c. caracterización bioquímica de quitinasa a y hdl-βgbp de
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Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C.
Caracterización Bioquímica de Quitinasa A y HDL-βGBP de Camarón Blanco Litopenaeus vannamei
Por:
EDGAR FELIPE MORÁN PALACIO.
TESIS APROBADA POR LA COORDINACIÓN DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS
Hermosillo, Sonora, México Febrero del 2006
RESUMEN
La lipoproteína de alta densidad y unidora de β-glucanos (HDL-βGBP) y la quitinasa, son
proteínas involucradas en el desarrollo del camarón. Mientras que la HDL- βGBP actúa en
los sistemas de transporte lipídico y de defensa innata, la quitinasa es necesaria en eI ciclo
de muda y digestión de quitina. Estas proteínas tienen en común la capacidad de unir a β-
glucanos bajo condiciones de mediana salinidad. En esta tesis se evaluó la interacción de
la HDL-βGBP de plasma de camarón con vesículas lipídicas unilamelares y la actividad
enzimática de la quitinasa purificada de hepatopáncreas con análogos de quitina. Los
mecanismos de interacción fueron evaluados mediante ensayos fluorométricos,
encontrándose que la lipoproteína agrega las vesículas sin fusión de membranas o pérdida
de contenidos acuosos. Respecto a quitinasa, se detenninó la cinética de Michaelis-
Menten para la hidrólisis de un análogo fluorescente, y se evalúo el efecto del pH y fuerza
iónica en su actividad. La quitinas a es estable en un rango de pH 5.0-8.0 con un óptimo
de actividad en pH 5.5-6.0. La fuerza iónica afectó favorablemente la actividad enzimática
en el rango de 0.35-0.75 M de NaCl, mostrando estabilidad en el rango 0-1 M NaCL Los
parámetros cinéticos de la enzima no son modificados por esos factores. Aún cuando la
interacción con sus respectivos ligandos es diferente entre HDL-βGBP y quitinasa de
camarón, se encontró que los valores de las constantes de Michaelis-Menten (Km) de
quitinasa/4-metilumbeliferil-triacetilquitotriósido y de disociación (Kd) para HDL-βGBP/
laminoribiosa se encuentran en el mismo orden de magnitud. Los resultados anteriores
justifican futuros estudios comparativos mediante técnicas de biología molecular,
bioquímica y biofísica para profundizar en su estudio a nivel de estructura y función.
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triacetilquitotriósido y de disociación (Kd) para HDL- GBP/laminoribiosa se encuentran
en el mismo orden de magnitud. Los resultados anteriores justifican futuros estudios
comparativos mediante técnicas de biología molecular, bioquímica y biofisica para
profundizar en su estudio a nivel de estructura y función.
SINOPSIS
La lipoproteína de alta densidad y unidora de P-glucanos HDL- GBP y la
quitinasa del camarón realizan diferentes funciones. Mientras que la HDL- GBP actúa
en los sistemas de transporte lipídico y de defensa del organismo; la quítinasa es una
enzima necesaria en el ciclo de muda, así como en el proceso de digestión de nutrientes.
La HDL- GBP y la quitinasa, aunque tienen funciones diferentes, poseen la
característica común de reconocer y unir -glucanos. La quitinasa reconoce -1,4
glucanos, mientras que la HDL- GBP reconoce -1,3 glucanos. Un aspecto interesante
de estas proteínas, es la capacidad para funcionar en condiciones de alta salinidad; la
HDL- GBP en hemolínfa y la quitinasa en músculo. Una pregunta lógica sería ¿qué
adaptaciones sufrieron las proteínas para realizar, en tales, condiciones funciones
similares a las de proteínas análogas de organismos terrestres?
En la presente tesis se planteó como hipótesis que en la interacción de HDL-
PGBP con vesículas lipídicas la salinidad tiene mayor efecto que el pH, mientras en la
quitinasa estos efectos son opuestos en la interacción con el sustrato. Para contrastar la
hipótesis, se purificó la HDL- GBP de la hemolinfa y la quitinasa a partir de
hepatopáncreas de camarón blanco (Litopenaeus vannamei). Una vez purificadas las
proteínas, se evaluó el efecto de la fuerza iónica en la interacción entre HDL- GBP y
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vesículas lipídicas mediante técnicas fluorométricas. Para la enzima quitinasa, se evaluó
el efecto de la fuerza iónica y pH sobre las constantes cinéticas Km y kcat·
En esta tesis, se realizó una revisión actualizada de las dos proteínas con base a
su similitud en el reconocimiento de 0-glucanos (Capítulo 1). En la revisión se discute la
función biológica de la HDL-PGBP y quitinasa en camarón, encontrándose que estas
proteínas están relacionadas con el sistema de defensa y la nutrición. Por otro lado, aún
cuando su función biológica la realizan en diferentes lugares, la síntesis de ambas se
realiza en el hepatopáncreas.
Un punto abordado en la discusión del Capítulo 1, es el de las similitudes y
diferencias entre la lipoproteína y la quitinasa. Se comenta que ambas poseen una
composición de aminoácidos muy similar; además, la estructura primaria de la HDL-
GBP presenta también regiones tipo de glucanasa. Se ha demostrado que la PGBP de
Pacifastacus leniusculus, no hidroliza los -glucanos, a diferencia de la enzima
quitinasa, la cual es capaz de romper el enlace -1,4 glucano. En cuanto a su estructura
secundaria, ambas proteínas presentan una proporción similar de hojas tipo beta, sm
embargo su plegamiento espacial se anticipa sea diferente entre ellas.
La revisión del Capítulo 1, lleva a concluir que a pesar de las diferencias en su
plegamiento y la región de reconocimiento a 0-glucanos, la HDL-PGBP y la quitinasa
comparten la característica de tener afinidad por 0-glucanos, con constantes de afinidad
para la primera y cinéticas (K111) en la última, en el mismo orden de magnitud. Por lo
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anterior la posibilidad de estudiar estas proteínas como modelo de evolución
convergente en invertebrados, mediante técnicas de biología molecular, bioquímica y
biofisica, justifica ampliamente la investigación de su estructura y función.
En el Capítulo 2, se analiza la capacidad de interacción de la HDL-PGBP con
vesículas lipídicas. Para determinar si esta interacción se lleva a acabo por medio de
fusión de membranas o el de agregación, se utilizaron ensayos con vesículas lipídicas
cargadas fluorescentemente. Los primeros ensayos realizados fueron los de pérdida de
contenido acuoso o "leakage" y el de opacamiento de la fluorescencia o "quenching".
Los resultados obtenidos indicaron que la interacción entre la lipoproteína-vesículas
lipídicas ocurre agregación y no por fusión de membranas. Estos resultados fueron
confirmados mediante un ensayo de transferencia de energía, en el cual se utilizaron
liposomas marcados con lípidos capaces de emitir fluorescencia, como se explica en el
Capítulo 2. En base a estos resultados se concluye que la HDL-PGBP es una
lipoproteína no fusogénica, por lo cual la interacción con vesículas lipídicas es mediada
por la agregación de las mismas alrededor de la lipoproteína
En el trabajo del Capítulo 2, se analizan también los resultados de microscopía
electrónica de transmisión. Se estudiaron las partículas de lipoproteína y el complejo
lipoproteína-vesículas lipídicas, revelando la microfotografia que la lipoproteína posee
una forma discoidal en el espacio y presenta el apilamiento de "monedas" característico
de las lipoproteínas con esta morfología. Asimismo, con la microfotografía del complejo
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lipoproteína-vesículas lipídicas, se da un acercamiento de cómo se lleva a cabo esta
agregación al observarse las vesículas agregadas alrededor de la lipoproteína.
La actividad de la quitinasa simulando las condiciones fisiológicas del camarón,
se estudió por medio de la hidrólisis del análogo sintético de quitina, 4-metilumbeferil -
N,N ,N '-triacetilquitotriosido. Este estudio está plasmado en un artículo de
investigación (Capítulo 3).
La quitinasa de camarón se purificó a partir del hepatopáncreas, la cual presentó
un peso molecular de :::50 kDa, estimado mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y un
pI = 4.7. Tomando en cuenta las condiciones fisiológicas a las cuales está sometida esta
enzima dentro del organismo, se evaluaron lo parámetros de estabilidad a pH y pH
óptimo así como estabilidad a la fuerza iónica y [Na+] óptima, utilizando diferentes
buffers a una concentración 50 mM. Los resultados obtenidos mostraron que la quitinasa
es estable en un rango de pH de 5.0 a 8.0 y tiene pH óptimo entre los valores de 5.5 y
6.0. Este comportamiento es similar a la quitínasa obtenida de cebada, la cual pertenece
a la familia 18 de las quitinasas. La actividad de la enzima aumentó 2 10% a
concentraciones de 0.35 a 0.75 M Na+ con respecto al control (O M Na+); además fue
estable a la fuerza iónica cuando fue incubada a diferentes concentraciones de Na+ (0-1
M) durante 30 minutos. Estos resultados confirman la adaptación de la quitinasa a las
condiciones fisiológicas del camarón.
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En el Capítulo 3 se discute también el efecto del pH y fuerza iónica en los
parámetros cinéticos de la enzima quitinasa. Para ello se hicieron co1Tidas bajo
diferentes condiciones (pH=6.0, O M Na+ y pH=5.5, 0.6 M Na+). Los resultados indican
que la capacidad catalítica de la quitinasa no es afectada por estos factores ya que se
encontró poca diferencia en las constantes Km y kcat· Asimismo, la afinidad de la
quitinasa de L. vannamei, es similar en orden de magnitud a la afinidad de las quitinasas
de cebada y Penaeus japonicus, así como la de HDL- GBP discutidos n el Capítulo 1.
La hipótesis establecida para el estudio sólo pudo ser evaluada para la quitinasa,
encontrándose que la salinidad tiene un efecto favorable en la actividad de la enzima.
Sin embargo, la fuerza iónica y el pH no tienen un efecto significativo en las constantes
cinéticas de la enzima.
