Métodos histológicos "El arte y la ciencia tienen su punto de encuentro en el método."

Bulwer

Fig. 2-1. Dibujo esque- mático que muestra un microscopio óptico co- mún. (Dibujo cedido gentilmente por Fa. Carl Zeiss AG.)

La totalidad del conocimiento actual re- ferido a la estructura y la función de los or- ganismos biológicos tiene su fundamento en los métodos necesarios para la investi- gación de las células y los tejidos. En algu- nos casos, los grandes avances en la com- prensión y el conocimiento fueron conse- cuencia directa del desarrollo de una nue- va técnica. La creación de la microscopia electrónica, los métodos de fracciona- miento celular, la inmunohistoquímica y la tecnología del DNA son ejemplos claros. Es necesario contar con ciertos conoci- mientos respecto de los principios funda- mentales de los métodos aplicados con mayor frecuencia, para que el estudio de la histología no sea tan sólo un aprendizaje de determinados hechos, sino que además permita adoptar una postura crítica frente a ellos. En consecuencia, se comenzará el estudio de la histología con un breve aná- lisis de las generalidades de los métodos histológicos, si bien a menudo será de gran utilidad revisar algunos de estos métodos,

Ojo

Ocular

Tubo

Prisma

Tornillo macrométrico

Tornillo micrométrico

relacionados con el estudio específico de las células y los tejidos.

En general, los métodos histológicos se clasifican en dos p p o s : los que se basan en la observación directa de células y teji- dos vivos, y los que analizan material muerto o inanimado. En un lugar interme- dio se ubican las técnicas de aislamiento de los componentes de células vivas me- diante métodos de centrifugación. En to- dos los casos se comienza con el análisis microscópico, de importancia fundarnen- tal para todos los métodos histológicos.

Análisis microscópico

El microscopio es el instrumento más importante en la histología, debido al pe- queño tamaño de las estructuras analiza- das. Cabe destacar que cuando en este texto se alude al término "microscopio" siempre se refiere al microscopio óptico, a menos que se especifique otra cosa.

Revólver

Objetivo

Platina

Condensador Tornillo de centrado Filtro de luz diurna Brazo del condensador

S- Diafragma

Ldmpara Colector Espejo

Cuando la luz atraviesa un material bio- lógico, por ejemplo un preparado histoló- gico, cambian sus caracterfsticas, y estas modificaciones se hacen visibles median- te los sistemas de lentes. El ojo puede di- ferenciar variaciones de intmsidad de la luz (contraste entre luz y sombras) y de color (distintas longitudes de onda). En consecnencia, es necesario modificar la luz, para que el preparado se observe co- mo formado por elementos más oscuros y más claros o de distintos colaes. Las cé- lulas y los tejidos no coloreados se suelen captar con el microscopio como carentes de color y transparentes, porque no pre- sentan suficiente contraste, Con la ayuda de tinciones histológicas se logra una ab- sorción diferencial de la luz, de modo que se visualizan las distintas estructuras.

Poder de resolución y m e n t o . Estos dos conceptos se emplean para determi- nar la utilidad de un microscopio y se de- ben diferenciar con claridad entre sí. Es

mucho más importante el poder de reso- lución d, que se define como la distancia mfnima que debe existir entre dos purrtos del oljeto para que se visualicen separa- dos. La calidad de una imagen (claridad y riqueza de detalles) depende del poder de resolución de un mimascopio.

El aumento se define como la relacitn entre el tamaño de la imagen y del objeto, en valores lineales. El aumento no depen- de del poder de resolución, pero se tiene en cuenta esta propiedad al elegir el au- mento. En cuanto todos los detalles re- sueltos se visualizan con facilidad, todo aumento ulterior sólo hace más borrosa la imagen, porque no se incrementa el poder de resolución. La imagen no adquiere más detalles y se habla de aumento vacío.

Mimscopio óptico

El microscopio SpIico está compuesto por partes mecánicas y ópticas. Los com-

ponentes ópticos constan de tres sistemas de lentes: condensador, objetivo y ocular (fig. 2-1). El condensador produce un haz de luz que ilumina el objeto estudiado. El objetivo aumenta el objeto y proyecta la imagen sobre el ocular. El ocular aumenta aun más la imagen y la proyecta sobre la retina del ojo del observador.

El aumento total resultante se determi- na mediante el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular (even- tualmente se debe multiplicar por un fac- tor que depende del tubo).

El poder de resolución depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aperturas numéricas del objetivo y el condensador (el ocular sólo actúa aumen- tando la imagen del objetivo, no mejora el poder de resolución).

El máximo poder de resolución que se puede obtener es de 0,2 pm, pero con los preparados de rutina habituales rara vez ex- cede de 0,5 pm.

Como se vio antes, los detalles resueltos se deben aumentar lo suficiente para poder ser observados sin esfuerzo, lo cual se lo- gra con el aumento adicional del ocular. Para obtener el máximo poder de resolu- ción, de alrededor de 0,2 pm, se requiere un aumento de unas 1.000-1.400 veces, da- do que el poder de resolución del ojo, a la distancia normal de observación (25 cm), es de aproximadamente 0,2 mm. Como re- gla mnemotécnica vale que, para evitar el aumento vacío nunca se debe emplearma- yor aumento que 2.000 veces la apertura numérica del objetivo. Por lo general, en el objetivo están grabados el aumento y el valor de la apertura numérica. Además, se suele especificar la longitud del tubo y el espesor de cubreobjetos (en mm) para el cual está corregido el objetivo.

Sobre la base del microscopio óptico común se han desarrollado varios micros- copios especiales, cada uno de los cuales presenta ventajas y limitaciones específi- cas, según veremos a continuación.

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro se uti- liza para analizar partículas pequeñas, que presentan muy escaso contraste con la microscopia óptica o que se encuentran en el límite del poder de resolución o por debajo de éste. Para la microscopia de campo oscuro se emplea un condensador especial, el cual impide que llegue luz di- recta al objetivo, de manera que sólo inci- de en esta lente la luz desviada o esparci- da por las pequeñas partículas que se de- sea investigar. Estas se observan lumino- sas sobre un fondo oscuro (del mismo mo- do que las partículas de polvo se visuali- zan por la dispersión que realizan de la luz de un rayo de sol).

En histología se utiliza a menudo el campo oscuro para el análisis de prepara- dos radioautográficos (véase más adelan- te), mientras que es una importante aplica- ción clínica la determinación de la espiro- queta de la sífilis, el Treponema pallidum.

Microscopio de contraste de fase

Los tejidos no coloreados producen muy escaso contraste, dado que no absorben cantidades importantes de luz. Sin embar- go, producen cierto retardo en las longitu- des de onda, de acuerdo con la "densidad óptica" variable de los tejidos, es decir, los distintos índices de rehacción. Este retraso variable de las ondas sinusales produce cierto desfasamiento entre ellas. Mediante el microscopio de contraste de fase es posi- ble transformar estas diferencias de fase, no visibles, en diferencias de amplitud, es decir, que las diferencias de refracción en- tre los componentes del tejido se transfor- man en diferencias de intensidad, que pue- den ser captadas por el ojo humano. De es- ta manera es posible transformar en visibles componentes de las células vivas que, de otra manera, sólo se observan en tejidos muertos y teñidos (fig. 2-3).

Fig. 2-3. Se observan dos fotomicrografías (A y B) de las mismas células vivas (fibroblastos de cultivo de tejido), A obtenida con un mi- croscopio óptico común y B captada con un microscopio de contraste de fase. En la imagen de contraste de fase se observan con claridad el límite entre las células (flechas), el núcleo (N), los nucléolos (Nu), mitocondrias alargadas (M), lisosomas redondos (L) y otros detalles que apenas se distinguen con el microscopio óptíco común. (Según Novikoff y Holtzman.)

Micrascopio de interferencia

El microscopio de interferencia está construido sobre la base de principios si- milares al microscopio de contraste de fa- se, dada que también en este caso se utili- zan las diferencias de fase producidas por la luz que abaviesa el objeto. Mientras que el miaascopio de contraste de fase sólo es un instrumento cualitativo, mediante el microscopio de interfer obtener datos cuantitati al dividir la luz de una haces luminasos, de los cuales uno se en- vía a t ra&~ del objeto y el otm no se alte- ra, por lo que actúa como haz de referen- cia. Después se vuelven a unir mbos ha- ces, que interfieren entre si del mismo mo- do que en el microscopio de contraste de fase. El haz que atravesó el objeto sufre un retraso respecto al haz de referencia, es de- cir, sufre una modificación de fase. Dado que el retraso es función del índice de re- fracción y del espesor, el valor del retraso se puede emplear para determinar la masa por unidad de superficie del pre arado y, en co~mcuencia, la masa de los e ementos celulares mindivduales.

P Una variate especial del microscopio

de interfermcia es el rnicmscopio de con- traste por interferencia diferencial (tam- bién denominado microscnpio de interfe- rencia de Nomarski), en el cual los dos ha- ces luminosas separados timen polaridad opuesta, por lo que se aumenta e l contras- te y se abtisne- una imagen de aspecto tridi- mensional del objeto investigado (fig. 2-4).

Microscopio de luz polarizada

Los componentes cristalinos y fibrosos del material biológico poseen una orienta- ción cmacterfstica de las mol6culas. En consecuencia, cuando se ilumina el obje- to con luz polarizada plana (luz que sólo vibra en un plano), ésta se divide en dos compcmentes con distinta velocidad, es decir, desfasados entre si. Se habla de es- tructuras bimefringentes o anisátiopas (gr. an, no; isos, igual; trope, movjrmiento). En contraste, se denomina estructuras isótro- pas a las que no dividen la luz polarizada, por lo que el índice de rehccifm es igual en todas direcciones.

Se obtienen datos referidos a la anisotro- pía del objeta mediante el microscopio de luz polarizada, que se diferencia del mi- croscopio dptico común por tener dos fil- tros polarizantes. Uno de elllos, el polariza- dor, se m a t r a antes del preparado y el otro, el analizador, está ubicado por detrás. El polarkdor transforma la luz en una po- larizada plana (al filtrar la luz que vibra en otros planos) antes de llegara1 objeto, mien- tras que el analizador se utiliza para regis-

Fig. 2-4. Fotornicrografía de una célula pilosa del oído interno captada con microscopio de Interfe- rencia diferencial (o mi- croscopio de interferen- cia de Nornmki). Ohér- vese el notable efecto tri- dimensional. x 6 2 5 (Según Msrup Jsrgensen.)

tcar las modificaciones de la polarización de la luz que ha atravesado el preparado.

La birrefringencia de un objeto d e p a - de de una estructura regular determinada. En las ct5lulas y los tejidos puede ser una disposición asimétrica regular de molécu- las o l a e s , por ejemplo, en ciertas inch- simes celulares, birrefsngencia cristaü- na, o una distribución regalar de unida- des suBmicroscópicas asimétricas, por ejemplo, en' las fibras musculares, bims fingmcia de forma. Ea consecuencia, me- diante el microscopio de I i n polarizada es- posible obtener información respecto a la. estructura a nivel mo1ec.ula.r. Además, el micros~opio de luz poliirizada se puede utilizar para el estudio de células vivas

Detmminadas sustancias fluorescen, es decir, tienen la particdmidad de irradiar luz de otra longitud de onda (color) al ser

iluminadas. La luz irradiada siempre pre- senta una longitud de onda más larga que la original. Algunos componentes biológi- cos (p. ej., la vitamina A) tienen fluores- cencia natural y se denominan autofluo- rescentes, mientras que otros adquieren la fluorescencia después de un tratamiento con determinados colorantes fluorescen- tes, por ejemplo fluoresceína, que emite una intensa fluorescencia verdosa al ser irradiada con luz azul.

En el microscopip de fluorescencia se ilumina el preparado con intensa luz de la longitud de onda capaz de activar el colo- rante fluorescente empleado. Esto se lleva a cabo mediante un filtro del color ade- cuado que se coloca por debajo del con- densador: asi se filtra la luz antes de que incida en el preparado. Además, se coloca un filtro por encima del objetivo con un color correspondiente a la longitud de on- da de la luz que emite el colorante utiliza- do cuando fluoresce. De esta manera se lo- gra que la imagen se forme sólo debido a la emisión de la luz fluorescente. Las es- tructuras fluorescentes se destacan enton- ces en color sobre fondo oscuro (véase fig. 2-14), como fuentes luminosas, por lo que es posible visualizar estructuras de di- mensiones mucho más pequeñas que el poder de resolución del microscopio.

En los últimos años se ha observado un notable incremento en el empleo de la mi- croscopia de fluorescencia, debido funda- mentalmente a la aplicación de colorantes fluorescentes que se ligan a anticuerpos específicos, que reaccionan con determi- nados componentes tisulares (véase más adelante en este capítulo).

Fig. 2-5. Imagen de las células productoras de insulina en los islotes de Langerhans del pán- creas, captada con microscopio de barrido confocal. Se distinguen gránulos citoplasmáticos que contienen insulina mediante reacción con un anticlierpo fluorescente azul contra hsulina, se determina la ~resencia de una molécula liaada a la membrana'celular (denominada transp&ado- ra de glucosa) con un anticuerpo fluorescente ro- jo y se observa una molécula localizada sobre el núcleo celular (llamada factor de transcripción para insulina) mediante un anticuerpo fluores- cente verde. (Cedida por L.-l. Larsson.)

C A P I T U L O 2

Microscopio de barrido confocal

Una limitación de la microscopia de fluorescencia radica en la necesidad de que todo e1 espesor del preparado emita fluorescencia, pero sólo es posible enfocar el objetivo en un plano del corte a la vez. En consecuencia, la luz emitida por fluo- rescencia desde zonas del preparado ubi- cadas por encima y por debajo del plano foca1 puede restar nitidez a la imagen. Me- diante el microscopio de barrido confocal se impide esta tendencia, dado que se ex- cluye la luz no emitida por el plano focal. El preparado se ilumina por un rayo láser que barre todos los puntos del plano focal, mientras que la luz emitida por el prepa- rado atraviesa una hendidura muy estre- cha que detiene la luz emitida por otros niveles, distintos del plano focal. De esta manera se logra obtener la información necesaria para formar una imagen bidi- mensional (fig. 2-5) que se registra sobre una pantalla de televisión. Al recoger con una computadora una serie de imágenes de distintos planos focales es posible re- construir una imagen tridimensional del objeto.

con nm, que

&@@m 6ptGo su el^ e@ cans- W& + cmazo, permite el pego de la luz ul'tra%&o~&ta, que es invisible. lb conse- oumcEa, Ea .fos&6n de la imaw se re- g t b a en uña pelácrula fotográ6ca,

Aunque se lo8ra un Iigem aumento del p d e r de r idución mediante esta t&dca, la tacipal importada de1 mi- cmrn~pi d e luz ultravioleta es que 10s d d d m nuclPi~gs absorben In luz ultra- videfa de d&@~mZnada longitud de onda [Z~O n&, ar 10 que se pueden detectar B con facili ad.

La c o n s ~ ~ ~ s del microscopio elec- txónico repeesenta un verdadera lago en cuanto a incrementos del aumento y del pode3 de l'emluci6n. 'En prindpie se debe a que se rei5.mplazu la luz Vpsifde, de Im- @tud de oirda da alrededor de 55-09 nm, por un h a de elmtrones de I~ngitud de anda del ordrm de 0,005 m. Bdo 9% d (poder de re;solución) es d i r m n t e psoporci~nd a A (véase pág. 20), wn &orla la aplicaciirnr de m haz de eleatrmss per- mite obtenq ua poder de mBJ.u&n muy elevado. Coma los electrones ng pueden ~traaesa l e lmtw de vidrio, u gecesario reemplazarlas por bobinas ebdmmagné- ticas (denmisradas lentes electrpmagnéti- cas), en ~ Q B qampos elecWomwgn&icos o elecWs~tki&s ce madifka saJ aitr,ym% dd haz 63: de&wes, rzle ma& sir@& a como S@ .el haz de la 1-wi@I~ m una de CEital.

EI esgwwm &e conetruocitk M mi- cirowpip & 1 ~ ó n i c o de fmmimisix5n

se pm&ta en la f l p 2-6 Ila pa- labw hm-knse refiere a que bs elec- trones awmn el objeto]. Se calienta un c6todo fiímentoso del meta1 W s t e n o [denomiaadu f f ~ ~ e n t o ) en una atmdsfera de vack'o, p la que emite s~EcCtroms que son acelaxgdm hacia el &do debfdo a una di%reat:it~ de p&m&al& alrededor de 50-100 kíf. a bodo Em6 h-f@íma de una p b me@ice c m m mifkl~ (deno- minado ap-3 en s1 c e n e a tmvBs del cud pa&m *os de los E&&CBI.B~, p u a formar Ud flnjo cdnstñnte O kaz de electro- nes. El h~ de deetroms * ..i;foba me- dian% la leate &l cande&+ en e1 pla- no del ob@bQ, y la lente del Q@W@ b m a la imagen del &jeto. La hqpim obEdda

Fig. 2-6. Dibujo esque- Gdtado mhtim de un microsco-

pio electrónico. Ánodo

Lente condensadora

Objeto

Lente objetivo

Lente proyectara

Imagen

se apmm~ pw &.a pqectora, que camqCmdml ,awIa!r copio Óp- tico* DE& qne el baz de &%&mes es Jjl, visible, la imagcm foi.91ád.a se ~egs t ra por p rq~~cQ6n cubre una pantalla duorescen- te o m pelicula fotogMkzt. Debido a la -escasa movilidad de los electrones en el aire, t a h e1 sistema debe estar en una at- &&m de mxcía. , La fim.%ddn de fera imag?an en e1 mi- m'9eis@o decXr6níei3 Se ddk!i$, p+rinrApal- msma a -1EE d i ~ r r s ? i f f i v . los elstrones. m $El T5.usperm 10s &+tsmm - q w cdi- s i m a em los n ~ ~ l w ~ - ~ i z f l c m y con stís ele&cmm en el objeto, a meqdo de ma- nera tal que inclida par hnra de la lente abj@ivo. En consecusnci&, la imagen so- bre la pantalla se forma porla ausencia de esto& electrones, como ‘bis n en som- bra". La dbpersión de los-e r &tmnes de.- pmde del espesor del-&?& y de su den- s i d ~ d moYeclar. En ap.eicid &peade -1 n b m gtdmico d~ las $tomp p;cesmtes en d ~bj&o, dada que la dizqaemibn obk- nida myor, cuantu- m% &vado sea el número flt6mico. La ~.zlay& de los áto- mos de les estrucium bioldgicas tienen número &5mico bastañte baja y contribu- yen mq poco a la formación de la ima- gexi, por lo que ce adidonen titomos pesa- dae al preparar los mabrialee [véase m&$ adelante).

Como se vio antes, dvala del microsou- pío d e m c o radica en el @m poder de resolu@ón que se puede obtener, de unas O,2 m. Na obstante, es importante diseren- ciar entre el denominado poder de res&- cibñ dei instrumento, que m del orden menciuilido y se puede i o p a1 analizar, pm-ejemplo, polvo ms€&o, el denomi- n a d ~ peder de resolmib d d obje-. Este *o m el poder de mlución que

Fig, 2-7. Dibujo esque- m&im de Lin miorosco- picl et&t&~ico de barrí- do. (D@ Hwrle, Sparrow y CM.)

Fuente de (- electrones I

puede Iogmr en Irr minvestigaei6n de prqm mdos biol6@cas y es .del orden de 2 Izm, dx- da que depende en grtm parte de los pace- W e n t o s de p r e p d 6 n (v6ase m& a&- late). Con el poder de resolución p & t k o qw se puede obtener es posible logwr m- xmntos Útiles sqeriorc?$ a 500.000 vpce8.

El microscopio ektr6nico esta limita- do por el escaso padw de penetruci& del haz de eJectrone&. Esto .implica la necesi- dad de utilizaircmes de tejido muy deiga- dm [de alrgdedor de 50 nm). Esta limite- cíón se puede supm en parte rned$m@ el uso del dematdmd~ mimseopi.O altic. frásico de al@ -&aja, cuyo haz de 4kc- imaes es alredednr de 10 veces m& r&o .en energía que el que Se utiliza en los ES- cro-scopios electrónicos comunes, El mi- cmxkopio estewm1ec'tr6nic~ per- ca- tr;s de tejido m& grumos, ya que el mismo prciparado es fotogffido desde dss'isngu- los al80 difemneir. Si después se analiaan las fotograflas mediante un estermscrspfo se obtiene un notable efecto fridimmsizr nal, en el cual la pm.@ndidad es m-, cuanto más grnese es el corte de tefido.

Otra limitacib es el requerixnlmto- de 1TtiYizar a1t0 m%, lo cual descarte in- &pciones en c8Ialas vivas.

Mimoscopio electr$nico de barrido

Easta aquí -+e aualizó el micmcoplo 1klectr6nico estándar que, coma se m=- ciirnS, se den~mina i&croscopio dactF6-

"Scanner" (barredor)

Objeto

Fig. 2-8. 1- de ~il ias de la twum cap- tada m micmsmpio etectrhha de Laarri- do. (Cedida- por B. Holma.)

nico de m m i s i d n (MET). Bu ambpar- tida es d m i ~ o p i o eleeia3dw" de $a- mido (MEB) gire, en principio y utludad, es t o t a w t e dfferente de los mkmwx- pios 6p€k8 y e k t r 6 n b d ~ . t r d s i & n , pero qU6 representa un impmtiinte suple- mento del MET. En e1 microscopia de ba- rrido los d t m m e s no atitdii@¿m el obje- to, la imsgea se forma in&ec&men~e, .a través de la mptaci6n p u n M de detalles en la suptrsffde del prepara*, El prqma- do se reabm de una debade mpi de un metal peadoJy se bombwdea c m un haz de eieatmnks muy ez%m&o (de dfededor de 10 nm de; di&netrc& qw sobre el objeto @n m paMh 1iÍlé)d y 10 copia (&g. 2-71. I3iade cade pmto se mxi~gn electrones

%mmdari~s, de medo tal que la intensidad de Ia emisi6n s~cmdMa va- ria segtín el -10 con que incide el haz he elec~i~nizs &e la supsrfiete, %te án- gulo depende de las isregdwidyidm del contorno de la euperficie. La .eui&&n se- cundaria - mide con un dat- ubicado cerca del p a p m d o y adaptado a mia pan- talla de &levisi&n, cuyes m p s CW$&CQS bmen en Jnfowa coordinada cm d haz de electrones "que flumlnan". La hn%@n 133- tenida se w¿su&za dire&-9 $ Q ~ Q la pantalla y se puede r~gistrm &a una foto- &a o 3 fimm digital.

El WiZ h m a la imggen de la superfi- cie y na e3 mzwariu utiiim so* dtm- fiaos, &&O p - e l haz de elecikmes no atraviesa d pqarado. El p ~ & r de $es&- cidn con le x&mscopiia ebctr6nic-a de ba- rrido S& de ahdedor le! Pa nm pero, en conbqmdda, la nitidez de& h o g m en profundidad es de hasta 1B m e s la

que se obtiene c m el microscopio óptico. En consecuenctía, se puede lograr una imagen tridimensi~nal definida de la su- perficie @g. 2-81.

~ c r o s c o p i o de htnel de barrido [m)

Con este ins-trurnento es posible captar la estructura de la superficie de un pre- parado hasta e1 nivel atómico. El princi- pio se basa en colocar una sonda delgada a una distancia de hasta 1 nm, por deba- jo de la superficie del preparado. Se apli- ca luego un contacto eléctrico en el ex- tremo de la sonda, que al mismo tiempo barre por sobre la superficie del prepara- do. De este modo se crea un "túnel" de electrones a través de la hendidura for- mada entre el preparado y la sonda. Mientras que 6 t a se desplaza por sobre el preparado, se mantiene constante la corriente debido al movimiento antoriiá- tico de la sonda hacia arriba y hacia aba- jo por las irregularidades de la superficie del preparado. La informacióp obtenida durante estos movimientos se registra en una computadora, la cual produce una "imagen" de la superficie del preparado. La microscopia de t h e l de barrido per- mite, entre otros adelantos, obtener nna imagen de las dos hebras de la molécula de DNA.

La microscopia de túnel de barrido está limitada por la necesidad de que el prepa- rado sea un conductor eléctrico.

Difracción de rayos X

La difracción de rayos X es un paso adi- cional en dirección a la resolución d@ de- talles cada vez m& pequeños mediante la aplicación de rayos de longitud de onda más corta. Los rayos X parecerían ser es- pecialmente adecuados para el análisis microscópico, dado que se puede aumen- tar el poder de resolución, pero no existen lentes capaces de enfocar y sacar prove- cho de estas longitudes de onda tan cor- tas. En lugar de lentes se debe aplicar el análisis matemático, lo cual limita la nti- lidad.

El principio se basa en enviar un estre- cho haz de rayos X a través de la muestra que se desea analizar (fig. 2-9). El haz se separa y se dispersa en un patrón de di- fracción (lat. fractum, rotura) que se regis- tra en una pelicula fotográfica ubicada por debajo de la muestra. En la práctica sólo es posible utilizar la difracción de rayos X en la investigación de estructuras muy or- denadas de naturaleza cristalina o semi- cristalina (de allí que, en ocasiones, se de- nomina cristalografía de rayos X) dado que, en los dem6s casos, el patrón de di-

PelCcula fotográfica A

fracción obtenido es casi imposible de descifrar. Incluso en las estructuras orde- nadas la falta de imagen formada hace que se pierda información referida a las rela- ciones entre las fases y los rayos secunda- rios, por lo que el patrón de difracción no se corresponde con exactitud con el obje- to investigado. En consecuencia se debe trabajar con aproximaciones e interpreta- ciones, que sólo presentan la estructura más probable.

Sin embargo, la difracción de rayos X ha tenido importancia fundamental en el desarrollo de la biologfa molecular y ha permitido obtener información esencial respecto a mts de 300 marmmoléculas, entre ellas la mioglobina, la hemoglobina y el DNA.

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Métodos de observación directa de células y tejidos vivos

Si bien el objetivo de la Mstología es la descripción y la comprensión de la es- tructura de las celulas y de los tejidos vi- vos, lamentablemente, por motivos técni- cos, a menudo ha sido necesario seguir el camino de la investigación de tejidos muertos y preservados. Los procedimien- tos utilizados implican muchas posibili- dades de modificación del aspecto de las estructuras debidas a causas tknicas y dejan sin respuesta numerosas incógnitas referidas a los procesos celulares vitales. Además, es imposible lograr un control más directo sobre el medio que circunda a la célula y crear modificaciones experi- mentales del mismo.

En consecuencia, existen claras venta- jas en el estudio de células y tejidos vivos; a continuación se verán algunos de los métodos disponibles.

Fig. 2-9. Dibujo esque- mático del principio de difracción de rayos X. (Según Arnberson y Smith.)

Fig. 2-10. Dibujos de cultlvo de tejido conec- tivo embrionario. En a se observa el explantado como una masa central negra, rodeada del creci- miento más claro. b y c muestran el desarrollo a aumentos crecientes. (Según Leonhardt.)

H 1 rnm

Cultivo de tejido

El cultivo de tejido es un importante método para e1 estudio de poblaciones ce- lulares vivas fiera del organismo. El mé- todo se menciona a menudo como cultivo in vitro, dado que se refiere a frascos de reactivo o de vidrio (lat. vitro, vidrio), a diferencia de in vivo, es decir, en el orga- nismo vivo.

En la actualidad, el cultivo de tejido se clasifica en tres categorías: 1) El cultivo de c6lulas comprende el cultivo de células aisladas, ya no organizadas en un tejido. Las células se pueden transportar a otro frasco con medio de cultivo, a medida que crece su número. 2) El cultivo de tejido por lo general comprende la transferencia de un trozo de tejido embrionario (gr. embryon, feto) o explantado a un medio de cultivo. Durante el cultivo crecen ex- crecencias celulares, que suelen ser de ti- po conectivo (fig. 2-10), mientras que las células especializadas del órgano perma-

kecen en el explantado, donde mantienen algunas de sus fruiciones características. 3) El cultivo de órganos comprende el ex- plantado de órganos embrionarios o ma- duros (totalmente desarrollados), como órganos completos o partes de ellos. Se in-

tenta mantener la estructura del órgano y sus funciones normales, ademhs de su po- sible evolución ulterior.

Las primeras células de mamíferos que y se observaron en estado vivo fuera del or- ganismo fueron las células sanguíneas. Eran de fácil acceso y se podían analizar al colocar una gota sobre un portaobjeto, cubierta por un cubreobjeto, y sellar los bordes para evitar la evaporación. Si se calentaba a temperatura del cuerpo la pla- tina del microscopio se lograban condi- ciones muy cercanas a las del organismo vivo. De esta manera se descubrieron los distintos tipos de glóbulos blancos y sus propiedades de movimiento independien- te y de captación de partículas (véase cap. 3). En la actualidad estos cultivos a corto , plazo de glóbulos blancos tienen amplia aplicación como el método más simple para estudiar los cromosomas humanos (más detalles en el cap. 4).

Los estudios más prolongados y la in- vestigación de las células en los tejidos or- ganizados u órganos recién fueron posi- bles después de la incorpor~ción de los cultivos de tejido. Para los estudios de cultivo de tejido se toma la muestra y se mantiene estéril (libre de micmmganis- mos vivos), porque los factores de creci-

miento también favorecen la fmmación de bacterias y h~ngos. Después de obtener la muestra se debe mantener el tejido en una solución de composición similar a la de los líquidos tisulares. Mediante el trata- miento cuidadoso con enzimas digestivas como tripsina y colagenasa, que degradan el material extracelular tendiente a man- tener unidas las células, se liberan las uniones entre ellas. El proceso se facilita con el agregado de sustancias que captan calcio, dado que los iones calcio son nece- sarias para la adhesión írrtercelular. Ade- más se efectria una separación mecánica. De esta manera, el tejido obtenido se divi- de en células individuales.

Después del agregado de medio nutriti- vo se pueden mantener las células en un cultivo en suspensión, en el que flotan, o se pueden transferir a una superficie de vidrio o de plástico, al que se adhieren. Sobre esta superficie crecen las células y forman una capa única, denominada mo- nocapa,

La composición del medio nntritivo es de irerpmtancia crítica para el exito del cultivo de tejido. La meta ideal buscada ha sido obtener medios sintéticos con compo- sición química totalmente definida y sin el agregado de sustancias orgánicas naturales como, por ejemplo, plasma smp'neo. Es- te tipo de medio representa las mejores condiciones para la investigación de la in- fluencia de distintas sustancias sobre el crecimiento y la función de las células es- tudiadas, por ejemplo, factores de creci- miento bien definidos. Hasta el momento, los medios sintéticos desarrollados sólo satisfacen los requerimientb de creci- miento de muy pocos tipos celulares, dado que la mayoría de las célules y tejidos so- lamente se pueden mantener vivos duran- te corta tiempo sin el agregado de suero al medio. En estos últimos msos se habla de medios naturales. Un paso impartante ha sido la posibilidad de agxegar antibióticos y disminuir así en gran parte el problema de las infecciones bacterianas en los me- dios de cultivo. La temperatura óptima pa- ra el cultivo de células es de alrededor de 37,50C para las células de los mamíferos (si bien varía en parte para distintos teji- dos), pero para mantener una población celular durante un periodo más prolonga- do es necesario recurrir al congelamento. En condiciones normales, las células mue- ren debido a,la formación de cristales de hielo si se las enfria por debajo del punto de congelación pero, si se trrman algunas precauciones, es posible contxalar la for- maci6n de cristales y entonces se pueden congelar y preservar en nitrógeno líquido a -1960C durante meses o años. Si después se descongelan, estarán en condiciones de continuar su crecimiento.

Mediante el cultivo de tejidos es posi- ble aislar clones celulares. Un clon mlu- Iar (gr. klon, rama, brote] es una población de células idénticas, originadas de la mis- ma célula por mitosis (división celuIar). El establecimiento de un don celular, de- nominado clonación, se efectúa, en prin- cipio, a través del &lamiento de células indbiduales, que después generan el clon por cultivo. A su vez, el clon da origen a una Enea celular parrt, es decir, un mlti- vo compuesto por un único tipo celular. Para muchas de las imrestigaciones que se realizan mediante cultivos de tejido es ne- cesario el empleo de lineas celulares pu- ras.

También es posible aislar el tipo celular que se desea investigar a partir de una suspensión mixta, que contenga distintos tipos celulares. Un método especialmente efectivo para este fin es la selección celu- lar activada m e d i a ~ e fluoresc'encia (FACS). Se utilizan anticuerpos que se fi- jan exclusivamente al tipo celular que se desea aislar. A las moléculas de anticuer- po se l e adiciona un colorante fluorescen- te ( v h s e más detalles más adelante) y se agrega la mezcla a la suspensión mixta de c6lulas. El anticuerpo fluorescente se fija exclusivamente al tipo celular que se de- sea aislar. A continuación se separan las células fluorescentes mediante un cito- fluorómetro de flujo.

En el cultivo de tejido es importante di- ferenciar entre líneas celulares primarias y líneas celulares estublecidas. Una línea celular primaria aparece en el primer cnl- tivo del tejido, denominado cultivo prima- rio, inmediatamente después de la obten- ción de la muestra, y se caracteriza por ser un tejido vital al principio, cuando hay es- casas células en relación con el espacio disponible. Despues de cierto tiempo las células pierden la capacidad de dividirse, por lo general, después de unas 50 divisio- nes celulares para las células hum-s, y la mayor parte de las células mueren.

Por el contrario, las h e a s celulares es- tablecidas pueden mecer en cultivos con elevada densidad de población. Una línea celular establecida puede aparecer espon- táneamente, es decir, sin causa conocida, debido a que algunas células del cultivo primario retoma el crecimiento, tras lo cual suele continuar de esa manera. Si es- te tipo de línea celular se transfiere unas 70 veces de un frasco de cultivo a otro, se considera establecido. Se dice que las cé- lulas que dan origen espontáneamente a una línea celular establecida han sufrido una modificación o transformación es- pontánea, donde las células transformadas tienen capacidad para formarse casi sin in- hibiciones. Sin embargo, las células tam- bi6n se pueden transformar si se las expo-

Heterocarion

tró, alrededor del año 1960, que ocurre en la formación de células hhridas en cultivos celulares. Sin embargo, recién cuando poco después se descubrió que era posible indu- cir la fusión celular en los cultivos celula-

Virus Sendai res, mediante el agregado de ciertos vinis (el más usado es el denominado virus Sen- dai, que incrementa la tendencia a la fusión de las membranas celulares), cobró real im- portancia la técnica de la hibridacih. Me- diante la fusión de dos células diferentes desde el punto de vista genético, la célula formada contiene dos núcleos con distinto contenido genético, lo que se denomina he- terocarion (fig. 2-11). Algunas de las célu- las formadas tendrán capacidad para divi- dirse y los dos núcleos comienzan la divi-

Célula híbrida sión al mismo tiempo. A su vez, esto a ve- (sincarion) ces también da lugar a la formación de dos

. . células, cada una de las cuales contiene un núcleo. Este núcleo (en cada una de las dos

mg. 2-1 1. Dibujo ~esquem&ico de hibridación células hílsridas neoformadas) contielle una oelular. Se induce la fusión celular por agrega- copia de los mmosomas de ambas células; do de virus Sendai, que favorece la formación este tipo celular se denomina sincarion. de un heterocarion y de células híbridas cuan- Entre otras aplicaciones, la hibridación do éste se divide. celular ha contribuido a las mvestigacio-

nes sobre el crecimiento de células tumo- rales, donde se han fusionado células nor-

ne a acciones cancerígenas como irradia- males con c6lulas cancerosas. La técnica ciones, agentes químicos o infecciones por también se ha utilizado para demostrar virus cancerígenos. Se obtene una línea que las proteínas de las membranas celu- celular establecida de este tipo de células lares tienen cqacidad para desplazarse transformadas a partir de un tejido tumo- dentro de estas últimas, como se verá con ral o de un cultivo primario, después que mayor detaIle en el capítulo 3. Una aplica- este último ha sido expuesto a una acción ción muy especial es el desarrollo de an- cancerígena. Se puede entonces establecer ticuerpos manoclonales, cuya utilización un cultivo homogéneo de línea pura por tiene gran impata&&ia en las imestiga- clonación del cult ivo primario. Las líneas ciones inmunohistoquímicas (véase más klulares transformadas de crecimiento rá- adelante en este capítulo). pido y supervivencia ilimitada (ing. im- Para terminar con el tema de cnltivo de mortal cell lines) representan un material tejido se puede decir que, si bien no es especialmente importante para las irrvesti- una alternativa, representa una posibili- gaciones experimentales. dad para realizar trabajos experimentales

Por último se verá el fenómeno de hibri- sobre tejidos humanos sin chocar con pro- dación celular, de gran importancia en la blemas éticos. investigación de células cultivadas. Las cé- Idas híbridas se fomian por fusión celdar, Manipulación expefimental es decir, la unión de dos o más células. La de células vivas fusión celular se puede producir en forma espontánea, por ejemplo en la fecundación, Además de las posibilidades experimen- cuando se unen las células sexuales mascu- tales de actuar sobre células y tejidos a tra- lmas y femeninas, pero también se demos- vés de las modificaciones del medio circun-

Rg. 2-12, Tin616fl aupravital de macrbfagos de tejido coneotivo, por q~regado de Gbirmin de Mío a un preparatfo de tejido viva. Las parrí- culas rojas de cxirnifn de Mio han sido f8gacRa- das por .las rn&R%f@os. ~440.

dante relacionada c m el cultivo. de tejtda* existen varios métodos para h manipula- ción más o mmos directa de dlda &as,

Tincion~s vital y snpradtd. Algunas colorantes ralatívamente ihocuos 9011 cap- tadas en forma selectiva por doteminadas células v.ít.os. En conseouwcia, la locali- zaci6n del c o l o ~ e se puede &m pa- ra detectar estas células Q detenninadas oqpnelas, a las que se une el colmante desp.uás de ser captado. De e-sta matraera tarnbiien se pueden identificar algunas sustancias interce1ulares.

Para la thndin vital se inyecta el mlo- rante en el animal vivo. Papa latinción su- pravital se agrega el colorante a las célu- las o el tejido vivo después de su extrac- ción del orgmism.

~l azul tliipdn y el carmim de Iitío se composen de partículas finas y han tani- da importancia definitiva p m el mtudio de la fagocIinsis, es decir, la. fgrma sn que determinada c&lulas captan p d c u l a s del medio [Q, 2-12).

El rUja neufro y el ver$@ @.no se utrlizan para el emdio de las @6bulos 'hlmcws. El verde Jano M e bdectimnmnte rnitocm- &as y el mjo m t r o para ~&tifkar los distint? su,btipm de leuca~itos.~

La aIíz&a se une a la matriz k P n e o - formada y le-cnnfiere colora~"r6n roja. La tinciéh vital c m alizarina ha sido muy

importmfe en los trabaj~s sobre-el meca- nismo de CpfPciniieIkto 6 s ~ .

Mkromaaip~oit5~a m e ~ W c a . Nume- rosas tGcnims, agpxaa& baja la denomi- naciiin m3cpom~Uaacibn o microcim- gía, se hm demrd$~&-.subre la base del m i c r ~ r n & p d a ~ 'ES& i r r m n t a se compone- ds m &awscoph, en el que el preparado a eshtdiat se enm~ntra en una cámara hitmeda de ~'pmagL;ón, sobre la platina. En el micromanipialador se mn- tan aguja finas, ganchos o pQetas de ~ 4 - drio, cuyos extremos aparecen eq e1 c m - po visual y que se puedm desplazw can tanta precisión, que se p u e d a disecar las células individuales con gran aumento.

Este m6todo de disección ha inmementa- do el conocimiento de I& naturaleza fisica de las células. Se ha demostrado que el pro- toplasmam viscoso y se han desplazado las organelas dentro de la células. También se puede: empujar el núcleo celular dentro del citoplasmay ha demostrado ser una vesícu- la defmable llena de liquida Así, se pue- den hacer muesca$ en 61 al presionar con una aguja. Con k microdiserccl6n tambi6n se demmtró muy pronto la existencia de una membma celular (fig. 2-13).

F@ BT& Wmicmg@fY*as (a m p o oscure) de aC4lukss huem dermlFiv& ;que 3ctemmWra.n &no sepmoesben la mi~mmaidpuksiQn mecibioa. W ase obsenran d a + inwtWones en la m~mbrana adular prdsicidas por preeión con dos microelectrodas. En b se vivisualizan los rnicroelrntttXios después de attBm$ar Ia mem- brana celular hacia el interbr del citoplasma. La mediffa incluida representa 100 prYi. (Según Kanno y LoewensZeh.)

Fig. 2-14. Fotomicrogra- fía de una neurona de la retina captada con mi- croscopio de fluorescen- cia. Mediante un microin- yector se inyectó el colo- rante fluorescente amari- llo Lucifer directamente en la neurona viva. Luego se sacrificó el animal y se efectud un preparado his- tológico de la retina. (Ce- dida por J. Zimmer.)

Los microelectrodos son pipetas muy finas que contienen soluciones salinas concentradas. Mediante la micromanipu- lación se inyectan éstas en las células, y después se puede medir la diferencia de

Fig. 2-15 Fotomicrografía de una célula viva cap- Jada con microscopio de contraste de fase. La cé- 'lula se encuentra en la etapa denominada metafa- se de una división celular, por lo que se observan ciaramente los cromocomas. La línea clara angos- ta entre las dos flechas se forma por irradiación con un haz de luz ultravioleta de 3 pm de an- cho, que parece haber "desplazado" un corto seg- mento de una hilera de cromosomas paralelos. Esto se confirma al demostrar que los segmentos clams de cromosomas ya no contienen DNA (me- diante investigación histoquímica, según el méto- do de Feulgen). x900. (Según Bloom y dzarslan.)

potencial eléctrico entre el interior de la célula y el medio (fig. 2-13). De esta mane- ra es posible investigar los potenciales de membrana variables de los tejidos nervio- so y muscula~:.

Los rnicroiqwctores son una variante especia1 de microelectrodos y se pueden emplear para la inyección de cantidades microscópicas (picolitros) de sustancias dentro de las células. Una aplicación es- pecial es la hyección de un colorante que difunde en las distintas partes del cito- plasma y que se hace fluorescente con el microscopio óptico. Con esta técnica es posible dibujar el contorno de cada célula individual en tejidos con estructuras muy complicadas, por ejemplo, del sistema nervioso central (fig. 2-14).

Utilizacion de haces de rayos angostos y de alta energía. Mediante aparatos es- peciales es posible concentrar protones en un haz de rayos con un diametro de 2,5 pm, y con irradiación ultravioleta se pueden lograr diámetros de alrededor de 2 pm. Este microrrayo es tan angosto que puede incidir y, en consecuencia, destruir los componentes individuales del núcleo celular, por ejemplo, parte de un cromoso- ma (fig. 2-15). En el último tiempo se han utilizado especialmente los rayos láser con este propósito.

Microcinematografía. Si bien esta téc- nica no implica en sí misma una manipu- lación directa de células vivas, representa un método importante para su observa- ción. La microcinematografía (gr. kinema, movimiento) es una técnica que registra en una película (como imágenes vivas) lo que se observa a través del objetivo de un microscopio, mediante una c h m a de vi- deo. Tiene especial importancia para el análisis de movimientos cuando son de- masiado rápidos o lentos para poder ser considerados directamente. Por ejemplo, con una aceleración de cien veces es posi- ble observar la división celular y, además, se puede observar cómo se desplazan las mitocondrias dentro de la célula viva.

Por el proceso inverso (frenando los movimientos muy rápidos) es posible analizar, por ejemplo, los movimientos de las cilias.

Métodos de fraccionamiento celular

Mediante los métodos de fracciona- miento celular es posible separar los dis- tintos componentes celulares y mantener, al mismo tiempo, sus funciones. Por lo tanto, los métodos de fraccionamiento ce- lular han jugado un importante papel en la resolución de la organización funcional de la célula.

lulares. ~ r & b ~ ~ ó ~ se efec- túa una h8B@~m*zdd6nR Se d o c a n pe- queños -nwzm de te@& ea. una solución adecmi&g $. ej., de sacarosa) que contri- buye a &mtt&kir intactas las organelas y se opm a su mdencia a apparse . Des- pu& se colma h solución con los trozos de tejido ea un homogenizador, que pue- de r e - llafmma de un cilindro de vidrio, en el c m l rota a gran velocidad una vari- lla de tefldn (fig. 2-16). Los trozos de teji- do son aplastadm por la frimiión de la va- rilla contra las paredes del cilindro. Así se rompen las membranas celdares y que- dan libres en la solución las organelas y las inclusiones. Se pueden utilizar otros métodos para la homogenizacih de las c61ulas y los tejidos, por ejemplo ultraso- nido. Después de unos minutos de reposo se centrifuga el sobrenadante (lat. super- natant, flotante) con velocidad moderada y temperatura apenas superior a OoC. Des- pués de la eedimentación de las partículas más pesadas se puede hacer sedimentar las partículas con masa mmor, mediante centrifugaciones con velocidades crecien- tes. La ídmyTcación de una fracción y la evaluaoi6n de su grado de pureza, en el caso de los núcleos celular@, w puede efectuar por microscopia de contraste de fase. Las pitrt3'culas más pequeñas (es de- cir, la mayda) deben ser identificadas mediante rnicroscopia electrónica de los cortes ultrrtfinos del sedimento sólido ob- tenido por centrifugación, el denominado "pellet". De esta manera se tiege la segmi- dad de que las fracciones no contienen mezclas de distintos t i ~ m de oramelas.

Cent r i fqdón por gradient& de den- sidad (centrifuaación eqpiLibrad&). Con este miétodo e; posible- obtener mayor cantidad de fracciones m i s limpias que con la centnfugación diferencial. Se ob- tiene el hornogenizado como en el caso anterior y se agrega una solución de, por ejemplo, sacarosa, que contiene concen- traciones crecientes de sacarosa a medida que se acerca al fondo, es decir, con den- sidad creciente. La centrifugación prolon- gada a g a n velocidad hace que las partí- culas sedimenten en el sitio que les per- mite su densidad (se detienen cuando al- canzan una "profundidad equivalente a su propia densidad).

De esta manera se logra &tener fraccio- nes casi p u m de núcleos, el%mentos nu- cleares, mitocondrias, lisosomas, riboso- mas, r&'culo endoplasm&tico y gránulos de secreci6n. Estos hornogenactas celula- res fraccionados, en los cual- lm compo- nentes mantienen su funQ6n biolbgica, se denominan sistemas l ibm de c6ldas. El

estadio de estos s i s t e m libres de c6lular; ha cont&%uido con gran parte del cono&- lmLientn actual sobre la biología molecular & la c$lula, por ejernplo respecto a la re- plicackin y la transaipción del DNA 7 e: la síntesis de proteínas. En ajios recientes, los mbtodos de frac-

cionaniento celular haa sido suplementa- dos con varias técnioas para la investiga- ción de macromoléerrlas, entre ellas dis- tmtas formas de cronzat-ografía y de elec- traforwís. Sin embaqo, estas técnims pmermwn más a la pate Woquimica de la biologla celular y n o SE las incluirá m e& presentadión gae-ral(s,e refiere al lec- tor a tmtos de biolagla mdecular y bio- quitiiica), si bien es abvig que se hará m fereacia a ellas en relaciones relevantes ch; los p~dximos capftdos.

Preparación e investigación de tejidos muertos

El *tudio direct-o de ~e-lulas y tejidos vivos-S~D tiene aplicadones limitadas. Es. diflcil diferenciar los distintos componen- tes entre sí con la microscopia de transmi- sión, dado que tienen igual grado de re- hccirón de la luz. AdemBs, por lo genera1 el tejido presenta u n espesor tal que la pe- netración de la luz es demasiado escasa. En conmcuencia, se utiIiza con mucha maym h u e n c i a el tejido muerto, que m mantiene mediante acciones químicas in- mediatamente después de extraído y en- tonces se corta en secciones muy delga- das, denominadas cortes histológicos. Despixés de la tincitrn con distintos colo- rantes se observan los cortes con el mi- croscopio óptico, dado que el mayor can- traste entre los corapmeakes tisulares per- mite diferenciarlos. Es obvio que al prepa- rar lss cortes bistológicas se debe pracu- rar maritener, en lo posible, el aspecto de Irirs estructuras en el o ~ s m o vivo.

Prepmción de tejidos para microscopia Óptica

Fijación. Las c6lulas se matan con la fi - jacidn, para detener los procesos celulares dindmicos con la mayor rapidez posible y mantener la estructura con las minimas modificaciones posibles. Esto se logra dan la insolubilización de las componentes estructurales de la célula y la formad^ de enlaces cruzados, por la acción de &S- tintos agentes químicos, los fijadares, En el proceso de fijación se estabikan las protefaas, porque los fijadores favor~cqn la formación de enlac~s cruzados entra ks mol6culas proteica. De esta manera SB mantienen todas las relaciones entre las estnicitnras como en la d u l a viva. Lw

Fig. 2-16. Dibujo esque- mático del procedimiento de fraccionamiento ce- lular (véase el texto para los detalles).

HomogeneizaciQn

teiido - I

10.00L) g, 20 min

Centrifugación

Sobrenadante

Cantrifugación 2ao.000 g, 1 hora t

- - Núcleos BIulSrW

''Miuoswna~* - swe Complejo de Gola *

proteínas solubles se unen a las do son espeEialmrite efectimfs en b refe- d e s y se transforgm así en insolubles. rido a la h&% de enlaces tr'ansversa- Al mismo tiempo se damza cierta hetza les. Estos ~ C T S fijadores, junto con ei tetró- rnednica, que posibilita los pasas si- xido de o&, que también h a enlaces guíüntes del proceso de preparacih. AI- transversales, San algunos de los aentes gimm fijadores c h o , por ejemplo, @ fm- más efectivm. Mantienen el a s p ~ t ~ de la muidehído y, en especial, el glu taddehf célula en condicicmes muy simil- a las

que se observan con el microscopio de contraste de fase, como control de la es- tructura de las células vivas.

La fijación también produce la inactiva- ción de dgum3 de las enzimas celulares, las cuales de otro modo iniciarían la auto- digestión o autólisis y conducirfan a la degeneración post mortem (Iat. mors, muerte). AdemBs, se eliminan bacterias y muchos otros microorganismos, que po- drían destruir el tejido.

En la práctica, la fijación se lleva a ca- bo por inmersión de un pequeño trozo de tejido en el fijador, apenas se haya to- mado la muestra. Es conveniente reali- zar la extracción del tejido mediante pinzas y una cuchilla afilada, y procurar no dañar el tejido. Para los tejidos huma- nos, esto se puede efectuar durante pro- cedimientos quirúrgicos o por biopsia (gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, una muestra de tejido extraída del organismo vivo. De los tejidos accesibles directos, como la piel, se puede tomar la muestra por corte con cuchillo, pero también es posible tomar muestras de órganos inter- nos como, p a ejemplo, el hígado o el ri- ñón, mediante cánulas especiales. Las biopsias también se pueden extraer du- rante procedímientos como endoscopias (gr. endon, dentro; skopein, ver), es decir estudios internos de cavidades mediante un instrumento munido de una fuente luminosa, el endoscopio. Después de la extraccibn del tejido se lo snrnerge en el fijador, en la fijación por inmersión, a diferencia de la fijación por perfusión, que se puede aplicar a animales de expe- rimentación. En este caso se inyecta el fijador en d torrente sanguíneo del ani- mal vivo anestesiado y el fqador llega por vía hematógena rápidamente a todo el tejido. De esta manera se logra matar todas las células de un ó~gano completo en forma casi instantánea después de in- terrumpir la administración de oxígeno, y se obtiene una fijación más rápida y uniforme. El método se aplica en traba- jos muy exigentes, por ejemplo prepara- dos para microscopia electrónica, en los que se destacan con nitidez incluso las pequeñas modificaciones estructurales post mortem.

Inclusión y corte. El tejido fijado se cor- ta en secciones delgadas, que permiten el paso de la luz. La mayoría de los prepara- dos para microscopia óptica tienen un es- pesor de alrededor de 5-10 p m , para lo que se requiere un micrótomo, instrumen- to similxr, en principio, a una cortadora de fetas. Para obtener la consistencia ne- cesaria para poder cortar secciones tan delgadas es necesario incluir antes el teji- do en un material que, al sacarse, le con- fiera suficiente dureza. Las sustancias

Fig. 2-17. La ilustración muestra el corte de tejidos incluidos en un rnicrótomo de parafl- na. Tras el corte se reúnen los trozos en serie sobre una pequeña "cinta transportadora" y se colocan en el baño de agua caliente de la dere- cha para que se estiren. A corrtmuación se '

montan sobre portaobjetos y se procesan. So- b ~ e la mesa se ven 7 bloques de parafina, en los que se distinguen lo$ trozos de tejido inclui- dos. Cada bloque está fijado a un pequeño cu- bo de madera que se ajusta al micrótomo du- rante el corte del bloque.

adecuadas para este fin, los medios de in- clusión, son tipos de cera insolubles en agua, por lo general parafina. En conse- cuencia, antes de la inclusión, es necesa- rio ddidratar el tejido. Para ello se pasa el tejido por una serie de soluciones acuo- sas de etanol en concentracioes crecien- tes, hasta llegar al anhidro. El tejido se su- merge entonces en un líquido miscible en etanol y parafina, por ejemplo xileno, pro- ceso denominado "aclaramiento". Des- pu6s del aclarainiento se coloca el tejido en parafina líquida, que disuelve el xileno y penetra así en el tejido. Al enfriar, se so- lidifica la parafina y forma, junto con el tejido incluido, un bloque sólido o "taco", que es 10 que se seccima (fig. 2-17).

A pesar de los cuidados, se producen ciertas modificaciones al procesar el taco. El alcohol y el xileno extraen grasas y el calentamiento de la inclusión inactiva muchas enzimas; además, a menudo el te- jido se contrae de modo perceptible. Para evitar estos problemas, a veces se efectúa un corte por congelamiento de tejido fija- do o no. Un taco de tejido congelado tiene consistencia suficiente para ser cortado en un crióstato (véase fig. 2-33, pág. 43).

La técnica de congeIación es tan rápida que se pueden obtener seccianes en pocos minutos. Se utiliza, por ejemplo, para de- terminar si el material de una biopsia ex- traída en un acto quirúrgico es benigno o maligno. El resultado de la biopsia se'ob- tiene mientras el paciente permanece

anestesiado, por lo que el cirujano puede decidir en el momento el alcance del pro- cedimiento quirúrgico.

Método de congelaci6n-desecacidn. Con este método se inienta lograr que la variación estructural y la extracción quf- mica sean las mínimas posibles, para conservar la actividad enzimática. Se congela rápidamente el trozo de tejido y se lo coloca en una cámara de vacío a ba- ja temperatura, después se seca (se deshi- drata) por evaporación lenta (sublima- ción) del agua.

En la congelación-sustitución se efec- túa primero una fijacih moderada y un tratamiento con sacarosa, después una congelación rápida del tejido y a contí- nuación una deshidratación a -850C en metano1 puro. Una vez eliminada el agua se transfiere el tejido a unmedio de inclu- sión plástico adecuado, que se infiltra mientras se incrementa gradualmente la temperatura hasta alrededor de -20°C. Par último se polimeriza por irradiación con luz ultravioleta el medio de inclusión, que se seca, y ya se puede cortar el taco terminado.

Fig. 2-1 8. Fotomicrograf fa que muestra las ga- mas de color del método de tinción histológica d e uso más frecuente, la coloración con he- matoxilina-eosina (HE). El corte de tejido es de,páncreas, por lo que se distingue un islote de Langerhans, con células cuyo citoplasma se tiñe de color rosa claro con la eosina, y nume- rosas bcinos, con células cuyo citoplasma se ti- ñe.de azul liláceo con la hematoxilina en la zo- na basal y de rosa c o ~ la eosina, en la porción apical. ~ 6 6 0 .

Lai

Ácino

igerhans

El método es muy poco agresivo con el tejido y es apropiado para muchos proce- dimientos inmunohistoquímicos (v6ase más adelante).

Coloración. Los cortes de tejido se sue- len montar sobre portaobjetos y se colo- rean. La mayoría de los colorantes histoló- gicos se utilizan en solución acuosa, por lo que los cortes incluidos en parafina de- ben ser "desparafinados", mediante un tratamiento con xileno, y rehidratados por pasajes por concentraciones decrecientes de alcohol en agua, ante's de ser teñidos. Los cortes por congelación se pueden tra- tar con las soluciones acuosas inmediata- mente después de seccionados.

La mayor parte de los métodos de ün- ción histológicos se desarrollaron en fun- ción de su capacidad para teñir selectiva- mente los distintos componentes tisula- res. El método de tinción más utilizado es la combinación de hematoxilina y eosina (HE), que tide los componentes nucleares de azul violticeo, mientras que casi todas las estructuras citoplasmáticas adquieren una tonalidad rosada (fig. 2-18). En con- secuencia, la tinción con HE muestra con nitidez la forma y la estructura del nú- cleo, ademgs de la forma y la extensión de la célula. Cabe destacar, sin embargo, que la tinción histológica es un procedi- miento químico y que se ha producido un gran desarrollo en los métodos que in- forman sobre la composición química de las células y los tejidos. Esto se verá con mayor detalle en la sección sobre histo- química.

Después de la tinción, por lo general se deshidrata y se aclara nuevamente la muestra de tejido y entonces se monta, es decir, se cubre con una gota de medio de montaje transparente (Depex, Enkitt). Por último se coloca un cubreobjeto para pro- teger el preparado. Algunos medios de montaje son miscibles en agua, por lo que se puede montar inmediatamente, sin ne- cesidad de deshidratación y aclaramiento.

Preparación de tejidos para microscopia electrónica

Debido al poder de resolución mucho mayor del microscopio electrónico, en es- te caso se agudizan las exigencias de man- tener las estructuras originales del tejido. Para la fijación se suele utilizar glutaral- dehído. También se puede emplear tetró- xido de osmio que, además de fijar el teji- do, se une con las membranas lipoprotei- cas y así logra mayor contraste en la ima- gen del microscopio electrónico. Esto se debe al aumento de la dispersión de elec- trones por la membrana, a causa del eleva- do número atómico del osmio. En conse- cuencia, se habla de "tinción" o contras-

Fig, 2-19, Imagen de un oorte ultrafino captada can microscopio elew trcánko, aumentada 13.000 veces. La imagen mugstra la pared de m t&ub renal, y se observa con claridad una &lu4 del tílbulo compl@q, ro- d W a de partes de dos @lulas vecinas. Nótese la gran riqueza de d&lles qm facilitan la identifica- d h de organelas e indu- sianec, por ejemplo, mito- condrias (M). (Cedida por A.B. Maunsbach.)

tado. El cmtrastado con osmio se emplea a menudo después de la fijación con glu- taraldehído, p e por sí misma no aumen- ta el contraste,

Despues de la fijación se &&idrata y se incluye el tejido. Pafa la indusión se suelen utilizar resinas epaxj y distintos materiales plásticos, que adquimen gran dureza después del secado y permiten la sección de cortes ultrafinos.

El haz de electrones se detiene con faci- lidad, por lo que los cortec de tejido utili- zados no deben ex~eder de 20-100 nm, Desde el punto de vista tbcnico, el corte de estas secciones ultrafinas es muy di- fícil y se necesita un ul~micrótomu, con una cuchilla de vidrio o de diaman- te. El corte se controla con un microsco- pio y se aumenta el contraste mediante el pasaje rápido de las secciones por una

Pig. 2-20. ~ohmicro~rafia de un corte semiti; no de tejido de riAGn. Tras la fijación se incluy6 . el tejido en plástico y se cortó en secciones &? 1 pm de espesor, que se colorearon con azul . de toluidina. x660. . -

" . . -

solución de acetato de uranilo. Por lo general no es necesario eliminar el pl6s- tic0 de inclusión, dado que es homogé- neo y transparente, y además estabiliza el preparado durante el análisis con el microscopio. Los cortes ultrafinos se montan después de la sección sobre un pequeño reticulada de cobre, denomina- do "grilla", que suele estar cubierto por una película plástica de sostén muy del- gada. En la observación microscópica (fig. 2-19), el haz de electrones atraviesa el corte por los orificios de la grilla.

La gran calidad técnica que se obtiene con la preparación de tejidos para la mi- croscopia electrónica también se aplica para la microscopia óptica, con los cor- tes semifinos, de alrededor de 1 ym de espesor, y la posterior tinción con, por ejemplo, azul de toluidina (fig. 2-20). Se usa azul de toluidina por su capacidad para penetrar en los medios de inclu- sión de resinas epoxi, lo cual no ocurre con los colorantes Mstológicos comu- nes. Los cortes sernifinos también se pueden seccionar después de ser inclui- dos en resinas acrilicas (en lugar de re- sinas epoxi), que dan resultados de cali- dad muy similar y permiten la tinción, par ejemplo, con hematoxilina y eosina (fig. 2-21).

Congelación y h c t n r a (ing. freeze- c l e d n g o freeze-fracture). Es una técni-

micrografía de la córnea. Es un 4orte semifino de tejido incluido en resina 41,c&@ca y pfiido.qo

de tejidos por m~croscopia electrónica. Consiste en congeIar rápidamente el te- jido en nitrógeno líquido y luego colo- carlo en vacfo, para después fracturarlo con un cuchillo o navaja (de modo simi- lar a como se parte un ladrillo). Se colo- ca entonces vapor de platino sobre la su- perficie de fractura, en ángulo inclina- do, lo que forma una delgada plantilla de platino de esa superficie, o réplica, que acentúa las formas del relieve. Se refuerza entonces la réplica de platino mediante la aplicación de partículas de carbón. A continuación se elimina el te- jido con un ácido fuerte y se monta la ré- plica de platino sobre una grilla, para la observación con el microscopio electró- nico de transmisión, dado que el haz de electrones es capaz de atravesar la répli- ca delgada.

Las ventajas del método sun evitar las acciones de losfijadores químicos y de los medios de deshidratación y de inclusión, por lo que se han podido comparar las es- tructuras de b s tejidos fijados y no fijados con el microscopio electrónico (fig, 2-22). El método tiene aplicación especialmente importante en la investigación de las es- tructuras internas de las membranas (véa- se con mas detalle en el cap.-3).

El poder de resolución es de alrededor de 3 nm.

Métodos histoquímicos A

El elemento fundamental de los méto- dos histológicos es la utilización de ac- ciones físicas y químicas sobre prepara- dos histológicos, para determinar la lo- calización de sustancias qufmicas en las cdlulas y los tejidos. Para la histoquímica es esencial la localización, dado que el empleo de cortes de tejido puede dar in- formación sobre la localización, imposi- ble de obtener por'determinaciones bio- químicas obtenidas de homogenados de tejidos.

Antes de la reacción histoquímica en sí es necesario efectuar una fijación y una preparación adecuadas, que conserven la sustancia qufmica estudiada y las estruc- turas celular y tisular. Los lipidos son so- lubles en solventes orgánicos como el xi- leno, por lo que se deben evitar cuando se estudian esos compuestos. Debido a la ac- ción desnaturalizante de los agentes fija- dores sobre las proteínas, la mayoría de las enzimas se inactivan con la fijación pero, por otra parte, algunas enzimas son

Fig, 2-22. Imagen dé t a ~ r@lica de un preparado realizado por conigpla- @iba y fractura, captada con mlcroscopio eles- trórrlco. La imagen mues- tra una cé.lula epitelial (del plexo coroideo cerebral) y $e oDservan con claridad el nucleolema y SS po- rus. x22.400. (Cedida por 8. Van Deurs.)

solubles y se pierden si no se lleva a cabo una fijación previa a la determinación his- toquímica.

La reacción histoquímica debe inducir la formacibn de un producto insoluble visible. ñn consecuencia, debe ser colo- reado o poder transformarse en fluores- cente. Para la microscopia electrónica es necesario que posea electrondensidad suficiente.

Se debe considerar la sensibilidad de la reacción histoquímica, dado que los re- sultados negativos no se pueden interpre- tar de inmediato como ausencia de la pro- piedad buscada. Es posible que la canti- dad presente sea demasiado pequeña para ser detectada, o que la sustancia se haya perdido o modificado durante la prepara- ción previa.

Se pasa gradualmente de los métodos de tinción morfológicos a los procedi- mientos histoquímicos más específicos. Por lo tanto, se verán primero algunas reacciones más generales antes de anali- zar los principales métodos histoquími- cos.

Fig. 2-23. Fotomicrografía de un corte de la médula espina1 teñido con tionina. En el centro de la imagen se distingue una neurona (una célula motora del as- ta anterior, n) con nucléo- lo basófilo y cúmulos ci- toplasmáticos muy ba- sófilos. x440.

Acidofilia y basofilia

Para obtener suficiente contraste de co- lor en los cortes histológicos comunes, por lo general se emplean combinaciones de colorantes ácidos y básicos. Tradicio- nalmente se denomina acidofilia (gr. fi- lein, amar) a la capacidad de tinción de los colorantes ácidos y basofilia a la capa- cidad de tinción de los colorantes básicos, pero la designación de colorantes "áci- dos" y "básicos" proviene de la era clási- ca de la histología, cuando las definicio- nes de ácidos y bases diferían de las ac- tuales (un ácido es una sustancia capaz de liberar un protón y una base es una sus- tancia capaz de aceptar un protón). En el lenguaje histoquímico, un colorante áci- do (aniónico) tiene capacidad para formar un enlace electrostático (ionógeno) con un grupo tisular con carga positiva. En contraste, un colorante básico (catiónico) puede formar un enlace electrostático con un grupo tisular con carga negativa.

Así, las uniones entre colorantes ácidos (aniónicos] y básicos (catiónicos) y los grupos tisulares tienen, esencialmente, características electrostáticas. En un corte de tejido, el esqueleto proteico y muchas otras macromoléculas contienen grupos ionizables, capaces de formar enlaces electrostáticos con los colorantes. Las dis- tintas proteínas de un corte de tejido tie- nen diferentes puntos isoeléctricos, dado que varían las composiciones de amino- ácidos. Para las tinciones histológicas co- munes se utiliza un pH del que se conoce por experiencia su buen contraste de co- ler. . Con el pH elegido, algunos compo- nentes tisulares son acidófilos, mientras

que otros serán basófilos (fig. 2-18), pero siempre en relación con el pH. A pH neu- tro, el DNA y el RNA presentan fuerte ba- sofilia, debido a la disociación de los gru- pos fosfato de las moléculas (fig. 2-23). Con ese mismo pH, la mayorfa de las pro- teínas citoplasmtíticas son acidófilas.

Cuando se desea analizar si la basofilia se debe a los ácidos nucleicos de, por ejem- plo el RNA, antes de la tinción se puede tratar el corte control con la enzima ribonu- cleasa. De esta manera se elimina el RNA del corte control, por lo que las zonas ricas en RNA ya no serán basófilas. El DNA se identifica de modo similar, con la-aplica- ción de la enzima desoxirribonucloasa.

Con la fijación se modifican las propie- dades de las proteínas, debido a la desna- turalización, y el resultado es un aumento de la afinidad por el colorante.

Para algunos métodos de tinción, por ejemplo la coloración tricrómica de Ma- llory, se utilizan varios colorantes, todos ácidos, que tiñen distintas estructuras tisu- lares. Se desconoce el fundamento quimico de la unión entre los colorantes y los com- ponentes tisulares, debido a que estos mé- todos n o son espec@cos, desde el punto de vista histoquímico. Por el contrario, se de- nominan selectivos cuando tiñen determi- nados componentes tisulares (fig. 2-24). Los métodos de tinción selectivos tienen

Fig. 2-24. Fotomicrografía de un preparado de la cápsula de un órgano, coloreado por el méto- do de Mallory. Se observa una tinción selecti- va, dado que, entre otras, las numerosas fibras colágenas del tejido conectivo se colorean de azul intenso. x275.

Fig. 2-25. Dibujo esquemático oie la rngtaotb masia, aue muestra la aareaación de 188 mQIé- wlas de"co~qmtsi & a r d a Guperfft% de_w pa- Iímero polianiórcm de elevado peW rYit31~iar (p. ej., un glucosamifmglucano en un cartfkgo) con viraje del wlot azul del colorante a violeta

gran valor práetíco, dado que el mayor con- traste de color facilita la identifkacibn de

gEtn k S ~ c ~ G G ~ w .2-25). En cemsemencia, a rojo,

Los camlJmo~Bs t i d a ~ e ~ qm m colo- rean par ~ c r m x a s h igB32u @a & aWpr p&e, las muy áddm gheaam&eJn@a- nos salfzkxdps de la m (qg. 2-26] y los msticu:M &id I~QGT~VO, que contierren 13 sy@B- fw- &&b&a $wparipa. Las I T L L G ~ ~ ~ . ~ presenta& mtacrmnasia modmxda

los átomos de carbono, par lo que se detie- ne la oxidación. Los p p o s aidehído neoL fomados ~eaccionan érztances con el

Fig. 2-26. Fotomicrogra- fía de un corte de trá- quea teñido con hemato- xilina-eosina, que muec- tra un ejemplo de meta- cromasia. La ancha zona inlensamente rojo viol8- cea de la mitad inferior de la imagen es cartílago hialinolc), cuya sustancia basa1 se tiñe por meta- cromasia. x 1 10.

Fig. 2 m . Fcmnííra- fía de una tinP%n con I m&tu& de P B de un prepamdo da la mmwa del Mtino Wg@df,. En el epitelio w Wnguen dtulóis @ilidWnws de color rojo intenso, que contienen ~ ~ c i ó n (una gluwproteina) que se tiñe mn la reacción de PG. ~275.

wactivo de Schiff, para dar lugar a la apa- rición del color rojo magenta caracteristi- co (fig. 2-27).

Varios componentes tisulares reaccio- nan con el método de PAS, se dice que son "PAS-positivos", como se verá en los próximos capítulos.

Para determinar si una sustancia PAS-po- sitiva está compuesta por glucógeno se tra- ta un preparado control con la enzima ami- laca, que escinde el glucógeno especí£ica- mente, antes de realizar la tinción de PAS.

Método de Feulgen. Es un método espe- d#co para la determínación histoquímica de DNA, sobre la base del contenido de desoxirribosa en el DNA. Se eliminan los grupos purínicos del DNA por medio de una hidrólisis ácida suave. De esta mane- ra se abre el anillo de la desoxirribosa y se forma un grupo aldehído (fig. 2-26], que

Flg. 2-28. Muestra el principio del método de Feulgen, en el que los grupos púricos del DNA son eliminados por hidró- lisis ácida debil.

Fig. 2-29. Fotomicrografía de un preparado del extremo de la raíz de una cebolla, teñida con el método de Feulgen, especifico para DNA. Só- lo. se tiñe de rojo la cromatina del núcleo (que contiene DNA). El color verde del citoplasma se debe al colorante de contraste verde claro. En- tre otras, en el centro de la imagen se distingue una célula en mitosis (división), donde los cro- mosomas estfm bien teñidos. x440.

reacciona con el reactivo de Schiff, con aparición del color rojo característico en el sitio que corresponde al DNA (fig. 2-29). Como control se utilizan cortes tratados con la enzima desoxirribonucleasa antes de la tinción de Feulgen.

Por lo general, los materiales positivos para Feulgen se limitan a la crcrmatina nu- clear. Como se verá, en el capítulo 3, las mitocondrias poseen DNA, pero en canti- dad demasiado pequeña para ser detecta- da con el método de Feulgen.

Determinación histoquímica de lfpidus

Después de la fijacih de los lípidos con formalina se cortan secciones conge- ladas, para evi t s la extracción de los lípi- dos mediante solventes orgánicos. Para la demostración histoquímicase utilizan muy a menudo los denominados coloran- tes Sudán. Son casi insolubles en agua, por lo que se utilizan disueltos en alcohol diluido, que no disuelve las grasas. La "tinción" se produce cuando las molécu- las del colorante se distribuyen entre los lípidos y el solvente, en relación corres- pondiente a la solubilidad en los dos me- dios. Pare evitar la extracción del coloran-

te y los I ípido~ &e incluyen Pos cortes, des- p~&s de la tinddni, m un medio acuoso. Ds este modo, lps colormbs 3 a d b ti*

fien con int~mddad los tITacil@fc~mb.s., romo por ejmglo, en la trncii4n de lq +ooi.tos con rajo Sud& Cfig. 2-90). El nqpo Sudb t ime gmn utilidad @ htin-ci6nde las vah(-sy mieiim de las'flbrias nerviosas, campn@as par tipopo.t%inafi.

quefias para sacarprovecho del gran poder de resolución del microscopio electnínico.

Fig. 2-31. El esquema muestra la forma en que habitualmente se produce la reaccián histoquímica con una enzima (véase el texto para los detalles).

Fig. 2-12. Ftomicrografia de la detenninación de fosfptasa &d#a mediante rnétoU6s histo- químlcoil en un corte de tejido rMal. Dentro de las células, la fmfatasa ácida wté lo~~ltlizada en organelas redondeadas denomi- lisoso-

Fig. 2-34. Fotomicrografía captada cgn micmscopia de fluoresceni3a de un cor- te de mijmub de pollo. El corte se COlOreg primero con antfcuerpo fluores- cente oorrtra mioslna de pollo, y Se bafta en una soluctBn del anticuerpo. La antimiosim sp une a las bandas A ricas en miosina, por lo que &as se ven fluorescentes (gancas en la imagen). x756. (Según Finck, HQltter y Marshall.)

Fig. 2-33. La ilustraci6n muestra el corte de trazo6 de tepio en un crlbStato. En principia se trata de una cdmara fría, en la que se ubica wn micdomo, que se opera a través de dos ori- ficios en la parte anterbr; el Corte se vigila por una ventana calefaccíonacia. Los cortes de W'i- do se Congelan instant8riearnente al ser extraí- dos y se mantienen así a temperatura baja Gonstante (p. ej. -20%), durante iodo el pro&- so de crxte, lo que reviste espscial importancia en emlmohistoquímica.

aerpos son proteínas producidas por las denominadas c6lulas plasmárticas y c h u - lan por la linfa y la sangre. Las celdas pro- dubgoras de anticuerpos pertenecen al sis- tema inmune del o r g d m o , que protege al individuo contra las macromolédas extrañas que intentan ingresar, por ejem- plo, como componentes de bacterias o vi- ms. Así, los anticnerpas son un eslabdn importante en la defeasa del organismo c6Btmlas enfermedades infecciosas (v#ase c m más detalle en el cap. 16). La reacción entre mi antígeno y su anticuerpo es en m- tremo especI'fica,

Los métodos imnimahistoquímico~ se basan sobre la utiLizacilln de un unticaer- po vpec@co, que se mosca qediante un

Fig. 2-35. Fotomicr6,$jtafla de neurms tddas mediante Inmunolrfstoquiínica con antiouer- po contra la mol6cufa transmisora spmtunifta (5-hidroxitríptmina), unido a peroxlclérsa La determinación enzimoPlrstoqufmica &e la pera& dasa p~rmite la identificación del anticuerpo después de su unión c a n el antígeno del corta de tejido y da origen a una reacción de mlor ro- jo parduzco. r 440.

enlace quimifi en una sustancia que se puede transformm en visible, sin afecta la capacidad del anticuerpo para fohnar un complejo c m el anrigeno. El principio se ilustra con la denominada tbcnica de anti- cuerpo fluomsc~@, Para localizax la pro- Mna muscular miosina se inyecta en un conejo rniosina pnriñcada de ~ ~ u l o de pollo. Al cabo de cierto. tiempo, el suero del conejo contendrá anticuerpos contra el antigeno miosina de pollo. A coII.tinuación se extrae el asticuerpo del suem del cone- jo y se adosa a flnrsresceína. Cofres histoló- gicos extraídos de pollo se b&an en una solución del anticuerpo fluorescente [mti- miosinal, que se une específicamante con 1tr miasina d e L corte. El a n t i c h ó ex- ceso se elimina por lavado y se maliza el preparado coa el mimoscopio de Alzores- cencia (figs. 2-54, 2-36 y 2-37).

En lugar da marcar el anticuerpo con fluoresceína se puede adosar a la e d a peroxidasa, poslo que se pueden idemti- &ar complejrre arrtigenB-antirrnexp me- diante la deteaninación eenPmohisto- química de la p m i d a s a (fig. 2-35). De esta manera es posible utilizar el mdtodo para la micro~capia electróníqa. A&- más, se puede acoplar el anticuerpo a la proteína electmsrdensa que contiene hie-

Fig. 2-36. Dibujo esque- mático del principio de la inrnunohostoquírnioa. -

C i- s e presentan 10s tres mé- ,I + todos más usuales de de- - -. terminación histoquímica

de proteínas específicas

rro, ferritina, o a partículas de oro, que también se puede identificar con el mi- croscopio electr6nico (fig. 2-36).

La especificidad de los métodos inmu- nohistoquímicos depende totalmente de que el antígeno utilizado se afsle sin mez- clas con otras sustancias, para que sea po- sible producir anticuerpos puros con la inmunización. En consecuencia, la inves- tigación del grado de pureza del antígeno es un importante control del método. Se obtiene un antígeno totalmente puro cuando se lo sintetiza, por ejemplo un po- lipéptido de secuencia de aminogcidos conocida, Es esencial señalar que no es necesario aislar el anticuerpo pripacio es- pecífico de la fracción mezclada de anti- cuerpos en el conejo inmunizado ni los anticuerpos específicos anticonejo en la cabra (véase recuadro).

En los últimos años ha sido posible ob- tener gran cantidad de mol6culas de anti- cuerpo totalmente iguales, los denomina- dos anticuerpos monoclmales. La técnica para formarlos implica una fusión celular de células de mieloma (una lfnea celular tumoral transformada) murinos con los denominados linfocifos B, productores de anticuerpo, del timo de ratones previa- mente inmunizados por la inyección del antígeno que se desea demostrar con el anticuerpo monoclonal. Después de la fu- sión celular, las denominadas células de hibridoma (híbridas de rnieloma) forma- das han adquirido la capacidad de las cé- lulas del mieloma de desarrollar un creci- miento prolongado en cultivos celulares y la capacidad de los linfocitos B de produ- cir determinado anticuerpo. Después de la clonización de las células híbridas indi-

mediante anticuerpos marcados.

Fig. 2-37. Fotomicrogra- fía de un microtúbulo den- tro del citoplasma de fi- broblastos provenientes de un cultivo de tejido, de- mostrado por inmunohis- toquimica mediante la utilización de un anti- cuerpo fuorescente mo- noclonal contra la proteí- na tubulina que conforma el microtúbulo. Los micro- túbulos citoplasmáticos se distinguen de color verde fluorescente sobre fondo negro. x400. (Cedida por H. Hager.)

viduales, cada clon produce grandes can- tidades de anticuerpo monoclonal idénti- CO (fig. 2-37).

Los métodos inmunohistoquímicos son uno de los más importantes utilizados en las investigaciones histológica y biológica celular. En principio es posible demostrar la localización de cada una de las proteí- nas que se forman en el organismo. Por ejemplo, en muchos casos se ha podido es- tablecer cuáles son las células que forman d%terminada hormona. Los anticuerpos también se pueden formar contra otras moléculas, distintas de las proteínas, ya sea antígenos en sí mismos o, en los casos de moléculas pequeñas, compuestos que se acoplan a sustancias antigénicas como las proteínas, a veces debido a otro trata- miento. Por ejemplo, se ha podido dernos- trar la existencia de pequeñas moléculas transmisoras como la serotonina (5-hidro- xitriptamina) (fig. 2-35).

Histoquimica con lectinas

Las lectinas son protefnas (en su mayor parte extraídas de vegetales, por ejemplo, porotos rojos) que poseen sitios de unión especficos para hidratos de carbono. Dis- tintas lectinas se unen con diferentes mo- léculas de hidratos de carbono o secuen- cias de éstas con notable especificidad. Así, existen lectinac que se unen a gluco- proteínas y glucolípidos específicos de la superficie externa de las membranas celu- lares y a determinados proteoglucanos del tejido conectivo. La utilización histoquí- mica de las lectinas se debe a que, al igual

que a los anticuerpos, se las puede mar- car, por ejemplo con un colorante fluores- cente o con le enzima peroxidasa, que permiten su localización en un corte de tejido. La histoquímica con lectinas tiene amplia aplicación para demostrar la exis- tencia de determinadas secuencias de hi- drato~ de carbono en las moléculas de las membranas ce~ulares.

La hibridación in situ se basa sobre la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridizarse entre sí, es decir, la ca- pacidad de unirse entre s í que presentan las monocadenas de ácidos nucleicos que tienen secuencias de bases complementa- rias. La hibridación puede ser de DNA- DNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a la característica muy específica de la hibrida- ción es posible demostrar con gran especi- ficidad la presencia de determinadas se- cuencias de DNA o de RNA en su localiza- ción en la célula. Para la técnica de hibri- dación in situ se utiliza una sonda (ing. sonde, probe), formada por un ácido nu- cl~ico monocatenario con una secuencia de bases conocida, complementaria de la secuencia de bases que se desea demos- trar. Las sondas son producidas en labora- torios (p. ej., mediante técnicas de clona- ción de genes, véase con mayor detalle en el cap. 4) y se marcan con un isótopo ra- diactivo (para ser demostradas por ra- dioautografia, véase la próxima sección) o con una ramificación adosada, que permi- te identificar la sonda mediante otras téc-

nicas, por eJeq&d la inmunohistoquími- ca. Estas sonda& vmfan en longitud, desde 10-15 basés hasta varios miles de bases.

Por 4js&pioJ s i se desea demostrar la existencia .de determinada secuencia de I2IVA en m cmmosoma de las ct5lulas de un corte M4Éal6gico o en un preparado es- pedal de crmosomas, primero se expone el p m ~ a d o a un pH elevado (básico), que Lndmelaseparación de la doble cadena de la mal8cula de DNA por desnaturaliza- ción. Despds se agrega la sonda, que pue- de poseer la secuencia complementaria de DNA o de WA. Una vez hibridizada la sonda con las zonas complementarias del DNA de los cromosomas se transforma en visible la localización en los núcleos celu- lares, por ejemplo, mediante radioautogra- fía o inmunohístoquímica.

Si se desea demostrar la presencia de moléculas específicas de RNA, no se efec- túa n i w n tratamiento previo de los cor- tes histológicos con pH elevado, dado que precisamente se desea que Ias cadenas do- bles de las moléculas de DNA no se sepa- ren y, en consecuencia, no se unan a la sonda. En este caso es suficiente incubar los cortes de tejido con la sonda (después de una fijación suave del tejido), que pue- de contener una secuencia complementa- ria de DNA o de RNA.

Así, mediante la hibridación in situ es posible demostrar las secuencias de áci- dos nucleicos correspondiente a determi- nados genes (véase fig. 4-36), además de la expresión de determinados genes por la demostración de la presencia de secuen- cias especificas de RNA mensajero (mR- NA) .

b Radioautografia

Con esta técnica es posible obtener in- formación directa respecto al sitio dentro de la célula donde se sintetiza un produc- to y los componentes químicos que lo for- man, ademtis de sus eventuales desplaza- mientos dentro de la célula o hacia otras localizaciones del organismo, después de salir de la célula. Además, es posible seguir los desplazamientos de toda la célula y su posterior destino en el organismo. Por lo tanto, la radioautografía provee de infor- mación referida a los aspectos dinámicos de la mo$ología de las células y los tejidos.

La radioautografía se basa sobre dos principios fundamentales: 1) la radiación ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsián fitográfica que la luz visible. 2) Un precursor biológico con marca radiac- tiva, por ejemplo, un amboácido, tiene exactamente iguales propiedades hioi6gi- cas y destino metab6lico en el m p i m que la mol6cula correspondiente sin mar- ca. Por marca radiactiva se entiende q u ~

un ápomo .$e la m&& determinada es reemplaza& por su &&topo radiactivo co- rrespondhte, por ejem lo el reemplazo de hidrdgeaa por Znüo 4.

El procedimienía sadioautog~áfico pue- de ser el siguiente, por ejemplo: en un mi- mal de experimmt&%ón se inyecta una molécula de imp~staw:~Ia biológica marca- da con un isótopo gaWtrvb, por ejemplo 3H-leucina, que intdr- la formación de v h proteínas. Las rndécdas con maca radiadva s a integradas rápida- mente a las macroamU&as, que se pue- den conservar m lo^ cm%es de tejido aJ ha* cerlas insolubles por Ej3538n. Las molém- las inyectadas son s$nbles y se eliminan por lavado h a n t e Ia p~spmacón de los cortes histokígicos, a ~E%(TS que hayan si- do incorporadas al pmdmto de sintesis macmmolecrrlar antes de ser sacrificado el animal. Despu4s del montaje de los cortes se les agrega en cámara oscura una capa muy deIgada de muE@n ht~pafia (cris- talas de bromuro de plata en eimulsiáh de gelatina) [fig. 2-38), Durante el posterior período de exposición, que puede durar algunos días o semanas, de acuerdo al tra- bajo experimental, desde los sitios radiac- tivos del tejido se emiten particulas o ra- yos gamma. Algunos de ellos atraviesan la emulsión fotográfica e inciden en los cris-

Fig. 2-38. Dibujo esquemático de un preparado radioautográfico para uso en el microscopio electrónico. Parte superior: el preparado du- rante la exposición. Una partícula beta prove- niente de un compuesto tritiado en el corte de tejido ha incidido sobre un cristal de bromuro de plata (grisado) de la emulsión fotográfica su- prayacente y generado una transformación par- cial de los iones plata del cristal en plata metáli- ca (presentado como una mancha negra arriba a la izquierda del cristal). Parfe inferior: el pre- parado tras el revelado y la fijación. El cristal in- cidido se ha transformado totalmente en gránu- lo de plata metálica y se eliminaron los demás cristales (no incididos). (Según Caro.)

Gray de plata

- Gelatina )-- Cristal de AgBr

- Corte de tejido - Película de sosten

- Gelatina - Corte de tejido

- Película de sostén

Fig, 2-39. Fotomicrografía de un preparado ra- dioautográfico para microscopia óptica de tejido renal. En el animal vivo se inyectó timidi- na tritiada, que antes de ser sacrificado el ani- mal se incorporó al DNA en todos los núcleos celulares en fase de síntesis como paso previo a la división celular. Los purrtos negros repre- sentan los gránulos de plata metálica y se loca- lizan en los núcleos de las células marcadas (nótese que, por lo general, las células total- mente desarrolladas no se dividen en los túbu- los renales, pero en este caso fueron estimula- das experimentalrnerrte para la división). x870. (Cedida por R. Rasch.)

tales de bromuro de plata, que se transfor- man entonces, en parte, de iones plata a plata metálica. Después de un período prudencial de exposición se aplica un re- velador químico que transforma todos los cristales incididos par los rayos en plata metálica. Por último se eliminan todos los cristales no incididos mediante una solu- cidn de tiosulfato (fijación fotográfica). A corrtinuación se puede tratar el corte de la gisma manera que cualquier otro, por ejemplo teñirlo de manera adecuada, con posterior deshidratación e inclusián.

En la observación con el microscopio se distinguen los granos de plata metálica como pequeñas manchas o puntos negros en los sitios de localización de la sustan- cia radiactiva en el corte de tejido subya- cente (fig. 2-39).

El poder de resolución, entendido como la exactitud de la localización del isótopo radiactivo, es de alrededor de 1 pm con el microscopio óptico, pero si se utiliza el mi- croscopio electrónico (fig. 2-40) es posible obtener un poder de resolución de alrede- dor de 0,1 pm. En las imágenes obtenidas par microscopio electrónico a menudo los gránulos ocultan varias estructuras y el es- tudio más exhaustivo de las radioautogm- fías puede requerir un anaisis estadístico.

El método sólo demuestra sustancias que se incluyen en los componentes tisu- lares, mientras que el material marcado se encuentra dentro del organismo. Pred- samente por ello es posible obtener infor- mación sobre las relaciones dinámicas de los procesos metabólicos. Una importante

Fig. 2-40. Imagen de un preparado radioauto- gráfico de eritrocitos y reticulocitos. (glóbulos ro- jos inmaduros), captada con microcsopio etectró- nico. Previo a la preparación para la radioauto- grafía para el microscopio electrónico se incuba- ron las células ín vito con leucina tritiada; se ob- serva gran cantidad de gránulos de plata por so- bre un reticulocito (R), pero ninguno sobre los dos eritrocitos (E). Esto se debe a que el reticu- locito incorporó la Ieucina radiactiva durante la incubación, puestD que aún es capaz de sinteti- zar hemoglobina (proteína que requiere leucina), mientras que los eritrocitos maduros han perdido la capacidad de sintesis proteica. x80.000.(Cedi- do en pré%tamo por A.B. Maunsbach.)

aplicación de la radiautografía es el mar- cado de los mídeos celulares (fig. 2-39), tras el cual se puede seguir el desplaza- miento y el destino de las c&Iulas marca- das dentro del organismo. Si, por ejemplo, se inyecta timidina marcada con tritio (que en el organismo se incluye como la base timina en el DNA) en un feto, smá in- cluido en el núcleo de todas las células que sintetizaban DNA en el momento de la inyección, camo paso previo para la di- visión celular. En la actualidad el metodo es muy importante para el estudio de la histogénesis (el desarrollo de las células embrionarias indiferenciadas a células es- pecializadas en un tejido).

Problemas en la interpretación de cortes de twdo

Por último se verán algunas cadicio- nes que conviene recordar respecto de la rnicroscopia dptica práctica.

Artificios. La p w a artificio significa producto &fi~jfES. y designa estructuras del preparado qae no existen en el tejido vivo, per@ qG.5 @parecen artifcialmnte du- rante el procedimknta de preparación.

Algunos de los artificios más comunes son la retra&bn [Bg. 2-4la), que en mayor o menor grado son una consecuencia inevi- table de la preparación habitual de los cor- tes tisulares. La retracción se presenta en los tejidos como hendiduras u orificios va- cíos y sin estructuras (p. ej., no presentan, como los capilares, una cubierta endotelial hacia el interior del espacio vacío). Los pre- cipitados de colorante se observan como cristales coloreados, a menudo ubicados por encima del corte (ffg. 2-41b). Los plega- mientos se pueden fonnar en el momento de la sección o durante el posterior proce- samiento de los delgados cortes (fig. 2-41c), mientras que las impegecciones de la cu- chilla del micrótomo causan defectos en el corte que se visualizan como líneas rectas que atraviesan las estructuras biológicas (fig. 2-41d):La rotum del tejido durante la extracción, por ejemplo debido a la pinza, puede dar lugar a la formación de groseras variaciones del aspecto de las células. Por últímo se debe nombrar la fijación dema- siado lenta o insqficiente como causa de cortes de mala calidad, debido a la degene- ración post mortem (véase con mayor deta- lle en la sección de lisosomas, en el cap. 3).

lnterpretaci8n tridimemional de un corte. Siempre se debe recordar que los cortes de tejido representan una delgada y, en principio, bidimensional rodaja de un objeto tsidimensional. En la figura 2-42 se muestra cómo un corte seccimado a través del mismo objeto puede presenw aspectos totalmente diferentes de los mis- mos tipos celulares. Muchas estructuras histológicas son tubulares, y la figura 2-43 presenta el aspecto muy variable de dis- tintos cortes transversales de la misma es- tnictura tubular.

Para establecer la h a tridimensional correcta de un órgano o de una estructura de gran tamaíío a menudo se realizan cortes senados, en los que se presentan sucesivas secciones a través de toda la estructura u Ór- gano. Mediante el cuidadoso análisis de las relaciones entre los cortes de toda la serie es posible obtener una representación más cierta de la conformación espacial, en algu- nos casos después de construir un modelo sobre la base de la serie de cortes. La infor- mación obtenida en el análisis también se puede transferir a una computadora, capaz de reconstruir un modelo tridimensional.

Aquí termina la somera introducción a la microscopia prgctica, recordando que para el diagnóstico es más importante descubrir 10 estructura de las células p los tejidos que los colores, dado que estos pueden variar de una técnica a otra.

Fig. 2-41. Estas 4 fotomi- crografías (a-d) de cortes coloreados con hematoxi- lina-easina muestran ejemplos de los artifi- cios histológicos más comunes. a muestra es- pacios como consecuen- cia d e retracción (fle- chas), mientras que en b se dbserva un cristal grande de colorante so- bre el tejido (flecha). c es un ejemplo de plega- rntento del corte al ser montado, mtentras que d mueStra líneas debidas a muescas en la cuchí. IEa del micrótomo (flechas).

Corte de 5 Km que atraviesa una célula de 1 5 p

Fig. 2-42. Dibujo esquemático que muestra c6- Fig. 2-43. Este dibujo esquemático muestra có- mo un corte fino entre un grupo de células si- mo cortes en dbtinta dlrecclón a través de milares puede presentar un aspecto fotalmen- la misma estructura tubular pueden presentar te diferente cuando se observa el corte por el aspectos totalmente diferentes. microscopio. (Según Ham.)