Boi San. Veg. Plagas, 26: 637-644, 2000

Caracterización bioquímica de un nucleopoliedrovirusde Chrysodeixis chalcites autóctono de España

R. MURILLO, J. J. LIPA, D. MUÑOZ, J. AMATE, P. BARRANCO, T. CABELLO Y P. CABALLERO

En las poblaciones naturales de larvas de Chrysodeixis chalcites (Esper) que atacana los cultivos hortícolas de los invernaderos de Almería se desarrolló, en 1997, una epi-zootia en la que se identificó como agente causal un baculovirus del género Nucleo-polyhedrovirus (NPV). El ADN genómico del aislado viral, obtenido a partir de polie-dros purificados de larvas muertas por virosis, fue analizado con las enzimas de restric-ción Bglll, EcoRI y Pstl. Este análisis, confirmó que se trataba de un virus único cuyoperfil de restricción, con las enzimas utilizadas, no presentaba similitud con los perfilesde restricción de otros NPVs, previamente aislados en esa zona sobre otras especies delepidópteros como Spodoptera exigua (SeMNPV-SP2) y Spodoptera littoralis(S1MNPV-SP1), o del NPV de Autographa californica (AcNPV-wt) que es la especietipo del género Nucleopolyhedrovirus. El análisis de las proteínas estructurales delvirus también permitió discriminar este aislado de otros del mismo género. Se trata, portanto, del primer aislado de un NPV de C. chalcites, en nuestras condiciones de medio,y siguiendo la nomenclatura propuesta por MURPHY et al (1995) se ha denominadoChChNPV-SPl. Ensayos preliminares de su espectro de huéspedes indican que estevirus es bastante específico ya que sólo resultó infectivo para larvas de C. chalcites,Plusia gamma (L) y Trichoplusia ni (Hüb). En cambio, no fue infectivo, por ingestión,para distintos estadios larvarios de Helicoverpa armigera (Hüb), Spodoptera exigua(Hüb), Spodoptera littoralis (Boisduval) y Spodoptera frugiperda (J. E. Smith).

R. MURILLO, D. MUÑOZ Y P. CABALLERO: Laboratorio de Entomología Agrícola y Pato-logía de Insectos, Departamento de Producción Agraria, Universidad Pública de Nava-rra, 31006 Pamplona.J. J. LIPA: Department of Biocontrol & Quarantine, Institute of Plant Protection, Mic-zurina 20, 60318 Poznan, Polonia.J. AMATE, P. BARRANCO Y T. CABELLO: Departamento de Biología Aplicada, EscuelaPolitécnica Superior, Universidad de Almería, 04120 Almería.

Palabras clave: Chrysodeixis chalcites, baculovirus, nucleopoliedrovirus, caracte-rización bioquímica, espectro de huéspedes

INTRODUCCIÓN

Chrysodeixis chalcites es una especie fitó-faga, perteneciente a la familia Plusiinae,que actualmente se distribuye por el Sur deEuropa, África, Oceania, Asia y algunospuntos de América (CAYROL, 1972). Lasplusias o geométridos, nombre común conel que se conoce a las orugas de este grupo,se han descrito sobre muchas especies hués-ped entre las que se encuentran cultivos or-namentales, hortícolas, industriales y tam-

bién sobre malas hierbas. Los daños sonproducidos por la alimentación de las larvasque llegan a originar importantes defoliacio-nes en las plantas. En España, causa dañosde importancia económica en el Valle delGuadalquivir (CABELLO, 1986), la Vegade Granada (CABELLO, 1988b) y en inver-naderos en la provincia de Almería (CABE-LLO y BELDA, 1994; APARICIO et al,1995; CABELLO et al, 1996). En estazona, las poblaciones larvarias de C. chalci-tes suelen producir infestaciones simultá-

neas, sobre los mismos cultivos y al mismotiempo, con otras especies de noctuídos queproducen el mismo tipo de daño, como sonla rosquilla verde (Spodoptera exigua) y larosquilla negra (Spodoptera littoralis).

En la actualidad el control de esta plaga serealiza por aplicación de insecticidas quími-cos de síntesis (CABELLO y BELDA,1994). Sin embargo, la creciente tendencia aminimizar los impactos negativos que seproducen por la continuada utilización deinsecticidas químicos ha favorecido la bús-queda de otros métodos de control entre losque destaca la utilización de depredadores,parasitoides y virus y microorganismos en-tomopatógenos. Entre los virus entomopató-genos que regulan las poblaciones de estaespecie fitófaga, de forma natural, destacaun nucleopoliedrovirus (NPV) de C. chalci-tes, responsable de epizootias en los inver-naderos de la región de El Ejido en Almería(BARRANCO, corn. pers.).

Los NPVs son virus pertenecientes a lafamilia Baculoviridae que han sido aisladosde numerosas especies fitófagas, entre lasque se encuentran muchas de las más impor-tantes plagas de insectos (MARTIGNONI yIWAI, 1986). Los NPVs tienen cualidadesinsecticidas, como su especificidad y seguri-dad de empleo, que los hace totalmentecompatibles con otros métodos de lucha(ROBERTS et ai, 1991). Varias aislados deNPVs, recogidos en distintos lugares delmundo, han sido caracterizadas a nivel bio-químico y biológico (GELERNTER y FE-DERICI, 1990; CABALLERO et ai, 1992;HARÁ et ai, 1995) y, actualmente, en va-rias partes del mundo se han registradoscomo bioinsecticidas y se utilizan en el con-trol de plagas (MOSCARDI, 1999).

Morfológicamente, los NPVs contienenpartículas virales compuestas de ADN decadena doble, de entre 90 y 160 kilobases(BLISSARD y ROHRMAN, 1990), las cua-les quedan incluidas en una matriz proteicaque forma el poliedro (también llamadocuerpo de inclusión). La poliedrina, proteínamayoritaria que forma la envoltura del po-liedro, les confiere gran estabilidad fuera del

huésped. El análisis del ADN viral con enzi-mas de restricción ha demostrado ser un mé-todo muy útil para diferenciar aislados y ca-racterizarlos (LEE y MILLER, 1978;HARÁ et ai, 1995; FIGUEIREDO et ai,1998). El objetivo de este trabajo es analizarbioquímicamente un NPV aislado de larvasde C. chalcites y determinar su relación conotro NPVs obtenidos en la misma zona,como el NPV de S. exigua (SeMNPV-SP2;Se-SP2) y el de S. littoralis (S1MNPV-M2;S1-M2), así como con la cepa tipo del géne-ro Nucleopolyhedrovirus, el NPV de A. cali-fornica (AcMNPV-wt; Ac-wt). También, seha determinado su espectro de huéspedessobre varias especies de lepidópteros de in-terés agrícola.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los insectos y los nucleopoliedrovirus

Los insectos empleados en este trabajo,proceden de poblaciones mantenidas encondiciones ambientales constantes (tem-peratura 26 ±2 °C, humedad relativa 70 ±5% y fotoperíodo de 16 h de luz) en el in-sectario de la Universidad Pública de Nava-rra (UPNA). Los individuos en estado delarva se alimentan con dieta artificial com-puesta por 18% de harina de maiz, 3,4% delevadura de cerveza, 3,2% de germen detrigo, 1,5% de caseína, 0,45% de ácido as-córbico, 0,11% de nipagina, 0,05% de de al-dehido fórmico, 0,13% de ácido benzoico y1,5% de agar (POITOUT y BUES, 1974) yen estado adulto con miel diluida al 30%(p/v) en agua destilada.

El NPV de C. chalcites se aisló de larvasde C. chalcites recogidas, en 1997, durante eldesarrollo de una epizootia en los invernade-ros de El Ejido (Almería). La cepa Se-SP2forma parte de la colección de baculovirusdel Laboratorio de Entomología Agrícola yPatología de Insectos de la UPNA. Esta cepa,originariamente, fue aislada de larvas de S.exigua recogidas en El Ejido (Almería), en1990, durante el desarrollo de una epizootia

ocurrida en los invernaderos de la zona (CA-BALLERO et al, 1992b). La cepa S1-M2 esuna variante genotípica purificada en placa apartir de un aislado marroquí obtenido de lar-vas muertas de S. littoralis, en 1967, que nosfue amablemente suministrado por el Dr.Croizier (Station de Recherches de Patholo-gie Comparée, Saint-Christol-les-Alés, Fran-cia). El aislado Ac-Wt, utilizado como re-ferencia, fue amablemente suministrado porel profesor Dr. R. D. Possee (Institute of Vi-rology and Environmental Microbiology,Oxford, Reino Unido). Se trata de la varianteC6 de la que actualmente se conoce toda susecuencia genómica (AYRES et al, 1994).

Multiplicación y purificación de poliedros

La multiplicación del NPV de C. chalatesse hizo alimentando larvas del cuarto estadiolarvario de C. chalcites con dieta artificialcontaminada superficialmente con poliedros.Las larvas muertas por virosis fueron homo-geneizadas en agua bidestilada y la suspen-sión resultante se filtró a través de una tela demuselina dos veces. El filtrado se centrifugó a8.000 r.p.m., durante 8 minutos, y el precipi-tado de poliedros se lavó en un volumen deSDS al 0,1%, dos veces, y una vez más enCINa al 0,1%. Los poliedros así purificadosfueron resuspendidos en agua destilada y laconcentración de virus se determinó haciendotres conteos independientes con una cámaraThoma (Hawksley, Lancing, Reino Unido) enun microscopio óptico con contraste de fasesa 400x. La suspensión de poliedros fue alma-cenada a 4 °C hasta que se hizo uso de ellapara el análisis de proteínas estructurales, laextracción del ADN genómico o los bioensa-yos de espectro de huéspedes.

Análisis de proteínas

Para el análisis de las proteínas estructura-les de las cepas virales se tomó una muestrade poliedros de cada una de las cepas a laque se le añadió 1/3 de bufer (124 mM-

Tris/HCl, pH 6,8, 2% (p/v) SDS, 10% v/vglicerol, 0,0001 (p/v) azul de bromofenol y5% (v/v) de 2-mercaptoetanol y se hirvierondurante 3 minutos. La electroforesis se llevóa cabo en un gei de poliacrilamida del12,5% (p/v) a 40 mA, durante aproximada-mente 1 h, según el método descrito por La-emmli (1970). Las bandas de proteínas fue-ron fijadas y teñidas en una solución quecontenía 50% (v/v) de etanol; 10% (v/v) deácido acético, 0.1% (p/v) de azul brillantede Coomassi R250 y 40% (v/v) de agua des-tilada. El peso molecular de las diferentesbandas fue estimado por comparación conlos pesos moleculares estándares de las si-guientes proteínas: MBP-pVgalactosidasa(158 KDa), p-galactosidasa (116 kDa), fos-forilasa (97,2 kDa) albumina de bovino(66,4 kDa), deshidrogenasa glutámica (55,6kDa), albumina de huevo (42,7 kDa), ani-drasa carbónica (36,5 kDa), inhibidor de latripsina de soja (20,0 kDa) y lisozima (14,3kDa).

Análisis del ADN

Los poliedros se trataron con 3xDAS (0,3M Na2CO3; 0,5 M NaCl; 0,03 M DTA; pH10,5) para liberar los viriones de la polie-drina que los rodea. Las muestras se centri-fugaron a 5.000 r.p.m., durante 1 minuto, yse recuperaron los viriones en el sobrena-dante. Estos fueron digeridos con500 mg/ml de proteinasa K, para romper lacubierta proteica de los viriones, a 45 °Cdurante 2,5 h. Se añadió SDS, hasta unaconcentración final del 1%, y las muestrasfueron incubadas 30 minutos más en lasmismas condiciones. Finalmente, el ADNfue extraído por fenolización con tres pasessucesivos con fenol y un pase final confenol: cloroformo: alcohol isoamílico(25:24:1). En cada pase se añadió un volu-men del reactivo, facilitando el mezcladode las dos fases con un leve balanceo de lostubos, y se centrifugó a 13.000 r.p.m., du-rante 5 minutos, recuperándose la faseacuosa. Por último, se precipitó el ADN por

centrifugación (15 minutos a 13.000 r.p.m)después de añadir a la muestra una décimaparte de NaAc 3M a pH 5,2 y dos volúme-nes de etanol al 96%. Se desechó el sobre-nadante y se volvió a lavar el pellet con eta-nol al 70% a 13.000 r.p.m. durante 2 minu-tos. El pellet se dejó secar y se resuspendiócada muestra en 50 jul de Tris 10 mM pH8,1. El ADN purificado se almacenó a 4 °Chasta el momento de su análisis con enzi-mas de restricción. El genoma fue digeridocon las endonucleasas de restricción Bg/ll,EcoRl y Pstl, a 37 °C durante aproximada-mente cuatro horas. Los fragmentos deADN resultantes se cargaron en un gei deagarosa al 0,7% preparado sobre bufer TAE(40 mM Tris-Acetato; lmu EDTA) conbromuro de etidio a una concentración de0,25 [Jg/ml. La electroforesis se realizó du-rante 14 horas a 20 V. El perfil resultante seobservó a través de una fuente de rayos UVy la imagen obtenida fue analizada en for-mato digital a través del programa informá-tico Molecular Analyst® (Bio-Rad, 1996).

Espectro de huéspedes

El espectro de huéspedes del NPV de C.chalcites se determinó para las siguientesespecies de lepidópteros: S. exigua, S. lit-toralis, Spodoptera frugiperda, Tricoplu-sia ni, Plusia gamma y Helicoverpa armí-gera. De cada una de estas especies se tra-taron grupos de 25 larvas de los estadiosL2 y L4, utilizando el método de bioensayodescrito por Hughes y Wood (1981). A laslarvas L2 se les suministró una única con-centración de 3x106 poliedros por mililitro(pol/ml) y a las de L4 una única concentra-ción de 3xlO9 pol/ml. Para cada especie deinsecto y estadio se incluyó un testigo de25 larvas que fueron tratadas de igualmodo excepto que la suspensión acuosa nocontenía virus. Las larvas tratadas fueronmantenidas en las mismas condiciones am-bientales descritas para la cría y observa-das diariamente hasta que se produjo sumuerte o pupación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El análisis de las proteínas mediante elec-troforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostró para todos los aislados unabanda única mayoritaria, que corresponde ala poliedrina, que tuvo un peso molecular de33 kDa para el aislado Ac-Wt, de 34 KDapara el NPV de C. chalcites y de 30 kDapara los aislados Se-SP2 y S1-M2 (Figura 1).El poliedrín, gen responsable de la expresiónde la poliedrina, es un gen muy conservadoentre los baculovirus (VAN STRIEN et al,1991), aunque se han encontrado ligeras va-riaciones en los pesos moleculares de estaproteína entre distintas especies del géneroNucleopolyhedrovirus. En este análisis seconfirmó el peso descrito para las cepas Se-SP2 y Ac-wt por CABALLERO et al.,(1992b). Además, se pudieron observar otrasbandas en el gei debidas a los péptidos es-tructurales de la membrana lipoprotéica delvirión. La mayor parte de las bandas tuvie-ron una movilidad electroforética similarpara los cuatro aislados, aunque se observandiferencias en las intensidades relativas dedichas bandas. Para el NPV de C. chalcitesse observó una banda intensa de 36 kDa queno estaba presente en el resto de las cepas.

El ADN viral del NPV de C. chalcites fueanalizado utilizando tres enzimas de restric-ción, EcoRl, BgM y Pstl y fue comparadocon los perfiles obtenidos para los aisladosAc-wt, Se-SP2 y S1-M2 con las mismas en-zimas. Para cada una de las enzimas se ob-servó un gran polimorfismo entre los distin-tos aislados, lo que se manifestó por la dife-rente movilidad de los fragmentos de ADNen el gei de agarosa (Figura 2). El perfil derestricción del NPV de C. chalcites no pre-sentó ninguna similitud con los obtenidospara el NPV de Se-SP2, recogida en estamisma zona, ni con la variante genotípicaS1-M2, que presenta un perfil muy similar aun NPV (S1-SP1) aislado en esta mismazona sobre larvas de S. littoralis (CABA-LLERO, corn. pers.).

Los tamaños estimados para los fragmen-tos del NPV de C. chalcites obtenidos con

Fig. l.-Gel de SDS-PAGE a] 12,5% mostrandolas proteínas estructurales del poliedro y de la

membrana lipoproteica de los viriones de los NPVde Ac-wt (columna 2), Chch-SPl (columna 3), Se-SP2

(columna 4) y S1-M2 (columna 5). En la primeracolumna se presenta el marcador (M) y a la izquierda

de la figura se indican los pesos molecularesde las bandas proteicas en KDa.

las tres enzimas se calcularon por compara-ción con la movilidad electroforética de losfragmentos del aislado Ac-wt (Cuadro 1). Eltamaño del genoma del virus, calculadocomo la suma total de dichos fragmentos,fue estimado entre 124 y 131 kpb, que resul-tó ser ligeramente inferior al de Ac-wt(AYRES et ai, 1994) y Se-SP2 (CABA-LLERO etal, 1992b).

La comparación de los perfiles obtenidospara el NPV de C. chalates con Ac-wt yotros NPVs presentes en la zona (SeMNPV-SP2; S1MNPV-M2), sugieren claramenteque se trata de un nuevo aislado del géneroÑucleopolyhedrovirus al que, según la no-menclatura propuesta por MURPHY et al(1995), se ha denominado C. chalcites NPV(ChchNPV) y por ser el primer aislado deorigen español ChchNPV-SPl (o abreviada-mente Chch-SPl). Además, el perfil deChch-SPl se comparó con otros perfiles denucleopoliedrovirus caracterizados que seencuentran en la bibliografía, como el deMamestra brasicae (MbMNPV) y el de He-

Fig. 2.-Perfiles de restriccióndel ADN genómico de los

NPVs de Ac-wt(columnas 1, 5 y 9),

de Chch-SPl(columnas 2,6 y 10),

de Se-SP2(columnas 3, 7 y 11)

ydeSl-M2(columnas 4, 8 y 12).

A la izquierdade la figura se indican lostamaños, en Kpb, de los

fragmentos de restriccióndel NPV de Ac-wt con Bgill.

Cuadro 1 .-Tamaños estimados de los fragmentos del NPV de C. chalcites obtenidos con las enzimasde restricción Bglll, EcoRI y Pstl y el tamaño del genoma total en kpb

Fragmento Bglll EcoRI Pstl

Genoma

licoverpa armígera (HearNPV) (FIGUEI-REDO et ai, 1999), sin que parezca tenersimilitud con ninguno de los ellos.

Se corrobora en este trabajo que el análi-sis del ADN genómico del virus con enzi-mas de restricción es una herramienta muyútil para la comparación de distintos aisla-dos de nucleopoliedrovirus y para la carac-terización de nuevas cepas (LEE y MI-LLER, 1978), siendo un método con mayorcapacidad de discriminación que el análisisde las proteínas estructurales del virus.

Para determinar el espectro de huéspedesdel aislado Chch-SPl se han realizado bio-ensayos sobre larvas de las especies de le-pidópteros H. armígera, S. exigua, S. litto-ralis, S. frugiperda, P. gamma y T. ni. Laslarvas de T. ni y P. gamma fueron suscepti-ble a la infección, mostrando claros sínto-mas de poliedrosis (inapetencia, cambio decolor, etc...), a partir del tercer día despuésde la infección, y, finalmente, muriendo, a

los siete días aproximadamente, con lossignos claros de una poliedrosis. En ningu-na de las otras especies, tratadas por inges-tión con el virus, tuvo lugar el desarrollode la enfermedad. Por lo tanto, el aisladoChch-SPl tiene una elevada especificidadya que su espectro de huéspedes está res-tringido a su huésped natural y algunas es-pecies filogenéticamente muy próximas.Esta característica, habitual entre los bacu-lovirus (Gróner, 1986), puede ser de inte-rés para su empleo como materia activa deun bioinsecticidas en situaciones donde seaun requisito imprescindible preservar otrasespecies presentes en el mismo ecosistema.Sin embargo, con vistas a estimar su poten-cial real para el control de C. chalcites o P.gamma es necesario realizar estudios deta-llados que nos permitan determinar las ca-racterísticas insecticidas del aislado comoson su patogenicidad (DL50) y virulencia(TL50).

ABSTRACT

MURILLO, R.; JERZY J. L.; MUÑOZ, D.; AMATE, J.; BARRANCO, P.; CABELLO, T. y CABA-LLERO P., 1999: Caracterización bioquímica de un nucleopoliedrovirus de Chrysodei-xis chalates autóctono de España. Bol. San. Veg. Plagas, 26 (Adenda al n° 4): 637-644.

A nuclearpolyhedrovirus identified as the etiological agent causing epizootics in natu-ral population of Chrysodeixis chalcites in the South of Spain (Almería), was biochemi-cally characterizated. Restriction endonucleases analysis and polihedrin analysis revealedthat the isolate is a new strain belonging to the genus Nucleopolyhedrovirus that we havecalled ChchNPV-SPl after the proposal of MURPHY et al (1995). The estimated Chch-SP1 genome size was between 124 and 131 kb. Preliminary bioassays against six lepidop-teran especies indicated that the ChchNPV-SPl has a narrow host range since only two ofthem, T. ni and P. gamma, were susceptible to this virus while the other insect species, 5.exigua. S. littoralis, S. frugiperda, H. armígera, were resistant.

Key words: Chrysodeixis chalcites, baculoviruses, nucleopolihedrovirus, biochemicalcharacterization, host range.

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(Recepción: 20 diciembre 1999)(Aceptación: 04 agosto 2000)