carrera de especializacion en biotecnologia...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEN-INTI

Materia de Especialización CEBI_E4b

Ingeniería Genética y Metabólica

Módulo Ingeniería Metabólica

Docente a cargo: Dra. Ana Paula Domínguez Rubio

• Manipulaciones genéticas manipulación de los procesos

metabólicos con el objetivo de mejorar las propiedades de los

organismos de interés biotecnológico

• Se modifican o introducen nuevas reacciones bioquímicas

específicas mediante tecnología recombinante para mejorar

propiedades celulares

• Ventaja de las bacterias haploides

Ingeniería genética y metabólica

Regulación de vías celulares

• Mecanismos de regulación de procesos de síntesis que le permiten al

organismo evitar el exceso de producción de un compuesto

- Ventaja evolutiva: si no se evitara sería una pérdida de recursos y

energía (suelen ser escasos en los ambientes naturales)

• Mejoramiento de cepas industriales con el objetivo de lograr la

SOBREPRODUCCIÓN

• Aumento de productividad:

1) Manejo nutricional: suministro controlado de sustrato limitante o

cofactores enzimático

2) Ingeniería Genética y Metabólica: manipulación genética

Mecanismos de regulación en bacterias

(a) Ambiente extracelular: recursos (fuente de C, H, O, N)

y condiciones (pH, temperatura)

(b) Barreras de

permeabilidad:

transporte

(c) Expresión

genética

(cromosomas,

plásmidos)

(d) Interacción

con otros

metabolitos

. Degradación de polímeros heterogéneos

hasta azúcares simples

. Fermentación simultánea de una mezcla

de azúcares

. Tolerancia a la concentración creciente

del producto final y a las condiciones del

proceso de fermentación

Características ventajosas de los microorganismos

usados en procesos biotecnológicos

¿Cómo se lograron cepas mejoradas a lo largo de la historia?

-Agentes físicos Radiación ionizante (rayos

gamma) y no ionizantes (UV)

-Agentes químicos agentes que reaccionan

con el DNA

¿Cómo se lograron cepas mejoradas a lo largo de la historia?

Del laboratorio a la industria…

Producción a gran escala

Fermentadores

Mejoramiento de cepas

y

optimización de condiciones

Producción a pequeña escala

Marco más general…

Productos microbianos de importancia industrial

Metabolitos primarios y secundarios

• Metabolitos primarios producidos durante la

fase exponencial

• Son considerados esenciales para el crecimiento (ej.:

alcoholes formado como parte del metabolismo

energético)

- Aminoácidos, vitaminas y solventes orgánicos

• Metabolitos secundarios: producidos durante la

fase estacionaria

• No son esenciales para el crecimiento y la

reproducción. Su formación depende de las

condiciones de crecimiento y en general su

producción se encuentra reprimida.

- Antibióticos

Productos microbianos de

importancia industrial

• Enzimas

• Metabolitos primarios

- Aminoácidos (Lisina y Glutamato)

- Vitaminas (B12 y B2)

- Solventes orgánicos (ácido acético, etanol)

• Metabolitos secundarios

- Antibióticos

Metabolitos primarios: aminoácidos

-Triptófano: soluciones intravenosas; antioxidante; precursor de la melatonina

-Ácido glutámico: soluciones intravenosas, potenciador de sabor, ablandador de carne, aditivo

para alimento balanceado

- Otros se obtienen por síntesis química como la glicina (precursor herbicida glifosato)

1) La extracción de aa de hidrolizados de proteínas es costosa

2) La síntesis química resulta en mezclas racémica ópticamente inactivas

D-aa y L-aa

- Puede ser por 3) fermentación o por 4) síntesis enzimática

- Las plantas son producen poca cantidad de lisina, metionina y triptófano

La producción microbiológica produce aa estereoespecíficos

L-aa biológicamente activos

¿Por qué la producción microbiológica de

aminoácidos?

Obtención de aa

1) Extracción

2) Síntesis química

3) Fermentación,

4) Catálisis enzimática

Biosíntesis de Aminoácidos

4) Síntesis enzimática 3) Fermentación

Fermentación en sentido biotecnológico y

no en sentido fermentación-respiración celular

El esqueleto carbono de los aminoácidos deriva de

precursores provenientes de tres vías metabólicas:

Biosíntesis de Aminoácidos

- Las plantas y las bacterias

sintetizan todos los aa

- Los mamíferos sólo

sintetizan 10 de los 20 aa

3) Ciclo Krebs

(aerobiosis)

1) Glucolisis

(anaerobiosis)

2) Camino de pentosas

In vitro: en tubo de ensayo a partir de enzimas

purificadas a partir de orgarismos

In vivo: en microorganismos con sustratos

específicos

Síntesis enzimática de aa

Sustrato Producto

2 opciones

- Aumentar la expresión de

enzimas que provenn

precursores

-Aumentar la expresión de

enzima limitante

limitante

- Aumentar la expresión de

punto ramificación

- Introducción de enzima

heteróloga que no sea

inhibida por el producto

- Introducción de nuevas

enzimas para favorecer la

catálisis

¿Cómo se logra incrementar la

productividad del proceso metabólico ?

Algunos ejemplos…

1) Introducir enzimas para aprovechar

nuevos sustratos

• HCE promoter: promotor fuerte constitutivo

• pgsA: proteína de anclaje del complejo poli-

Ɣ-glutamato sintetasa de Bacillus subtilis

• amyA: α-amilasa de Streptococcus bovis

• Km r: gen de resistencia a kanamicina

• Hom: homoserina deshidrogenasa de C.

glutamicum

• sacB: levansacarasa de Bacillus subtilis

C. glutamicum es una

bacteria gram-positiva

que originalmente se la

caracterizó por su

secreción de aa

Objetivo: Expresar la enzima α-amilasa en la superficie bacteriana para

que pueda sintetizar y secretar al medio externo un aa de interés a partir de

almidón


nuevos sustratos



almidón

Result of the Western blot analysis of

PgsA–AmyA fusion protein.

-Lanes 1 and 4 marker proteins,

-Lanes 2 and 3 cell wall fractions of

wildtype C. glutamicum and Δhom::HPA,

respectively.

The molecular sizes of the PgsA and AmyA

proteins were approximately 43 and 78 kDa,

respectively, and that of the PgsA-AmyA fusion

protein, therefore, was predicted to be

approximately 121 kDa.

SDS-PAGE using an 8% (w/v) gel and stained with the primary rabbit anti-AmyA antibody

followed by staining with the secondary goat anti-rabbit IgG conjugated with alkaline

phosphatase


nuevos sustratos



almidón

WT

mutante

WT

mutante

Fermentación de L-lisina con almidón soluble como la única fuente de C

WT

mutante

WT

mutante

2) Mutar genes para aumentar la expresión

de enzima limitante

También en C. glutamicum

Objetivo: mutar el promotor de la enzima DHPS (enzima limitante) para aumentar

el número de copias de las mismas y con ello su actividad

Dihydrodipicolinate

synthase

Objetivo: mutar el promotor de la enzima DHPS (enzima limitante) para aumentar

el número de copias de las mismas y con ello su actividad

WT

2) Mutar genes para aumentar la expresión

de enzima limitante

Objetivo: Aumentar la síntesis

de algún aa aromático de

interés

También en C. glutamicum

3) Mutar genes para desfavorecer vías

metabólicas que conduzcan a productos

indeseados

Esquema de metabolismo conversión a L-triptófano, L-fenilalanina y L-tirosina en

C. glutamicum. La líneas punteadas indican inhibición feedback negativo.

3) Mutar genes para desfavorecer vías

metabólicas que conduzcan a productos

indeseados

Esquema de metabolismo conversión a L-triptófano, L-fenilalanina y L-tirosina en

C. glutamicum. La líneas punteadas indican inhibición feedback negativo.

4) Incrementar el número de enzimas

mediante sobreexpresión

Esquema de la ingeniería metabólica para la producción de L-triptófano en C.

glutamicum.

5) Incrementar los genes de las enzimas

de vías que proveen precursores

5)

Ej.: Sobreexpresion de

enzimas en la ruta de las

pentosas (transcetolasa)


glutamicum.

6) Mutar genes para inactivar al transportador

6)


glutamicum.

5) Incrementar los genes de las enzimas

de vías que proveen precursores

3) Mutar genes

para desfavorecer

vías metabólicas

que conduzcan a

productos

indeseados

6) Mutar genes para inactivar al

transportador

3)

3)

4) 6) 4)

5)

4) Incrementar el

número de enzimas

mediante

sobreexpresión

Metabolitos primarios: vitaminas

- Se utilizan como suplemento alimenticio y producto

farmaceútico

Producción Microbiológicas: Vitamina B12 y Riboflavina B2.

Todas las otras se pueden producir ya sea por extracción desde fuentes

naturales o por rutas de síntesis química

Vitamina B12 (metilcobalina):

-Es una vitamina esencial (cofactor de enzimas mutasas )

-Es sintetizada únicamente por microorganismos

-Estructura química compleja, requiere 70 reacciones

químicas

-Se extrae como subproducto de la fermentación de

distintos antibióticos empleando cepas de streptomyces

con bajos rendimientos

Vitamina B12 (metilcobalina):

-Estructura química compleja, requiere 70

reacciones químicas

Diseño de una ruta biosintética heteróloga

a) Se selecciona un hospedador para la ruta de biosíntesis

heteróloga considerando:

- La capacidad de suministro de precursores y cofactores

- Las herramientas de ingeniería genética disponibles

- La capacidad de fermentación a escala industrial,

utilizando una fuente de carbono barata y fácilmente

disponible


b) La actividad de la enzima se

verifica in vitro y posteriormente in

vivo.

Se detectan productos del ensayo in

vitro o in vivo mediante análisis

espectroscópico, espectrometría de

masas o ensayos microbiológicos.


c) Se ensamblan los genes de interés y

otros elementos funcionales en

plásmidos o se los integra al genoma.

Para construir la ruta metabólica, se

divide en módulos separados. Estos

módulos se verifican secuencialmente en

un por separado y luego se los

ensambla.

Ribosomal Binding Site

CoDing Sequences


d) Sobre la cuantificación de los metabolitos,

se deben eliminar los cuellos de botella y se

debe integrar el flujo metabólico para apuntar

a la maximización del compuesto

Para optimizar la expresión génica en la vía

metabólica, se diseñan promotores, RBS y

número de copias de genes.


e) Las características de las cepas diseñadas se verifican

mediante fermentación.

Varios sustratos (i.e, ALA, iones de cobalto, betaína y

DMB) y condiciones (i.e, concentración de oxígeno

disuelto, pH y temperatura) pueden ser optimizado para

mejorar el rendimiento y la productividad

Metabolitos primarios:

ácidos orgánicos y solventes

Principales ácidos orgánicos y solventes

producidos por microorganismos

1. Acido cítrico

2. Acido acético

3. Acido láctico

4. Acido succínico

5. Acido propiónico y butírico

4. Acido succínico

6. Etanol

7. Butanol

8. Acetona

9. 1,2 y 1,3 propanodiol

10. 2,3 butanodiol

Etanol

-Obtención desde levaduras a partir de azúcares

Levaduras:

Saccharomyces spp.

Bacteria:

Zymomonas mobilis

¡Bacterias capaces de producir alcohol desde distintos sustratos

con alto rendimiento!

Pasteur

(1822-1895)

-Uso medicinal, químico y combustible (bioetanol)

¡Igual tolerancia y mayor

productividad que levaduras!

Investigaciones en bacterias durante los últimos 20 años:

Etanol

Se busca:

-Fermentaciones continuas con reciclado de levadura

-Ídem con vacío para evaporar etanol

-Levaduras inmovilizadas

Búsquedas de nuevas cepas:

-Toleren etanol

-Fermenten azúcares rápidamente

-Capaces de flocular

Enzimas claves: piruvato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa

Levaduras: Saccharomyces spp.

Etanol

Bacteria: Zymomonas mobilis

Bacilo gram negativo aerobio facultativo

Metabolismo fermentativo obligado con producción de etanol

Algunos fermentan sacarosa

Producen 2 moles de etanol y 2 de CO2 por mol de glucosa producción

de etanol del 10-12%

Genoma completo desde el 2005 (2,06 Mb)

Desde 1970 1400 trabajos publicados

•Vive sobre plantas como el cactus Maguey. Fermenta el jugo de

maguey produciendo el pulque: una bebida alcohólica de alta

graduación, espesa y de color blanco

Etanol

Tipo de glucólisis más común

Vía de Embden-Meyerhof,

Es una ruta metabólica

alternativa.

Es exclusiva de un número

reducido de microorganismos

que carecen la vía de

Embden-Meyerhof

Vía de Entner-Doudoroff

Z. Mobilis utiliza

esta vía

exclusivamente

Productos de fermentación de Saccharomyces vs. Zymomonas

Etanol

Zymomonas mobilis Saccharomyces carlsbergensis.

Etanol

-Uso medicinal, químico y combustible (bioetanol)

Combustible (bioetanol): al 95% puede ser usado como combustible

Agotamiento de las

reservas de petróleo

incremento del precio

$

Programas gubernamentales de búsqueda de nuevas fuentes de

energía

Etanol

$

Primera generación de bioetanol

Fuente: Nancy I. López

Etanol

Segunda generación de bioetanol: cambio de materia prima

No pueden usar pentosas

eficientemente

Menos susceptible a

manipulaciones genéticas

Diferentes requerimientos de

oxígeno durante crecimiento y

producción de etanol


Etanol

Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis

Escherichia coli

+

Genes recombinantes para

la síntesis de etanol

pentosas

hexosas

etanol

pentosas

hexosas

etanol


Etanol

Zymomonas mobilis

+

Genes recombinantes para usar lignocelulosa

Glucosa

Frutosa etanol

lignocelulosa

Lignocelulosa o biomasa

lignocelulósica:

materia vegetal seca

Materia prima más abundante

disponible en la Tierra para la

producción de biocombustibles

Objetivo: lograr un microorganismo productor de etanol a partir de la

fermentación de todos los azúcares (glucosa, manosa y xilosa)

liberados de la biomasa lignocelulósica para la producción bioetanol.

Bioetanol

etanol lignocelulosa

Zymomonas mobilis

Objetivo: lograr un microorganismo productor de etanol a partir de la

fermentación de todos los azúcares (glucosa, manosa y xilosa)

liberados de la biomasa lignocelulósica para la producción bioetanol.

Bioetanol


Zymomonas mobilis


Manosa Frutosa

E. coli

Introducem genes que

codifican enzimas

catabólicas

Zymomonas mobilis

recombinante

Pgap: promoter of the Z.

mobilis glycelaldehyde-3-

phosphate dehydrogenase

Gene (promotor fuerte)

manA: E. coli

phosphomannose

isomerase gene

Frk:

Z. mobilis

fructokinase

gene

Manosa

y

fructosa

Cell growth and fermentation of mannose or a mixture

of glucose and mannose in Z. mobilis carrying the

mannose catabolicenzyme genes.

Bioetanol

Residual glucose

Accumulation of ethanol

Growth of strain

Residual mannose


of glucose and mannose in Z. mobilis carrying the

mannose catabolicenzyme genes.

Bioetanol

Residual glucose


Growth of strain

Residual mannose

Capacidad de co-fermentar

manosa y glucosa


of glucose and mannose in Z. mobilis integrated with

manA

Bioetanol

Residual glucose


Growth of strain

Residual mannose

Integración de E.

coli manA en el

ADN cromosómico

de Z. mobilis


of glucose and mannose in Z. mobilis integrated with

manA

Bioetanol

Residual glucose


Growth of strain

Residual mannose

Integración de E.

coli manA en el

ADN cromosómico

de Z. mobilis


manosa y glucosa

Pgap: promoter of the Z.

mobilis glycelaldehyde-3-

phosphate dehydrogenase

Gene (promotor fuerte)

xylA, xilb, tal y tkt A:

E. coli genes.

Para conferirle habilidad que fermente xilosa:

introducción de 4 genes

Xilosa

Cell growth and fermentation of glucose or a mixture

of glucose and xylose in Z. mobilis carrying the xylose

catabolic enzyme genes

Bioetanol

Residual glucose


Growth of strain

Residual xylose


xilosa y glucosa

Fermentation profiles for glucose, xylose, mannose, and their

indicated mixtures in Z. mobilis harboring mannose and xylose

catabolic enzyme genes

Bioetanol

Residual glucose Residual xylose Residual mannose

Growth of strain Accumulation of ethanol

Capacidad de

co-fermentar

manosa ,xilosa

y glucosa

Time courses of 25-ml-scale continuous fermentation using 9:1

acid hydrolysate–RM medium in a reactor packed with immobilized Z.

mobilis [sucZE2::manA, pZA22-xtR]

Bioetanol

Residual glucose Residual xylose Residual mannose



manosa ,xilosa y glucosa

Hidrolizado ácido real

preparado a partir de

materia prima celulósica

que contiene glucosa,

manosa y xilosa.

Metabolitos primarios:

ácidos orgánicos y solventes

•Mantener alta productividad

•Requerir bajos requerimientos nutricionales

Ácidos orgánicos:

•Tolerar alta concentración de ácidos

¿Qué cepa a utilizar?

Ácido acético (vinagre)

Latín vīnum y ācrem, (vino agrio). Aunque no sólo se elabora a partir

del vino, cualquier otra bebida alcohólica puede emplearse como

base, como por ejemplo la cerveza para producir vinagre de malta y

también algunas frutas o verduras.

https://es.wiktionary.org/wiki/vinum#Lat%C3%ADn

https://es.wiktionary.org/wiki/acer#Lat%C3%ADn

Levaduras

(Saccharomyces cerevisiae)

Fermentación alcohólica

anaerobiosis

Ácido acético (vinagre): fermentación mixta

Bacterias del Ácido

acético (AAB)

(Acetobacter spp.,

Gluconobacter spp.)

Fermentación ácido

acética

aerobiosis

PQQ-ADH

pyrroquinoline quinone-

dependent alcohol

dehydrogenase

Ácido acético

Oxidación de etanol a ácido acético

PQQ-ADH is a key enzyme in the ethanol oxidase

respiratory chain of acetic acid bacteria

Ácido acético

Objetivo: sobreexpresar 2 subunidades de la

enzima PQQ-ADH (adhA y adhB) con el fin de

lograr aumentar la producción de ácido acético

Padh: promoter region of the

operon coding for PQQ-ADH

from A. pasteurianus

Ácido acético

Construction of recombinant plasmid PBBR-adhA-adhB.

Padh 367 bp

adhA 2226 bp

adhB 1419 bp

PCR amplification products shown by agarose gel

electrophoresis.

Ácido acético

M marker (bp)

1 Padh

2 adhA

3 adhB

Padh 367 bp

adhA 2226 bp

adhB 1419 bp

Verification of recombinant plasmids by restriction enzyme

digeston

Ácido acético

Lanes:

M 8-kbp marker

1 PBBR-adhA digested with Bam HI and Spe I

2 PBBR-adhB digested with Spe I and Xba I

3 PBBR-adhA-adhB digested with Bam H I.

Padh 367 bp

adhA 2226 bp

adhB 1419 bp

SDS-PAGE of recombinant protiens over-expressed in the

genetically engineered strain

Ácido acético

Lanes:

M molecular weight marker (KDa)

1 and 2 original strain

3 engineered strain

Comparison of fermentation parameters in the original and

engineered strains.

Ácido acético

original strain

engineered strain

Ethanol content

original strain

engineered strain original strain

engineered strain

Comparison of 2D-PAGE patterns between original

engineered strains.

Ácido acético

Protein spots whose expression level changed more than 50% were identified

as differentially expressed proteins.


engineered strains.

Ácido acético

El objetivo es separar las proteínas mediante un gel con gradiente de pH en

condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico

(isoelectroenfoque) y por su peso molecular en gel de poliacrilamida al 12%

con SDS (SDS-PAGE).


engineered strains.

Ácido acético

El punto isoeléctrico (pI) de un proteína es su pH cuando su carga neta es 0 y no

se desplaza cuando se le aplica un campo eléctrico. �

En un gel con un gradiente de pH, tanto los extremos N y C terminal como las

cadenas laterales ionizables de las proteínas captan o liberan protones de

acuerdo con el pH, de modo que la carga eléctrica global de las proteínas

dependerá del pH del entorno.

A medida que las moléculas de proteína se van acercando a su punto

isoeléctrico irán perdiendo carga eléctrica o ganando cargas de signo contrario,

hasta llegar al valor de pH en que la carga neta sea cero y las proteínas dejen

de moverse y se focalizan.


engineered strains.

Ácido acético

Nineteen representative differentially

expressed protein spots were identified

Differentially expressed protein spots were analyzed by tandem mass

spectrometry (MS/MS) and the peptide fingerprint spectrum was identified. The

Swiss-Prot protein database was used to search for peptides; 17 of the 19

queried peptides matched those in the database.

spots

Metabolic Flux Analysis

Ácido acético

El gen de la alcohol deshidrogenasa de A. pasteurianus se modificó mediante la

ingeniería genética aumentando la producción de etanol

TCA

Con un análisis de flujo metabólico de

las vías del etanol y la glucosa, los

resultados revelan que la sobreexpresión

de PQQ-ADH es una manera efectiva de

mejorar la vía de la cadena respiratoria de

oxidación de etanol.

Sin embargo disminuye los flujos de

diversos ácidos orgánicos en el ciclo del

ácido tricarboxílico (TCA) en omparación

con la cepa original

.

Para concluir…

• Es menos corrosivo y tiene una menor presión de vapor

• No absorbe agua Mezcla con gasolina sin separación de fases

• Se puede añadir en la refinería y ser transportados y entregados a través

de la infraestructuras existentes

•Mayor energía

•No requiere modificaciones para los motores de automóviles.

Ventajas del butanol frente al etanol

Factores que limitan la producción industrial de butanol:

Alto costo de la materia prima y bajo rendimiento por toxicidad del

solvente

El etanol hasta ahora ha servido como un combustible alternativo debido a

que su proceso de fabricación es fácil y rentable

El butanol, sin embargo, se considera más cercano al combustible fósil en

términos de su densidad energética e higroscopicidad

Limitaciones a la producción: toxicidad del etanol y butano

• Efecto citotóxico del etanol es la razón por la cual se puede usar como

desinfectante y preservante.

• Desventaja en procesos fermentativos

• Citotoxicidad desde efectos reversibles a muerte celular

• Butanol más toxico desestabiliza membrana e interfiere con transporte

• Efectos: alteraciones en metabolismo de fosfolípidos y de ácidos grasos

membrana principal blanco

• Costo en el proceso de fermentación: disminución de tasa de producción a

medida que el producto se acumula

• Organismo a utilizar tolerar altos niveles para producción a escala industrial

Butanol

Fermentación acetona-butanol-etanol (ABE)

Clostridium acetobutylicum

• Bacilos Gram positivos, anaerobios obligados y formadores de esporas

• Usada por Jaim Weizmann en la producción de acetona y biobutanol a partir

de almidón en 1916 (producción de pólvora y TNT: trinitrotolueno).

• Especie más usada para producción industrial.

n-butanol ha sido tradicionalmente producido por Clostridium

acetobutylicum a través de la fermentación ABE

Butanol

Objetivo: modificar genéticamente a E. coli

para la producción de butanol

Butanol

Conversion of butyryl-CoA to butanol

is more efficiently done by alcohol

dehydrogenase from C.

acetobutylicum as compared to the

corresponding native enzyme of host E.

coli due to its higher affinity towards the

butyryl-CoA than the acetyl-CoA

E. coli

C. acetobutylicum


Escherichia coli

+


la síntesis de butanol butanol

butanol

Ácidos

grasos

Ácidos

grasos

Butanol

<

-3 genes from C. Acetobutylicum were cloned in a vector and expressed in E. coli:

1) an operon containing phosphotransbutyrylase (ptb) genes

2) butyrate kinase (buk) genes

3) aldehyde-alcohol dehydrogenase (adhE2) gene


Escherichia coli

+


la síntesis de butanol butanol

butanol

Ácidos

grasos

Ácidos

grasos

(A) The DH5a strain containing test and control plasmids were grown in LB

medium in presence or absence of IPTG and analyzed for the expression of

aldehyde/alcohol dehydrogenase (AdhE2) and butyrate kinase (Buk) containing

6-histidine tag on Western blot.

Efficient expression of clostridial pathway enzymes

in E. coli

Butanol

Lane M – Molecular weight marker;

lane 1 – pQE30 – IPTG;

lane 2 pQE30 + IPTG;

lane 3 – pQE-adhE2/ptb/buk – IPTG;

lane 4 – pQE-adhE2/ptb/buk + IPTG.

IPTG.= inductor

Wstern blotting was performed to assess the expression of two enzymes, Buk (whose

gene was placed at the 3’end of ptb-buk operon) and AdhE2, where 6-histidine tag was

incorporated during cloning.

Clear bands corresponding to the molecular weight of Buk (~39 kDa) and AdhE2 (~96

kDa) were observed on Western blot using antibody against 6-histidine tag indicating

their efficient expression in E. coli

(~39 kDa)

(~96 kDa)

The grown cells in the LB medium were permeabilized with chloroform and

analyzed for the activity of phosphotransbutyrylase

Activity of phosphotransbutyrylase (Ptb), Buk and AdhE2

Butanol

Significant enzyme expression and their activities were also observed in the

uninduced cells, suggesting the leaking expression of these enzymes.

C) Cells containing control and test plasmids were grown in LB medium

containing 10 mM butyric acid and samples were withdrawn after 48 h and 120 h

to test for butanol production.

Activity of phosphotransbutyrylase (Ptb), Buk and AdhE2

Butanol

Both Ptb and Buk enzymes were reversible in nature and might be diverting some

of the internal butyryl CoA pool of E. coli into butyrate.

Butyrate tolerance level of engineered E. coli. The strain containing pQE-

adhE2/ptb/buk plasmid was grown under anaerobic condition and resuspended in

TB medium containing various concentration of butyric acid and 100 mM glycerol to

achieve OD of 1

Tolerance level of butyric acid to the E. coli host strain

Butanol

Butyric acid

concentration beyond

100 mM was inhibitory

to both cell growth

and butanol

production

Butyrate tolerance level of engineered E. coli. The strain containing pQE-

adhE2/ptb/buk plasmid was grown under anaerobic condition and resuspended in

TB medium containing various concentration of butyric acid and 100 mM glycerol to

achieve OD of 5

Tolerance level of butyric acid to the E. coli host strain

Butanol

Butyric acid

concentration beyond

100 mM was inhibitory

to both cell growth

and butanol

production

Four fold higher cell density at the time of induction and butyric acid

addition did not improve the tolerance level beyond 100 mM

Engineered E. coli MG1655 (pQE-adhE2/ptb/buk) strain was grown under anaerobic

condition and resuspended in Terrific Broth with 40 mM butyric acid and 40 mM of

either glucose or glycerol as electron donor. Various substrates consumed and

butanol produced were analyzed through HPLC after 120 h of incubation. The

butanol yield was calculated with respect to (wrt) each carbon source.

Substrate specificity and substrate ratio for butanol

production

Butanol

Different ratios of glycerol and butyric acid were tested for production of

butanol using cells at the OD of 1.0.

Substrate specificity and substrate ratio for butanol

production

Butanol

1.5:1

Different butyric acid concentrations were tested for production of butanol using

cells at the OD 600 600 of 10 by keeping the glycerol to butyric acid ratio fixed at

1.5:1.

Since glycerol to butyric acid ratio of 1.5:1 worked best for butanol production,

we analyzed the effect of increased biocatalyst on butanol production when higher

amount of substrates in the same ratio was used.

Butanol

. Maximum butanol concentration of ~60 mM

was obtained when butyric acid concentration in the

medium was 90 mM (Figure 4C).

Various short chain fatty acids were added in the growth medium (i.e. Terrific

broth + 45 mM glycerol) of E. coli carrying control or the test plasmid and their

conversion to the corresponding alcohol were monitored through HPLC or GC.

Butanol

Substrate specificity of engineered cells towards various

short chain fatty acids.

Butanol

Strain specificity of engineered cells on the uptake of

butyric acid and production of butanol.

Tested three commonly used laboratory E. coli strains, i.e., E. coli M15, E. coli

MG1655 and E. coli B, for their ability o convert butyric acid into butanol when

transformed with pQE-adhE2/ptb/buk plasmid.

Butanol

Production of butanol in the bioreactor in batch and

continuous mode

OD of 1.0.

OD of 10 To improve the titer and

productivity of butanol

Though the

butanol production

rate was

considerably lower

than what is

expected at the

commercial scale

¡OPTIMIZACIÓN!

OD of 10

Continuous production of butanol by cell

recycling through hollow-fiber cassette.

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