes al cervell per

donar descàrregues elèctriques i modular els símptomes motors del Parkinson.

Aquests elèctrodes estan connectats a un neuroestimulador situat al tòrax i reben

l’estimulació amb extensions sota la pell fins el cap. Normalment, s’utilitza en

casos amb períodes prolongats d’off i si són pacients menors de 70 anys sense

contraindicacions.

A banda de tractaments quirúrgics hi ha un seguit de teràpies que estan en vies

de desenvolupament: són el trasplantament neuronal, tractaments

neuroprotectors i teràpia gènica.

També s’investiguen tractaments neuroprotector que protegeixen les neurones

dopaminèrgiques de la degeneració i mort a través de fàrmacs o molècules. En

aquest moments no hi ha cap substància neuroprotectora que actuï contra el

Parkinson.

Finalment, la teràpia gènica té com a objectiu corregir les mutacions relacionades

amb el desenvolupament del Parkinson, introduint els gens correctes per

modificar-ne l’expressió. Utilitza virus no integratius per inserir el gen en les

neurones i produir una enzima que protegeix el cervell de la degeneració i dels

símptomes. Es troba sota investigació en aquest moments.

2.2.4.3. Altres tractaments

Els malalts de Parkinson també realitzen teràpies rehabilitadores per alleujar els

símptomes i les seves conseqüències. No curen la malaltia, però milloren les

condicions de vida dels pacients, que aconsegueixen més autonomia.


27

La fisioteràpia juntament amb exercici físic diari milloren la mobilitat i l’equilibri,

dues facultats afectades en el Parkinson. Poden retardar els símptomes motors i

altres com les alteracions del somni.

La logoteràpia té com a objectiu millorar la parla i la deglució dels pacients, ja que

totes dues es veuen afectades per la rigidesa muscular. Sol estar composta

d’exercicis respiratoris, dels músculs facials, sobre la veu i la laringe.

Entre altres teràpies trobem: l’estimulació cognitiva, la musicoteràpia (estimular el

moviment, la flexibilitat i la psicologia a través de la música), la teràpia

ocupacionals, risoteràpia...


28

2.3. Malaltia del Parkinson i cèl·lules mare

La pèrdua de neurones a les substància negra del cervell és una de les

característiques de la malaltia del Parkinson. Aquesta neurodegeneració provoca

els símptomes motors i no motors de la malaltia, tot i que se’n desconeixen

encara els motius i perquè progressa al llarg del Parkinson.

Una de les línies d’investigació per tractar aquesta pèrdua neuronal és la

substitució amb neurones dopaminèrgiques foranies.

El trasplantament neuronal ja es va iniciar a la dècada dels 80. Els primers

assajos van mostrar que tenien un benefici en la producció de dopamina, però

estudis posteriors van demostrar que les noves neurones produïen massa

dopamina, cosa que conduïa a contraccions involuntàries dels músculs o no

tenien efectes a llarg termini.

Actualment, s’està dirigint la investigació cap a les cèl·lules mare. Aquestes, per la

capacitat de generar tots el tipus cel·lulars i dividir-se, podrien ser una solució per

a la mort neuronal.

Algunes proves, consistents en trasplantar cèl·lules mare diferenciades a cèl·lules

dopaminèrgiques en cervells de ratolins i primats, han mostrat que les cèl·lules

trasplantades sobrevivien i milloraven els símptomes sense efectes secundaris.

Malgrat aquesta esperançadora descoberta, l’ús de cèl·lules mare presenta

diferents problemàtiques.

D’una banda, existeix el risc de desenvolupar teratomes per una divisió

descontrolada, el tractament del quan es faria molt difícil per la posició de la

substància negra en el cervell (massa interior per fer cirurgia).

D’altra banda, obtenir cèl·lules dopaminèrgiques a partir de cèl·lules mare és un

camí llarg i costós, i que podrien provocar rebuig immunitari. Per aquests motius,

es treballa amb iPSC que evitarien el rebuig del pacient al ser cèl·lules de la

persona, i tenen totes les característiques de les ESC.

A més, hi ha substàncies tòxiques, que formen els cossos de Lewy i els agregats

de proteïnes, que són emeses per les neurones a l’espai intercel·lular i són

captades per les altres neurones, per tant, passen d’una neurona a l’altra.


29

Així, a causa d’aquesta transmissió de molècules tòxiques, la implantació de

noves neurones es veuria afectada i no tindria efectes en la malaltia.

Per implantar cèl·lules mare diferenciades que milloressin la progressió de la

malaltia, es fa necessari conèixer els mecanismes que desencadenen la malaltia

per tal de corregir-los i donar lloc a una neurona sana i funcional. Cal saber les

mutacions o les raons genètiques que la provoquen i així corregir-les amb la

teràpia gènica.

Les cèl·lules mare s’utilitzen, també, com a model del Parkinson, sobretot les

iPSC perquè contenen els gens o “errors” que causen la malaltia i permeten

l’estudi in vitro de les proteïnes que intervenen visualitzant-hi la progressió.

Objectius e hipòtesis del treball pràctic de recerca: Cèl·lules mare i

Parkinson

Arribats a aquest punt, una vegada desenvolupada la part teòrica del meu Treball

de Recerca amb els coneixements necessaris sobre cèl·lules mare i la malaltia de

Parkinson (exposats als apartats anteriors), començaré el meu treball pràctic de

recerca Cèl·lules mare i Parkinson.

Els interrogants que em plantejo són: - Les cèl·lules mare, amb les seves

característiques, podrien ser una solució per a la mort neuronal?; - El

trasplantament de cèl·lules dopaminèrgiques en cervells permetria millorar els

símptomes del Parkinson?; - Coneixem els mecanismes que desencadenen la

malaltia per tal de corregir-los i donar lloc a una neurona sana i funcional, a través

de la teràpia gènica o la cel·lular?

A partir d’aquests interrogants, vull arribar a l’objectiu principal que és determinar

si la medecina regenerativa, ús de cèl·lules mare, majoritàriament, és una

solució per al Parkinson i esbrinar si la reprogramació (tornar a ser cèl·lules

mare) de cèl·lules d’un malalt de Parkinson pot generar neurones sanes, és a

dir, utilitzant cèl·lules mare i modificant els gens que provoquen el Parkinson amb

la teràpia gènica.


30

Les hipòtesis del meu treball, doncs, són:

1. La teràpia cel·lular ajuda a millorar la qualitat de vida de les persones

que pateixen Parkinson.

2. Pot ser que la teràpia cel·lular sigui segura per a aplicar a persones

sense efectes secundaris.

3. És difícil tractar amb cèl·lules mare i les seves tècniques.

4. Pot ser que Catalunya, en el conjunt del món, sigui un focus important

d’investigació sobre cèl·lules mare.

5. És necessari continuar la investigació sobre cèl·lules mare i malalties

neurodegeneratives.

Per trobar les respostes m’he plantejat com a treball de camp l’estada al CMRB i

la realització de dues entrevistes. Amb l’estada espero trobar la resposta a les

hipòtesis relacionades amb les cèl·lules mare, és a dir, la número 1 (“la teràpia

cel·lular ajuda a millorar la qualitat de vida dels pacients de Parkinson), la número

2 (“pot ser que la teràpia cel·lular sigui segura per aplicar a persones”), la número

3 (“és difícil tractar amb cèl·lules mare”) i la número 5 ( és necessari continuar la

investigació sobre cèl·lules mare”). Amb les dues entrevistes vull respondre a la

primera, la quarta (“pot ser que Catalunya sigui un focus important d’investigació) i

la cinquena hipòtesi.

A continuació detallaré les experiències.

L’autor d’aquest Treball realitzant uns talls d’una mostra amb volum en el CMRB


31

3. Treball de camp

3.1 Estada al CMRB

Entre els dies 8 i 11 de juliol del 2014 des de les 9 del matí a les 6 de la tarda,

vaig realitzar una estada al CMRB (Centre de Medicina Regenerativa de

Barcelona), juntament només amb altra estudiant de Batxillerat de Barcelona.

Aquestes pràctiques les vaig buscar per tal de donar resposta a algunes de les

hipòtesis que he plantejat, però també pel meu interès en les cèl·lules mare, per

tenir una experiència pràctica sobre el tema i conèixer el món de la investigació.

Les vaig aconseguir arran de la meva visita a les portes obertes del PRRB dins de

la celebració de les 48h Open House Barcelona. Vaig contactar amb la

responsable de comunicació del Parc de Recerca i ella em va posar en contacte

amb el CMRB, els quals em van oferir la possibilitat de realitzar uns dies de

pràctiques i d’observació al centre.

El CMRB és un centre de recerca dedicat a la investigació amb cèl·lules mare

humanes i models animals capaços de regenerar òrgans, tal i com el peix zebra.

Es va fundar al 2004 per tal d’aprofundir en el coneixement del desenvolupament

embrionari i les aplicacions de les cèl·lules mare a la medicina regenerativa. El

CMRB es troba dins del PRBB (Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona), al

costat de l’Hospital del Mar, i es divideix en Centre d’Investigació, Banc de Línies

Cel·lulars i Plataforma Tècnica (Core Facility).

Durant la meva estada al CMRB vaig conèixer el centre i vaig poder veure de

primera mà la feina dels investigadors. Concretament, vaig efectuar l’estada al

Core Facility, una plataforma del CMRB que dóna serveis a la resta

d’investigadors del centre. Està formada per les unitats de ratolins, peixos, cultius

cel·lulars, histologia, microscòpia òptica, microscòpia electrònica, citometria i

biologia molecular.

En el transcurs de la setmana, em van atendre la directora del Core Facility, Sra.

Mercè Martí, i els responsables i tècnics especialitzats de cada unitat: Bernd

Kuebler i Laia Miquel, a cultius; Cristina Morera, Lola Mulero i Cristina Pardo, a

histologia i bioimatge.


32

L’estada va consistir en fer diferents procediments i protocols específics

d’aquestes unitats, relacionats amb el manteniment, la diferenciació i la

caracterització de les cèl·lules mare.

En cada unitat, el responsable explicava el funcionament del departament i els

principals serveis que ofereixen al CMRB i al PRBB, a més d’una explicació de la

pràctica a realitzar en el departament en qüestió.

Ara a continuació recolliré tant l’aprenentatge teòric com les pràctiques

realitzades, les fotografies de les quals les vaig prendre jo mateix.

3.1.1 Conceptes teòrics adquirits

Durant la meva estada al PRBB vaig adquirir una sèrie de nocions relacionades

amb les pràctiques que anava realitzant que ajuden a poder entendre aquests

procediments i a realitzar-los correctament.

És un recull de coneixements que serveixen com a introducció a les pràctiques i

possibiliten el seu correcte anàlisi posterior.

3.1.1.1. Unitat de cultius. El cultiu in vitro de cèl·lules mare

En aquest apartat s’exposen els conceptes relacionats amb el cultiu ex vivo de

cèl·lules mare, és a dir, fora del seu medi natural en un organisme.

Introducció al concepte de cultiu cel·lular

Un cultiu cel·lular és un medi on es produeix el creixement d’unes cèl·lules sota

unes condicions determinades però fora del seu ambient natural, normalment en

un laboratori.

L’objectiu d’un cultiu cel·lular és imitar les condicions normals de temperatura,

pressió, pH... del medi habitual de la cèl·lula en qüestió i substituir els sistemes

del medi natural per processos i substàncies artificials.

Cultiu de cèl·lules mare

El cultiu de cèl·lules mare no difereix molt d’un cultiu de cèl·lules ja diferenciades

o d’altres organismes. Però hi ha una sèrie de diferències com les tècniques de

suport i les seves condicions que cal esmentar.


33

En el cultiu d’una colònia de cèl·lules mare, cal tenir en compte la temperatura,

l’alimentació, el suport i el material del contenidor en que es troben, entre d’altres

variables.

En les sales de cultiu del CMRB, les cèl·lules mare es troben en unes condicions

molt controlades ja que aquestes cèl·lules són molt delicades i es poden fer malbé

(contaminar, trencar o morir) o diferenciar-se espontàniament.

Tal i com vaig veure, cada cabina on treballa el personal de cultius està formada

per: una placa de metacrilat vertical, que impedeix que la persona respiri dins

l’espai de treball, una superfície horitzontal de metall, que s’ha de netejar cada

cop que s’utilitza, i una llum ultraviolada que destrueix els possibles

microorganismes que encara queden a la taula o als aparells. A més tota persona

que entri a la sala de cultius ha de dur bata i guants, i rentar-se amb alcohol els

guants i tot allò que vagi a tocar, ja que el risc de contaminar el cultiu és elevat (jo

mateix vaig haver de fer-ho cada vegada que entrava).

Les cèl·lules mare es mantenen en cultiu sobre pous o plaques de Petri, en

incubadors tancats amb una temperatura constant de 37º C i un percentatge de

CO2 del 5%. La pressió dels laboratoris de cultius és especial: l’aire surt de dins

cap a fora per evitar que partícules de l’exterior o microorganismes entrin a la sala

i contaminin els cultius.

Un cultiu de cèl·lules de qualssevol tipus sempre s’ha de tractar amb les màximes

condicions d’esterilitat per evitar qualssevol contaminació biològica.

Suport i manteniment d’un cultiu de cèl·lules mare

Per multiplicar una colònia de cèl·lules es necessita un medi de cultiu, un líquid o

gel que doni el suport i les substàncies necessàries per a que la mostra creixi. En

el cas de les cèl·lules mare, aquest suport pot ser altres cèl·lules (cèl·lules feeder)

o un líquid anomenat matrigel. El suport s’escolleix depenent de les necessitats de

la mostra i dels resultats que es volen obtenir.

Les cèl·lules feeder són fibroblasts (cèl·lules epitelials) que proporcionen suport a

les cèl·lules mare. Les feeder es troben sobre la superfície de la placa de Petri o

d’un pou, i aconsegueixen que la colònia de cèl·lules mare creixi ja que la fixen i

l’alimenten a través de les substàncies que desprenen (proteïnes, glúcids,

lípids,etc).


34

Al medi s’afegeix un factor anomenat FGF (Fibroblast Growth Factor): una

substància que manté anul·lada la capacitat d’especialitzar-se en les cèl·lules

mare i manté el seu creixement, proliferació, supervivència, migració i

diferenciació controlada. Gràcies a aquest factor les cèl·lules mare es poden

nodrir de les substàncies que produeixen els fibroblasts sense que, pel contacte,

es diferenciïn.

Les feeder poden ser humanes, HEF (human embryonic fibroblats), o de ratolins,

MEF (mouse embryonic fibroblats).

El matrigel és una matriu proteica formada per proteïnes i altres biomolècules,

pròpies de la matriu extracel·lular, que serveix com suport a les cèl·lules mare. En

aquest cas, es necessita incorporar un medi amb els nutrients i factors provinents

de les cèl·lules feeder per fer créixer les cèl·lules mare. Al CMRB fabriquen el seu

propi medi, no el compren de fora. Aquest s’anomena conditioned medium i es

fabrica a partir de les substàncies que desprenen les feeder. Així cada dia es

recull el medi de les feeder i s’afegeix al cultiu en matrigel.

Per a què les cèl·lules mare puguin créixer i dividir-se cal que el medi on es

troben, és a dir, el líquid que les envolta, contingui sals minerals, glúcids com a

font d’energia, lípids, aminoàcids, vitamines i proteïnes.

Tant el matrigel com les cèl·lules feeder s’han de renovar periòdicament. En el

cas del matrigel, perquè les substàncies del medi s’esgoten o perquè el matrigel

es degrada. En les cèl·lules feeder, perquè aquestes es degraden contaminant,

així, la colònia de cèl·lules mare. Cada dos dies, aproximadament, vaig veure com

es canviava el medi de cultiu.

En el cas de les feeder, es realitza de manera mecànica, és a dir, agafar petites

quantitats de la colònia amb una microagulla i posar-les en altre cultiu amb nou

medi. Aquest procediment per cèl·lules feeder el vaig realitzar jo mateix com a

pràctica en el transcurs del primer dia.

A més, les colònies s’han de canviar de medi per l’augment en la quantitat de

cèl·lules mare a la mostra, ja que un nombre massa elevat pot induir per contacte

a la diferenciació.


35

En aquest cas cal dividir la colònia en dos o més parts (mai deixar cèl·lules

individuals perquè és més complicat que es reprodueixi) i traspassar-les a un nou

contenidor amb un suport nou. Aquest canvi de pou s’anomena passaging i es

produeix cada setmana, més o menys.

En aquest procés de passar les colònies a una nova placa s’utilitzen dos

metodologies: mecànica o enzimàtica. Amb el mètode enzimàtic s’utilitzen

enzims per tallar les connexions entre cèl·lules mare i poder dividir així la colònia.

Aquest mètode és més agressiu que la manera mecànica. La forma mecànica té

el mateix procediment que el mètode mecànic en les feeder.

Cultiu de iPSC

El cultiu de les iPSC no té moltes diferències amb el cultiu general d’una cèl·lula

mare, però té un seguit de característiques pròpies.

Les iPSC es poden mantindre en cultiu sobre feeders o sobre matrigel amb

conditioned medium.

Tot medi de cultiu, ja sigui de iPSC, ESC o altres cèl·lules ha de contenir els

nutrients per a que la colònia creixi o es mantingui viva. Normalment, aquest medi

de cultiu conté sals minerals, lípids com a font d’energia, aminoàcids, vitamines i

proteïnes.

En el cas d’un cultiu amb feeder, les substàncies indispensables per a les cèl·lules

mare les aporten aquestes, les feeders, tot i que és necessari afegir altres

substàncies com penicil·lina, per evitar agents biològics, aminoàcids no

essencials, glúcids i, molt sovint, Dulbecco’s Modified Medium, que conté una

barreja de nutrients.

També, amb freqüència, el medi de cultiu es complementa amb un sèrum

compost per albúmines i factors de creixement o inhibidors de creixement, FGF

depenen del nostre interès. Abans s’utilitzava l’anomenat sèrum fetal boví, FBS,

però des del 2004 s’utilitza més el knock out serum replacement (KSR), perquè

presenta menys complicacions i problemes com contaminacions o diferenciacions

espontànies que el FBS.


36

És molt important la presència del FGF perquè les iPSC tenen una gran tendència

a diferenciar-se espontàniament. Per això és important posar inhibidors de

creixement, no només per controlar la seva divisió sinó també la seva

especialització a cèl·lules adultes.

Aquest medi de cultiu es canvia cada dos dies a través de traspassar les colònies

a un altre pou, sempre amb compte de no contaminar la mostra o danyar-la.

Els cultius de iPSC, com la resta de cultius de cèl·lules mare es mantenen en

incubadors a temperatura constant i condicions controlades.

També es controla el percentatge de confluència de les cèl·lules: quan arriben a

una confluència del 80%, s’ha de dividir la colònia en dos o més grups de cèl·lules

i es traspassen a pous o plaques de Petri diferents.

3.1.1.2. Unitat de histologia. Caracterització de cèl·lules mare

Les cèl·lules mare tenen un seguit de característiques que les fan úniques entre la

resta de cèl·lules. Per a assegurar que una cèl·lula és mare i, per tant, que té

aquestes característiques (capacitat de diferenciació, autorrenovació...) cal fer un

seguit de proves que les defineixin i en confirmin el manteniment al llarg del

temps. Aquest seguit de proves s’anomena caracterització

La caracterització d’una cèl·lula mare consta de diversos procediments:

Proves de pluripotència: procediments que, a través de substàncies

presents únicament a les cèl·lules mare, confirmen la seva naturalesa. Hi

ha dos tipus:

- Fosfatasa alcalina: enzima que es troba de manera molt abundant a la

membrana cel·lular de les cèl·lules mare. Per tant, a través de la detecció

d’aquest enzim es pot assegurar la presència de cèl·lules mare.

- Immunocitoquímica de colònies pluripotents: es confirma la presència

d’unes proteïnes específiques gràcies a l’acció d’uns anticossos que les

indiquen, a través de fluorescència.

Proves de diferenciació: mesuren la capacitat de les cèl·lules per

diferenciar-se en altres tipus cel·lular. Es classifiquen segons el lloc on es

produeixen:


37

- Ex vivo o EBs: consisteix en deixar que les cèl·lules proliferin i es

divideixin en una placa o pous fins a formar els anomenats EBs (embryonic

bodies), caracteritzats per contenir les tres capes germinals en ells

mateixos. Així es demostra que les cèl·lules de les quals provenen eren

mare i que podien diferenciar-se correctament en tots els tipus cel·lulars.

- In vivo o teratoma: és molt semblant a l’anterior però en comptes de

realitzar-se en plaques de vidre, es produeix en un organisme al qual se li

han introduït les cèl·lules a estudiar. Si aquestes són pluripotents

desenvoluparan un teratoma amb les tres capes germinals.

Tant ex vivo com in vivo s’ha de fer després una immunodetecció per comprovar

que s’han obtingut les tres capes germinals.

Immunodetecció de pluripotència

L’objectiu d’aquesta prova és determinar si les cèl·lules són pluripotents.

Per fer aquesta prova, s’utilitzen anticossos que s’adhereixen a proteïnes

específiques i, amb fluorescència, permeten visualitzar la seva presència.

Per indicar la presència de les proteïnes s’utilitzen dos tipus d’anticossos: primaris

i secundaris, els quals van conjugats amb fluorocrom per, quan s’uneixin als

anticossos primaris, marquin la seva presència en el microscopi gràcies a la

fluorescència i, per tant, determinar que s’hi troba la proteïna en qüestió.

Els anticossos provenen d’espècies animals a les quals s’han injectat les

proteïnes humanes que volem trobar. El sistema immunitari de l’animal produeix

anticossos contra aquesta proteïna. Així, es recullen aquests anticossos

específics i s’empren en la immunodetecció. Els anticossos primaris estan diluïts

en un sèrum de l’espècie animal de la qual són els anticossos secundaris, per tal

de bloquejar els llocs inespecífics on es podrien adherir els secundaris.

Els anticossos primaris provenen d’espècies animals, a les quals s’han injectat les

proteïnes humanes que volem trobar. El sistema immunitari de l’animal crea

anticossos contra aquesta proteïna, que es recullen i s’utilitzen per a la

immunodetecció.

Aquesta prova es realitza en cèl·lules aïllades, ESC o iPSC.


38

Caracterització de diferenciació d’un teratoma

Aquesta prova de caracterització consisteix en injectar cèl·lules que es vol

estudiar en un ratolí. Es deixen proliferar i formen un teratoma.

Un teratoma és un tipus de tumor que conté diversos teixits i tipus cel·lulars propis

de les tres capes germinals. Desenvolupa tipus cel·lulars diferents d’aquell en que

es troba envoltat.

Per això, s’utilitza un teratoma per demostrar la capacitat de diferenciació d’una

cèl·lula: permet observar els tipus cel·lulars que es desenvolupen, el procés i

assegurar que les cèl·lules embrionàries o iPSC tenen una correcta capacitat de

diferenciació.

El ratolí al qual se li injecten les cèl·lules està immunodeprimit, és a dir, que té

carències en el sistema immunitari. Gràcies a aquest fet, les defenses del ratolí no

atacaran el teratoma ni el destruiran.

Passades de 6 a 12 setmanes, s’extirpa el teratoma de l’individu i s’analitza per

veure-hi els resultats. Normalment, es fa una immunodetecció. En el cas dels

teratomes, com les mostres són grans, més que en mostres de iPSC, cal posar la

mostra en parafina i després es talla al micròtom, un aparell que produeix làmines

molt fines d’una mostra amb volum. A partir d’aquí es realitza la immunodetecció.

3.1.1.3. Unitat de bioimatge. Microscòpia i tincions

El microscopi confocal és un microscopi que

permet obtenir construccions tridimensionals

de les mostres. Això és molt útil per a

mostres amb volum, com EBs.

Està compost de dues parts: microscopi

òptic, actua com un microscopi òptic normal i

s’utilitza per enfocar el punt de la mostra que es vol estudiar i prendre la

fotografia, i de microscopi de fluorescència, capta les diferents fluorescències que

pot tenir una mostra i observar els anticossos d’una immunodetecció.

El microscopi de fluorescència es serveix d’una llum de fluorescència, que ens

ajuda a orientar-nos en el portaobjectes, i un làser.

Microscopi confocal


39

Aquest últim escombra línia a línia la mostra per tenir una imatge a l’ordinador, a

més que obté fotografies tridimensionals a partir de la superposició de imatges

bidimensionals.

A més, com aquest tipus de microscopi només enfoca un pla de la mostra o una

zona d’aquesta, s’obté una resolució major que si s’enfoqués la mostra sencera.

S’eliminen així els fons negres o desenfocats. Però per contra, a vegades, es

requereixen temps allargats d’exposició, el que pot provocar que la mostra es

cremi o es malmeti pel làser.

El làser passa per una sèrie de filtres fins arribar a la mostra. En aquesta, excita el

fluorocrom i fa que emeti una ona de longitud d’ona més petita que la que ha

rebut, i que es pot observar a l’ordinador.

L’ordinador utilitza el programa informàtic LAS AF per visualitzar i manipular la

mostra a la pantalla. Aquest consta de fins a quatre canals per veure els diferents

fluorocroms que hi ha a la mostra.

També vaig aprendre a utilitzar un microscopi electrònic de transmissió (TEM),

però les imatges que vaig prendre i el seu ús no aporten informació addicional per

confirmar o negar les hipòtesis.

3.1.2 Pràctiques realitzades en la Unitat de Cultius

La unitat de cultius consisteix en un conjunt de laboratoris on es produeixen els

cultius cel·lulars, és a dir, on es fan créixer les cèl·lules mare, on es fabrica el seu

medi de cultiu, on es congelen...

Seguidament explicaré dos processos que vaig observar a la unitat de cultius:

cultiu in vitro de iPSC i la diferenciació de cèl·lules mare en NPs. El primer el vaig

realitzar jo mateix, mentre que del segon només vaig realitzar les fotografies i les

conclusions, ja que el procediment l’havia realitzat el responsable de la unitat de

cultius, Bernd Kuebler.


40

3.1.2.1. Canvi de medi de cultiu en colònies de iPSC

El canvi de medi d’un cultiu és un procediment molt comú en la unitat de cultius.

En el meu cas es tractava d’un cultiu de iPSC sobre feeders, el qual, al cap de

quatre dies, vaig observar en un microscopi òptic per confirmar si la colònia

s’havia adherit a les feeders.

Aquest procediment consisteix en traspassar cèl·lules mare d’un pou de cultiu a

un altre per canviar-les de medi.

Procediment

Per a realitzar el canvi de medi d’un cultiu de iPSC es necessita el pou que conté

la colònia i un altre amb nou medi i feeders però que no tingui cap cultiu, és a dir,

que no hagi estat utilitzat. A més vaig emprar una lupa per observar la colònia i

seguir el procediment, guants, alcohol desinfectant i un stripper amb una

microagulla.

Vaig seguir la forma mecànica per realitzar el canvi de pou, ja que aquesta

manera és la més adient per a colònies en feeders.

Abans de començar, es neteja el lloc de treball amb desinfectant per evitar

qualssevol contaminació de la mostra. Es neteja la superfície horitzontal de metall

però també els nostres guants. És important intentar no treure les mans de la

zona de treball perquè, sinó ens hauríem de tornar a rentar els guants, per evitar,

així, possibles contaminacions. També cal treballar el més cap al fons possible

però sense arribar al final ja que com més a prop del corrent d’aire que impedeix

la entrada de microorganismes o partícules, més risc de contaminació hi ha.

Després, es posa el pou amb la colònia a la lupa i es troba un grup de iPSC.

S’agafa l’stripper i, amb molt de compte i sense tocar el fons ni els costats del pou

amb la microagulla, es rasca suaument la superfície de la colònia però sense

arribar a treure les feeders, i es continua rascant fins que es trenca casi totalment

la colònia.

Un cop desintegrada, es treu la microagulla del pou i es pressiona l’stripper per tal

de començar a agafar les iPSC. S’introdueix la microagulla al pou i, poc a poc, es

xuclen les iPSC.


41

Un cop tinguem les iPSC dins la microagulla, es traspassen lentament al nou pou.

Es fica la microagulla al medi del pou i s’alliberen les iPSC deixant d’apretar

l’stripper. Es buida varies vegades per assegurar-nos que no quedi res a la

microagulla.

Aquest procés es repeteix fins que més o menys totes les iPSC de la colònia

trencada i del pou s’hagin traspassat al nou medi.

Quan es repeteixi el procediment però amb un pou de iPSC diferent, hem de

canviar la microagulla de l’stripper per no barrejar pous diferents per precaució, ja

que podrien haver-hi contaminacions o canvis en les cèl·lules.

Després de traspassar un pou, s’observen les iPSC en el nou medi per confirmar

que estiguin allà i que no s’hagin danyat en el traspàs.

Ja acabat el procediment amb tots els pous, s’agafen els pous que contenen ara

les iPSC i s’introdueixen a l’incubador de nou per a un possible ús futur o per

repetir el procés al cap d’uns dies.

Resultats

Passats quatre dies en els quals les iPSC es van fixar a les feeders i van

proliferar, vaig observar en un microscopi òptic els resultats (figures 1 i 2) i els

vaig fotografiar.

Figura 1

La figura 1 va ser presa amb 5x. Mostra una colònia de iPSC (és la part més fosca

i amb forma de mitja lluna).

La colònia de iPSC es diferencia de les feeders perquè aquestes últimes són més

grans que una iPSC, tenen una forma més allargada i no formen conglomerats

iPSC

Cèl·lules feeders


42

definits. A més a més, les colònies de iPSC tenen la característica pròpia que

tendeixen a formar formes puntegudes o amb sortides.

Figura 2

La figura 2 és una fotografia de dues colònies de iPSC a 10x.

En la figura 2 es veuen iPSC, en aquest cas dues colònies, en un cultiu de

feeders. Aquesta fotografia presenta les mateixes característiques abans

esmentades de la figura 1.

Conclusions

A través dels resultats es pot assegurar que les iPSC s’han fixat correctament a

les feeders perquè al sacsejar el pou de cultiu aquestes no es movien de la seva

posició. També cal destacar que formaren colònies ben definides i sense

incorreccions aparents.

Es confirma així que el procediment seguit ha sigut el correcte i que aquest s’ha

fet seguint els passos fidelment i amb exactitud.

Aquest procediment demostra la cura que s’ha de tenir en el moment de tractar

amb cèl·lules mare en general i totes les precaucions a prendre per evitar

qualssevol situació no desitjable, contaminació o desbaratament del pou.

També ha servit com a pràctica per treballar el cultiu de cèl·lules mare i veure les

condicions en què es troben a un laboratori i el seu funcionament natural

(creixement, proliferació, fixació...).

iPSC

Feeders


43

3.1.2.2. Diferenciació de iPSC a NPs

Actualment, al CMRB s’està treballant en l’elaboració d’un protocol per obtenir

NPs (Neural Progenitors) a partir de cèl·lules mare embrionàries i iPSC.

Els NPs són cèl·lules mare multipotents amb capacitat per originar els diferents

tipus cel·lulars del teixit neuronal. La producció d’aquest tipus de cèl·lula mare

dóna molta informació sobre la generació de neurones i el desenvolupament de

la neurogènesi.

L’avantatge de la producció de NPs és que aquestes no necessiten passar per

altres fases de la diferenciació neuronal sinó que a través de factors es poden

especialitzar directament en el tipus de neurona o cèl·lula del sistema nerviós que

volem. A més tampoc cal que es formin a partir d’uns conglomerats de cèl·lules

mare, anomenats neural rosetes per la forma, sinó que s’originen directament des

de les iPSC seguint un procediment específic. Igualment, mantenen la seva

capacitat d’autorenovació i diferenciació.

El procés per generar-les i els resultats del procediment són extrets del document

Efficient and Rapid Derivation of Primitive Neural Stem Cells and Generation of

Brain Subtype Neurons From Human Pluripotent Stem Cells.

Les fotografies (figures 3 i 4) van ser obtingudes per mi mateix a partir dels

resultats obtinguts per Bernd Kuebler de la unitat de cultius del CMRB en el seu

protocol.

Procediment

Abans de començar la diferenciació a NPs, les colònies de iPSC es divideixen en

grups i es situen en nous pous cada tres o cinc dies quan arriben a un

percentatge de cèl·lules en la mostra superior al 70% de confluència.

Tant les colònies cultivades amb feeders i aquelles sense es divideixen en sis

parts de 20000 o 25000 cèl·lules per cm², que es posen en sis pous amb el mateix

tipus de cultiu en el qual es trobaven.

Unes 24 hores després d’aquest pas, es substitueix el medi de cultiu per Gibco

PSC Neural Induction Medium, un medi que indueix, pel seus components, a la

especialització en cèl·lules mare neuronals. Aquest medi permet obtenir més

cèl·lules mare neurals de les que s’obtenien abans amb altres mètodes, a més de

que s’originen més ràpidament.


44

Durant quatre dies, aquest medi es canvia una vegada al dia. Després del quart

dia, el medi es canvia quan les cèl·lules arriben a una confluència elevada.

Al setè dia ja s’obtenen cèl·lules mare neurals primitives. Aquestes se separen en

grups de 0,5-100000 cèl·lules per cm² de manera enzimàtica i es traspassen a

plaques que contenen un medi específic per expandir i induir a la diferenciació en

cèl·lules mare neurals. El medi es canvia cada dia fins arribar a cinc dies. En

aquest moment, s’obté una quantitat considerable de NPs, que tenen la capacitat

d’autorenovar-se i especialitzar-se en neurones i cèl·lules del sistema nerviós.

En les fotografies anteriors, realitzades en un microscopi òptic amb un augment de 10x i 20x respectivament,

les NPs correspondrien a les zones amb més volum o més pronunciades. En la segona imatge es poden

veure línies als conglomerats que serien les dendrites i els axons dels NPs que ja estan adquirint una forma

semblant a la d’una neurona.

Les cèl·lules mare neurals primitives que no s’han diferenciat en NPs es

criocongelen amb el medi en el qual es trobaven.

Per confirmar les característiques de les NPs, van induir a la diferenciació

d’aquestes en neurones dopaminèrgiques. Les cèl·lules mare neurals primitives

que es van criocongelar, es posen en plaques de 400000 cèl·lules per cm² en

Neural Induction Medium. Al dia següent, el medi de cultiu es canvia amb

Neurobasal medium, que indueix a la diferenciació en neurones dopaminèrgiques,

aminoàcids i FGF. Aquesta situació es manté durant deu dies reemplaçant el

medi de les cèl·lules que s’estan diferenciant cada dos dies.

Al desè dia es divideix la colònia de cèl·lules amb enzims i es traspassen a un pou

amb medi similar al anterior amb àcid ascòrbic i factors cerebrals, per assegurar

la maduració a neurones dopaminèrgiques.


45

Resultats

Després d’acabar el procediment, sempre és necessari fer una inmunodetecció

per anticossos.

En la mostra que vaig observar, les cèl·lules expressaven el marcador PAX6, una

proteïna situada al nucli de les NPC (figura3). Aquest fet indica que les cèl·lules

de la mostra expressen els factors de les NPs i, en conseqüència, que són

cèl·lules mare neurals (es correspondrien als nuclis més brillants de color verd en

la figura 3).

En la figura 3 (veure annex) també podem observar els nuclis de totes les

cèl·lules de la mostra amb el marcador DAPI, un factor que s’expressa en tots els

nuclis de les cèl·lules i mostra la seva ubicació. Aquest s’uneix a regions de l’ADN

riques en adenina i timina. Per tant, revela la ubicació dels nuclis de les cèl·lules

(lloc on es troba l’ADN cel·lular).

En l’última imatge de la figura 3, es pot veure una superposició de les dues

primeres imatges.

A més a més de l’expressió de PAX6 també vaig estudiar la presència de l’anticòs

anti-SOX2 que marca la presència de SOX2, una proteïna pròpia de les NPs.

Tal i com es pot veure en la figura 4, a més del DAPI es manifesta el marcador

neural SOX2; per la qual cosa ens assegura encara més que a la mostra hi ha

cèl·lules mare neurals.

També es va realitzar una inmunodetecció per la proteïna SOX1), però en aquest

cas, no es va mostrar perquè el marcador no es va expressar i la imatge en el

microscopi confocal era totalment negra.

Conclusions

A partir dels resultats, es poden treure varies conclusions:

Les cèl·lules de la mostra estudiada, després d’haver fet la

inmunodetecció, són cèl·lules mare neurals, perquè expressen els

marcadors neuronals PAX6 i SOX2 (encara que no es manifesti SOX1).

Són cèl·lules mare perquè es mostra la presència de les proteïnes ja

esmentades. Per confirmar del tot aquesta afirmació caldria diferenciar-les

en neurones i altres cèl·lules del sistema nerviós per provar la seva

capacitat de renovar-se i especialitzar-se.


46

Aquestes cèl·lules estan encaminades a produir tots els tipus cel·lulars del

sistema nerviós ja que són cèl·lules multipotents de la línea neuronal.

Aquesta pràctica confirma que es poden originar NPs in vitro a partir de iPSC i

ESC en poc temps però mantenint la seves característiques d’autorenovació i

diferenciació.

3.1.3. Pràctiques de la Unitat de Histologia i Bioimatge

Les unitats d’histologia i bioimatge són un conjunt de instal·lacions dintre del Core

Facility. Conformen unitats diferents però estan molt relacionades entre si per la

mena de serveis que donen als investigadors.

La unitat de histologia s’encarrega de realitzar proves moleculars o de teixits i les

preparacions de mostres per a la posterior observació en els microscopis o per a

investigacions.

La unitat de bioimatge ofereix serveis de microscòpia als investigadors. Aquesta

unitat té microscopis òptics, electrònics, confocals i lupes, a través dels quals,

poden donar resultats de les proves realitzades a histologia o respondre a

peticions dels investigadors relacionades amb estudis morfològics i qüestions a

petita escala o in vivo.

A la unitat de histologia vaig realitzar una inmunodetecció per anticossos d’unes

cèl·lules mare, guiat per la responsable de la unitat Lola Mulero. A bioimatge, vaig

ser atès per Cristina Pardo, Cristina Morera i Mercè Martí, responsable de tota la

plataforma. Aquí vaig fer observacions en microscopis òptics, confocals i en un

microscopi electrònic de transmissió.


47

3.1.3.1. Immunodetecció de diferenciació d’un teratoma

Procediment

Abans de començar la immunodetecció, com es tractava d’un teratoma, va caldre

fixar i parafinar la mostra per poder-la convertir en làmines.

Primer de tot es realitza la fixació del teratoma en una solució al 4% de PFA

(paraformaldehid). La mostra es manté en aquesta solució a 4ºC durant la nit.

Seguidament es fan una sèrie de quatre rentats de 15 minuts cadascun en PBS

(tampó fosfat alcalí, amb les seves sigles en anglès, és una solució isotònica), i

s’identifica la mostra per posar-la en una mena de cassettes que s’introdueixen en

un processador automàtic de parafina.

Així al processador automàtic de parafina la mostra es sotmet a concentracions

creixents d’etanol i, finalment, a parafina.

El procés consistiria en:

Una hora en una solució d’etanol al 30%.

Una hora en etanol al 50%.

A una solució d’etanol al 70% durant una hora.

Una hora en etanol al 90%.

Dues hores en etanol al 96%.

Dues hores més en una solució d’etanol al 100% de concentració.

Dues hores en xilol.

I, finalment, cinc hores en parafina.

Tot aquest procés és la inclusió en parafina.

Després de la inclusió, es formen els blocs

refredant la mostra que ara està envoltada

de parafina. Es fan utilitzant un motlle

metàl·lic i la part del cassette que té el

nombre identificador. Aquests es refreden

durant, mínim, una hora.

Un cop refredat i sòlids, es tallen els blocs al micròtom de rotació i es realitzen

talls de cinc µm. Aquests talls transversals es deixen a l’estufa durant tota la nit a

37ºC.


48

Els portaobjectes amb els talls dels blocs es fiquen a l’autostainer, una màquina

que s’encarrega de desparafinar i rehidratar la mostra. El procés és a la inversa

que el que té lloc al processador automàtic de parafina: xilol durant 5 minuts tres

vegades seguides, dues vegades cinc minuts en una solució d’etanol al 100% de

concentració, cinc minuts dues vegades en una solució al 96%, cinc minuts al

70% de concentració, cinc minuts al 50%, altres cinc minuts a una solució al 30%

d’etanol, i cinc minuts en aigua destil·lada.

Un cop acabada la rehidratació, s’agafen les mostres i s’introdueixen en una olla a

pressió, olla Pascal, que conté una solució de citrat amb un pH 9. Aquest pas

serveix com a desemmascarament antigènic, és a dir, recuperar els antígens que

s’uniran amb els anticossos i facilitar aquesta unió.

Finalment, es deixen temperar els talls entre deu i vint minuts a temperatura

ambient. A partir d’aquest moment es produeix la immunodetecció pròpiament

dita.

S’agafen els portaobjectes i es renten amb TBS1, un rentador, tres vegades

deixant cinc minuts de marge entre cada rentat. Després del rentats, es deixen els

portaobjectes en una solució tampó formada per TBS1 més un 0,5% de

concentració de sèrum de tritó i un 3% de sèrum d’ase. Restaran en aquesta

solució durant mitja hora.

A continuació es disposen els portaobjectes amb les mostres al bloqueig TBS++,

és a dir, en la solució que aporta els anticossos primaris per bloquejar els llocs

inespecífics. Aquesta solució conté TBS1, un 01% de sèrum de tritó i un 3% de

sèrum d’ase. També conté els anticossos primaris, la quantitat dels quals es

calcula segons la concentració que ha de tenir en la solució.

0,5 µl d’anticòs anti-ASMA provinent de ratolí.

4 µl d’anticòs anti-FOXA2 de cabra.

1 µl d’anticòs anti-AFP de conill.

0,4 µl de anti-TUJ1 provinent de ratolí.

0,2 µl de anti-GFAP de conill.

8 µl d’anticòs anti-MAP2 provinent de ratolí.

Els tres primers anticossos correspondrien al primer portaobjectes, mentre que els

tres últims s’afegiran a la mostra del segon portaobjectes.


49

Cadascuna de les quantitats esmentades d’anticossos primaris s’afegeixen a

microtubs de plàstic que contenen el TBS++.

Després d’afegir-los, es disposen a la centrifugadora i es fan vibrar perquè la

solució es barregi correctament.

Sense deixar passar molt de temps, s’aboquen les solucions TBS++ amb els

anticossos als portaobjectes amb l’ajut de pipetes de la manera abans indicada i

es deixen durant 24 hores a una temperatura de 4ºC, per a què els anticossos

s’uneixin correctament.

Passades les vint-i-quatre hores, es tornen a rentar els portaobjectes amb TBS++

tres vegades deixant cinc minuts entre cada rentat.

Seguidament s’afegeix TBS++, però en aquest cas conté els anticossos

secundaris en compte dels anticossos primaris. Aquests anticossos secundaris

s’uniran específicament als anticossos primaris, que actuaran com a antígens.

D’aquesta manera en 200 µl de TBS++, s’afegeix:

1 µl d’anticòs Antimouse Cy2.

1 µl d’Antigoat Cy3.

1 µl d’Antirabbit Cy5.

2 µl d’anticòs Antimouse Cy2.

1 µl d’anticòs Antirabbit Cy3.

2 µl d’Antimouse Cy5.

Un cop els anticossos són a la solució TBS++, es centrifuguen els microtubs a la

centrifugadora i s’aboquen els seus continguts a través d’una pipeta als

portaobjectes (els tres primers anticossos corresponen a la primera mostra i els

tres últims, a la segona).

Els portaobjectes es deixen reposar durant dues hores a 37ºC per a què els

anticossos secundaris es conjuguin correctament als primaris.

Es neteja amb TBS1 tres vegades la mostra per treure els anticossos que no

s’han adherit. Hem d’esperar cinc minuts entre rentat i rentat, així fins a tres

vegades. Quan s’acaba de fer l’últim rentat, es seca una mica el portaobjectes per

sota i els costats.


50

Després, amb l’ajut d’una pipeta, s’afegeix l’indicador cel·lular DAPI en

concentració 1:10000. Els portaobjectes reposaran ara durant deu minuts abans

de continuar.

L’últim pas és muntar el cobreobjectes i preparar la mostra per la seva

visualització al microscopi. Primer, es col·loca el cobreobjectes sobre la mostra

amb molt de compte de no trencar-lo i de danyar la pròpia mostra.

Després, es treu de les vores la solució en la qual es troba la mostra i es segella

el portaobjectes i el cobreobjectes amb un fixador, en el meu cas esmalt d’ungles.

Amb aquest pas s’assegura que cap de les peces del contenidor de la mostra es

mogui i danyi la mostra, ni que cap microorganisme o contaminació hi entri.

Ara, ja la mostra està preparada per ser observada al microscopi i treure’n

resultats d’ella.

Resultats

La meva mostra, un teratoma, va ser observada en un microscopi confocal per

visualitzar la fluorescència dels fluorocroms continguts en els anticossos

secundaris.

Totes les fotografies fetes del teratoma van ser preses amb un augment 20x.

Al portaobjectes número 1, la mostra contenia l’anticòs anti-ASMA per detectar

mesoderm a través de proteïnes al teixit muscular llis. També contenia els

anticossos anti-FOXA2 i anti-AFP que evidencien la presència d’endoderm.

L’anticòs anti-FOXA2 marca la presència de la proteïna FOXA2 que regula la

diferenciació de les cèl·lules cap a pàncrees i fetge; mentre que l’anticòs anti-AFP

és un marcador de teratomes i del desenvolupament embrionari del fetge i el sac

vitel·lí.

El portaobjectes 2 té els anticossos anti-TUJ1, anti-GFAP i anti-MAP2. Aquest

anticossos són específics per a ectoderm, capa germinal que es diferenciarà en la

pell i en el sistema nerviós, tant central com perifèric. El primer anticòs marca la

presència de neurones, concretament el seu citoplasma. L’anticòs anti-GFAP

mostra les cèl·lules de la glia, especialment els astròcits. La proteïna MAP2

només s’expressa en les neurones i destaca les dendrites i el soma o cos

cel·lular.


51

A més a més, totes dues mostres tenien el marcador DAPI per evidenciar els

nuclis de les cèl·lules presents.

Aquesta fotografia realitzada amb un

microscopi confocal mostra el marcador

fluorescent DAPI. Es poden veure els nuclis

de totes les cèl·lules que hi ha a la mostra.

Serveix com a control per a les següents

fluorescències que mostren cèl·lules

específiques de cada capa germinal. Així,

podem veure on es troben les cèl·lules en la

mostra per comparar amb les altres

fotografies. El marcador DAPI es concentra

principalment al centre de la imatge però

també als voltants encara que menys.

La següent fotografia exposa les àrees on

està present la proteïna ASMA. Així podem

observar, en color verd, zones que

contenen cèl·lules del mesoderm,

concretament teixit muscular llis, que es pot

veure en la forma allargada de les zones i

una major intensitat de verd (correspondria

a la part central de la fotografia i la meitat

superior esquerra). Així, es pot afirmar que

en la mostra del portaobjectes 1 s’ha format

mesoderm.

Figura 5

Figura 6


52

Tal i com es pot veure en la figura 7, les

àrees vermelles corresponen a les zones

amb anticòs anti-FOXA2. Les zones més

vermelles són la part superior, sobretot

l’esquerra, on es congreguen en tres o quatre

formes glandulars. Es pot extreure que el

teratoma s’ha diferenciat cap a endoderm,

perquè s’ha expressat el fluorocrom indicant

la presència de la proteïna. També es pot

saber que hi ha endoderm per la forma similar

a glàndula que desenvolupen les àrees

vermelles, una elevada concentració de cèl·lules concentrades en forma d’anell.

També vaig realitzar la immunodetecció per a la proteïna AFP, però en el moment

d’observar els resultats no es va veure l’anticòs d’aquesta proteïna expressat.

Aquesta situació podria indicar o bé que els anticossos primaris i secundaris no

s’han unit correctament o que no hi ha proteïnes AFP.

Respecte al portaobjectes 2 que també contenia una mostra del mateix teratoma

que el portaobjectes 1, els resultats van ser:

La figura 8 correspon a l’expressió

del marcador DAPI. Mostra

l’existència de cèl·lules en la

colònia i la seva ubicació per a una

posterior comparació. Així, es pot

veure com en les zones més

blaves indica una concentració

major de cèl·lules, principalment al

centre de la fotografia i al costat

dret en una franja que va des de

dalt de tot fins el cantó inferior dret.

Figura 7

Figura 8


53

La següent imatge (Figura 9) és

l’expressió del fluorocrom de

l’anticòs que indica la presència

de l’anticòs anti-TUJ1 i, per tant,

de la proteïna TUJ1. Partint de la

base que la proteïna TUJ1

s’expressa al citoplasma de les

neurones i que en la imatge hi ha

fluorescència verda, es pot

concloure que la proteïna TUJ1

està present. També es conclou

que a la mostra hi ha ectoderm.

L’àrea amb ectoderm

correspondria sobretot a la part més verda de la fotografia, però hi ha neurones

per casi tota la imatge, menys a la cantonada superior dreta.

La figura 10 mostra l’anticòs

anti-GFAP. Com la proteïna

GFAP només s’expressa en

cèl·lules de la glia, en especial

a astròcits, podem afirmar que

hi ha cèl·lules de la glia i que

també hi ha ectoderm (ja que

aquestes cèl·lules també

deriven del ectoderm, a l’igual

que les neurones). Podem

assegurar-nos de la presència

d’astròcits, per la forma

allargada i filamentosa, i més

concentrada en algunes zones

que en altre, que adopta el fluorocrom. A més, la concentració de fluorocrom és

major en zones on l’anti-TUJ1 ha evidenciat una proporció major de neurones.

Figura 9

Figura 10

Figura 9


54

Així es pot lligar la presència de més astròcits amb més neurones, ja que

aquestes primeres són cèl·lules de suport de les neurones.

La següent fotografia (Figura

11) és una imatge de la

ubicació de la proteïna MAP2.

Aquesta proteïna, present en

les dendrites i el cos cel·lular

de les neurones, es detecta a

través de l’anticòs primari anti-

MAP2. La situació de les

neurones en aquesta fotografia

coincideix amb l’emplaçament

de les neurones en la figura 9.

En aquest cas, les parts més

intenses de color són al centre

de la part inferior i la meitat

superior, tot i que té menys color.

Conclusió

Després d’obtenir els resultats i interpretar-los, s’obtenen varies conclusions:

El teratoma s’ha diferenciat en les tres capes germinals, perquè

s’expressen els marcadors de les proteïnes específiques de cada capa

germinal. Així, a través de l’observació de la fluorescència que emeten els

fluorocroms podem assegurar que hi ha presents en la mostra cèl·lules de

les tres capes germinals (endoderm, ectoderm i mesoderm).

La diferenciació del teratoma confirma que les cèl·lules que van formar el

teratoma tenen la capacitat de diferenciar-se en els diferents tipus cel·lulars

i, per tant, són cèl·lules mare. La seva pluripotència es manifesta en les

imatges, les quals mostren tots els tipus cel·lulars desenvolupats i la

confirmació d’aquesta característica pròpia de les cèl·lules mare.

Figura 11


55

L’objectiu d’aquesta prova es veure si les cèl·lules que tenim són mare o no. Per

tant, després de realitzar la immunodetecció, podem dir que les cèl·lules en

qüestió són cèl·lules mare pluripotents (per la capacitat de desenvolupar les tres

capes germinals ).

Al ser aquestes cèl·lules pluripotents poden ser utilitzades com a modelatge de

malalties infeccioses, genètiques, neurodegeneratives... Aquesta opció obre

moltes possibilitats de investigació, per exemple en Parkinson o en diabetis.

També podrien servir com a base per a investigacions sobre el desenvolupament

embrionari, l’envelliment o el funcionament de la regeneració de teixits com la pell

o el fetge.

3.1.3.2. Observació d’ iPSC en un microscopi confocal

Vaig realitzar aquesta pràctica al

departament de bioimatge del Core

Facility. Va consistir en la visualització d’

iPSC mitjançant un microscopi confocal

després de que aquestes haguessin estat

sotmeses a una immunodetecció de

pluripotència.

Així, l’objectiu d’aquesta pràctica era

obtenir els resultats de la immunodetecció

a partir de fotografies de les mostres amb fluorescència i confirmar el caràcter

pluripotent de les cèl·lules.

Aquesta pràctica em va permetre aprendre el funcionament d’un microscopi

confocal (molt utilitzat en biologia) i obtenir resultats a partir de la interpretació de

fotografies, el que pot ser molt útil en la meva vida acadèmica, però també en el

meu futur professional.

Tant aquesta pràctica com les dues següents, vaig realitzar l’obtenció de les

imatges però no els procediments que han donat lloc a les mostres a analitzar.

Jo mateix utilitzant un microscopi confocal


56

Procediment

En aquest cas, no seria necessària la utilització del microscopi confocal perquè

les iPSC no tenen molt de volum i no caldria fer reconstruccions amb diferents

plans.

Primer de tot, és imprescindible encendre el microscopi, però també l’ordinador.

Un cop que estan tots dos encesos, s’enfoca al microscopi confocal, que funciona

en aquest moment com a microscopi òptic, la part de la mostra que ens interessa

més.

Aquí es canvia la funció del microscopi, que passa a ser de fluorescència. En

aquest moment no es pot mirar directament al microscopi (es fa a través de

l’ordinador), perquè el làser podria danyar els ulls. Per això el microscopi

incorpora la opció de tallar la transmissió de les imatges de la mostra als

binoculars del microscopi.

Seguidament s’escolleix el nombre de canals, que corresponen al nombre de

fotografies de diferents fluorescències que s’obtindran. En el meu cas vaig

escollir-ne fins quatre canals: el primer canal correspon al anticòs DAPI, en color

blau, el segon és de color verd, ja que rep una longitud d’ona blava, el tercer és

vermell perquè s’excita amb verd, i el quart canal emet rajos infrarojos perquè rep

una ona vermella.

És important apuntar en el programa informàtic el format de la imatge, és a dir, la

seva resolució, i també el factor del zoom, l’objectiu utilitzat, perquè aquests dos

factors poden modificar la imatge i millorar-la o empitjorar-la.

Després, es defineix la freqüència de l’ona que s’emet pel làser (en el meu cas

400Hz, standard) i el pinhole o obertura del diafragma, és l’amplada del pla

enfocat on 1 és la confocalitat màxima. Quan més s’obre el pinhole més àrea

s’observa però es perd resolució.

Es pot escollir l’opció de frame average, es fa una mitja d’entre varies imatges per

eliminar el soroll de fons i potenciar la zona de la mostra que ens interessa.

Finalment, es seqüència, per veure tots el canals en conjunt i guardar tota la

configuració feta fins aquest moment. Els passos següents aniran destinats a la

millora de la qualitat de les imatges per a un correcte anàlisi posterior.

S’acciona l’opció live del programa, que permet veure en directe la mostra però

només la fluorescència. Així, per aconseguir una bona fotografia es mou la zona


57

d’observació en l’eix de les x i l’eix y. També es pot modificar la potència del làser

per augmentar o disminuir la intensitat dels colors i obrir o tancar el pinhole, o

augmentar la sensibilitat dels detectors amb el fotomultiplicador.

Per veure quins punts es troben massa potenciats, el que pot indicar una

cremació d’aquests, s’acciona el captable. Així, a través d’aquest es pot veure si

el fotomultiplicador està massa intensificat. També existeix l’opció de l’offset, que

ajuda a treure soroll de fons i netejar la imatge.

Aquest pas s’ha de repetir amb els quatre canals per tenir la quantitat d’imatges

de la mostra desitjades per a poder realitzar posteriorment un correcte anàlisi. Un

cop fet amb tots el canals, es prem el botó start, que mostra a la pantalla els

quatre canals a la vegada per veure’ls en conjunt.

Finalment, es prem l’opció d’overlay. Aquest botó sobreposa els quatre canals i

crea una imatge composta amb quatre colors, cosa que fa més fàcil la futura

interpretació; i es guarden les fotografies de cada color i la superposició indicant el

objectius utilitzats i l’anticòs la presència del qual evidencien.

Resultats

Les quatre primeres fotografies mostren la mateixa zona de la mostra però

evidencien la presència de proteïnes diferents segons el color i van ser preses

amb 20x i amb una escala de micròmetres.

A continuació es recullen els resultats de manera resumida. L’explicació de cada

fotografia es dóna més detallada a l’annex.

La primera fotografia (figura 12 de l’annex) és l’expressió del marcador DAPI. És

un control de l’experiment per assegurar-nos de la presència de cèl·lules a la

mostra.

La figura 13 representa la manifestació de l’anticòs anti-Nanog. Aquesta proteïna

es codifica a través del gen Nanog i es situa al nucli. Com que és un factor propi

de cèl·lules pluripotents i s’expressa en aquesta mostra, indica que les cèl·lules

tenen característiques pluripotents.

La imatge 14 de l’annex és la manifestació de la proteïna TRA-1-80 a la cèl·lula.

Aquesta proteïna es situa a la membrana cel·lular de les ESC. Aquest fet afirma

que en la colònia hi ha cèl·lules que contenen molècules pròpies de ESC.


58

La figura 15 correspon a la superposició de les expressions dels tres anticossos

anteriors. Amb la imatge es pot fer una distinció en la colònia de les cèl·lules no

pluripotents i aquelles que sí ho són.

La segona sèrie de fotografies comprèn quatre fotografies d’una mateixa colònia

de cèl·lules preses a 20x. Malgrat que es va realitzar una cinquena fotografia per

un anticòs, aquest no es va manifestar, la fotografia era negra, sense cap

expressió de l’anticòs, i no aporta informació per caracteritzar les cèl·lules.

L’indicador DAPI, tal i com es mostra en la imatge 16 de l’annex, es concentra al

ben mig de la il·lustració. Hi ha altres cèl·lules al voltant però ens interessen

sobretot les centrals.

La següent fotografia, figura 17, correspon a la expressió de l’anticòs anti-Oct4.

Aquest anticòs s’uneix amb la proteïna Oct4, molt lligada amb l’autorenovació

cel·lular i les ESC. Per tant, podem dir que aquestes cèl·lules es troben en un

estat no diferenciat.

Aquesta imatge, figura 18 és la manifestació de l’anticòs anti-SSEA3. Detecta la

molècula SSEA3, present en la superfície de les ESC. Aquesta mostra conté una

molècula pròpia de les ESC, indicant que les cèl·lules de la colònia són semblants

a les embrionàries.

L’última imatge de la sèrie (figura 19 de l’annex) és la superposició de les tres

fotografies anteriors. Així la majoria de cèl·lules de la colònia expressen els tres

marcadors abans explicats.

La tercera sèrie està formada per quatre imatges, en les quals es poden veure les

expressions dels mateixos anticossos que en les quatres imatges anteriors però la

colònia de cèl·lules és diferent i es van prendre a 63x. També, igual que en

l’anterior sèrie, es va realitzar la inmunodetecció per a una tercera molècula però

tampoc va sortir correctament: la fotografia resultant era negra, sense cap

manifestació de l’anticòs amb el fluorocrom.

La primera fotografia, figura 20, correspon a la expressió del DAPI en la colònia.

Com a anècdota hi ha cèl·lules que estan en procés de mitosi, cosa que es pot

assegurar perquè els cromosomes que apareixen estan marcats en blau intens ja


59

que són rics en adenina i timina. Entre les

cèl·lules en mitosi podem trobar cèl·lules en

anafase (al ben mig de la fotografia hi

ha dues i al cantó inferior esquerre, tot i que

aquesta ja estaria produint la citocinesi.) i en

metafase, com a la part inferior dreta, al mig cap

a la esquerra i la part superior de la imatge

(metafase tardana).

La figura 21 mostra la manifestació de l’anticòs

anti-Oct4. S’expressa en la majoria de cèl·lules

excepte en aquelles en mitosi, ja que aquestes

momentàniament no tenen nucli definit, per tant,

aquesta molècula, que es situa en el nucli, no

està present al no haver-hi nucli definit (es mostra

verd igualment perquè la molècula es troba

escampat per tot el citoplasma). Les cèl·lules de

la colònia són riques en una proteïna pròpia de

les ESC, del que es desprèn que tenen un estat

semblant a aquestes.

L’esfingolípid SSEA3 (fotografia 22) es mostra en la colònia repartidament. Això

exposa que les cèl·lules de la mostra contenen el lípid propi de les ESC, cosa que

ens va confirmant cada cop amb més força la seva naturalesa

L’última figura, fotografia 23 de l’annex, és la exposició de les tres fluorescències

anteriors. Els nuclis, ben definits, tenen un color entre blau i verd que confirma la

doble pertinença de DNA i Oct4.

La següent sèrie de fotografies està formada per quatre imatges, figura 24 de

l’annex, preses a 63x més un zoom del 01 i una escala de 2cm:7,5µm. Mostren la

cantonada inferior dreta de la mostra anterior. Al ser un zoom de fotografies

anteriors, la immunodetecció té els mateixos anticossos i l’expressió d’aquests és

la mateixa.

Figura 20

Figura 21


60

A les quatre imatges es visualitza cèl·lules que manifesten amb intensitat l’anticòs

anti-Oct4 i una cèl·lula al centre que es troba en la metafase de la mitosi. Els

punts vermells es situen al voltant del nucli amb una forma més o menys circular,

seguint la forma de la membrana.

L’última sèrie comprèn cinc imatges de la mateixa colònia a 20x i 2:75µm

d’escala. A més, en aquesta sèrie sí que va sortir la immunodetecció per a la

cinquena molècula.

El marcador DAPI, figura 25, s’expressa amb normalitat i es defineixen els nuclis

cel·lulars, encara que una mica difuminats.

En aquesta imatge (imatge 26, annex) s’observa l’expressió de l’anticòs anti-Sox2,

que s’uneix a una proteïna de les ESC. La manifestació d’aquesta proteïna

evidencia el caràcter semblant a ESC de les cèl·lules de la colònia.

La següent fotografia, figura 27, és la exposició de l’anticòs anti-SSEA4. El

SSEA4 és una glicoproteïna de les ESC. Per tant, la seva expressió en aquesta

colònia mostra que les cèl·lules de la imatge són semblants a les ESC.

La figura 28 correspon a l’anticòs anti-TRA-1-60. Es situa a la superfície de les

ESC. La ubicació d’ella en la colònia indica unes característiques que

s’assemblen a les d’una ESC.

La superposició de les quatre fotografies anteriors es plasma en l’última fotografia

de la sèrie (imatge 29 de l’annex).

Conclusió

Després d’obtenir els resultats de la immunodetecció es pot afirmar que aquestes

cèl·lules són pluripotents i així ho demostra el seguit de molècules que es troben

en les cèl·lules de la mostra.

Es pot assegurar perquè aquestes molècules estan presents només en cèl·lules

pluripotents, concretament ESC, per tant, si es troben en les cèl·lules de la mostra

és que ho són.

Es realitzen tantes proves per a molècules diferents per assegurar amb la màxima

seguretat la potencialitat i no caure en l’error que podria afectar a futures

investigacions amb cèl·lules provinents d’aquesta colònia.


61

A partir d’aquesta conclusió principal es pot treure d’altres:

- Les cèl·lules de la mostra es troben en un estat semblant al de ESC

perquè tenen les mateixes biomolècules que aquestes però no ho

són estrictament perquè no s’han obtingut del blastocist durant el

desenvolupament embrionari, així que són iPSC, perquè s’han

produït a partir de cèl·lules adultes diferenciades.

- El procés de retrocés a un estat no diferenciat (reprogramació) s’ha

realitzat correctament ja que les cèl·lules obtingudes expressen les

característiques pròpies d’una cèl·lula pluripotent i contenen les

molècules que les defineixen.

Com a crítica es podria dir que hi ha dues immunodeteccions que no tenen

resultats. Aquest fet pot haver estat causat per un error en la realització de la

reprogramació, en la unió dels anticossos a la molècula o en la obtenció de les

fotografies. Encara que no hagin sortir aquestes dues, es pot confirmar igualment

que les cèl·lules de la mostra tenen un caràcter pluripotent ja que contenen molts

dels principis immediats presents en les ESC, cèl·lula pluripotent per excel·lència.

Aquest tipus de cèl·lula i concretament aquesta colònia podria ser utilitzada en

investigacions sobre el Parkinson perquè permet esbrinar reprogramant cèl·lules

adultes d’un malalt de Parkinson quins gens intervenen en l’enfermetat i com es el

desenvolupament d’una neurona afectada de la malaltia comparant-la amb una de

normal. També es podrien utilitzar, gràcies al seu caràcter pluripotent, en

medicina regenerativa dirigida al Parkinson reprogramant neurones afectades i

modificant-les per tal d’obtenir cèl·lules sanes, tot i que es necessitaria saber els

gens i els motius pels quals les neurones degeneren en aquesta enfermetat. Així

les iPSC obren moltes possibilitats de investigació en la malaltia del Parkinson,

però encara cal saber més coses de la malaltia i aplicar-les amb finalitat de

curació.


62

3.1.3.3. Observació d’EBS en un microscopi confocal

Aquesta pràctica té com a objectiu confirmar la potencialitat de les cèl·lules de les

qual es parteix. Es deixa que aquestes cèl·lules es diferenciïn i proliferin les tres

capes germinals per veure si són capaces de donar origen a tots els tipus

cel·lulars de l’organisme adult.

Es realitza una immunodetecció sobre les masses cel·lulars que s’obtenen, EBs,

per a diferents principis immediats característics de cada capa germinal. Després

es visualitzen les mostres a un microscopi confocal ja que les masses cel·lulars

tenen un cert volum i el microscopi confocal permet produir fotografies de cossos

amb volum.

Jo vaig realitzar l’obtenció de les imatges de les mostres però no la

immunodetecció o el procés per originar EBs. El procés per captar les imatges és

el mateix que en la pràctica anterior, per la qual cosa no es fa necessari repetir la

explicació del procés.

La única cosa que canvia és l’amplitud del camp de visió en la vertical (eix z) que

s’ha d’augmentar i es fa una mitjà de les diverses capes que es capten.

Resultats

Prèviament es va realitzar una immunodetecció per a molècules característiques

de cada capa germinal, gràcies a la qual es poden diferenciar entre si i confirmar

la seva pluripotència.

Les quatre primeres fotografies corresponen a la immunodetecció per a molècules

pròpies de l’endoderm, a més del ja conegut marcador DAPI. Van ser preses amb

20x augments i una escala 2:75.

Els tres marcadors propis d’endoderm (anti-AFP i anti-FOX 2) van confirmar la

presència d’endoderm en la mostra. Els EBs han pogut diferenciar-se en cèl·lules

d’aquesta capa germinal, el que evidencia que aquestes cèl·lules tenen

característiques pluripotents. Per a una major descripció de les fotografies i dels

resultats per a l’endoderm, aneu a l’annex a l’apartat d’observació d’EBs en un

microscopi confocal.


63

Seguidament vaig realitzar fotografies per detectar mesoderm en la mostra. El

resultat són tres imatges, que tenen la mateixa escala que les imatges anteriors i

van ser preses amb els mateixos augments.

També es va realitzar la immunodetecció per a la molècula ASA però no va sortir

per causes no conegudes, possiblement errors.

Van mostrar que les cèl·lules de la mostra també s’havien diferenciat cap a

mesoderm. L’explicació detallada de cada fotografia i les imatges es troba en

l’annex.

Les últimes quatre fotografies corresponen a una colònia, la qual es va sotmetre a

anticossos que indicaven molècules de l’ectoderma. Es va realitzar una

immunodetecció amb tres anticossos

més el DAPI, però un d’aquests no va

sortir.

El marcador DAPI (figura 37) com en els

altres casos, permet situar els nuclis

cel·lulars i les cèl·lules de la colònia. En

aquesta mostra, els nuclis són més petits

i més nombrosos que en l’anterior colònia

malgrat va ser presa amb els mateixos

augments (20x). Aquest fet pot voler dir

que el tipus cel·lular és diferent que

l’anterior i que les cèl·lules es troben en

estats no diferenciats del tot.

Aquesta fotografia, imatge 38, és

l’expressió de l’anticòs anti-TUJ-1 unit a

la proteïna TUJ-1. Aquesta és una

constituent primordial del citoesquelet,

dels microtúbuls del citoplasma de les

neurones. Concretament es situa en els

axons i intervé en el seu manteniment i

control.

Figura 37

Figura 38


64

La manifestació del TUJ-1 en la colònia de la fotografia evidencia que les cèl·lules

pertanyen a l’ectoderma. A la imatge s’aprecien els axons de les neurones i les

xarxes que començaven a establir-ne. A més, les construccions allargades i

filamentoses que adquireixen confirmen la naturalesa neuronal de les cèl·lules.

En la figura 39 és visible un color vermell intens amb formes filamentoses i

allargades. Es tracta de l’expressió de la

proteïna GFAP. Aquesta proteïna es

troba en el citoplasma de les neurones i,

durant el desenvolupament embrionari,

distingeix astròcits d’altres cèl·lules de

la glia. Per tant, a la imatge hi ha

astròcits i, conseqüentment, hi ha

ectoderma ja que aquestes són un tipus

de cèl·lules del sistema nerviós.

L’última imatge és la superposició de les

tres anteriors fotografies preses.

L’àmplia gamma de colors indica que

l’expressió dels tres marcadors previs

s’estén per tota la fotografia. Aquesta

fotografia permet observar les xarxes

neuronals que formen les neurones més

els astròcits. També es observable que

en aquelles zones on hi ha molta

concentració de nuclis i axons, es troben

molt a prop astròcits, cèl·lules de

suport.

Figura 39

Figura 40


65

Conclusió

Aquesta pràctica respon rotundament i amb suficients proves a la hipòtesi inicial:

la mostra davant la qual ens trobàvem sí que n’era, de capaç de generar cèl·lules

de les tres capes germinals del desenvolupament embrionari. És a dir, són

pluripotents i es poden caracteritzar com a pluripotents i cèl·lules mare, per tant,

poden ser utilitzades en estudis de desenvolupament o regeneració.

També es confirma la característica generadora dels EBs com a forma cel·lular

que conté les tres capes germinals. Aquest tipus de cèl·lula ens permet no haver

d’utilitzar embrions naturals, que comporta inconvenients ètics, alhora que són

molt similars a aquests.

Tot i que alguns dels marcadors de cada capa germinal no s’han expressat, la

majoria ho ha fet i permeten confirmar el caràcter de les cèl·lules de les quals es

partia.

Aquesta pràctica ha sigut molt útil perquè m’ha permès veure les tres capes

germinals de primera mà i poder distingir les diferències entre elles. Ja en

pràctiques anteriors havia observat diferents tipus cel·lulars però la claredat

d’aquesta és major i els resultats són més clarificadors.

A més, la pràctica també permetia visualitzar els processos de diferenciació en les

tres capes germinals en el desenvolupament embrionari. Aquest fet és destacable

en el meu cas perquè en el Parkinson es vol conèixer els motius de l’incorrecte

funcionament de les neurones en el cervell d’un malalt i una de les causes podria

estar relacionada amb l’origen de tot el teixit neuronal, és a dir, a les primeres

etapes de la vida, l’embrió.

Malgrat els avenços que es fan dia a dia en aquest camp encara s’està

relativament lluny de trobar una causa del Parkinson i una possible solució a

aquest, per tant, qualssevol investigació destinada a portar llum en aquest terreny

és important.


66

3.2. Entrevistes

3.2.2. El Parkinson des de la recerca i la situació econòmica de la

investigació: doctora Cristina Malagelada

El desembre de 2014 vaig realitzar una entrevista a la doctora Cristina

Malagelada, del departament de farmacologia de la facultat de medicina de la UB.

L’entrevista va girar entorn del Parkinson, els tractaments i l’estat actual de la

recerca a Espanya. Tenia com a objectiu conèixer les teràpies que actualment

s’investiguen com a tractament per al Parkinson i per donar resposta a tres

hipòtesis: si Catalunya és un focus important d’investigació, si és necessari

continuar la recerca sobre malalties degeneratives i si la teràpia cel·lular es pot

aplicar com a tractament per al Parkinson.

- Què tracta el seu departament?

És un departament de farmacologia. Tot i que fem coses relacionades amb la

farmacologia, fem moltes més coses relacionades amb la neurociència (biologia

cel·lular, bioquímica i biologia molecular). Farmacologia ens va molt bé a nivell

terapèutic, per provar una molècula o compost. És una mica multidisciplinari,

encara que pertanyi a farmacologia.

- A què es dedica exactament, és a dir, vostè investiga o coordina les

diferents investigacions que es realitzen en el seu departament?

Estem organitzats com a grup de recerca: una estudiant de fi de grau, tres

estudiants de doctorat i jo. Cadascú té el seu projecte. Jo ideo projectes (ells

també tenen idees, però), que, si hi ha diners i medis, es porten a terme; a més

coordino i controlo els projectes.

- També dóna classes?

Sí, a gent de medicina, ciències biomèdiques, ciències mèdiques bàsiques i altres

graus de biologia. No gaires classes perquè per contracte no puc donar masses.

Intento fer coses interessants com pràctiques.


67

- Quines investigacions estan desenvolupant en aquests moments?

Gairebé tots estem centrats en una proteïna, que serveix d’excusa per a

investigar: la RTP801. Hem vist que és necessària per induir mort neuronal. Com

és una peça important per a què les neurones es morin, qualsevol maniobra que

fem per modular-la i mantenir-la baixa ens dóna la idea que seria una aproximació

terapèutica per a malalties amb mort neuronal com el Parkinson. Si mantens els

seus nivells baixos i estresses la neurona, les protegeixes. A partir d’aquí hem

desenvolupat diversos projectes: la seva relació amb la parkina, una proteïna que

degrada la RTP801, amb la Nedd-4, en la malaltia de Huntington, on hi ha una

expressió d’una proteïna mutada, la huntingtina, que provoca un augment de la

RTP801 i la mort neuronal, per tant es bloqueja l’expressió de la RT801 per

protegir les neurones.

El problema és que si mantens baix la RTP801 en una situació de càncer, les

cèl·lules canceroses no es moren i s’agreuja més. També modifica la proliferació

neuronal modificant el camí que segueixen les cèl·lules mare fins a arribar a

especialitzar-se en neurones, i les connexions entre neurones, la quantitat de

neurotransmissors.

- Quants anys porta el departament funcionant?

Molts anys. Jo només en fa cinc, però el departament porta entre trenta i quaranta

anys, o més fins i tot.

- Quants investigadors o professionals treballen en el departament i en

el seu grup?

Al departament, som quatre grups de més o menys 17 persones entre tots. En el

meu grup som cinc persones.


68

- Creu que els fàrmacs personalitzats, no només per al Parkinson per

exemple, sinó també per altres malalties, són el futur?

Home sí, però és molt car personalitzar. Si hi ha una manera de decidir quin

fàrmac és adient per a una persona, la seva dosi i amb un patró concret de

preses, estaria bé. És molt utòpic perquè és molt car; és molt més fàcil

homogeneïtzar una dosi per tothom.

- Com d’avançada es troba la recerca sobre el Parkinson? I

concretament sobre el seu tractament?

És complicat dir-ho. S’ha avançat molt a nivell de mecanismes, d’entendre perquè

passa, però no s’ha avançat prou en el tractament. Tot sembla que funciona molt

bé en cèl·lules i models d’animals però quan proven aquestes estratègies en

persones, no els hi acaben de sortir. Normalment les persones que participen en

assajos clínics són persones fartes de la malaltia, així que s’ha d’escollir molt bé

el tipus de pacient de Parkinson on es prova el fàrmac. Com que hi ha molts tipus

de Parkinson i alguns acaben també en Alzheimer, és una barreja que costa

abordar. És complicat, però alguna cosa sortirà aviat.

- Pensa que hi haurà en pocs anys un tractament especialitzat per a

aquesta malaltia? I una cura?

Jo crec que costarà. Tant de bo perquè hi ha molta gent que hi treballa. Penso

que el que té més potencial són fàrmacs que ja es donen en altres malalties però

que provades en una altra patologia curen el problema, per exemple la

metformina dels malalts de diabetis tipus 2. Pot ser és el que té més probabilitats

de que s’utilitzin fàrmacs que ja estan al mercat, que ja han passat tots els estudis

de seguretat i els assajos clínics, i s’adaptin a la nova malaltia.

Cura total, això ja s’hauria de fer amb cèl·lules mare perquè la gent ha perdut

tantes neurones quan comencen els símptomes del Parkinson (els queden entre

el 30 i el 40%). Les neurones que queden haurien de funcionar molt bé i repoblar-

les d’alguna manera. Seria més amb estratègies amb cèl·lules mare.


69

Però en un assaig clínic on van introduir cèl·lules mare en pacients de Parkinson,

tot i que els símptomes motors milloraven, van veure en el teixit post mortem que

les neurones noves també presentaven cossos de Lewy. O sigui que la causa és

del pacient: per molt que posis noves neurones, l’entorn neuronal les fa tornar

malaltes, per la comunicació.

- Quines són les seves línies d’investigació sobre el Parkinson?

Hi ha moltes: hi ha gent que mira les causes, què fa que les neurones es morin, i

altres estan més centrats en tractaments, en millorar a nivell farmacològic, a nivell

de pacient, i teràpies cel·lulars o gèniques.

- Treballa en col·laboració amb altres centres de recerca? Us passeu

informació

Sí, amb Boston per exemple. Vam estar col·laborant amb ells. També amb gent

de Nova York, de la Universitat de Columbia, amb Alemanya... Ens anem movent,

també amb gent de la universitat.

Sempre i quan no ens ho trepitgin. Hi ha molta competència, sobretot entre els

grups més grossos.

- S’investiga a Espanya el Parkinson? I a Catalunya?

Home, déu ni do! Crec que hi ha grups potents que fan coses interessants. Penso

que en neurologia i càncer, Espanya és un dels llocs on s’hi posen més. Tot

depèn de les inversions: hi hagut molts grups que han tancat.

Sí, les inversions a Catalunya en ciència han estat molt ben cuidades per la

Generalitat. La política en investigació de la Generalitat ha estat una de les més

aplaudides, i han provocat que els grups consolidats hagin continuat investigant.

Es pot competir a nivell europeu i americà, o al menys es podia, ara ja no ho sé.


70

- Reben ajuts de la Generalitat, l’Estat o una altra institució pública?

Ara de l’estat espanyol sí, del ministeri d’economia i competitivitat. De la

Generalitat, diners específics per fer investigació no, només beques o bé ajuts per

a grups de recerca consolidats, però és molt poc. Estem pendents de la resolució

d’una demanda d’ajut al ministeri que ja ens van concedir aquest any. També

tenim finançament americà: un projecte de la fundació del Michael J. Fox, l’actor

de les pel·lícules de Retorn al futur, que té Parkinson; i d’un projecte europeu.

- Tenen financiació privada?

També, però no una persona física que et pagui tota la recerca perquè és molt

difícil de tramitar a nivell fiscal. Hi ha casos: una persona ens està donant diners -

no milions- perquè volia fer-ho directament sense passar pel crowdfunding que

vam organitzar.

- Té un cos elevat desenvolupar un projecte de recerca?

Sí. Són molt cars els reactius, que fins i tot és vergonyós. Són coses molt

específiques. Per exemple, en el primer projecte que vam fer teníem 90000€ per

tres anys i ens els vam gastar molt ràpid. Parlem de molts diners, i el que rebem

nosaltres és poc en comparació amb grups més grans.

- Hi ha hagut retallades en el seu departament? Les ha notades?

Sí, perquè com hi hagut retallades a la universitat, de retruc al departament també

han retallat. Ens van treure bombetes i abans la facultat obria per vacances; ara

tot l’agost i el Nadal tanca per estalvia. Nosaltres podem entrar per acabar

experiments però no hi ha consergeria i has d’entrar amb targeta.


71

- S’investiga més o menys que abans de la crisi?

Crec que abans de la crisi s’investigava més, però tampoc ho sé molt perquè

quan no hi havia crisi jo estava als Estats Units. Nosaltres aquest primer trimestre

no teníem diners per a res, no podíem comprar ni les puntes, ni les pipetes, ni els

reactius...

- Com qualificaria l’estat de la investigació en aquest país?

Molt pèssim. És una pena perquè es fa molt bona ciència i hi ha gent molt bona,

però degut a això és molt trist que no es pugui fer en les condicions que toca.

Suposo que en algun moment s’arreglarà. A nivell d’intencions, hi ha molt bones

intencions i idees amb molta qualitat, però l’ambient econòmic no acompanya.

- Sap si altres països han tingut retallades?

Jo crec que s’ha notat a tot arreu. Als Estats Units va haver-hi retallades

importants i ha afectat a tot el món. A Europa, els projectes europeus van de capa

caiguda, als EEUU amb la guerra de l’Irak es van gastar-hi tots els diners.

- Veu sortida a l’estancament de la recerca per l’economia?

Penso que sí, perquè si no penséssim que hi ha sortida, tancaríem tot i ens

marxaríem a casa. Hem superat aquesta etapa tant bèstia i poc a poc anirem

remuntant.

- Veu preparades les noves generacions d’investigadors?

Hi tant! Són generacions que heu estat exposades a informació molt més ràpida i

el grau d’accés a la informació és molt gran. Jo crec que estan molt ben preparats

i que tenen una agilitat per captar i aprendre les coses i per aplicar i pensar noves

idees que és gràcies aquest ambient tant positiu que et dóna la xarxa o la

interacció.


72

3.2.2. El Parkinson segons els afectats: president de l’associació de malalts

de Parkinson de L’Hospitalet

El 19 de maig de 2014 vaig realitzar una entrevista a en José María, president de

l’Associació de malalts de Parkinson de L’Hospitalet i el Baix Llobregat, per tal

d’informar-me sobre la pròpia associació i les teràpies que efectuen, però també

sobre la pròpia vida d’un malalt de Parkinson.

L’objectiu d’aquesta entrevista era respondre a dues hipòtesis del Treball de

Recerca: cal continuar la recerca sobre malalties neurodegeneratives i cèl·lules

mare, i si la teràpia cel·lular es pot aplicar per millorar la qualitat de vida de

pacients de Parkinson o com a tractament.

- En quin any va néixer?

Vaig néixer al1938 en un poble petit. En el Parkinson el lloc de naixement no

influeix, és a dir, afecta per igual a persones de diferents pobles o ciutats.

- Quan li van detectar la malaltia?

Fa onze anys. Ara mateix tinc 76.Normalment el Parkinson es detecta entre els 55

i els 60 i pico,però cada vegada tendeix a presentar-se en persones més joves.

- Quin era el seu treball quan li diagnosticaren l’enfermetat?

Quan em van detectar Parkinson ja portava quinze anys jubilat. Abans treballava

a la fàbrica SEAT, en el sector de construccions metal·lúrgiques. No hi ha una

relació directa entre el tipus de treball que has tingut i la presencia de Parkinson.

- Com va saber que tenia l’enfermetat? Com se la van detectar?

Per la tremolor de la mà. La majoria dels parkinsonians comencen amb aquesta

tremolor característica.


73

- Té antecedents previs a la família?

Que jo sàpiga no. Ningú dels meus familiars propers la pateix. En la majoria de

casos de Parkinson, l’aparició d’aquesta no és un motiu hereditari.

- Quins símptomes se li han manifestat?

Sobretot, la tremolor en les mans i la rigidesa. També em costa més

moure’m,camino i faig les coses més lentament i, a vegades, em costa dormir. En

cada malalt, els símptomes que es manifesten són diferents, és a dir,pot aparèixer

la rigidesa però no la tremolor a les mans; però sempre afecta la mateixa part del

cervell.

- Ha hagut d’adaptar la seva vida i vivenda a la seva situació?

La meva casa no perquè el malalt de Parkinson no necessita més que la

medicació i una mica d’ajuda d’una altra persona quan ja està molt

desenvolupada l’enfermetat. La meva vida segueix sent més o menys la mateixa,

encara que puc fer menys coses o les faig amb més lentitud.

- Necessita ajuda d’una altra persona?

Jo, personalment, no. Algunes persones en l’associació ja han de vindre

acompanyades perquè no poden arribar fins aquí soles. Quan ja portes molts

anys amb l’enfermetat costa donar-te la volta al llit,llavors també hi ha gent que

necessita una persona per donar-se la volta i llevar-se.

- Quins tractaments utilitza? Quins fàrmacs?

Tots prenem L-dopa o levodopa, però a partir dels cinc/sis anys l’efecte es

deteriora i és més dèbil. El que passa amb el Parkinson és que les neurones van

morint amb molta facilitat. La L-dopa fa que no es deteriori tant. Normalment,

s’administra amb pegatines i, sovint, es dóna amb pastilles o una bomba d’infusió.


74

- Quines teràpies no farmacològiques segueix?

Doncs aquí faig rehabilitació i logoteràpia. Fins fa poc es donava més importància

a la fisioteràpia, però últimament es treballa més la logoteràpia perquè la malaltia

també afecta a la parla: la part de la gola que controla la deglució i la respiració es

posa rígida i pot passar que l’aliment vagi a la part respiratòria, provocant

infeccions.

- L’enfermetat també afecta a la psicologia del malalt? Necessita ajuda

psicològica?

Pot haver-hi depressió però, entre els afectats que conec, no veig problemes

psicològics. Sobre tot la família i la parella, que reaccionen d’una forma negativa,

poden agafar depressió perquè el Parkinson té conseqüències en l’entorn ja que

el malalt deixa de ser la mateixa persona que abans (tendeix a ser més passiu).

- Aquesta passivitat del malalt, és una passivitat física (no pot fer una

cosa) o psicològica?

En el meu cas i en la majoria, és psicològica: em dic a mi mateix, he de fer això

però sóc incapaç d’arrencar, fins que arriba un moment semblant a un flash i

arrenco. És com un resort que falta. La voluntat en el Parkinson s’ha de buscar

molt, fa falta automotivar-se.

- Si li diguessin de participar en un assaig clínic, acceptaria a

participar?

Segurament sí, però m’ho pensaria. Si fos per provar un fàrmac de

manteniment,no ho faria perquè com estem amb la L-dopa ja estem bé. Hauria de

ser un fàrmac per a la curació ja que val la pena per tu i pels demés. Necessitaria

valorar els pros i els contres.


75

- Segueix alguna investigació sobre el Parkinson?

Respecte a la investigació pura, aquella que va dirigida a curar el Parkinson

(cèl·lules mare...) no ha sortit res i no se sap res que hagi realment. El que sí que

ha millorat és la dosificació de la L-dopa: s’han buscat maneres de subministrar-la

a través del pàncrees periòdicament. També hi ha un tractament quirúrgic

anomenat estimulació cranial profunda. És una intervenció cranial en la qual es fa

un forat al crani i es posa un elèctrode que es passa pel cap i activa la substància

negra del cervell per a que aquesta reculli millor la L-dopa. Però només s’aplica a

persones menors de setanta anys i amb uns requisits específics, sobretot físics.

- El tractament de cada malalt és personalitzat?

D’alguna manera sí, però sempre s’aplica el mateix tractament, la mateixa

medicació amb dosis diferents; excepte en l’estimulació cranial profunda que

només alguns se’ls pot aplicar. Hi ha tractaments que milloren la malaltia però no

hi ha ara mateix res que la curi totalment i tampoc tinc expectatives de que es

curi.

- Quants anys porta com a president de l’Associació de malalts de

Parkinson de l’Hospitalet i el Baix Llobregat?

Set anys. Abans ja havia sigut tresorer: redactava els llibres de comptes i d’actes

des del 2003. L’associació porta onze anys en funcionament.

- Quantes persones formen l’associació? Ve gent de fora de

L’Hospitalet?

Ara mateix som una mica més de vint persones però hem arribat a ser quaranta-

cinc. La majoria som de L’Hospitalet i de Cornellà, tot i que tenim persones de

Sant Boi i Barcelona.

- Coneix algun cas d’una persona jove amb Parkinson?

La veritat és que no. Perquè,normalment, el jove que té la malaltia i treballa, no ho

diu ja que sinó el podrien acomiadar.


76

- Quina és la mitjana d’edat en l’associació?

La mitjana d’edat és més o menys de setanta, una mica més. Hi ha persones que

tenen l’enfermetat des de fa 22 anys. A l’associació hi ha més homes que dones

perquè el Parkinson afecta una mica més a homes que a dones.

- Quin tipus d’ajut proporcionen a l’associació? Quines teràpies fan?

Els dilluns fem fisioteràpia i logoteràpia, el dimecres, musicoteràpia, i el dijous

tornem a fer fisioteràpia. L’associació, sobretot, dóna suport al malalt, informa de

que és el Parkinson,com evoluciona i com viure amb aquest.

- Reben ajuts de l’Administració?

No. Abans teníem una subvenció per a un fisioterapeuta però, per les retallades,

ens van treure l’ajuda i ara fem nosaltres mateixos la fisioteràpia. Al contrari que a

un malalt d’Alzheimer,a un malalt de Parkinson se li pot millorar la qualitat de vida,

però l’Administració no ens ajuda ni compta amb nosaltres.

- Estan emparats per la llei de dependència?

No, perquè no tenim un grau de dependència o minusvalidesa elevat. El que

pateix Parkinson es pot valdre per si mateix fins que l’enfermetat està molt

avançada. Ara mateix a l’associació estem en un percentatge del cinquanta per

cent de persones que venen acompanyades i cinquanta per cent que venen soles.

- Entre les associacions de malalts de Parkinson, fan alguna reunió per

a coordinar-se?

No, som independents entre nosaltres. De tant en tant, la Federació Espanyola

ens convoca per a un Congrés Nacional, però no ens marca cap directriu. Decidim

per nosaltres mateixos.


77

- En quins hospitals els atenen si tenen algun problema?

A mi m’atenen a l’Hospital de Bellvitge. Has d’anar amb una periodicitat perquè

els medicaments que et recepten s’han d’adaptar, per exemple la L-dopa. Un dels

problemes que té aquest medicament és que els efectes es passen de seguida,

per això després se li va afegir la carbidopa que feia que s’allargués la duració,

però igualment s’ha d’adaptar la medicació (augmentar la dosi). En el meu cas,

les pegatines de L-dopa, en un inici eren de 4mg i només portava una; ara porto

una de quatre i una altra de vuit.

- Els malalts de Parkinson, per informar-se de l’enfermetat, pregunten a

l’associació o al propi metge?

Com la diagnosi i el seguiment, els fa el metge, ell ja respon als dubtes, però com

tenen poc temps i utilitzen un llenguatge tècnic i poc usual, venen a l’associació ja

que podem respondre a les preguntes d’una forma més entenedora perquè som

més propers al ser també afectats pel Parkinson.


78

4. Conclusions

Després de realitzar tot el recull documental, explicar la part teòrica del Treball i

obtenir els resultats de les pràctiques, és el moment de confirmar o desmentir les

hipòtesis plantejades al principi del treball.

Respecte a la primera hipòtesi (la teràpia cel·lular és segura), tal i com explico a

l’apartat de medicina regenerativa i al de iPSC, actualment s’utilitza teràpia

cel·lular per a algunes malalties. Per tant, si tingués efectes secundaris o

provoqués reaccions a l’organisme, no s’empraria contra aquestes afeccions ja

que per a què un tractament es pugui aplicar a una malaltia, cal que aquest passi

una sèrie de controls: primer s’aplica en models in vitro al laboratori i després en

animals (és la fase preclínica), després d’uns quants anys on els resultats en

animals són bons, es passa a la fase clínica, en humans, i si el tractament resulta

ser eficaç en persones i sense efectes secundaris, es realitza el registre. La

teràpia cel·lular que ja ha passat tots aquests controls es converteix en tractament

i, conseqüentment, és segura.

També cal tenir en compte que les iPSC tenen l’avantatge que no suposen un risc

immunològic per al pacient, així que no produeixen rebuig immunològic o altres

reaccions al pacient, però, tot i això, tenen riscos, com una divisió incontrolada i la

producció de teratomes.

Malgrat tots aquests avenços i aplicacions que ja té la teràpia cel·lular, no hem

d’oblidar que les cèl·lules mare encara es troben sota investigació i que tenen els

seus riscos. Per tant, la teràpia cel·lular és segura, per a algunes malalties, però

utilitzar-la en altres malalties on no s’aplicava fins ara com a nou tractament

comporta riscos encara no solucionats.

La següent hipòtesi (és difícil tractar amb cèl·lules mare i les seves tècniques) es

respon en tota la part pràctica del Treball. Com es pot llegir en aquests apartats,

les tècniques que envolten les cèl·lules mare i amb les quals es tracten tenen

molts passos a seguir, el que augmenta la probabilitat d’error, i han de ser

realitzades amb molta cura, el que fa que sigui dificultós treballar-hi, com per

exemple diferenciar-les en el tipus cel·lular desitjat (apartat 3.1.2.2.).


79

A més, les possibilitats d’error són elevades perquè, com les cèl·lules no deixen

de ser organismes vius, no se sap amb certesa com reaccionaran a les diferents

substàncies ni si donaran els resultats esperats.

Per aquest motiu la hipòtesi inicial és certa: tractar amb cèl·lules mare és difícil,

no només per tots els minuciosos procediments que s’han de seguir sinó també

per la complexitat com a organisme viu.

Catalunya és un focus important d’investigació en el món sobre cèl·lules mare.

Aquesta hipòtesi es confirma gràcies a l’entrevista amb la doctora Malagelada i

pel fet que moltes investigacions que vaig consultar tenien participació catalana

(veure bibliografia).

A més, Catalunya consta d’una quantitat considerable de centres de recerca (com

el PRBB, l’Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona i els diferents centres

hospitalaris) gràcies a les inversions públiques i la qualitat del sistema de salut i

dels investigadors (malgrat la crisi, que les està reduint i empitjorant-ne la

qualitat).

El nombre de publicacions no és comparable amb el de grans països que donen

molt de suport a la recerca, com els Estats Units, el Regne Unit o el Japó, però és

considerable i fan de Catalunya un focus a tenir en compte.

L’última hipòtesi (és necessari continuar la investigació sobre cèl·lules mare i

malalties neurodegeneratives) es confirma al llarg d’aquest treball. Hi ha moltes

qüestions desconegudes sobre les cèl·lules mare, la seva diferenciació, la

progressió del Parkinson i els seus inicis, etc, que fan que el desenvolupament

d’aquests dos camps de la medicina es vegin ralentins. Així, es fa molt necessari

continuar la recerca de les respostes, tant a nivell teòric com pràctic, les quals es

puguin aplicar a la vida de les persones per sanar-les i avançar en la cura del

Parkinson i d’altres, com la malaltia del Huntington, l’Alzheimer o l’ELA, totes elles

en espera d’una solució. Per aquest motiu, també cal invertir en investigació. Per

tant, la investigació sobre cèl·lules mare i malalties degeneratives és necessària i,

fins i tot, una obligació per a l’avenç de la medicina, al societat i les persones.


80

En definitiva, la teràpia cel·lular podria ser una solució per al Parkinson, com es

pot veure a l’apartat de medicina regenerativa, teràpia cel·lular i Parkinson i en

l’entrevista a la doctora Cristina Malagelada, del departament de farmacologia de

la UB, i en l’estada al CMRB.

Per començar, hi ha precedents en ratolins i primats on es trasplantaven cèl·lules

dopaminèrgiques als seus cervells i milloraven els símptomes sense efectes

secundaris. Són una bona base per a continuar en la recerca d’un tractament.

A més, la teràpia cel·lular ja és un fet, com per exemple es fan sovint

trasplantaments de cèl·lules del moll de l’os, còrnia i pell.

En aquesta línia, s’estan desenvolupant aquelles investigacions sobre iPSC ja que

no causen rebuig en el pacient i s’obtenen fàcilment a partir de fibroblasts.

Constitueixen el següent pas en la investigació (actualment hi ha assajos clínics

per aplicar-les en humans, encara que estan en fase preclínica).

Per arribar a ser la solució, caldria corregir les mutacions o reaccions que causen

el Parkinson i evitar la transmissió de substàncies tòxiques entre neurones, que

en comprometria l’aplicació.

Ara bé, les cèl·lules mare com a tractament per restaurar les neurones mortes -ja

que generen noves cèl·lules- alberga esperances per al tractament de la malaltia i

la millora de la vida dels pacients, perquè en pocs anys s’ha avançat molt en la

investigació sobre cèl·lules mare i Parkinson i la perspectiva és bona, malgrat que

queda temps per l’aplicació i hi poden haver errors en aplicar-les.

Per tant, podem dir que la teràpia cel·lular és un possible tractament del

Parkinson en un futur, quan es coneguin les causes de la malaltia i aquestes es

puguin corregir per millorar els símptomes.

Conseqüentment, l’objectiu del meu Treball s’ha assolit i la resta de hipòtesis

plantejades s’han confirmat i matisat.

Ara bé, aquest treball tindria continuació, perquè és possible aprofundir més en

aspectes del Parkinson i les cèl·lules mare, per tal de solucionar els problemes

que encara plantegen, abans explicats.


81

Respecte el Parkinson, es podrien descriure més detalladament el seguit de

processos que donen origen a la malaltia i com funciona la neurona malalta de

Parkinson, la seva progressió, és a dir, la mort neuronal i tot el que desencadena,

a més de l’efecte dels fàrmacs a nivell cel·lular i de la persona.

Es podria aprofundir en les cèl·lules mare: explicant les reaccions que originen la

diferenciació i el desenvolupament embrionari. Però, en la meva opinió, no es

podria continuar aquest treball de recerca que uneix cèl·lules mare i Parkinson,

perquè no hi ha més investigacions i informació que desenvolupin aquesta idea i,

per tant, fins que no avenci la recerca en aquest àmbit, seria fer suposicions.

Aquest Treball de Recerca ha estat una molt bona experiència. L’estada al CMRB

va ser molt profitosa, tant personalment com per al treball ja que ha enriquit molt

el meu treball i he après molt amb els professionals. Ha suposat la meva primera

experiència en un laboratori realitzant investigació i el primer contacte amb el món

de la recerca. M’ha refermat en el meu interès per la investigació i per dedicar-

m’hi com a professió en el futur.

He après a buscar informació per tots els mitjans, contrastar-la, a decidir quina

d’aquesta informació era important per al meu treball i redactar, una tasca

imprescindible per transmetre els coneixements i arribar a les conclusions.

Malgrat la gran quantitat de feina que suposa un treball de recerca i la quantitat

d’hores que cal dedicar, crec que és una bona preparació per al futur. Ha suposat

una inversió de temps i treball profitosa, a més que ha respòs satisfactòriament a

les meves inquietuds per conèixer coses sobre les cèl·lules mare i el Parkinson.

El meu treball Cèl·lules mare i Parkinson constitueix una experiència enriquidora i

enormement positiva, que m’acompanyarà al llarg de la meva vida.


82

5. Fonts

Referències

- ABAD, María, et al. “ Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS

cells with totipotency features”. Nature (EEUU). 502, 2013, p.340-345.

- ARDUINI, Brigitte. Teratoma Assay. Estats Units: Rensselear Plytechnic

Institute, 2013.

- ATHAUDA, Dilan; FOLTYNIE, Thomas. The ongoing pursuit of

neuroprotective therapies in Parkinson disease. Regne Unit: Nature

Reviews, Macmillan Publishers Limited, 2014.

- BI, Kun, et al. Generation of transgene-free iPSCs from Parkinson’s

disease patients. Estats Units: Life technologies, 2013.

- Cèl·lules mare i medicina regenerativa, programa professors i ciència de

CatalunyaCaixa. Espanya: CMRB, 2014.

- CHO, Myung-Soo, et al. Efficient derivation of functional dopaminergic

neurons from human embryonic stem cells on a large scale. Corea del Sud:

Nature Publishing Group, 2008.

- DE LA CASA FAGES, Beatriz. Guía informativa de la enfermedad del

Parkinson. Espanya: Federación Española del Parkinson, 2013.

- GARCÍA, Pedro. “Prehistoria de la enfermedad del Parkinson”. Neuciencias

(Espanya), 2004.

- GOLBE, Lawrence, et al. Parkinson’s disease handbook. Estats Units: The

American Parkinson Disease Association, Inc, 2010.

- GRAZIA, Maria, et al. “α-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies

from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies”. Neurobiology

(Estats Units). 95, 1998, p.6469-6473.

- LANSKA, Douglas. History of Neurology. Estats Units: Elsevier B.V. , 2009

(Handbook of Clinical Neurology; 95).

- LIU, Guang-Hui, et al. “Progressive degeneration of human neural stem

cells caused by pathogenic LRRK2”. Nature Letters (Estats Units). 491,

2012, p.603-607.


83

- Logoteràpia y Parkinson: alteracions de la parla en la malaltia del

Parkinson. Espanya: Associació de malalts de Parkinson de L’Hospitalet i

del Baix Llobregat.

- MARTÍ, Mercè, et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte

dedifferentiation and proliferation. Estats Units: Nature Letters, 2010.

- MARTIN, Gail. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos

cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Estats Units:

Procl. National Academy of Science, 1981.

- MCCULLOCH, Ernest; FILL, James. The radiation sensivity of normal

mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow

transplantation into irradiated mice. Estats Units: Academic Press Inc,

1960.

- MCCULLOCH, Ernest, et al. A stochastic model of stem cell proliferation,

based on the growth of spleen colony-forming cells. Canadà: Departament

de biofísica mèdica de la Universitat de Toronto i Institut del càncer

d’Ontàrio, 1963.

- MEJÍA, Eva. Sessió informativa. Espanya: CMRB, 2014.

- Musicoteràpia i Parkinson: un projecte de rehabilitació mitjançant la música.

Espanya: Associació de malalts de Parkinson de L’Hospitalet i del Baix

Llobregat.

- ORENSTEIN, Samantha, et al. “Interplay of LRRK2 with chaperone-

mediated autophagy”. Nature Neurosciences (EEUU). 16, 2013, p.394-406.

- PARKINSON, James. An essay on the shacking palsy. Regne Unit, 1817.

- RAYA, Angel, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent

stem cells from human keratinocytes. USA: Nature biotechnology, 2008.

- REYNOLDS, Brent; WEISS, Samuel. “Generation of neurons and

astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous

system”. Science (USA). 255, 1992, p.27.

- SHULTS, Clifford. “Lewy bodies”. Proceedings National Academy os

Sciences (EEUU). 103, 2006, p. 1661-1668.

- SONG, Peipei, et al. “Perspectives on human clinical trials of therapies

using iPS cells in Japan: Reaching the forefront of stem-cell therapies”.

BioScience Trends: Japó. 7, 2014, p.157-158.


84

- Stem cell facts. Estats Units: International Society for Stem Cell Research,

2011.

- THOMPSON, James, et al. “Embryonic stem cell lines derived from human

blastocysts”. Science (USA). 282, 1998, p. 1145.

- Tipus de cèl·lules mare. Espanya: CMRB, 2014.

- WOLTJEN, Knut, et al. “piggyBac transposition reprograms fibroblasts to

induced pluripotent stem cells”. Nature (Estats Units). 458, 2009, p.766-

770.

- YAMANAKA, Shinya; KAZUTOSHI, Takahashi. “Induction of pluripotent

stem cells from mouse embryonic and adult fibroblasts cultures by defined

factors”. Cell (Japó). 126, 2006, p.663-676.

- YAMANAKA, Shinya, et al. “Induction of pluripotent stem cells from adult

human fibroblasts by defined factors”. Cell (Japó). 131, 2007, p.861-872.

Webgrafia

- EuroStem Cell. www.eurostemcell.org (25 de novembre i 2 de desembre

del 2014).

- Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona. CMRB. www.cmrb.eu (21

d’octubre i 1 de desembre del 2014).

- California’s Stem Cell Agency. Definiciones de célula madre.

http://www.cirm.ca.gov/our-progress/definiciones-de-c%C3%A9lulas-madre

(25 de novembre del 2014).

- Viquipèdia. Teràpia amb cèl·lules mare.

ca.wikipedia.org/wiki/Ter%C3%A0pia_amb_c%C3%A8l%C2%B7lules_mar

e (2 de desembre del 2014).

- Viquipèdia. Controvèrsia amb les cèl·lules mare.

http://ca.wikipedia.org/wiki/Controv%C3%A8rsia_amb_les_c%C3%A8l%C2

%B7lules_mare (2 de desembre del 2014).

- StemGen. International Database on the legal and socio-ethical aspects on

stem cells. www.stemgen.org (2 de desembre del 2014).

- National Institutes of Health. Stem cells Information. stemcells.nih.gov (25 i

29 de novembre i 2 de desembre del 2014).


85

- National Institutes of Health. National Center for biotechnology information.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (30 d’octubre del 2014).

- International Society for Stem Cell Research. www.isscr.org (2 de

desembre del 2014).

- Centre for Regenerative Medicine. Stem cells and Regenerative Medicine.

http://www.crm.ed.ac.uk/stem-cells-and-regenerativemedicine/regenerative-

medicine (2 de desembre del 2014).

- Generalitat de Catalunya. Diari Oficial de la Generalitat.

http://dogc.gencat.cat/ca (2 de novembre del 2014).

- Gobierno de España. Boletín Oficial del Estado. www.boe.es (2 de

novembre del 2014).

- BBC. First trial of embryonic stem cells in humans.

http://www.bbc.co.uk/news/health-11517680 (1 de desembre del 2014).

- Wikipedia. Stem cell. http://en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell (27 i 29 de

novembre i 2 de desembre del 2014).

- El Periódico. “Científicos suecos descubren nuevas vias para curación del

Parkinson”. http://www.elperiodico.com/es/noticias/sociedad/cientificos-

suecos-descubren-nuevas-vias-para-curacion-del-parkinson-3668945 (1 de

novembre del 2014).

- Nature. Pluripotent Stem Cells, iP Cells.

www.nature.com/scitable/topicpage/turning-somatic-cells-into-pluripotent-

stem-cells-14431451 (27 de novembre del 2014).

- Abcam. Antibodies and reagents. www.abcam.com (28 i 30 d’octubre i 1, 2 i

4 de novembre del 2014).

- Wikipedia. Malattia di Parkinson. it.wikipedia.org/wiki/Malattia_di_Parkinson

(3, 4, 5, 9, 24 i 30 de desembre del 2014).

- Associació Catalana per al Parkinson. www.acaparkinson.org ( 3 de

desembre del 2014).

Treball de recerca

Rosa Díaz

Cèl·lules mare i Parkinson: Annex

Julián Bobis Camacho

2n Batxillerat B,

Departament de Ciències

INS Santa Eulàlia

L’Hospitalet, gener 2015

Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho

2

Fotografies

Figura 3

DAPI PAX6 Superposició

Figura 4

DAPI SOX2 Superposició


3

3.1.3.2. Observació d’ iPSC en un microscopi confocal

La primera fotografia és

l’expressió del marcador DAPI.

En la imatge es pot veure la zona

més acolorida, que correspondria

quasi amb la totalitat de la imatge,

excepte aquelles parts en negre

de les cantonades superiors. És

un control de l’experiment per

assegurar-nos de la presència de

cèl·lules a la mostra.

La figura 13 representa la

manifestació de l’anticòs anti-

Nanog, que s’uneix a un factor de

transcripció molt relacionat amb

l’autorenovació i el manteniment

de l’estat pluripotent de les ESC.

Aquesta proteïna es codifica a

través del gen Nanog i es situa al

nucli. Com que és un factor propi

de cèl·lules pluripotents i

s’expressa en aquesta mostra,

indica que les cèl·lules d’aquesta

es troben en un estat no diferenciat i mantenen la propietat de multiplicar-se.

Figura 12

Figura 13


4

La imatge 14 és la manifestació

de la proteïna TRA-1-80 a la

cèl·lula. Aquesta proteïna es

situa a la membrana cel·lular de

les cèl·lules embrionàries.

Comparant aquesta il·lustració

amb l’anterior, es pot observar

que les parts més il·luminades

amb vermell aquí corresponen a

les parts amb un verd menys

intens a la figura 13. Aquest fet

afirma que en la colònia hi ha

cèl·lules que contenen

molècules pròpies de ESC, el

que es podria derivar en la confirmació de la seva potencialitat.

La figura 15 correspon a la

superposició de les expressions

dels tres anticossos anteriors. A

la imatge es visualitzen els

espais en vermell (citoplasma); el

color blau ens permet veure tots

els nuclis cel·lulars, mentre que

el verd, aquells que contenen

molècules pròpies de ESC

(extrem superior sobretot). Així

es pot fer una distinció en la

colònia de les cèl·lules no

pluripotents i aquelles que ho són.

Figura 14

Figura 15


5

L’indicador DAPI, tal i com es

mostra en la imatge 16 de

l’annex, es concentra al ben

mig de la il·lustració. Hi ha

altres cèl·lules al voltant però

ens interessen sobretot les

centrals. Gràcies a aquest,

podem conèixer la ubicació de

les cèl·lules a través del seus

nuclis, definir l’àrea que ocupa i

la seva grandària com a

control de concentració.

La següent fotografia, figura 17,

correspon a la expressió de

l’anticòs anti-Oct4. Aquest

anticòs s’uneix amb la proteïna

Oct4, molt lligada amb

l’autorenovació cel·lular i les

ESC (normalment s’utilitza com

a marcador de cèl·lules

indiferenciades). Per tant, si és

un marcador de cèl·lules no

diferenciades, i en aquesta

colònia es manifesta, podem dir

que aquestes cèl·lules es

troben en un estat no diferenciat, semblant al de les cèl·lules pluripotents.

Figura 16

Figura 17


6

Aquesta imatge, figura 18 és la

manifestació de l’anticòs anti-

SSEA3. La proteïna que

detecta és la SSEA3, un

glicoesfingolípid present en la

superfície de les ESC. Es

desprèn que aquesta mostra

conté el lípid i, per tant, conté

una molècula pròpia de les

ESC, indicant que les cèl·lules

de la colònia es troben en un

estat semblant a les cèl·lules

embrionàries i que podrien

tenir les mateixes

característiques que aquestes.

L’última imatge de la sèrie

(figura 19) és la superposició

de les tres fotografies

anteriors. En aquesta es pot

veure que al voltant dels

cossos cel·lulars d’un color

entre blau i verd hi ha punts

vermells que corresponen a la

proteïna de la membrana

cel·lular. Així la majoria de

cèl·lules de la colònia hi

expressen els tres marcadors.

Figura 18

Figura 19


7

L’esfingolípid SSEA3, tal i

com es pot observar en la

fotografia 22, es mostra en la

colònia repartidament.

S’acumula sobretot a la

cantonada inferior dreta i en

petits cúmuls a la resta de la

superfície. Això exposa que

les cèl·lules de la mostra

contenen el lípid propi de les

ESC en el seu cos cel·lular,

cosa que ens va confirmant

cada cop amb més força seva

naturalesa.

L’última figura, fotografia 23

de l’annex, és la exposició de

les tres fluorescències

anteriors. Els nuclis, ben

definits, tenen un color entre

blau i verd que confirma la

doble pertinença de DNA i

Oct4. Aquesta imatge permet

veure com al voltant dels

nuclis turqueses hi ha punts

vermells que delimiten el seu

citosol ja que els esfingolípids

es situen a les membranes

cel·lulars. Les cèl·lules en

divisió tenen diferenciat el color verd del blau per la concentració en els

cromosomes de l’ADN, i moltes no tenen al seu voltant punts vermells

(expressió del anti-SSEA3), fet que significaria que estan en procés de

diferenciació i han perdut característiques pròpies de cèl·lules pluripotents.

Fotografia 22

Figura 23


8

Figura 24


9

El marcador DAPI, figura 25,

s’expressa amb normalitat i es

defineixen els nuclis cel·lulars,

encara que una mica

difuminats perquè es tractava

d’una colònia amb volum, per

la qual els nuclis es

superposaven.

En aquesta imatge s’observa

l’expressió de l’anticòs anti-

Sox2, que s’uneix a una

proteïna essencial per a

detectar cèl·lules

embrionàries i pluripotents.

També està present en

cèl·lules mare neuronals. La

manifestació d’aquesta

proteïna (tant en la colònia

circular com a l’esquerra de la

fotografia) evidencia el

caràcter semblant a ESC de

les cèl·lules de la colònia, a

més de tenir molècules pròpies de NSC, el que indica que es troben en un estat

anterior a cèl·lules mare neuronals.

Figura 25

Figura 26


10


és la exposició de l’anticòs anti-

SSEA4 amb un fluorocrom

vermell. El SSEA4 és una

glicoproteïna situada a la

superfície de les ESC. Per tant,

la seva expressió en aquesta

colònia mostra que les cèl·lules

de la imatge són semblants a

les ESC, ja que sinó no tindrien

aquesta molècula en la seva

superfície i l’anticòs no s’hi

uniria.

La figura 28 correspon a

l’anticòs anti-TRA-1-60. Com la

molècula anterior, es situa a la

superfície de les ESC, per això

forma figures arrodonides amb

un buit interior on s’ubica el

nucli i el citoplasma. La seva

expressió és major que la de la

molècula anterior, tot i que es

manifesta de manera puntual

com a conglomerats no de

forma llisa com el Sox2 o el

DAPI. La ubicació d’ella en la

colònia indica unes característiques que s’assemblen a les d’una ESC.

Figura 27

Figura 28


11

La superposició de les quatre

fotografies anteriors es plasma en

l’última fotografia de la sèrie. En

aquesta s’observen figures arrodonides

de color verd blavós (nuclis) sobre un

fons groc amb punts vermells

(membrana plasmàtica). Aquesta

fotografia ens permet visualitzar quines

cèl·lules de la colònia tenen les quatre

molècules abans detectades per

caracteritzar-les

Observació d’EBS en un microscopi confocal

La primera fotografia, figura 30,

es tracta de l’expressió del

marcador DAPI en una colònia

de EBs. Tal i com es pot

observar a la imatge, la major

concentració de cèl·lules,

definides pel nucli, es situen al

centre, disminuint la

concentració cap als extrems.

Encara que la intensitat del

color és baixa als voltants del

centre, hi ha cèl·lules en ella i

Figura 30

Figura 29


12

cal tenir -les en compte.

La segona fotografia, figura

31, posa de manifest la

presència de la proteïna AFP

Aquesta proteïna es secreta

des del citoplasma cap a

l’exterior (per això els nuclis

cel·lulars estan enfosquits) en

la formació del fetge i l’intestí

durant el desenvolupament

embrionari indicant, així, que

és una molècula pròpia de

l’endoderm. Per tant, la seva

expressió en aquesta colònia

evidencia que hi ha teixit

endoderm en la colònia, sobretot al centre de la imatge on hi ha més intensitat

de color però també en una franja en diagonal. A més les cèl·lules ja estan

començant a adquirir una certa ordenació, símptoma que les cèl·lules s’estan

diferenciant i adquirint funcions característiques.


és la manifestació de l’anticòs

anti-FOX-2 unit a la proteïna

FOX-2, que indica divisió

cel·lular, ja que regula una part

de la transcripció i diferenciació.

La seva manifestació en

aquesta colònia fa palès que les

cèl·lules tenen capacitat per

dividir-se, reproduir-se i

diferenciar-se en tipus cel·lulars

més especialitzats.

Figura 31

Figura 32


13

L’última imatge d’aquesta tirada és la

superposició de les tres anteriors

(figura 33). Es pot observar com hi

predominen els verds i els tons

roses. Aquest fet s’explica perquè la

majoria de cèl·lules de la colònia

tenen la proteïna FOX-2 que les

diferencia cap a teixits diferenciats

d’un organisme adult, i la proteïna

AFP, característica de l’endoderm.

Així, es desprèn que les cèl·lules de

la fotografia es diferencien cap a teixit

endodèrmic.

En aquesta figura 34 que

mostra el marcador DAPI en

la colònia es veu que els

nuclis de les cèl·lules es

troben més separats i són

més grans que en imatges

anteriors. Aquest fet podria

presagiar una major

diferenciació que en mostres

anteriors ja que les cèl·lules

adultes són més grans que les

cèl·lules mare. Per la resta, la

seva manifestació és normal i

l’esperada.

Figura 33

Figura 34


14

La figura 35 ens aporta una

informació molt valuosa.

Primer, evidencia la presència

d’actina, una proteïna globular

que és un dels components

principals dels microfilaments

que formen la part contràctil

dels músculs. D’aquí es

desprèn el segon fet: intervé

en la mobilitat de molts tipus

cel·lulars, però en el nostre

cas, lligat al fet que es troba

en els músculs, fa d’aquesta

una proteïna molt típica del

mesoderm. L’àmplia manifestació de la actina en la colònia, el gran nombre de

filaments que es poden veure, l’alta definició i estructuració d’aquests

comporten que les cèl·lules de la imatge són pròpies del mesoderm i tenen

característiques d’aquesta capa germinal.

La superposició de les anteriors

imatges, figura 36, permet

visualitzar la ubicació dels

microfilaments segons el nuclis

cel·lulars. L’amplitud dels nuclis

també es veu reflectida a la extensió

dels citoesquelets d’aquestes i, per

tant, dels seus citoplasmes, més

allargats que amples (típic de les

cèl·lules musculars del teixit

muscular estriat).

Figura 35

Figura 36

cèl lules mare i parkinson

Documents