UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTÍN

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas “Dr. Rodolfo A. Ugalde”

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL MOTIVO CEST EN

LA PROTEÍNA TCLP1 DE TRYPANOSOMA CRUZI

Tesis para optar por el Título de Licenciado en Biotecnología de la Universidad Nacional de General San Martín.

Autor: Raúl Takada

Director: Carlos A. Buscaglia

Co-Director: Gabriel Briones

2017

Agradecimientos

Agradezco a Carlos (Dr. Carlos A. Buscaglia) por darme la oportunidad de trabajar en su

grupo de investigación, y formarme como profesional. Y por sobre todo la paciencia que tuvo

al trabajar juntos.

Al Dr. Gabriel Briones que ha colaborado con nosotros, siempre dispuesto a ayudarnos y

resolver nuestras dudas.

A toda mi familia que me ayudaron a terminar la carrera, a mi novia Silvia que siempre me

da fuerzas para seguir, y no abandonar.

A Mili que me enseñó que es un laboratorio y dar mis primeros pasos, me enseñó cómo

trabajar en la mesada y siempre me ayudó muchísimo.

A mis compañeros de mesadas que siempre estuvieron dispuestos a ayudarme: Vir,

Pablito, y Maite.

A todos los del laboratorio del piso 2 y también los del piso 1, que siempre les pedí ayuda y

me prestaron reactivos o me dieron una mano.

A todos mis amigos de la infancia, nuevos amigos, y todas las personas que me ayudaron a

terminar este trabajo.

ÍNDICE

Introducción Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y enfermedad de Chagas 1 Tratamiento anti‐T.cruzi 2 Ciclo de vida de T.cruzi 2 El flagelo y el bolsillo flagelar de T. cruzi y tripanosomátidos 4 TCLP1 (Trypanosomatid CesT‐like Protein1) de T. cruzi 5 Sistema de secreción tipo 3 (T3SS) de enterobacterias 10

Hipótesis 15

Objetivos 16

Materiales y métodos 17 Soluciones generales y medios de cultivo 17 Técnicas de biología molecular 17

Preparación de Escherichia coli (E. coli) DH5αF' competentes 17 Transformación E. coli DH5αF' por el método de “shock térmico” 18 Minipreparación estándar de plásmidos 18 Minipreparación de plásmidos por precipitación con polietilenglicol 18

Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) 19 Electroforesis de ADN en geles de agarosa nativos 19 Digestión de ADN con enzimas de restricción y defosforilación 19 Cambio de buffer y purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa 19 Ligación de fragmentos de ADN 20 Técnicas de S. Typhimurium 20

Preparación y electroporación de S. Typhimurium LT2 electrocompetentes 20 Sistema λ-Red 20 Inducción del T3SS y precipitación de proteínas secretadas por método ácido 21 Técnicas analíticas para proteínas 21

Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida desnaturalizante 21 Ensayos de Western-blot 21

Anticuerpos 22

Resultados 23 Generación de una S. Typhimurium genéticamente deficiente para el gen sicP 23 Evaluación genotípica de la bacteria mutante 28 Evaluación fenotípica de la bacteria mutante 30 Complementación de la cepa sicP KO con el motivo CEST de TCLP1 32

Discusión 36

Material suplementario 41

Bibliografía 48

ABREVIATURAS Y GLOSARIO

aa: Aminoácido. abs: Absorbancia. ADN: Ácido desoxirribonucleico. amp: Ampicilina. ARNm: Ácido ribonucleico mensajero. Bolsillo flagelar: superficie única que carece de microtúbulos, y región en donde se producen intercambios de nutrientes en el parásito. CAT: Cloranfenicol acetil transferasa. CEST: dominio del tipo CesT. CesT (Chaperone for E. Coli Secretion of Tir): Proteína pequeña con actividad chaperona sustrato-específica involucrada en la traslocación de efectores a través del T3SS. cm: Cloranfenicol. DMSO: Dimetilsulfóxido. DTT: Ditiotreitol. D.O.: Densidad óptica. EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético. FLAG: Epitope basado en la secuencia DYKDDDK, usado para etiquetar proteínas. FLAGELO: estructura que posee nueve dobletes de microtúbulos periféricos y un par

central, además de un cuerpo basal, y responsable de la motilidad de los trypanosomátidos. HIS-tag: Epitope basado en la secuencia HHHHHH (His6), usado para etiquetar proteínas. HRP (Horseradish peroxidase): Peroxidasa de rábano picante. IgG: Inmunoglobulina G. IPTG: Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido. kan: Kanamicina. kDa: KiloDalton. Kinetoplasto: estructura basófila que forma parte de la mitocondria y donde se concentra el DNA mitocondrial. Kpb: Kilo pares de bases. KO (knock out): Cepa mutada por deleción específica de un gen. LB: Medio de cultivo Luria-Bertani. MCS (multiple cloning site): Sitio múltiple de clonado. MS: Material suplementario. NES (Nuclear Exportation Signal): Señal de exportación nuclear. NLS (Nuclear Localization Signal): Señal de importación nuclear. ON (Over Night): Durante la noche. ORF (Open Reading Frame): Marco abierto de lectura. PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis): Electroforesis en gel de poliacrilamida. Pb: Pares de bases. PBS: Buffer fosfato salino. PCR: (Polimerase Chain Reaction): Reacción en cadena de la polimerasa. PDZ: PSD95/Dlg1/zo-1, dominio presente en algunas proteínas de eucariotas. PIPES: piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid). RBS (Ribosome Binding Site): Sitio de unión al ribosoma. rpm: Revoluciones por minuto. SDS: Dodecil sulfato de sodio. SOB (Super Optimal Broth): Medio de cultivo bacteriano súper óptimo. SP (signal peptide): péptido señal de traslocación a vía secretoria en eucariotas. TBS: Tris buffer salino.

TCLP1 (Trypanosomatid CesT-like Protein 1): Proteína tipo CesT N°1 de tripanosomátidos. TEMED: N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina. TPBS: PBS suplementado con Tween 20 al 0,05% (v/v). Tripanosomátidos: orden de protistas del filo Kinetoplastea que se caracterizan por tener un solo flagelo, todos sus miembros son exclusivamente parásitos. T3SS: Sistema de secreción tipo 3 de bacterias enteropatógenas. WB: Western-blot. WT (wild type): Cepa silvestre.

1

INTRODUCCIÓN

La Enfermedad de Chagas es una afección parasitaria causada por el protozoo flagelado

Trypanosoma cruzi, de gran impacto social y económico [1], para la cual no existen vacunas ni

drogas apropiadas para su tratamiento [2]. Esta enfermedad tiene una amplia distribución y

una elevada prevalencia en América Latina. Se estima que hay unas 8 millones de personas

infectadas y unas 120 millones más viviendo en zonas endémicas y por lo tanto, en riesgo de

contraer la infección [3]. Este parásito es usualmente transmitido hacia el hombre y otros

vertebrados susceptibles por insectos vectores hematófagos de la subfamilia Triatominae,

siendo el más frecuente en la Argentina Triatoma infestans [4, 5]. Tras la ingesta de sangre, el

insecto deposita los parásitos junto a sus deyecciones, los cuales invaden al hospedador

mamífero a través de microescoraciones en la piel o mucosas [6]. Por otra parte, la infección

puede ocurrir sin participación del insecto vector, ya sea por transfusión o trasplante con

sangre/tejidos contaminados con T. cruzi o de madre a hijo durante la preñez o al momento

del parto [7, 8]. Estudios epidemiológicos recientes indican que la transmisión congénita

ocurre en el 2 a 3% de los casos [9]. También se ha descripto la infección con T. cruzi por vía

oral, debido al consumo de bebidas y alimentos contaminados con el parásito y/o insectos

vectores y por manipulación de material contaminado [10].

La enfermedad de Chagas presenta en general tres fases: la fase aguda, la indeterminada y

la crónica. La fase aguda ocurre en un período corto (40 a 60 días) luego de la infección [11]. En

general, no se observan manifestaciones clínicas en esta etapa o si las hay no son distintivas, lo

cual dificulta el diagnóstico. Durante esta etapa se suele verificar altas parasitemia, por lo que

es frecuente encontrar parásitos en sangre periférica, sobre todo en niños y neonatos. Pasados

unos 2 meses del momento de la infección, el individuo ingresa en el período indeterminado,

que tampoco está asociado a síntomas evidentes, durante el cual el parásito se encuentra

localizado en distintos tejidos. Esta etapa se caracteriza por parasitemia muy baja o nula,

aunque la infección puede detectarse fácilmente por métodos serológicos [12]. Datos

epidemiológicos indican que años o décadas después de la infección original, un 30% de los

infectados progresan hacia una fase crónica sintomática, con un daño irreversible en el

corazón y/o el aparato digestivo y desórdenes en el sistema nervioso periférico, resultando en

unas 12000 muertes al año [13]. Estos síntomas pueden variar ampliamente dependiendo de

la(s) cepa(s) infectante(s) del parásito, el perfil inmuno-genético del individuo infectado, el

grado de exposición al vector, la vía de infección y el tiempo transcurrido desde el momento

de la infección.

2

Tratamiento anti-T. cruzi

Existen 2 drogas para el tratamiento de la Enfermedad de Chagas, el Nifurtimox y el

Benznidazol. Ambas son derivados nitroheterocíclicos que actúan inhibiendo la síntesis de

proteínas [14]. Cuando son administradas durante la fase aguda de la enfermedad, han

demostrado una eficiencia (cura parasitológica) del 50 al 70% de los pacientes, pero debido a

sus efectos adversos y a su limitada eficacia en las etapas más avanzadas de la enfermedad, la

utilización de estas drogas continúa siendo objeto de controversias [15]. Actualmente se

recomienda el tratamiento en todo paciente que se encuentre en la fase aguda, niños y

adolescentes en fase indeterminada, pacientes adultos en fase indeterminada o con

sintomatología incipiente y en casos de accidentes con material contaminado en laboratorio o

durante cirugías. Las reacciones adversas más frecuentes observadas en el uso del Nifurtimox

son: anorexia, pérdida de peso, alteraciones psíquicas, excitabilidad, insomnio,

manifestaciones digestivas tales como náusea, vómitos y ocasionalmente cólico intestinal y

diarrea [16]. En el caso del Benznidazol, las manifestaciones cutáneas son las más notorias

(hipersensibilidad, dermatitis con erupciones cutáneas), aunque también puede ocurrir edema

generalizado, fiebre, linfo-adenopatía, dolor articular y muscular. Esta droga también puede

provocar manifestaciones más severas como la depresión de la médula ósea, púrpura

trombocitopénica y agranulocitosis. Los estudios de toxicidad en animales de experimentación

tratados con Benznidazol evidenciaron neurotoxicidad, daño testicular, toxicidad ovárica y

efectos deletéreos en corazón, tejido mamario, adrenal, colon y esófago [17]. Peor aún, ambas

drogas exhibieron efectos mutagénicos significativos y se demostró en algunos estudios que

eran carcinogénicas o tumorigénicas [15]. En definitiva, la eficacia limitada, la imposibilidad de

ser aplicadas en ciertas poblaciones de pacientes (por ejemplo, embarazadas) y los efectos

colaterales de las drogas existentes indican que una de las prioridades en la investigación

aplicada en Enfermedad de Chagas debe ser la búsqueda de nuevas drogas y/o blancos

terapéuticos de intervención.

Ciclo de vida de T. cruzi

El ciclo de vida de T. cruzi alterna entre una amplia gama de vertebrados susceptibles,

incluyendo al humano, y una multiplicidad de insectos vectores (Fig.1), con 4 estadios de

desarrollo principales fácilmente diferenciables [11]. El epimastigote, con forma de huso con

flagelo visible, constituye la forma replicativa no infectiva del parásito y se lo encuentra en el

intestino medio del insecto. Los epimastigotes son alargados, el kinetoplasto

delante del núcleo central) y el flagelo queda libre hacia el extremo

se adhieren a la cutícula del epitelio rectal del insecto vector

trypomastigotes metacíclicos

alargada, con el kinetoplasto

se concentra el DNA mitocondrial

posterior del trypomastigote y permanece unido todo a lo largo del cuerpo del parásito hasta

quedar libre hacia el extremo anterior creando la im

Los trypomastigotes metacíclicos

aprovechando los mecanismos

Una vez en el citoplasma de la célula infectada,

caracterizan por su forma redondeada

no protruye fuera del bolsillo flagelar.

amastigotes se diferencian a

distintos de los trypomastigotes metacíclicos), los cuales representan la forma infectiva, no

replicativa en el torrente sanguíneo del mamífero

hospedador vertebrado y, si son captados durante la ingesta de sangre, pueden transmitir la

infección al insecto hematófago, completando así el ciclo de vida.

Los epimastigotes son alargados, el kinetoplasto

y el flagelo queda libre hacia el extremo anterior. Los epimastigotes

e adhieren a la cutícula del epitelio rectal del insecto vector, donde

clicos infectivos, no replicativos. Estos se caracterizan por su

alargada, con el kinetoplasto (estructura basófila que forma parte de la mitocondria y donde

el DNA mitocondrial) situado por detrás del núcleo. El flagelo emerge de

posterior del trypomastigote y permanece unido todo a lo largo del cuerpo del parásito hasta

a el extremo anterior creando la impresión de una “membrana ondulante

Los trypomastigotes metacíclicos son capaces de invadir una gran variedad de

aprovechando los mecanismos endógenos de reparación de membranas de las células blanco

vez en el citoplasma de la célula infectada, se diferencian a amastigote

forma redondeada y por presentar un flagelo extremadamente

uye fuera del bolsillo flagelar. Luego de una serie de divisiones binari

amastigotes se diferencian a trypomastigotes sanguíneos (bioquímica y morfológicamente

trypomastigotes metacíclicos), los cuales representan la forma infectiva, no

replicativa en el torrente sanguíneo del mamífero [12, 18]. Estos diseminan la in

hospedador vertebrado y, si son captados durante la ingesta de sangre, pueden transmitir la

infección al insecto hematófago, completando así el ciclo de vida.

3

(se encuentra por

Los epimastigotes

se diferencian a

. Estos se caracterizan por su forma

basófila que forma parte de la mitocondria y donde

El flagelo emerge de la parte

posterior del trypomastigote y permanece unido todo a lo largo del cuerpo del parásito hasta

de una “membrana ondulante”.

variedad de tipos celulares

de las células blanco.

amastigotes, los que se

flagelo extremadamente corto que

visiones binarias, los

sanguíneos (bioquímica y morfológicamente

trypomastigotes metacíclicos), los cuales representan la forma infectiva, no

. Estos diseminan la infección en el

hospedador vertebrado y, si son captados durante la ingesta de sangre, pueden transmitir la

4

Fig.1: Diagrama esquemático del ciclo de vida de T. cruzi. Adaptado de Center for Disease Control and

Prevention. (http://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.html).

El flagelo y el bolsillo flagelar de T. cruzi y tripanosomátidos

Una característica que define a T. cruzi y tripanosomátidos (grupo de protozoarios que

incluye a distintos Tripanosomas y Leishmanias, muchos de los cuales tienen gran relevancia

médica/veterinaria) en general, es la presencia de un flagelo único, crítico para su motilidad, el

cual emerge de una invaginación de la membrana plasmática llamada bolsillo flagelar [19]

(Fig.2). Este bolsillo flagelar no sólo representa una simple cavidad, sino que constituye un sitio

activo y estratégico del parásito, involucrado en diversos procesos como la polaridad celular, la

morfogénesis y la replicación. En particular, el bolsillo flagelar es el único sitio en el cual se

disrumpe la malla del citoesqueleto subcortical , que mantiene la forma y rigidez del parásito,

y por lo tanto es el único lugar por donde ocurren todos los mecanismos endo- y exocíticos,

incluyendo la importación de nutrientes, la exportación de glicoproteínas de cubierta y/o el

reciclado de anticuerpos potencialmente líticos unidos a sus moléculas de superficie [20]. Por

estos motivos, el bolsillo flagelar es una estructura clave para establecer las múltiples

interacciones del parásito con los hospedadores vertebrados e insectos. Hasta el momento,

sólo unas pocas proteínas asociadas al bolsillo flagelar han sido descriptas y caracterizadas. La

mayoría de ellas demostró ser esenciales, debido a que su pérdida o direccionamiento erróneo

llevaron a defectos morfológicos disruptivos de funciones celulares [21]. Además el hecho de

que la endocitosis está profundamente relacionada con la virulencia, diferenciación,

supervivencia en este grupo de parásitos, señala a esta estructura como un blanco terapéutico

particularmente valioso.

5

Fig.2: Imagen esquemática, en donde se detallan el bolsillo flagelar, kinetoplasto (estructura de ADN

mitocondrial), núcleo, microtúbulos y flagelo del epimastigote de T. cruzi. Adaptado de [19].

TCLP1 (Trypanosomatid CesT-like Protein1) de T. cruzi

Siguiendo una estrategia combinada de herramientas computacionales, bioquímicas y

genéticas identificamos recientemente en nuestro laboratorio una molécula en el proteoma

deducido de la cepa de referencia CL Brener, que estaría involucrada en la interacción con el

hospedador mamífero y/o el insecto vector [19]. Esta molécula, llamada TCLP1 (por

Trypanosomatid CesT‐like Protein1, TcCLB.510241.10), posee una estructura compleja, en la

que pueden delimitarse distintos motivos con anotación funcional y/o estructural, algunos de

ellos de características excepcionales (Fig.3A). Distintas aproximaciones experimentales nos

permitieron concluir que TCLP1 se expresa exclusivamente en los estadios replicativos de T.

cruzi (epimastigotes y amastigotes, Fig.1), localizándose en la fracción citoplasmática que

subyace al bolsillo flagelar [21]. Sugestivamente, epimastigotes sobre-expresando esta

molécula muestran afectada su capacidad endocítica y su crecimiento en condiciones de estrés

nutricional, por lo que postulamos que TCLP1 estaría involucrada en la captación de nutrientes

del medio extracelular para el desarrollo y crecimiento del parásito [22].

Entre los motivos con funcionalidad putativa de TCLP1, pudimos identificar 2 señales de

importación nuclear funcional (NLS), 1 señal de exportación nuclear (NES), 1 motivo de

homología de ligando a ubiquitina (UBL, [23]), 1 motivo llamado PDZ (por PSD95/Dlg1/zo-1)

que está usualmente involucrado en fenómenos de interacción proteína-proteína [24] y 1

putativo péptido señal (SP) en el extremo N-terminal, que fue posteriormente asignado a un

error de anotación [22] (Fig.3A). Más importante, también identificamos dentro de TCLP1 1

dominio al que denominamos 'CEST' (Fig.3A), ya que muestra homología marginal de

secuencia con proteínas del tipo CesT (Chaperone for E. coli secretion of Tir). Estas proteínas

configuran una familia de chaperonas pequeñas y sin actividad de binding y/o hidrólisis de

nucleótidos, que contribuyen a la secreción de factores de virulencia a través del sistema de

secreción tipo 3 (T3SS) de bacterias enteropatógenas [25, 26]. En particular, el motivo CEST de

TCLP1 muestra máxima identidad de secuencia (~38%) con proteínas CesT del grupo

procariota Chlamydiae/Verrucomicrobia, compuesto por patógenos intracelulares obligados

que expresan T3SS funcionales durante todo su ciclo infectivo [27, 28] (Fig.3B).

Distintos análisis filogenéticos nos permitieron identificar una familia de genes ortólogos

y/o parálogos a TCLP1 en distintas cepas de T. cruzi y en otros trypanosomátidos, pero no en

6

eucariontes por fuera de este grupo evolutivo (Fig.3C). A diferencia de las CesT bacterianas

que son pequeñas y muestran este único dominio funcional, las proteínas conteniendo

motivos CEST de trypanosomátidos, tal cual lo descripto para TCLP1, muestran estructuras

multi-modulares complejas (Fig.3C). Todas estas características nos permiten hipotetizar que la

familia de proteínas definidas por TCLP1 se originó por un evento de transferencia horizontal

de un gen codificante para una proteína tipo CesT de Chlamydiaceae a algún ancestro

evolutivo del grupo de los trypanosomátidos, y su posterior duplicación/diversificación dentro

del phylum (Fig.3C). La posible transferencia de material genético entre Chlamydias y

trypanosomátidos ya ha sido postulada en base a análisis genómicos comparativos [29]. Una

hipótesis alternativa para explicar el origen de los motivos CEST de trypanosomátidos sería

mediante convergencia evolutiva. En cualquier caso, análisis exhaustivos de bases de datos

sugieren la ausencia de otros componentes de la maquinaria T3SS de enterobacterias en el

genoma de los tripanosomátidos ([30], y datos sin publicar).

7

Fig.3: TCLP1 pertenece a una nueva familia de proteínas multi-dominio restringida a

trypanosomátidos. A) Predicciones in silico y motivos anotados identificados en TCLP1 de T. cruzi. El

asterisco indica el sitio de iniciación de la traducción identificado experimentalmente (Met 71), que

difiere del anotado en el genoma (Met 1). Abreviaciones: SP, péptido señal; UBL, motivo de homología a

ubiquitina; CEST, motivo tipo CesT; PDZ, dominio tipo PSD95/Dlg1/zo-1; NLS, señal de localización

nuclear; NES, señal de exportación nuclear. B) Alineamiento del motivo CEST de TCLP1 y proteínas CesT

bacterianas. Los residuos conservados están grisados y la identidad aminoacídica total (en %) se indica a

la derecha. C) Árbol filogenético de proteínas tipo CEST de trypanosomátidos (se indican los

8

identificadores de genes). La arquitectura de dominios de las proteínas CesT bacterianas y tipo CEST de

trypanosomátidos está indicada con código de colores. Adaptado de [22].

Para caracterizar en más detalle el motivo CEST de TCLP1, buscamos templados apropiados

en la base de estructuras tridimensionales PDB (Protein Data Bank) sobre los que realizar

experimentos de modelado. En ausencia de estructuras cristalinas para la CesT de Chlamydias,

seleccionamos dos templados de S. Typhimurium, llamados 3epuA y 1jyoD. La primera

corresponde a la estructura cristalina a una resolución de 2.5 Å de una chaperona tipo CesT,

mientras que la segunda corresponde a la estructura cristalográfica a una resolución de 1.9 Å

del complejo entre la chaperona tipo CesT llamada SicP y su efector específico SptP [31] (ver

debajo). A pesar de la baja identidad de secuencia (19% y 17%, respectivamente), los modelos

estructurales del motivo CEST de TCLP1 generados a partir de estos templados, mostraron un

significativo nivel de solapamiento, especialmente en la disposición de las α-hélices y hojas

plegadas β (Fig. 4A, 4B). La conservación de las estructuras α-hélices y hojas plegadas β es

clave para actuar como chaperona. Los valores QMEAN obtenidos fueron de 0.627 y 0.601,

respectivamente, los cuales son considerados aceptables [32]. Más importante, estos valores

son comparables al valor QMEAN obtenido al superponer ambas estructuras bacterianas (Fig.

4B), las cuales tampoco presentan altos valores de identidad de secuencia (no mostrado).

Todos estos resultados, en conjunto, sugieren una alta conservación estructural entre el

motivo CEST de TCLP1 y las proteínas CesT de origen bacteriano.

9

Fig.4: Conservación estructural entre el motivo CEST de TCLP1 y chaperonas tipo CesT de S.

Typhimurium. A) Las secuencias del motivo CEST derivado de TCLP1 y las secuencias completas de

3epuA y 1iyoD, fueron alineadas con el programa informático PROMALSD3D. Los motivos predichos en

donde se encontró consenso entre estas moléculas, son mostradas como bloques sólidos (hélices α) o

bloques vacíos negros (hojas β). Por otro lado se han predicho las estructuras secundarias de los motivo

con otro programa, Jpred3, en donde las hélices α se muestran como cajas sólidas y las hojas β como

cajas grises. B) Superposición de modelos del motivo CEST de TCLP1 con los templados 3epuA y 1jyoD.

Izquierda, modelo de CEST de TCLP1 basado en 3epuA (rojo) y 3epuA (verde). Centro, modelo de CEST

de TCLP1 basado en 1jyoD (rojo) y 1jyoD (azul). Derecha, modelo de 1jyoD basado en 3epuA (verde) y

3epuA (azul). Los valores QMEAN se indican debajo de cada panel [22].

10

Dada la similitud estructural encontrada entre la chaperona 1jyoD (SicP) de S. Typhimurium

y el motivo CEST de T. cruzi, así como la disponibilidad de conocimiento acerca de su modo de

acción e interactores, hemos optado por trabajar con dicha molécula. Además, debe

mencionarse que S. Typhimurium es un microorganismo muy utilizado en los laboratorios de

investigación biológica, y para el que se dispone de una variedad de herramientas bioquímicas,

moleculares y genéticas necesarias para realizar los diferentes ensayos propuestos en esta

Tesis. En nuestro caso deseamos generar y evaluar una cepa mutante por deleción del gen de

la chaperona sicP, a la cual utilizaremos como modelo experimental para testear la

complementación funcional mediada por el dominio CEST de TCLP1. A continuación se detallan

algunos aspectos del sistema de secreción T3SS de S. Typhimurium, relevantes para nuestro

trabajo.

Sistema de secreción tipo 3 (T3SS) de enterobacterias

Los T3SS de bacterias enteropatógenas son estructuras claves en la interacción con el

hospedador, capaces de exportar efectores hacia el interior de las células blanco. Una vez

traslocados, estos efectores se ocupan de remodelar ciertas estructuras y/o de cooptar ciertos

procesos celulares para favorecer la invasión, sobrevida y el crecimiento intracelular de la

bacteria, e incluso su eventual transmisión hacia otras células [33, 34] (Fig.5A). Los sistemas

T3SS están constituidos por aproximadamente 20 componentes cuya expresión se ve inducida

por ciertos estímulos ambientales (osmolaridad, pH, tensión de oxígeno, etc. [35] ) y que

conforman una maquinaria supramolecular compleja que se logró visualizar por experimentos

de microscopía electrónica de transmisión [36]. Esta consiste en anillos polipeptídicos en la

membrana interna y externa conectados por una estructura de tipo aguja o “inyectisoma” que

protruye por fuera de la bacteria, y que contiene un poro interno de ~20 Å. A través de este

poro son traslocados los efectores del citoplasma bacteriano al interior de la célula blanco, por

medio de la ayuda del translocón (Fig.5A) [36]. Además de las proteínas estructurales del

‘inyectisoma’ y de los efectores, los T3SS incluyen proteínas traslocadoras (SipB, SipC, SipD) y

proteínas adicionales que proveen energía al sistema (InvC), proteínas reguladoras (HilA, HilD)

o que asisten en la traslocación de los distintos efectores [37], tales como algunas chaperonas

ilustradas en la Fig.5. Todas estas moléculas se encuentran codificadas próximas entre sí en el

genoma de las distintas enterobacterias portadoras, en regiones denominadas “islas de

patogenia” [38], que se presume son transmitidas horizontalmente entre estas bacterias.

11

Fig.5: Estructuras y organización del T3SS de S. Typhimurium: A) Estructura y proteínas que constituyen

el aparato de secreción T3SS. B, C) Representación esquemática de la isla de patogenia SPI-1 en donde

se codifican las distintas proteínas del T3SS, coloreadas de acuerdo a que sean proteínas del aparato de

exportación, del complejo de la aguja, translocasas, reguladores, efectores y chaperonas. Adaptado de

[39].

En el caso de S. Typhimurium, la totalidad del T3SS está codificado en el centisoma 63 del

cromosoma bacteriano [40]. Los efectores secretados por S. Typhimurium provocan

alteraciones en las vías apoptóticas [41], la biogénesis , tráfico de vesículas [42], la

modificación post-traduccional de proteínas [43], la expresión genética y el citoesqueleto de la

célula blanco. Este último aspecto, la polimerización/ despolimerización regulada de

filamentos corticales de actina en la célula huésped, es esencial y recurrente para el proceso

de invasión de numerosos patógenos [37]. En el caso de S. Typhimurium, algunos de los

efectores del T3SS más importantes involucrados en el remodelado del citoesqueleto celular

12

son SipA y SipC los cuales actúan directamente, uniéndose a la actina y produciendo la rápida

enucleación y elongación de los filamentos.

Fig.6: Actividad intracelular de los efectores del T3SS: SipA y SipC se asocian directamente a los

filamentos de actina, y a la vez que están involucrados en reclutar vesículas exocíticas en el sitio de

entrada de la bacteria. SopE, SopE2, y SopB manipulan el citoesqueleto celular de manera indirecta,

activando las Rho GTPasas. SptP actúa de manera opuesta a SopE, SopE2 y SopB, inhibiendo la actividad

de Rho GTPasas, y permitiendo que la célula huésped retome la conformación inicial de su

citoesqueleto. Adaptado de [39].

Los efectores SopE y SopE2 (efectores no codificados en la isla de patogenecidad SPI-1),

mimetizan a GEF, un factor de intercambio de guanosina, lo que provocan la activación de las

Rho GTPasas. Al activarse las Rho GTPasas, se produce la activación de las N-WASP y WASP,

luego éstas activan al complejo nucleador Arp2/3, lo que promueve la polimerización de actina

(Fig.6). Por otro lado el efector SopB también activa las Rho GTPasas, y además promueve la

fisión de la membrana del huésped a través de la liberación de metabolitos de señalización

intermediarios [44] (Fig.6). Estos efectores en conjunto provocan la formación de ‘ruffles’ en la

membrana de la célula huésped, necesarios para la invasión de S. Typhimurium [39]. Una vez

verificada la invasión celular, la despolimerización de los filamentos de actina es necesaria para

la viabilidad de la célula huésped, y por ende para la sobrevida intracelular de la bacteria

(Fig.6). Este proceso compensatorio se verifica un tiempo después del contacto inicial bacteria-

célula (aproximadamente entre 1-3 horas) y es promovido mayoritariamente por el efector

13

SptP, una tirosina fosfatasa que inactiva las Rho GTPasas Rac-1 y Cdc42. Debido a sus

actividades antagónicas respecto de las de SopE, SptP conduce a la enucleación y

despolimerización de filamentos de actina e, indirectamente, al desarmado de los ‘ruffles’ de

membrana (Fig. 6). Inicialmente, S. Typhimurium inyecta ambos tipos de efectores en la célula

blanco en igual cantidad al momento del contacto inicial pero como SopE es ubiquitinilada y

rápidamente degradada en el proteosoma, la actividad ‘compensatoria’ de SptP se vuelve

dominante en etapas tardías de la infección (Fig. 7).

Fig. 7: Coordinación funcional entre SopE y SptP: Ambos efectores son translocados en cantidades

equivalentes y de manera simultánea en la célula huésped. SopE activa las Rho GTPasas Cdc42 y Rac

provocando la formación de ruffles de membrana para su internalización. En etapas más tardías, SopE

es ubiquitinilado y degradado por la maquinaria celular, pasando a ser ‘dominantes’ las actividades de

SptP (inactivación las Rho GTPasas, disolución de los ruffles de membrana, despolimerización de

filamentos de actina). Adaptado de [45].

Una característica distintiva de los efectores del T3SS es que están asociados, física y

funcionalmente, a chaperonas citoplasmáticas, entre ellas las proteínas del tipo CesT [46]

(Fig.5A), las cuales son necesarias para que los mismos sean translocados/secretados en la

célula blanco. A diferencia de otras chaperonas bien caracterizadas tipo GroEL o Hsp70 con un

amplio rango de sustratos, las chaperonas del tipo CesT muestran especificidad para un único

sustrato, con el cual establecen interacciones complejas e íntimas. En el caso de SptP, la

chaperona que cumple dicha función es SicP, un polipéptido ácido de 13 kDa, codificado

inmediatamente rio arriba de SptP y con el que constituye una única unidad transcripcional

[47] (Fig.5B). Se ha demostrado que la sobrevida de S. Typhimurium deficiente en el gen sicP es

muy baja, ya que como se mencionó SptP es importante para la reconstitución del

14

citoesqueleto y la membrana de la célula huésped. La co-estructura cristalográfica y otros

experimentos bioquímicos revelan que SicP se une a una región del extremo N-terminal de

SptP, manteniéndolo extendido y desplegado en el citoplasma de S. Typhimurium, en una

conformación apropiada para su traslocación [46]. Experimentos genéticos indicaron que

pérdida de función de la chaperona SicP por la inserción de una mutación en el gen sicP,

provoca una drástica reducción en los niveles citoplasmáticos (y por tanto también en la

fracción de secreción) de SptP [48]. Esta regulación se ejercería fundamentalmente a nivel

post-traduccional, incrementando la tasa de degradación de SptP ‘libre’ (no asociada a SicP).

Resultados más recientes indican que la disminución de SptP en ausencia de SicP también

podría estar regulada a nivel traduccional [48].

15

HIPÓTESIS

La identificación de un dominio 'bacteriano' en TCLP1 y en toda la familia de proteínas tipo

CEST de tripanosomátidos, que no poseen estructuras funcionalmente comparables al T3SS de

bacterias enteropatógenas [22], plantea interesantes preguntas evolutivas y mecanísticas

acerca del rol y funcionalidad de estas moléculas en T. cruzi y organismos relacionados. La

verificación de homología no sólo estructural sino también funcional entre el motivo CEST de

TCLP1 y las CesT bacterianas es fundamental para empezar a responder estas preguntas y, más

importante, podría abrir nuevas posibilidades para el desarrollo de terapias alternativas contra

estos patógenos.

16

OBJETIVOS

De acuerdo a los antecedentes expuestos previamente, durante la presente Tesina de

Licenciatura, lo que nos proponemos es evaluar la actividad chaperona del motivo CEST

presente en TCLP1 de T. cruzi, mediante ensayos de complementación funcional en un modelo

de S. Typhimurum.

Objetivos Específicos

- Generación de una cepa de S. Typhimurum genéticamente deficiente para

sicP.

- Evaluación genotípica y fenotípica de la cepa mutante.

- Evaluación fenotípica de la cepa mutante complementada con el motivo CesT

de TCLP1.

17

MATERIALES Y MÉTODOS

1) Soluciones generales y medios de cultivo

Azul de Coomassie: Coomassie R250 0,25% (p/v); metanol 30% (v/v); ácido acético 10% (v/v)

en agua.

Buffer TAE (1X): 40 mM tris; 20 mM ácido acético; 1 mM EDTA, PH 8,3.

Solución de transferencia: Tris 250 mM; glicina 25 mM; 20% (v/v) metanol, PH 8,3.

Solución de Rojo Ponceau: 0,1% (p/v); Rojo Ponceau; 5% (v/v) ácido acético.

PBS: 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; pH 7.

T-PBS: PBS; 0, 05 % (v/v) Tween 20.

PI: 25 mM Tris-HCl (pH8); 10 mM EDTA (pH8); 50 mM glucosa.

PII: 0,2 N NaOH; 1% (v/v) SDS.

PIII: 3 M acetato de potasio pH 4,8 o 3 M acetato de sodio pH 5,2.

TE: 10 mM Tris-HCl pH8; 1 mM EDTA.

Solución de siembra para muestras de ADN (LB6x): 0,025% (p/v) azul de bromofenol; 0,25%

(p/v) Xylen cyanol; 30 % (v/v) glicerol.

Solución de siembra para muestras de proteínas (CB5x): 50% (v/v) glicerol; 7,7% (p/v) DTT;

10% (p/v) SDS; 0,4 M Tris-HCl pH 6,8; 0,002% (p/v) azul de bromofenol.

Solución Inoue (1lt): 10.88 g MnCl2-4H2O; 2,2g CaCl2; 18,65 g KCl; 10 ml PIPES (0,5 M pH 6,7) a

un litro. Esterilizado por filtrado.

LB: se disuelven 10 g de triptona de caseína, 5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl en 1 l de

agua, y luego se autoclava a 121 °C por 20 minutos.

SOB: se disuelve triptona de caseína 20 g; extracto de levadura 5 g; NaCl 0,5 g, KCl 0,186 g en

950 ml de agua. Se ajusta el pH a 7 con una solución de NaOH 5 N. Se lleva a 1 litro. Se

autoclava a 121 °C por 20 minutos. Antes de utilizar se adicionan 5 ml de una solución MgCl2 2

M estéril.

2) Técnicas de biología molecular

Todas las técnicas de biología molecular que se detallan a continuación fueron realizadas

siguiendo los protocolos de Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. Detalles relevantes sobre los clonados de los distintos plásmidos/constructos

utilizados en este trabajo se indican en Resultados.

Preparación de Escherichia coli (E. coli) DH5αF' competentes

18

Se inocula un erlenmeyer conteniendo 250 ml de medio SOB respectivamente con 4 ml de un

cultivo de E. coli en fase estacionaria y se incuba a 18-22 °C con agitación moderada. Al

alcanzar una D.O. a 600 nm de 0.55, se lo transfiere a hielo por 10 minutos. Se cosechan las

células por centrifugación a 2500 x g durante 10 minutos a 4 °C, las que luego se resuspenden

suavemente en 80 ml de solución Inoue helada. Nuevamente se centrifugan a 2500 x g durante

10 minutos a 4 °C y se resuspende el pellet bacteriano suavemente en 20 ml de solución Inoue

helada. Se agrega 1,5 ml de DMSO, se divide la suspensión en alícuotas de 100 µl y se las

congela de manera rápida en nitrógeno líquido. Los tubos se almacenan a -70 °C hasta su

utilización.

Transformación E. coli DH5αF' por el método de “shock térmico”

Se incuba una alícuota de bacterias competentes con el ADN durante 15 minutos en hielo y

luego se las somete a un “shock térmico” a 42 °C durante 90 segundos. Rápidamente fueron

recuperadas a 37 °C en 1 ml de medio LB. Después de 45 minutos, fueron centrifugadas a baja

velocidad y plaqueadas en LB ágar conteniendo el antibiótico correspondiente.

Minipreparación estándar de plásmidos

A partir de 3 ml de cultivo de E. coli en fase estacionaria, se cosechan las bacterias por

centrifugación a 15000 x g durante 5 minutos. Se descarta el sobrenadante y se resuspende el

pellet bacteriano en 100 µl de solución PI. Se adicionan 200 µl de solución PII y se homogeniza

cuidadosamente, provocando la ruptura celular con la consiguiente liberación y

desnaturalización de ADN genómico y plasmídico. Luego de 5 minutos, se agregan 200 µl de la

solución PIII, se homogeniza cuidadosamente y se centrifuga a 16000 x g durante 10 minutos.

Se descarta el precipitado de ADN genómico y se recupera el sobrenadante, conteniendo el

ADN plasmídico. Se adicionan 500 µl de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1 v/v), se

emulsionan las fases mediante fuerte agitación y se centrifuga a 16000 x g durante 1 minuto.

Se recupera la fase acuosa y se repite la extracción orgánica. Finalmente se precipita el ADN

plasmídico por el agregado de 500 µl de isopropanol seguido de centrifugación a 16000 x g por

15 minutos. El precipitado es lavado con 500 µl de etanol 70% (v/v) y secado a temperatura

ambiente. Finalmente, el ADN se resuspende en 32 µl de agua destilada.

Mini-preparación de plásmidos por precipitación con polietilenglicol

Similar al método estándar, este protocolo incluye un paso adicional que permite la obtención

de ADN plasmídico de la pureza necesaria para reacciones de secuenciación. Una vez

resuspendido el ADN plasmídico en 32 µl de agua tal cual se detalla arriba, se adicionan 8 µl de

19

una solución de NaCl 4 M y 40 µl de una solución de polietilenglicol-8000 13% (p/v)

previamente autoclavada. Se homogeniza y se incuba a -20 °C durante 20 minutos. Luego se

centrifuga a 16000 x g por 20 minutos a 4 °C y el precipitado se lava con 500 µl de etanol 70%

(v/v), se deja secar a temperatura ambiente y finalmente se resuspende en 20 µl de agua

destilada. Los plásmidos así purificados fueron cuantificados, diluidos a 200 ng/µl y enviados a

Macrogen Inc (Seul, Korea) para su secuenciación.

Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR)

Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo con Taq ADN polimerasa (Promega), en las

soluciones provistas por los fabricantes con 100 - 10 ng de ADN como molde, 2 mM de MgCl2,

200 μM de dNTPs y 10 pmol de cada oligonucleótido (ver MS. 11) en un volumen final de 50 μl.

Las amplificaciones se realizaron de acuerdo al siguiente esquema:

Desnaturalización inicial: 5 minutos a 95 °C

35 ciclos:

Desnaturalización: 30 segundos a 95 °C

Hibridación de oligonucleótidos: 1 minuto a la temperatura indicada para cada reacción

Extensión: 1 minuto por cada Kpb a copiar a 72 °C

Extensión final: 10 minutos a 72 °C

Electroforesis de ADN en geles de agarosa nativos

Los geles de agarosa utilizados se prepararon en solución TAE 1X al 1% con 0,5 μg/ml de

bromuro de etidio. Las corridas electroforéticas se realizaron a 5-10 V/cm. Antes de la siembra

las muestras de ADN se adicionaron con el correspondiente volumen de solución de siembra

LB-6X. Los geles fueron visualizados en un transiluminador UV y fotografiados.

Digestión de ADN con enzimas de restricción y fosforilación

Se utilizaron 5 U de enzima por μg de ADN a digerir incubando en las condiciones sugeridos

por el fabricante, durante un mínimo de 3 horas. En el caso de plásmidos linealizados con una

sola enzima de restricción se los fosfataseó incubando con 1 U de SAP (shrimp alkaline

fosfatase, New England Biolabs) durante 1 h a 37 °C en el mismo buffer de restricción.

Cambio de buffer y purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa

Los plásmidos y/o fragmentos de ADN fueron cambiados de buffer y las bandas deseadas

fueron extraídas del gel manualmente y purificadas mediante los kits Ilustra GFXM-PCR DNA

and GEL BAND PURIFICATION KIT (GE), respectivamente.

20

Ligación de fragmentos de ADN

Las ligaciones se realizaron con una relación molar inserto: vector de 3:1 utilizando 50 ng de

vector en un volumen final de 20 μl con 100 U de T4 ADN ligasa (New England Biolabs). Las

incubaciones fueron a 4 °C durante toda la noche o alternativamente durante 4 horas a

temperatura ambiente. Para la ligación de productos de PCR al vector pGEM-T Easy (Promega)

se prosiguió de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

3) Técnicas de S. Typhimurium

Preparación y electroporación de S. Typhimurium LT2 electrocompetentes

Se inocularon 10ml de LB con colonias de S. Typhimurium del genotipo indicado, todas ellas

portando el vector pKD46 [49] (MS.1), a una concentración final de 0,2% (p/v) de L-arabinosa a

37 °C hasta llegar a una DO de 0,6 medido a 600nm. El cultivo se centrifugó a 10000 rpm a 4 °C

por 10 minutos, se descartó el sobrenadante, se lavó el pellet bacteriano con 25 ml de agua

mili-Q estéril y se lo resuspendió en 1 ml de agua estéril. Alícuotas de 50 ul de esta suspensión

se electroporaron con 200 ng del material genético de interés, en cubetas de 1 mm a 1,6 kV.

Inmediatamente después del pulso eléctrico, se agregó 1 ml de medio SOB y se dejó recuperar

las células por 1 hora, para luego plaquearlas en medio sólido con antibiótico.

Sistema λ-Red

Este método se basa en el sistema de recombinasas del bacteriófago λ, y fue optimizado (en E.

coli) de forma tal de permitir la recombinación homóloga de fragmentos lineales presentando

un mínimo de 40 pb de homología con la secuencia blanco (Fig.8). Se requieren 3 genes del

bacteriófago para la recombinación: gam, bet y exo. Gam inhibe las nucleasas RecBCD y

previene la degradación de los fragmentos lineales de ADN. Exo es una exonucleasa que

genera extremos 3´simple cadena a partir de los fragmentos lineales de ADN, y Bet cataliza la

alineación entre el fragmento insertado y la secuencia blanco [50]. Estos 3 genes están

clonados en el vector de expresión pKD46 (MS.1), bajo el promotor pAraBad inducible por

arabinosa. Este vector es replicativo en S. Typhimurium, posee resistencia a ampicilina y tiene

la cualidad de ser termosensible a 42 °C (MS.1).

21

Fig.8: Estrategia general de recombinación homóloga del sistema de λ-Red en S. Typhimurium. En este

ejemplo el cassette de resistencia a cloranfenicol está flanqueado por 40pb de homología al sitio blanco.

Las proteínas del sistema λ-Red (Gam, Bet, Exo) facilitan la recombinación homóloga del fragmento en el

cromosoma. En este caso las recombinantes se seleccionan en placas con cloranfenicol.

Inducción del T3SS y precipitación de proteínas secretadas por método ácido

Se inocularon las cepas indicadas de S. Typhimurium LT2 en medio LB 0,3M NaCl, y se las

creció a 37 °C y 50 rpm por 12 horas. Luego se hizo una dilución de 1:30 en medio LB NaCl

0,3M, y se las creció a 37 °C y 50 rpm hasta alcanzar una D.O. de 1, medido a 600nm.

Posteriormente se centrifugó las bacterias a 10000 rpm por 20 minutos [51]. El sobrenadante

se pasó por filtros de 0.45µm para retener bacterias o restos bacterianos, y luego se lo incubó

3 horas con el agregado de ácido tricloro acético a una concentración final de 10% (v/v) para la

precipitación de proteínas totales. Después de centrifugar el sobrenadante a 10000 rpm por 20

minutos a 4 °C, se lavó el pellet de proteínas en 1 ml de acetona, se lo dejó secar y finalmente

se lo resuspendió en 50 µl de una solución de 50 mM NaCl; 100 mM tris pH 8 en agua[52] .

4) Técnicas analíticas para proteínas

Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE):

Las muestras se prepararon agregándoles los volúmenes correspondientes de solución de

siembra 5X y calentándolas por 5 minutos a 100 °C. Luego se sembraron en geles

desnaturalizantes discontinuos (0,1% SDS; 12-15% acrilamida) y se corrieron en solución de

Tris-Glicina-SD. Los marcadores de peso molecular utilizados cubrían los rangos de 17 a 200

kDa (PageRuler, ThermoFisher). Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie [53] o

transferidos a membranas para ser ensayados por Western-blot.

Ensayos de Western-blot

Las proteínas presentes en los SDS-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa

(Pierce) durante 2 horas a 100 V en solución de transferencia. La correcta transferencia se

verificó mediante la tinción de las proteínas con rojo Ponceau-S. Las membranas fueron

22

bloqueadas en solución de T-PBS con 5%(m/v) de leche en polvo descremada durante 1 hora a

temperatura ambiente en agitación e incubadas con el anticuerpo primario diluido en solución

de bloqueo por 12 horas a 4 °C. Posteriormente las membranas fueron lavadas tres veces con

T-PBS durante 10 minutos en agitación. Luego se las incubó con el anticuerpo secundario

diluido en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las

membranas fueron lavadas tres veces con T-PBS. El revelado se llevó a cabo con el reactivo

para quimioluminiscencia Supersignal TM West Pico (Pierce) por exposición de placas

radiográficas (Agfa).

Anticuerpos

Anti-FLAG: Anticuerpo monoclonal de ratón (clon M2 Sigma) reactivo contra el epitope

“FLAG”. Anti-HIS: Anticuerpo monoclonal de ratón (Sigma) contra el epitope de poli-histidinas.

Anti-GroEl: suero policlonal de conejo inmunizado con la chaperona GroEl de Brucella sp,

expresado en E. coli y purificado. Estos anticuerpos primarios se usaron en ensayos de

Western-blot en dilución 1:4000, 1:3000 y 1:2000, respectivamente. Como anticuerpos

secundarios, se usaron un anti-IgG de ratón (Vector Labs) y un anti IgG de conejo (Sigma). En

ambos casos, los anticuerpos estaban realizados en cabra, purificados por afinidad y

conjugados a HRP. Las diluciones de uso fueron 1:5000 y 1:3000, respectivamente.

23

RESULTADOS

Como se mencionó en la introducción, la ausencia de expresión de la proteína SicP en S.

Typhimurium determina una reducción drástica de la estabilidad de SptP y la inhibición de su

translocación a la célula huésped a través del sistema T3SS. En la presente Tesina de

Licenciatura decidimos estudiar el fenotipo del mutante sicP utilizando técnicas moleculares,

bacteriológicas y bioquímicas sencillas. Más precisamente, se generó una cepa KO deficiente

para la expresión de SicP por recombinación homóloga de un alelo mutante. Esta cepa se

complementó con plásmidos expresando el gen wild type de sicP (como control positivo), el

motivo CEST de la proteína TCLP1, o con el mismo plásmido vacío (como control negativo).

Con todas estas cepas se realizaron ensayos de inducción del sistema T3SS in vitro y se

determinaron los niveles de un reportero SptP etiquetado molecularmente con un epitope

3xFLAG en el citosol y en el sobrenadante bacteriano.

Generación de una S. Typhimurium genéticamente deficiente para el gen sicP.

Ha sido demostrado que distintas cepas o aislamientos de S. Typhimurium muestran

distintas capacidades de secreción de SptP o de efectores del T3SS en general, lo que podría

estar relacionado a su virulencia diferencial [54]. Por esto, el primer paso que realizamos fue

seleccionar la cepa más adecuada de S. Typhimurium sobre las que realizar nuestros

estudios. Las cepas de S. Typhimurium de las que disponíamos en el laboratorio eran LT2 y

SL140. Para evaluar la secreción de SptP, generamos una construcción en donde el gen del

efector sptP se encuentra fusionado en su extremo C-terminal a un epitope 3xFLAG, en el

vector de expresión pSB3153 (MS.4). Para generar este constructo diseñamos un par de

oligonucleótidos (MS.11) que amplifican el Open Reading Frame (ORF) completo del efector

sptP (1632 pb). Dichos oligonucleótidos poseen sitios de restricción (HindIII y XbaI, MS.11), y

fueron utilizados para la amplificación del gen a partir de ADN genómico de S. Typhimurium, y

luego digeridos para permitir el clonado orientado del constructo en el vector pSB3153, que

provee fusión traduccional a un epitope 3xFLAG y resistencia a ampicilina.

Se verificó la correcta construcción e identidad de este vector (pSB3153-sptP::3xFLAG) por

ensayos de restricción con las mismas enzimas usadas para el clonado (HindIII y XbaI, datos no

mostrados) y secuenciación. Este plásmido pSB3153-sptP::3xFLAG lo utilizamos para

transformar por electroporación cepas de S. Typhimurium LT2 Y SL140, las cuales fueron

24

seleccionadas con ampicilina. Colonias de ambas cepas portando el vector pSB3153-

sptP::3xFLAG fueron usadas para ensayos de inducción del T3SS in vitro, fraccionamiento por

centrifugación de proteínas intracelulares, secretadas, y análisis del nivel de SptP en ambos

compartimientos por ensayos de Western-blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-

FLAG (materiales y métodos). Como se puede observar en la Fig.9, la cepa LT2 muestra una

más eficiente secreción de la proteína SptP al sobrenadante bacteriano y una consecuente

menor acumulación citoplasmática del mismo. Incluso pueden observarse unas bandas de

menor peso molecular aparente en la calle correspondiente al citoplasma de la cepa SL140,

las que podrían corresponder a productos de degradación parcial del reportero SptP. En base

a estos resultados elegimos la cepa de S. Typhimurium LT2 para realizar los ensayos de

inactivación del gen sicP.

Para poder obtener los resultados previamente mostrados, se realizaron distintos

ensayos hasta poner a punto la inducción óptima del sistema de secreción T3SS que

maximice la secreción de SptP a través de este sistema. En primer lugar utilizamos

solamente la secuencia señal mínima del efector sptP desde el residuo 1 (ATG) hasta el 100,

que según lo reportado es suficiente para poder unirse a SicP y ser translocado por el T3SS

[40, 46]. Con este efector reportero truncado, sin embargo nunca logramos obtener niveles

de secreción comparables a los obtenidos con el SptP completo (datos no mostrados).

Consecuentemente, utilizando el efector SptP completo se probaron distintas condiciones de

inducción del T3SS en S. Typhimurium LT2 (datos no mostrados). Las condiciones óptimas

resultaron ser: crecimiento a 37 ° C con 0,3 M de NaCl y a 50 rpm de rotación hasta que el

cultivo adquiriera una D.O. de 1 a 600 nm.

Fig.9: Acumulación del efector SptP::3xFLAG en citoplasma (pellets) y sobrenadante de las cepa LT2 y

SL144 de S. Typhimurium. Alícuotas (10 µl) del cultivo bacteriano y del precipitado de proteínas del

25

sobrenadante (10 µl, equivalentes a 10 ml del sobrenadante) se analizaron por SDS-PAGE seguido por

Western-blot utilizando anticuerpos anti-FLAG en una dilución 1:5000.

Una vez seleccionada la cepa LT2, lo siguiente fue la generación de una cepa genéticamente

deficiente en sicP. Para lograr este objetivo se generó primeramente una construcción

conteniendo al gen sicP interrumpido por un cassette conteniendo la enzima cloranfenicol acetil

transferasa (CAT), que confiere resistencia a cloranfenicol.

Para ello se realizó una reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos SICP HIS FOR y

SICP REV (MS.11) que amplifican la secuencia completa del gen sicP (Fig.10A). Estos

oligonucleótidos poseen secuencias adicionales en sus extremos 5', útiles para el clonado y/o la

expresión del amplicón. Por ejemplo, el oligonucleótido forward posee un sitio de restricción

HindIII, un sitio de unión a ribosoma (RBS) que promueve su traducción, y un sitio iniciador de

la traducción (residuo de metionina) seguido por un tag de 6 residuos de histidinas en tándem

(HIS6x) y 20 pb de homología al extremo 5´del gen sicP. El oligonucleótido reverse, por otro lado,

posee un sitio de restricción EcoRI, y 20 pb de homología al extremo 3´del gen sicP, incluyendo

el sitio terminador de la traducción propio (codón TGA) de sicP. Todas estas secuencias

adicionales en el oligonucleótido forward fueron agregadas, ya que el mismo amplicón se utilizó

para inactivar el gen sicP, y también como control en la complementación funcional en el vector

pBBR1-MCS2 (ver debajo).

A

26

B

Fig.10: Amplificación de sicP. A) Diagrama de PCR realizado sobre el gen sicP para su amplificación,

utilizando los oligonucleótidos sicP HIS forward y sicP reverse (MS.11). B) Patrón de migración en

geles de agarosa 1% del amplicón con el peso esperado. La señal difusa que se observa debajo del

amplicón (~50 pb) podría corresponder a oligonucleótidos que no entraron en la reacción de PCR.

El amplicón obtenido presentó un tamaño aproximado de 500 pb, congruente con el

esperado (Fig.10B). El mismo fue clonado en el vector comercial pGEM-T Easy (MS.3) utilizando

protocolos rutinarios en el laboratorio y chequeada su identidad por análisis de restricción y

secuenciación (MS.12). Este plásmido (llamado pGEM-T Easy-sicP) fue digerido con la enzima

EcoRV, que presenta un sitio único de corte dentro de la secuencia sicP (Fig.10A).

Por otro lado se obtuvo el gen de la enzima CAT de Campylobacter spp, la cual posee su

propio promotor, por digestión del vector Pry-109 (MS.2) [55] con la enzima Smal. Los

productos de digestión fueron resueltos en geles de agarosa 1% y se procedió a la extracción y

purificación de la banda de ~900 pb (correspondiente al inserto cat) por resina de

intercambio iónico. Dado que tanto Smal como EcoRV dejan sitios romos y por lo tanto

compatibles, se ligó el inserto cat en el vector pGEM-T Easy-sicP digerido previamente. La

correcta construcción e identidad de este plásmido, llamado pGEM-T Easy-sicP::cat (MS.9) fueron

chequeadas por secuenciación utilizando los oligonucleótidos T7 y SP6, que hibridizan en las

regiones flanqueantes al MCS (múltiple cloning site) del vector pGEM-T Easy (MS.13). Los

resultados de la secuenciación muestran que el cassette cat se clonó correctamente, aunque en

sentido contrario al del gen sicP.

Para introducir el alelo mutante sicP::cat generado en la cepa S. Typhimurium LT2 y

maximizar las probabilidades de su recombinación con el alelo sicP wild type, se utilizó el

Sistema λ-Red [56]. Brevemente, la secuencia correspondiente a sicP::cat fue amplificada por

PCR utilizando los oligonucleótidos T7 y SP6 (Fig.11A). Se obtuvo un amplicón de 1300 pb,

27

tamaño esperado, ya que la secuencia sicP::cat es de 1217 pb, sumado a que los

oligonucleótidos amplifican unas 40 pb por fuera del MCS (Fig.11B).

A B

Fig.11: A)Patrón de migración en geles de agarosa 1% de la secuencia sicP::cat amplificada por PCR,

utilizando los oligonucleótidos T7 y SP6, y usando como templado el vector pGEM-T Easy-sicP::cat. B)

Detalle esquemático del producto de amplificación. En verde se indican las secuencias correspondientes

a sicP y en azul a cat.

Este producto de PCR sicP::cat, (200 ng totales) se introdujo por electroporación en S.

Typhimurium LT2 previamente transformadas con el vector pKD46 (MS.1), las que luego se

seleccionaron en medio sólido con cloranfenicol. Obtuvimos 54 colonias, que luego se

repicaron a otra placa de ágar con cloranfenicol la cual fue crecida a 42°C para eliminar el

vector termosensible pKD46. Para constatar la eliminación del vector pKD46, se crecieron

las 54 colonias en placas con ampicilina. Este paso, además, fue realizado para descartar que la

resistencia a cloranfenicol pudiese provenir de la contaminación con el templado utilizado para

la reacción de PCR (vector pGEM-T Easy-sicP::cat). De las 54 colonias plaqueadas, 32 mostraron

ser resistentes a ampicilina y fueron por tanto descartadas. Las colonias sensibles a ampicilina,

además resultaron negativas para un ensayo de PCR utilizando los oligonucleótidos T7 y SP6,

específicos del vector pGEM-T Easy (datos no mostrados). Un esquema de esta estrategia de

selección y chequeo de las colonias obtenidas se detalla en la Fig.12.

28

Fig.12: Esquema del proceso de selección y verificación de los clones mutantes para el gen sicP.

Para llegar a estos resultados hemos debido ajustar distintas condiciones experimentales

(ver arriba), e incluso cambiar nuestro protocolo de mutagénesis original. Como primer

abordaje, habíamos tratado de mutar el alelo del gen sicP utilizando un cassette de resistencia

a cloranfenicol, con apenas 30 pb de homología en sus extremos. Con el mismo, sin embargo,

realizamos 5 intentos, y en ninguno de ellos se han obtenido clones resistentes a cloranfenicol.

Posiblemente 30 pb no sean suficientes para forzar la recombinación homóloga en S.

Typhimurium; como sí ha sido reportado en E. coli [49].

Evaluación genotípica de la bacteria mutante

El genotipo de las posibles colonias mutantes de S. Typhimurium LT2 fue evaluado por

PCR. Para ello diseñamos 2 pares de oligonucleótidos; un primer par que hibridiza con

secuencias genómicas por fuera del ORF de sicP (y por tanto ausentes en el plásmido pGEM-T

Easy-sicP::cat) y un segundo par que hibridiza dentro del gen cat. Se realizaron distintas

reacciones de PCR sobre colonias WT (sensibles a Cm y amp) y posibles mutantes

(resistentes a Cm y sensibles a amp) utilizando combinaciones de estos oligonucleótidos

(Fig.13A).

29

La primera reacción de PCR, utilizando ambos oligonucleótidos complementarios a regiones

flanqueantes al ORF de sicP, mostró productos de amplificación de aproximadamente 1400 pb

para cada uno de los 4 mutantes analizadas y un amplicón de 500 pb para la WT. Estos

tamaños son concordantes con los predichos para el alelo sicP::cat y WT en el locus sicP,

respectivamente (Fig.13B). Cuando utilizamos los pares de oligonucleótidos; cat reverse + sicP

reverse; y sicP forward + cat forward, en cambio, sólo obtuvimos productos de amplificación, y

del tamaño esperado, en los clones mutantes (Fig.13B). Esto es congruente con lo esperado, ya

que los oligonucleótidos cat reverse y cat forward no poseen homología con la cepa WT.

En la combinación cat reverse y sicP reverse, observamos un amplicón de

aproximadamente 1000 pb, compatible con lo esperado, y en la combinación sicP forward +

cat forward observamos un amplicón de aproximadamente 1100 pb también como era de

esperarse (Fig.13B).

En el caso de la combinación sicP forward + cat forward, observamos además una banda

de tamaño levemente menor al esperado que está en todas las calles y que podría representar

un producto de reacción inespecífico.

El análisis integrado del tamaño diferencial y/o de la ausencia/presencia de amplicones en

las distintas PCRs nos permite concluir que los clones seleccionados son genotípicamente

deficientes para el gen sicP.

30

B

Fig.13: Análisis genotípico de las colonias mutantes de S. Typhimurium. A) Combinación de

oligonucleótidos para las distintas reacciones de PCR ensayadas y los correspondientes pesos

moleculares según el par utilizado y el genotipo. B) Reacción de PCR utilizando diferentes

combinaciones de oligonucleótidos sobre los distintos clones: Flecha negra y negra sólido

corresponden a los oligonucleótidos por fuera del gen sicP, forward sicP y reverse sicP. Flecha celeste

y flecha negra sólido, corresponden a los oligonucleótidos: reverse cat y reverse sicP. Flecha negra y

flecha celeste sólido, corresponden a los oligonucleótidos forward sicP y forward cat.

Evaluación fenotípica de la bacteria mutante

Para evaluar fenotípicamente a las colonias deficientes para SicP obtenidas realizamos

ensayos de Western-blot sobre fracciones de proteínas totales y secretadas luego de la

inducción del sistema T3SS, tal cual lo mostrado en la Fig.9. Para ello, seleccionamos un clon

KO y la cepa WT y las transformamos por electroporación con el vector pSB3153-sptP::3xFLAG.

La selección se hizo en placas de ágar con ampicilina y cloranfenicol para el clon KO y en

ampicilina para la cepa WT. Estas cepas luego fueron crecidas en paralelo en medio de

inducción de T3SS tal cual lo descripto anteriormente, no observándose un fenotipo de

crecimiento deficiente para la cepa KO en sicP (datos no mostrados).

Como podemos observar en la Fig. 14A, el clon KO es incapaz de secretar al efector SptP,

a diferencia del control WT, ya que no se observa una banda de un peso de 60 kDa

31

correspondiente al efector SptP en el sobrenadante. Esto se correlaciona con un aumento

aparente de los niveles de SptP en el citoplasma de la cepa KO en relación a la WT, lo que

podría interpretarse que al no ser secretado el efector, éste se acumula intracelularmente.

También se observan varias bandas de menor tamaño, en relación a la cepa WT, las que

podrían corresponder a especies parcialmente degradadas tal cual lo descripto [40].

Esas mismas fracciones fueron analizadas por Western-blot utilizando anticuerpos anti-

GroEl (Fig.14B), una chaperona de expresión constitutiva y muy prevalente en enterobacterias,

de localización exclusivamente citoplasmática [57]. Lamentablemente, la sensibilidad de este

anticuerpo mostró ser muy baja, lo que puede deberse a que estaba dirigido a la proteína

GroEl de Brucella spp y no de S. Typhimurium y sólo pueden observarse señales débiles y de

intensidad semejante en la fracción correspondiente a los pellets bacterianos. Este control, si

bien debe ser optimizado utilizando otro anticuerpo más apropiado, indicaría que las

diferencias de SptP extracelular entre las cepas WT y sicP KO no pueden atribuirse a

diferencias en la tasa de lisis celular espontánea (o inducida por el manipuleo posterior de las

muestras) durante el ensayo de inducción del T3SS.

Por último, para descartar que la deficiencia de la secreción del efector SptP no se debiera

a una alteración inespecífica del sistema T3SS en la bacteria mutante, llevamos a cabo la

cuantificación de secreción de otro efector del T3SS , SopE [58] (Fig.14C), en nuestras cepas

WT y KO. Para medir los niveles de secreción de SopE, utilizamos un protocolo equivalente al

descripto para SptP. Brevemente, transformamos cepas WT y KO con el efector SopE clonado

en el vector de expresión pWSK29 (que provee resistencia a ampicilina) en fase con el epitope

3xFLAG, previamente construido en el laboratorio del Dr. Gabriel Briones. Como muestra la

Fig.14C, en todos los casos se observa una banda de aproximadamente 35 KDa,

correspondiente al efector SopE, no observándose diferencias significativas en los niveles de

secreción entre las cepas WT y SicP KO. Esto es consistente con el hecho que el efector SopE

en vez de utilizar SicP utiliza otra chaperona (InvB) para ser secretado a través del T3SS. Un

SDS-PAGE de estas mismas muestras teñido con Coomassie-blue reveló un perfil de bandas

proteicas muy similar en el sobrenadante de las cepas WT y SicP KO (datos no mostrados), lo

que soporta aún más que la cepa SicP KO no muestra una deficiencia generalizada a nivel de

secreción T3SS-dependiente y/o independiente.

32

Fig.14: A) Ensayos de secreción del efector SptP en clones deficientes en el gen sicP y en cepas WT. En

las calles correspondientes a los sobrenadantes, se sembraron 10 µl de 50 µl totales de la resuspensión

de proteínas totales, del sobrenadante de 10 ml de cultivo. En las calles correspondientes a los pellets,

se sembraron 10 µl del cultivo bacteriano con una D.O. de 0,6 medido a 600 nm. B) Control de lisis

celular utilizando anticuerpos anti Gro-EL en una dilución 1:2000 C) Ensayos de secreción del efector

SopE en clones deficientes en el gen sicP (KO) y en cepas WT, mediante ensayos de Western-blot

utilizando anticuerpos anti-FLAG en una dilución 1:5000.

Complementación de la cepa sicP KO con el motivo CEST de TCLP1

Para evaluar la capacidad del motivo CEST de TCLP1 de complementar la función de SicP,

amplificamos el motivo CEST del gen TLCP1 utilizando los oligonucleótidos Tc-cesT HIS forward

y Tc-cesT reverse (MS.11), utilizando como templado ADN genómico de la cepa CL Brener de T.

cruzi. El oligonucleótido Tc-cesT HIS forward fue diseñado de forma tal que el producto de

amplificación (Fig.15A) tenga un sitio de unión a ribosoma (RBS) para promover su traducción,

una fusión de 6 histidinas en tándem en el extremo N-terminal que permite verificar y

cuantificar su expresión utilizando anticuerpos monoclonales anti-HIS (MS.11) y un codón

STOP inmediatamente después del motivo CEST definido en [22]. De manera análoga,

generamos un vector pBBR1-MCS2 conteniendo el gen sicP, para ser usado como control positivo

de complementación. Al igual que en el caso de CEST de TCLP1, el oligonucleótido sicP HIS forward

fue diseñado de forma tal que el producto de amplificación tenga un sitio de unión a ribosoma

(RBS) y una fusión de 6 histidinas en tándem en el extremo N-terminal. (Fig.15B).

33

Ambos amplicones (Fig.15C) fueron purificados y digeridos con las enzimas EcoRI y HindIII para

luego ligarlos en el vector de expresión pBBR1-MCS2 (MS.5), previamente digerido con las mismas

enzimas. Este vector posee resistencia a kanamicina, y se expresa constitutivamente en S.

Typhimurium. La correcta identidad de estos vectores (llamados pBBR1-cesT y pBBR1-sicP (MS.6,

7)) fue chequeada por restricción con las enzimas EcoRI y HindIII (datos no mostrados) y

secuenciación (MS.14, 15).

A C

B

Fig.15: Amplificación de los genes para la complementación. A y B) Diagrama del amplicón cesT (A) y

sicP (B) en donde se detalla la estructura molecular de los constructos y los sitios de restricción

relevantes para su construcción. C) Productos de amplificación del motivo CEST de TCLP1 y el gen sicP,

con los oligonucleótidos mencionados en texto. Los chorreados de bajo peso molecular observadas en

ambas reacciones se deban probablemente a oligonucleótidos que no entraron en reacción.

Para llevar a cabo los ensayos de la complementación funcional, se co-transformaron por

electroporación las cepas de S. Typhimurium WT y KO con los vectores

pSB3153::sptP::3xFLAG y con el vector de complementación pBBR1-cesT o pBBR1-sicP. Como

control adicional, co-transformamos los clones WT y KO con los vectores

pSB3153::sptP::3xFLAG y pBBR1-MCS2. Las cepas electroporadas, se seleccionaron con

ampicilina y kanamicina. Después de ensayos de inducción in vitro del T3SS, se analizaron

fracciones de bacterias totales y de sobrenadantes por Western-blot anti-FLAG.

Al evaluar los sobrenadantes, concluimos que el motivo CEST de TLCP1 restaura la

capacidad de secretar el efector SptP en las bacterias KO. Se observa una banda de

aproximadamente 60 kDa correspondiente al efector SptP (Fig.16A). Esta señal es de un nivel

de intensidad algo menor en comparación de la cepa KO complementada con sicP, que podría

correlacionar con el hecho que SicP es la chaperona original de S. Typhimurium. Como era de

esperarse en los sobrenadantes de las bacterias KO complementadas con el plásmido vacío no

se observa señal correspondiente a al efector, al igual que cuando se evaluó el fenotipo de la

bacteria mutante, lo que indicaría que el protocolo de secreción fue realizado correctamente y

34

que las diferencias de los niveles de SptP no puede explicarse por lisis celular espontánea o

debida a errores de manipuleo de las muestras.

En los pellets de las cepas KO analizados (Fig.16A), los niveles de expresión del efector son

similares al complementarlos con SicP y el motivo CEST de TCLP1, pero podemos observar

que cuando se complementa con el vector vacío, la intensidad de señal es menor respecto a

las otras 2 complementaciones y también en relación al pellet WT sin complementar. Esto

podría deberse a que a falta de la chaperona SicP, el efector SptP se esté degradando [48].

En los ensayos de los sobrenadantes de las cepas WT, se puede observar la banda de 60

KDa correspondiente al efector SptP, pero también se observan bandas de aproximadamente

40 kDa y 50 kDa en los sobrenadantes al complementarlo con el motivo CEST, y una banda de

40 kDa en el caso de la cepa WT complementada con el vector vacío, estas bandas podrían ser

productos de la degradación parcial del efector (Fig.16B). Interesantemente, en el caso de

complementar la cepa WT con el motivo CEST de TCLP1, la intensidad y cantidad de bandas

son mayores que en las observadas en la cepa WT sin complementar, lo cual nos hace pensar

que la chaperona SicP puede ser un limitante para la secreción del efector SptP. Algo similar

podemos observar si comparamos los sobrenadantes de la cepa WT y KO complementado con

el motivo CEST de TCLP1. Se observa una mayor señal en los sobrenadantes de las cepas WT a

comparación de la KO, esto puede ser debido a que la cepa KO sólo dispone del motivo CEST y

en cambio la cepa WT dispone de su propia chaperona SicP y además el motivo CEST, para

estabilizar y evitar la degradación del ARNm de sptP.

En los pellets WT complementado con el motivo CEST de TCLP1 se observa un mayor nivel

de expresión del efector en relación a la cepa sin complementar, ya que se observa una banda

de 60 KDa de mayor intensidad, y además de una banda adicional de 40 KDa. Esta banda

podría corresponder a productos de degradación intracelular debido a la sobreexpresión y

acumulación en el citoplasma bacteriano. Si comparamos los pellets de la cepa WT y KO

complementadas con el motivo CEST de TCLP1, observamos el mismo patrón, es decir que la

coexistencia de la chaperona SicP y CEST en la cepa WT incrementa la concentración del

efector dentro de la célula.

Para validar la correcta expresión del motivo CEST y de la chaperona SicP, llevamos a cabo

ensayos de Western-blot utilizando anticuerpos primarios anti-HIS, ya que estos constructos

poseen en su región N-terminal un marcador de 6 histidinas en tándem. Podemos observar la

correcta expresión de las chaperona SicP y del motivo CEST en las bacterias totales tanto al

complementarlos en las cepas KO y WT, ya que se visualizan bandas de similar intensidad de

aproximadamente de 25 KDa, correspondientes al motivo CEST y a la chaperona SicP (Fig.16C).

Por otro lado, como era de esperarse aquellas bacterias WT y KO que fueron complementadas

35

con el pBBR vacío, no muestran reactividad con el anticuerpo anti-HIS, lo cual verifica la la

especificidad de las señales obtenidas con este anticuerpo.

Para normalizar la carga, se sembraron 10 µl de cada muestra (células totales y

precipitación del sobrenadantes) en geles de poliacrilamida, y luego teñidas con Coomassie-

blue (Fig.16D). Podemos observar un perfil característico para los pellets, y otro perfil para los

sobrenadantes, más allá de la masa que se ha sembrado en cada calle. Sin embargo, se puede

observar que la cepa WT complementada con el vector pBBR1-sicP, posee un perfil de

secreción que difiere del resto de los clones. Esto, si bien no fue explorado en profundidad,

podría deberse a un control transcripcional/traduccional ejercido por sicP sobre SptP y algunos

otros mensajeros involucrados en el funcionamiento del T3SS, el cual no puede ser

recapitulado por el motivo CEST de TCLP1.

Fig.16: A) Ensayos de Western-blot sobre muestras de sobrenadantes y pellets del clon KO

transformados con cesT y sus respectivos controles. Se llevó a cabo utilizando anticuerpos primarios

anti-FLAG a una dilución 1:5000. pBBR= vector vacío; CesT: motivo CEST clonado en pBBR1-MCS2; SicP:

secuencia de la chaperona SicP clonado en el vector pBBR1-MCS2. B) Ensayos de Western-blot sobre

muestras de sobrenadantes y pellets del clon WT transformados con cesT y sus respectivos controles. C)

Ensayos de Western-blot utilizando anticuerpo anti-histidina para verificar la correcta expresión de los

constructos pBBR1-cesT y pBBR1-sicP. D) Sobrenadantes y pellets de los distintos clones, resueltos en

geles de poliacrilamida y teñidos con Coomassie-blue para normalizar las cargas en los ensayos de

Western-blot.

36

DISCUSIÓN

En esta Tesina demostramos que a pesar de la enorme divergencia de secuencias (Fig.3), el

motivo CEST de TCLP1 de T. cruzi es capaz de reemplazar funcionalmente a la chaperona SicP

de S. Typhimurium. Brevemente, utilizamos el Sistema λ-Red [56] para generar una cepa de S.

Typhimurium KO para el gen SicP por recombinación homóloga de un alelo mutante,

portando un marcador de resistencia a cloranfenicol. La confirmación de la correcta

obtención de la mutante sicP fue confirmada por PCR (Fig.13) indicando el reemplazo alélico

exitoso. Este genotipo fue confirmado mediante el estudio de la ausencia de expresión de la

proteína SptP (ver debajo). Si bien no realizamos una genotipificación exhaustiva de las

posibles cepas mutantes (por ejemplo, haciendo secuenciación de genoma completo),

experimentos posteriores de complementación con el vector pBBR-sicP mostraron una

reversión completa de los niveles de secreción de SptP, con lo cual puede descartarse la

posibilidad de un posible efecto ‘off-target’ durante la generación de la cepa sicP KO en este

fenotipo.

Para evaluar el fenotipo de esta mutante desarrollamos las herramientas necesarias y

optimizamos las condiciones para detectar los niveles de secreción de SptP in vitro (Figs. 9-

12). Al ser evaluada en ensayos de inducción y secreción de efectores vía T3SS, la cepa sicP KO

fue completamente incapaz de secretar al efector SptP al sobrenadante bacteriano tal cual lo

esperado. Esto se correlacionó con un aumento aparente de los niveles de acumulación

citoplasmática de SptP y la aparición de productos de degradación parcial (Fig.14),

coincidente con lo descripto [40]. Como se muestra en las Fig.14, la deficiencia en la

secreción de SptP de la cepa sicP KO es específica para el efector, y no se debe a una

alteración generalizada a nivel de secreción T3SS-dependiente y/o independiente. Más

importante, la falta de secreción de SptP también pudo ser revertida por la complementación

de la cepa sicP KO con el vector pBBR conteniendo el motivo CEST de TCLP1 de T. cruzi pero no

con el vector pBBR vacío. Las diferencias en los niveles de secreción de SptP entre las

bacterias complementadas con SicP o con el CEST de TCLP1 no puede atribuirse a diferencias

en los niveles de expresión de estas moléculas (Fig.16). Por el contrario, el perfil de secreción

atípico de la cepa WT complementada con el vector pBBR1-sicP (Fig.16) y distintas

evidencias reportadas en literatura [48, 59] sugieren que estas diferencias podrían deberse a

regulaciones transcripcionales/traduccionales ejercido por la proteína SicP, pero no

observables con la complementación con el motivo CEST de TCLP1, siendo esta una

característica diferencial entre ambas.

37

En definitiva, nuestros resultados en conjunto sugieren fuertemente que el motivo CEST

de TLCP1 de T. cruzi es capaz de complementar la función de SicP de S. Typhimurium para la

secreción de SptP dependiente del T3SS. Experimentos adicionales del laboratorio realizados

luego de la finalización de la parte experimental de esta Tesina refuerzan aún más esta

hipótesis, que muestran que el motivo CEST de TCLP1, además de complementar la función

de secreción de SptP a través del T3SS al sobrenadante bacteriano, es capaz de

complementar también su traslocación funcional del efector SptP al citosol de la célula

hospedadora.

Como se mencionó en la introducción, S. Typhimurium promueve modificaciones del

citoesqueleto de las células blanco induciendo la polimerización de actina y generando

estructuras de membrana denominadas ruffles, que favorecen la internalización de la bacteria

(Figs. 6 y 7). Este mecanismo inducible de entrada es el resultado de la acción coordinada de

distintos efectores del T3SS, que co-optan o manipulan distintos aspectos de la fisiología

celular. Mientras los efectores SopE, SopB y SopE2 provocan la activación de las Rho GTPasas,

la polimerización de actina y la fisión de la membrana del huésped a tiempos cortos [39], el

efector SptP promueve la reversión de todos estos procesos a tiempos más largos después del

contacto inicial bacteria-célula. Como se observa en la Fig.17, y utilizando un modelo de

células Vero en cultivo, el pico de rearreglos del citoesqueleto de actina de la célula huésped

inducido por S. Typhimurium WT ocurre 1 hora post-infección, revirtiendo a niveles similares a

los normales a las 3 horas. En ensayos de infección utilizando la cepa deficiente del gen sicP

generada en este trabajo, sin embargo, los eventos compensatorios tardíos no fueron

verificados (Fig.17). Esto indicaría que el efector SptP no es translocado al interior de las

células blanco, coincidente con la falta de secreción observada en nuestros ensayos in vitro

(Fig.16). Interesantemente la complementación de la sicP KO de S. Typhimurium con dominio

CesT de TCLP1 (o con la propia SicP, Fig.17) revirtió este fenotipo, observándose una cinética

de polimerización/despolimerización de filamentos de actina similar a la verificada en células

infectadas con bacterias WT.

38

Fig.17: Cinética de inducción/desensamblado de rearreglos en el citoesqueleto de actina de la célula

blanco durante la infección con S. Typhimurium. Infección de células Vero con diferentes clones de S.

Typhimurium expresando la proteína RFP en el citoplasma; ya sean WT, KO complementadas con el

motivo CEST, KO sin complementar y KO complementadas con la chaperona SicP. Las células fueron

fijadas a los tiempos post-infección indicados y procesadas para inmunofluorescencia indirecta usando

faloidina-Alexa 488 (señales verdes). Los preparados fueron también teñidos con DAPI (azul).

Desde un punto de vista evolutivo, estos resultados apoyan la hipótesis de que el dominio

CEST se adquirió en el linaje de los trypanosomátidos vía un evento de transferencia génica

horizontal a partir de un antecesor de las enterobacterias. Más aún, sugieren la existencia de

una presión de selección en trypanosomátidos tendiente a la conservación de la actividad

chaperona en el motivo CEST, la cual podría tener relevancia para la biología de estos

parásitos.

Teniendo en cuenta la localización en bolsillo flagelar y la función de TCLP1 en procesos

endo-exocíticos [22], podría postularse que la posible función tipo chaperona de esta molécula

estaría asociada al reciclado de algún tipo de receptor de superficie involucrado en la nutrición

39

del parásito [60, 61]. Alternativamente, esta actividad chaperona podría promover la

interacción de TCLP1 con alguna/s molécula/s que posibilitan su direccionamiento específico al

bolsillo flagelar (es decir no estar relacionada directamente con su aparente función en los

procesos de endo/exocitocis) o mediar la formación de agregados entre polipéptidos de la

propia TCLP1. En bacterias, las chaperonas del T3SS (como SicP) forman complejos con los

efectores proteicos (como SptP) destinados a ser inyectados al interior de la célula eucariota,

de manera de mantener a los efectores en un estado extendido o desplegado, un estado

competente para la secreción. Es interesante discutir que las chaperonas del T3SS son capaces

de distinguir entre diferentes efectores. Por ejemplo mientras SicP es especifica de SptP, la

chaperona InvB cumple un rol equivalente para la secreción del efector SopE, siendo esta

chaperona InvB incapaz de complementar la ausencia de SicP para la secreción de SptP como

observamos en esta tesina. Es interesante pensar que el dominio CEST pueda tener una

función más promiscua que SicP en cuanto al reconocimiento de efectores ya que aun

proviniendo de un organismo eucariota no relacionado es capaz de complementar una

chaperona efector-especifica como SicP. Estudios de secreción de SopE en mutantes InvB

complementados con CEST podrían responder esta cuestión.

La formación de agregados de alto peso molecular en chaperonas en general es un

fenómeno recurrente [62, 63] y evidencias preliminares del laboratorio indican la agregación

de TCLP1 in vivo en el parásito ([22], resultados sin publicar).

Experimentos futuros

Luego de los resultados obtenidos y la cantidad y variedad de técnicas aprendidas, queda

claro que logré cumplir con los objetivos de la Tesina. En el futuro, podría pensarse en ampliar

la caracterización funcional del motivo CEST de TCLP1 a otros motivos CEST de otras proteínas

de trypanosomátidos, tales como Leishmanias, Trypanosoma brucei [22] (Fig.3). Con todas las

herramientas ya generadas, la validación de estos dominios sólo implicaría el clonado del

motivo deseado en el vector pBBR y su evaluación en ensayos similares a los aquí descriptos.

Para optimizar esta validación, sería ideal obtener un anticuerpo monoclonal anti-SptP, para

observar los niveles de secreción de SptP endógenos de la bacteria. También sería

recomendable desarrollar anticuerpos específicos contra algún antígeno intracelular de S.

Typhimurium para verificar de manera más apropiada que los ensayos de secreción fueron

realizados correctamente, sin lisis celular en los productos de precipitación de proteínas del

sobrenadante.

40

Estos resultados también podrían contribuir al mejor entendimiento de los roles de TCLP1

in vivo, en T. cruzi. La hipótesis de que CesT actúe como chaperona en el parásito permite

sugerir la posibilidad de identificar a sus posibles interactores mediante criterios estructurales

(proteínas con dominios análogos cristalográficos al motivo de interacción con SicP de SptP).

Por último, y como aspecto más importante, nuestros resultados podrían abrir nuevas

posibilidades para el desarrollo de terapias alternativas contra T. cruzi y patógenos

relacionados.

41

MATERIAL SUPLEMENTARIO

MS.1: Vector pDK46; utilizado para favorecer la recombinación homóloga de fragmentos lineales

parcialmente homólogos. Tiene la particularidad de ser termosensible a 42°C, codifica los genes exo,

gam y bet, bajo el promotor pAraBAD inducible por arabinosa, los cuales facilitan la recombinación. Por

otro lado codifica la resistencia ampicilina como marcador de selección.

MS.2: Diagrama esquemático del vector pRY109, en la cual está clonado el cassette de resistencia

cloranfenicol. Utilizamos la enzima SmaI para digerir el vector y purificar el cassette. B= BamHI, Sm=

SmaI, K= KpnI, P= PstI, E= EcoRI, Pv= PvuII.

42

MS.3: Vector comercial pGEM-T Easy, este vector fue utilizado para clonar los productos de

amplificación de PCR del motivo CEST y el gen sicP. Por fuera del MCS posee sitios para poder ser

amplificada por diferentes oligonucleótidos tales como M13 forward, M13 reverse, SP6, T6 y entre

otros.

MS.4: Vector pSB3153; posee un marcador triple FLAG rio abajo del MCS como proteína de fusión,

resistencia a ampicilina, se expresa en S. Typhimurium constitutivamente, y es replicativo en la misma.

Se utilizó este vector para clonar el efector SptP en fase respecto al marcador triple FLAG, en los sitios

HindIII y XbaI.

43

MS.5: pBBR1-MCS2: Vector replicativo con expresión constitutiva en S. Typhimurium, fue utilizado para

la complementación funcional del motivo CEST y su control sicP. Ambos insertos fueron clonados por

digestión en los sitios EcoRI y HindIII. Este vector posee resistencia a kanamicina, y el MCS puede ser

amplificado con los oligonucleótidos M13 forward, M13 reverse, SP6, T6 y entre otros.

MS.6: pBBR1-sicP: Vector que fue utilizado para la complementación funcional de las cepas KO. Se clonó

el gen sicP en los sitios HindIII y EcoRI.

44

MS.7: pBBR1-cesT: Vector que fue utilizado para la complementación funcional de las cepas KO. Se

clonó el motivo CEST en los sitios HindIII y EcoRI.

MS.8: Vector comercial pGEM- T Easy en el cual se ligó el producto de amplificación sicP.

45

MS.9: Vector generado al cual llamamos pGEM-T Easy-sicP::cat. En este vector se encuentra clonado el

gen sicP, interrumpido por el cassette de resistencia a cloranfenicol. Utilizamos este vector como

templado para realizar las amplificaciones de PCR para obtener los fragmentos lineales, las cuales fueron

utilizadas para la inactivación del gen sicP por medio de la electroporación.

MS.10: Efector sptP clonado en pSB3153 en los sitios HindIII y XbaI.

46

Oligonucleótidos utilizados

Oligonucleótido Secuencia Sitio de

restricción Otros

Forward sptP GGCAAGCTTATGCTAAAGTATGAGGAGAG HindIII

Reverse sptP GGTCTAGAGCTTGCCGTCGTCATAAGCA XbaI

Primer forward sicP-flanqueantes AGACATTGTGTAACCAGATT

Primer reverse sicP-flanqueantes CTTTTGAAAACGAAGACAAC

Primer forward cat CTGCTCGGCGGTGTTCCTTT

Primer rev cat CAAACGGCATGATGCACTTG

Tc-cesT HIS forward CCAAGCTTCAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATCGAGAAAATGCCATTGACACC HindIII

RBS+ HISx 6

Tc-cesT HIS reverse CGGAATTCTCATTGCGTATCTACAGTGTCCAGTAACTC EcoRI

sicP HIS forward CCAAGCTTCAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATCATTTGCAAGCACACCAGGATATT HindIII

RBS+ HISx 6

sicP HIS reverse CCGAATTCTCATACTTTAGCATATTCCTGCAGTATGTT EcoRI

MS.11: Secuencias de oligonucleótidos utilizados y sus características

Muestras de ADN secuenciados

CAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATTTGCAAGCACACCAGGATATTATCGCTAATATTGGTGAGAAATTGGGTTTACCGCTCAC

TTTTGACGACAACAATCAGTGCTTATTATTACTCGATAGCGATATTTTTACGTCTATTGAAGCTAAAGATGATATCTGGTTATTGAACGGTATGATT

ATACCGTTATCGCCTGTTTGTGGCGATTCTATCTGGCGGCAGATTATGGTGATTAATGGTGAACTGGCTGCGAATAATGAAGGTACGTTAGCGTA

TATTGATGCCGCAGAGACGTTGTTGCTTATACATGCAATTACCGATCTGACAAATACTTACCATATTATATCGCAGCTTGAGTCATTTGTGAATCA

GCAGGAAGCGCTCAAAAACATACTGCAGGAATATGCTAAAGTATGA

MS.12: Secuenciación del gen sicP clonado en el vector pGEM-T Easy con los oligonucleótido M13

forward. Amarillo: RBS, rojo: codón de inicio de traducción, verde: tag de histidinax6, negro: secuencia

de interés.

A

CAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATTTGCAAGCACACCAGGATATTATCGCTAATATTGGTGAGAAATTGGGTTTACCGCTCACTTTTGACGACAACAATCAGTGCTTATTATTACTCGATAGCGATATTTTTACGTCTATTGAAGCTAAAGATGATGGGTACCTGCAGAATTCAGCTGCTCGGCGGTGTTCCTTTCCAAGTTAATTGCGTGATATAGATTGAAAAGTGGATAGATTTATGATATAGTGGATAGATTTATGATATAATGAGTTATCAACAAATCGGAATTTACGGAGGATAAATGATGCAATTCACAAAGATTGATATAAATAATTGGACACGAAAAGAGTATTTCGACCACTATTTTGGCAATACGCCCTGCACATATAGTATGACGGTAAAACTCGATATTTCTAAGTTGAAAAAGGATGGAAAAAAGTTATACCCAACTCTTTTATATGGAGTTACAACGATCATCAATCGACATGAAGAGTTCAGGACCGCATTAGATGAAAACGGACAGGTAGGCGTTTTTTCAGAAATGCTGCCTTGCTACACAGTTTTTCATAAGGAAACTGAAACCTTTTCGAGTATTTGGACTGAGTTTACAGCAGACTATACTGAGTTTCTTCAGAACTATCAAAAGGATATAGACGCTTTTGGTGAACGAATGGGAATGTCCGCAAAGCCTAATCCTCCGGAAAACACTTTCCCTGTTTCTATGATACCGTGGACAAGCTTTGAAGGCTTTAACTTAAATCTAAAAAAAGGATATGACTATCTACTGCCGATATTTACGTTTGGGAAGTATTATGAGGAGGGCGGAAAATACTATATTCCCTTATCGATTCAAGTGCATCATGCCGTTTGTGACGGCTTTCATGTTTGCCGTTTTTTGGATGAATTACAAGACTTGCTGAATAAATAAAATCCCAGTTTGTCGCACTGATAAAAACCCTTTAGGAACTAACGGGCGCAGCTGAATTCTGCAGCCGGGATCCCCACCCGGTTATTGAACGGTACGATTAAACCGTTATCGCCTGTTTGGGGCGATCCCATCTGGCGGCAGATTATGGGGATTAATGGGGAACTGGCTGCCAAAATCGACGGTCGTTACCGCAATTTGAGGCCATAAAAACGTTGTTGCTTAACAGGCAA

47

B

ATGGGGATCCCGGCTGCAGAATTCAGCTGCGCCCTTTAGTTCATAAAGGGTTTTTATCAGTGCGACAAACTGGGATTTTATTTATTCAGCAAGTCTTGTAATTCATCCAAAAAACGGCAAACATGAAAGCCGTCACAAACGGCATGATGCACTTGAATCGATAAGGGAATATAGTATTTTCCGCCCTCATCATAATACTTCCCAAACGTAAATATCGGCAGTAGATAGTCATATCCTTTTTTTAGATTTAAGTTAAAGCCTTCAAAGCTTGTCCACGGTATCATAGAAACAGGGAAAGTGTTTTCCGGAGGATTAGGCTTTGCGGACATTCCCATTCGTTCACCAAAAGCGTCTATATCCTTTTGATAGTTCTGAAGAAACTCAGTATAGTCTGCTGTAAACTCACTCCAAATACTCGAAAAGGTTTCAGTTTCCTTATGAACAACTGTGTAGCAAGGCAGCATTTCTGAAAAAACGCCTACCTGTCCGTTTTCATCTAATGCGGTCCTGAACTCTTCATGTCGATTGATGATCGTTGTAACTCCATATAAAAGAGTTGGGTATAACTTTTTTCCATCCTTTTTCAACTTAGAAATATCGAGTTTTACCGTCATACTATATGTGCAGGGCGTATTGCCAAAATAGTGGTCGAAATACTCTTTTCGGGGCCAATTATTTAAATCAATCCTTTGTGAATTGCATCATTTATCTTCCGTAAATTCCGAATTGGTTGAAAACTCATTTAAGTCTGTAATTCTAACCAATTTTAATTTTAAACCTAACCCCCTTTTTTGATTCAATGTG

MS.13: A) Secuenciación del constructo pGEM-T Easy-sicP::cat utilizando los oligonucleótidos M13

forward. B) Secuenciación del constructo pGEM-T Easy-sicP::cat utilizando los oligonucleótidos M13

reverse. Amarillo: RBS, rojo: codón de inicio de traducción, verde: tag de histidinax6, negro: secuencia

del gen sicP, violeta: secuencia del gen Acetil cloranfenicol transferasa de Campylobacter spp.

CAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATCGAGAAAATGCCATTGACAACCTGGTTTGCATGGGGCGAGACCTTGGCCTGGAGAACACGCTAGAGTTTGATAATAACAATACTTGTGTCATAAGTGTTGACGGACAGTACAATTTAATAGTAACCTTTGATGCAGCAACAGAGCGGCTCTATATTTATTCTACCCTCATGACAAACATTCCACATGACCCGGTCTTACGACTGCGTGTCTACGAGTTTTTGATGGAGGGAGCATTACTGGGGCGTGAAATGTGTGGCGGTGGCGTTGGGGCTTCCATTAAGAATGACTTTATTCTTCTTTCTTCCAGCATATACTTGCCAACGAGTCTCCCCACAACCTTGAGCACTCTCGTACCCCAGTTTCTGTTTTCCCTTAATAAATGGCGAGAAAAACTGGGAGAGTTACTGAGC

MS.14: Secuenciación del constructo pBBR1-cesT utilizando el oligonucleótido T3. Amarillo: RBS, rojo:

codón de inicio de traducción, verde: tag de histidinax6, negro: secuencia de interés.

CAAGAGGAAAGTAAAATGCATCATCATCATCATCATTTGCAAGCACACCAGGATATTATCGCTAATATTGGTGAGAAATTGGGTTTACCGCTCAC

TTTTGACGACAACAATCAGTGCTTATTATTACTCGATAGCGATATTTTTACGTCTATTGAAGCTAAAGATGATATCTGGTTATTGAACGGTATGATT

ATACCGTTATCGCCTGTTTGTGGCGATTCTATCTGGCGGCAGATTATGGTGATTAATGGTGAACTGGCTGCGAATAATGAAGGTACGTTAGCGTA

TATTGATGCCGCAGAGACGTTGTTGCTTATACATGCAATTACCGATCTGACAAATACTTACCATATTATATCGCAGCTTGAGTCATTTGTGAATCA

GCAGGAAGCGCTCAAAAACATACTGCAGGAATATGCTAAAGTATGA

MS.15: Secuenciación del constructo pBBR1-sicP utilizando el oligonucleótido T3. Amarillo: RBS, rojo:

codón de inicio de traducción, verde: tag de histidinax6, negro: secuencia de interés.

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