Caracterización del

transcriptoma de

parásitos helmintos

Cecilia Fernández

Estudios genómicos en parásitos

Biología básica Identificación/desarrollo de productos

control (drogas, vacunas)diagnóstico (Ag)

Objetivos

Dificultades

Los parásitos no son organismos ‘modelos’ Las especies relevantes son diversas

Análisis del genomaProtozoariosAnálisis del transcriptoma Helmintos

Estrategias “clásicas”

Desarrollos tecnológicos:secuenciación, (bio)informática

Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

Clonas genómicas vs clonas de ADNc

Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

• contienen UTRs 5’ y 3’• incluyen información de ARNnc (que no codifican para proteínas)

• no contienen intrones• frecuencia

nivel de transcripción

Estudios genómicos en parásitos helmintos

Los helmintos son organismos que causan infecciones crónicas, con alta prevalencia en todo el mundo

Importancia

Dificultades

Poseen genomas grandes (108 pb/102

Mb) Las especies relevantes son diversas

Proyectos EST: Secuenciación sistemática

de ADNc seleccionados al azar de genotecas de diferentes estadios

• Nematodos ~ 550,000 ESTs (excl.C. el.) • Trematodos • Algunos cestodos

Datos dbEST (NCBI), 11/09

Estrategia

~ 450,000 ESTs

Ensamblaje (‘clustering’) y análisis de ESTsTomado de Parkinson y Blaxter (2004) Methods in Mol Biol 270: 93-126

‘Genoma parcial’ del organismo

Los helmintos…Nematodos y Platelmintos (Cestodos y Trematodos)

integran grupos distintos de metazoarios

Protostomados

Deuterostomados

Lofotrocozoarios

Ecdisozoarios

Tomado de Balavoine G. ‘Evolution and development of protostomes’

Anelids

Estudios genómicos en “helmintos” de vida libre (organismos modelos)

Genomas de:

● NematodoCaenorhabditis elegans (1997) - http://www.wormbase.org

(Caenorhabditis spp. 4 especies adicionales)

● Platelminto - Turbelario

Schmidtea mediterranea (2008) - http://smedgd.neuro.utah.edu

Estudios genómicos en parásitos helmintos

Genomas de:

● NematodosBrugia malayi y Meloidogyne spp.

- 1a versión terminada y publicada (2007 y 2008)

● Platelmintos

Trematodos

Schistosoma mansoni y S. japonicum - 1a versión terminada y publicada (2009)

Cestodos

Echinococcus multilocularis y Taenia solium- en proceso de ensamblaje

Estudios genómicos en parásitos helmintos

Draft completed

Tomado de Brindley et al. PLoS NTD, 2009

Estudios genómicos en nematodos

http://www.nematode.net

Ver también Martin et al (2009) NAR

NEMBASE:base de datos de ESTs de Nematodos

http://www.nematodes.org

Tomado de: Parkinson et al (2004) NAR 32: D427-D430

Tomado de: Mitreva et al. Trends in Genetics 21(10): 573-81, 2005

Genómica y/otranscriptómic

a de nematodos

Filogenia (ARNr 18S) especies con proyecto EST (‘genoma parcial’) y/o proyecto genoma (*)

Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004

Secuencias predichas de “genomas parciales” vs proteoma de C. elegans

C. elegans:20,000 genes (12,000 flías) 22,000 polipéptidos

Otros: 30 especies (28 parásitos)~ 93,000 “genes” (60,000 flías)(> 250,000 ESTs)

‘Espacio génico’ del phylum Nematodos

• 50% sin homólogos fuera del phylum Nematodos• 15% en todos los grupos de nematodos:

la mayoría (90%) con homólogos fuera del phylum

~ 1,300 específicos de nematodos

Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004

C. elegans

Aunque poseen un plano corporal uniforme…

• los nematodos son extraordinariamente diversos

• el genoma de C. elegans representa una porción pequeña del espacio génico del phylum

Algunos genes identificados a partir de ESTs

• poseen ortólogos fuera del phylum

• no están presentes en el genoma de C.

elegans

• genes perdidos en la evolución del linaje de C.

elegans

• genes asociados con el parasitismo (?)

Tomado de: Aboobaker y Blaxter, Current Biology 13: 37-40, 2003

El complejo de genes Hox en la evolución de los nematodos

Genes asociados con el parasitismo: ‘factores de virulencia’ adquiridos por transferencia

horizontal

Meloidogyne spp. (parásitos de las raíces de plantas) habrían adquirido 12 genes de bacterias del suelo por transferencia horizontal (HGT)

Varios genes habrían sido “donados” por rizobios (bacterias fijadoras de nitrógeno en nódulos en raíces de

leguminosas) con los que estos nematodos comparten

. el nicho. los mecanismos de interacción con la

planta

Tomado de: Mitreva et al. TIG 21(10): 573-81, 2005

NodL: N-acetil transferasa que participa en la síntesis del factor Nod,

glicolípido involucrado en el intercambio de señales entre la bacteria y la planta

Incongruencia entre las filogenias del gen y de la especie

Caracterización del transcriptoma de Ancylostoma caninum

Tomado de: Wang y col. BMC Genomics 211:307, 2010

La comparación revela que: • el transcriptoma de los nematodos es diverso (tanto A. caninum como C. elegans integran el Clado V)

• existirían genes “relacionados con el parasitismo”(A. caninum (Clado V) y B. malayi (Clado III) integran clados distintos)

Análisis del transcriptoma de trematodos

S. mansoniS. japonicum

El transcriptoma de S. mansoniNúmero de secuencias

Total de secuencias 163,586

Total de secuencias analizadas Adultos Huevos Miracidios B. Germinales Cercarias Esquistosómulas (7 días)

33,18019,07718,63816,71510,01427,016

124,640

Tamaño promedio de ESTs (pb) 385

Total de SmAEs SmAEs con más de una EST (‘contigs’) SmAEs con una EST (‘singlets’)

12,32218,666

30,988

Tamaño promedio de un contig (pb) 505

SmAEs de secuencias conocidas de S. mansoni Genes conocidos (GenBank) ESTs conocidas (dbEST)

639 (2%)6,447 (21%)

7086 (23%)

SmAEs de genes nuevos de S. mansoni Similares a proteínas de S. mansoni (nuevos parálogos) Similares a genes de otros organismos (nuevos ortólogos) Sin similitud con otros genes (función desconocida)

449 (1%)6,274 (20%)17,179 (55%)

23,902 (77%)

Total de genes (estimado) 13,960-14,200

Tomado de: Verjovski-Almeida et al . 2003

Assembled S. mansoni EST sequences

S. mansoni EST Genome Project

http://bioinfo.iq.usp.br/schisto/

‘Otras estrategias’ / Desarrollos futuros

Genotecas enriquecidas en tipos particulares de ADNc

• normalizadas y sustraídas enriquecidas en genes poco expresados [hasta 50% - 15,000 – 20,000 ARNm de célula somática típica]

• de expresión diferencialenriquecidas en genes expresados

diferencialmente

Genotecas enriquecidas en ADNc completos

Análisis del transcriptoma sin clonar (RNA Seq)

Desafíos de la era ‘post-genómica’...

• interpretar el genoma (ADN) y el transcriptoma (ADNc derivados de genes expresados en distintos estadios) junto con estudios de las proteínas expresadas (proteoma) y vías metabólicas (metaboloma) de los organismos

• comparar estos procesos fisiológicos con los de los hospederos para contribuir al desarrollo de nuevas estrategias de control de las parasitosis

Bibliografía

• Brindley et al (2009) Helminth genomics: the implications for human health. PLoS NTD

3(10):e538

Una revisión actualizada a 2009 de los proyectos genoma y transcriptoma de helmintos patógenos del

hombre.

• Parkinson et al (2004) A transcriptomic analysis of the phylum Nematoda. Nat Genet

36(12):1259

Una estudio global del transcriptoma de 30 especies de nematodos, incluyendo 28 parásitos.

• Mitreva et al (2005) Comparative genomics of nematodes. Trends in genetics 21(10): 573

Otra revisión que enfatiza la idea de diversidad molecular del Phylum; incluye las evidencias de adquisición

de genes de bacterias fijadoras de nitrógeno por transferencia horizontal por parte de los nematodos de

plantas.

• Wang et al (2010) Characterizing Ancylostoma caninum transcriptome and nematode

diversity. BMC Genomics 11:307

Caracterización muy completa del transcriptoma de un helminto, utilizando tanto estrategias de generación

de ESTs “clásicas” como con las nuevas herramientas de secuenciación.

• Verjovski-Almeida et al (2003) Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite

Schistosoma mansoni. Nat Genet 35(2):148

• Hu et al (2003) Evolutionary and biomedical implications of a Schistosoma japonicum

complementary DNA resource. Nat Genet 35(2):139

Artículos que describen análisis exhaustivos del transcriptoma de dos especies de Schistosoma, ambas

patógenas del hombre.

• Parkinson & Blaxter (2004) Expressed sequence tags: analysis and annotation. Methods Mol

Biol 270: 93

Capítulo de un volumen de protocolos experimentales que describe una plataforma de herramientas para el

análisis de ESTs.