capitulo 16
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ADN Recombinante e Ingieniería Genética
Capítulo 16
Hipercolesterolemia Familiar
• Un gen codifica una proteina que sirve como
receptor celular para LDL
• Dos alelos normales para el gen mantienen
bajos los niveles sanguíneos de LDLs.
• Dos alelos mutados producen niveles de
colesterol anormalmente altos y enfermedad
del corazón.
Ejemplo de Terapia Génica
• Mujer con hipercolesterolemia familiar
• Se le removió parte de su hígado
• Se utilizó un virus para insertar un gen normal para el receptor
de LDL en las células del hígado cultivadas en el laboratorio
• Las células modificadas del hígado se pusieron de regreso en
la paciente
Resultados de la terapia génica
• Las células modificadas vivieron en el hígado
de la mujer
• Los niveles sanguíneos de LDLs bajaron en
un 20%
• No presentó evidencias de aterosclerosis
• Los niveles de colesterol permanecieron altos
• Falta todavía saber si el procedimiento
prolongará su vida.
Cambios Genéticos
• Los humanos han estado cambiando la
genética de otras especies por miles de años
– seleccion artificial de plantas y animales
• Los procesos naturales también han
trabajado
– Mutaciones, crossing over
Ingieniería Genética
• Los genes son aislados, modificados, e insertados dentro de un organismo
• Es posible gracias a la tecnología del ADN recombinante
– Corte del ADN y recombinación de piezas
– Las piezas modificadas se pueden amplificar
Discubriendo las Enzimas de restricción
• Hamilton Smith estaba estudiando la forma en que la bacteria Haemophilus influenzae se defiende del ataque de los virus bacteriófagos
• Descubrió que la bacteria tiene una enzima que corta el ADN viral
Especificidad de los cortes
• Las enzimas de restricción cortan el ADN en una secuencia específica
• El número de cortes hecho en el ADN dependerá del número de veces en que la secuencia de reconocimiento existe en ese genoma
Preparando ADN Recombinante
5’
3’
G
C T T A A
A A T T C
G
G A A T T C
C T T A A G3’
5’
one DNA fragment another DNA fragment
3’
5’
In-text figure
Page 254
nick
5’
3’
3’
5’
G A A T T C
C T T A A G
nick
G A A T T C
C T T A A G
DNA ligase action
In-text figure
Page 254
Usando Plásmidos
• Un plásmido es un pequeño cromosoma circular de
ADN bacteriano
• ADN extraño puede ser insertado dentro de un
plásmido
– Se forman plásmidos recombinantes
– Los plásmidos pueden servir como vectores de clonación
– Pueden enviar ADN a otra célula
DNA fragments+enzymes
recombinantplasmids
host cells containing recombinant plasmids
Figure 16.4Page 255
¿Podría escapar del laboratoriouna bacteria genéticamente
modificada?
• Las bacterias genéticamente modificadas son diseñadas para que no puedan sobrevivir fuera del laboratorio
• Si se liberan al medio ambiente mueren, son dependientes de las condiciones del laboratorio.
Preparando ADNcmRNA transcript
mRNA–cDNA hybrid
single-stranded cDNA
double-stranded cDNAFigure 16.5Page 255
Amplificando ADN
• In vivo: Los fragmentos pueden ser insertados dentro de microorganismos de crecimiento rápido
• In vitro: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Reacción en cadena de la Polimerasa
• Se calienta la secuencia que se desea copiar
• Se agregan los iniciadores o primers, los cuales reconocen su secuencia complementaria y se unen a ella
• La ADN polimerasa usa nucleótidos para crear la hebra complementaria.
• Se obtienen miles de copias del fragmento deseado.
Polymerase Chain Reaction
Double-stranded DNA to copy
DNA heated to 90°– 94°C
Primers added to base-pair with ends
Mixture cooled; base-pairing of primers and ends of DNA strands
DNA polymerasesassemble new DNA strands
Figure 16.6Page 256
Stepped Art
Polymerase Chain Reaction
Figure 16.6Page 256
Stepped Art
Mixture heated again; makes all DNA fragments unwind
Mixture cooled; base-pairing between primers and ends of single DNA strands
DNA polymerase action again doubles number of identical DNA fragments
Huellas genéticas o DNA Fingerprints
• Patron de bandas único que se obtiene
después de una electroforesis del
genoma previamente cortado con
alguna enzima de restricción.
• Se heredan de padres a hijos de una
forma mendeliana
Repeticiones en Tandem
• Cortas regiones de ADN que difieren sustancialmente entre las personas
• Existen muchos sitios del genoma donde existen repeticiones en tandem
• Cada persona es portadora de una única combinación de la cantidad de repeticiones.
RFLPs (Restriction fragment length polymorphisms)
• Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción
• El ADN de regiones con repeticiones en tandem se corta con enzimas de restricción
• Debido a la variación en la cantidad de ADN repetido, los fragmentos de restricción varían en tamaño
• La variación se detecta por una electroforesis
Electroforesis
• El ADN se pone en un “pozo” en uno de los extremos del gel.
• Se aplica una corriente al gel.• Las moléculas de ADN están cargadas
negativamente y se mueven hacia el extremo positivo
• Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes.
Analizando huellas genéticas
• El ADN se hace visible mediante el marcaje
con un isótopo de una sonda de ADN que se
hibridiza. El patrón de bandas se usa para:
– Identificar o rechazar al sospechoso de un crimen
– Identificar cuerpos
– Determinar paternidad
Huellas genéticas con sondas multilocus
Secuenciación de Genomas
• 1995 – Primera Secuencia en ser determinada: bacteria Haemophilus influenzae.
• Actualmente se usa la secuenciación automática como método principal
• La secuencia “borrador” del genoma humano completo se determinó de esta forma.
Nucleotidos para secuenciación
• Nucleótidos (A, T, C, G)
• Versiones modificadas de estos nucleótidos:– Marcados para emitir fluorescencia
– Estructuralmente diferentes para que detengan la síntesis cuando ellos se unen a la molécula.
Mezcla para la reacción
• Copias del ADN a ser secuanciado
• Primer
• DNA polimerasa
• Nucleotides
• Nucleótidos Modificados
Procedimiento de la reacción
• Se sintetiza una hebra complementaria con los nucleótidos
• Cuando se incorpora un nucleótido modificado, se detiene la síntesis
• Como resultado se obtienen millones de copias de longitud variable
Obtención
de la secuencia
T C C A T G G A C CT C C A T G G A C
T C C A T G G A
T C C A T G G
T C C A T G
T C C A T
T C C A
T C C
T C
T
electrophoresisgel
one of the many fragments of DNA migratingthrough the gel
one of the DNA fragmentspassing through a laser beam after moving through the gel
T C C A T G G A C C A
•ADN se pone en un gel
•Fragmentos migran por el
gel en orden de tamaños;
pasan a través de un rayo
laser. El color de la
fluorescencia de cada
fragmento se almacena en
la computadora y se puede
imprimir .
Figure 16.8Page 258
Bibliotecas de genes
• Bacterias que contienen
diferentes fragmentos de
ADNs clonados :
– Bibliotecas Genomicas
– Bibliotecas de ADNs copias
Usando una sonda para encontrar un gen
• Usted desea saber cual bacteria de todas en
una librería contiene un gen específico
• Se necesita una sonda del gen
– Una secuencia de ADN del gen, marcada
con radio-isótopo que reconocerá su
secuencia complementaria en la librería.
Uso de una sonda
Colonies on plate
Cells adhere to filter
Cells are lysed;DNA sticks to filter
Probe is added
Location where probe binds forms dark spot on film, indicates colony with geneFigure 16.9
Page 259
Ingieniería de proteinas
• Las bacterias pueden ser usadas para
obtener miles o millones de copias de
moléculas de una proteina de interés médico
– Insulina, interferon, Factores de
coagulación de la sangre
– Vacunas
Limpieza del ambienteBio-remediación
• Existen microorganismos que normalmente
digieren basura orgánica y reciclan
materiales
• Algunos pueden ser usados por la ingieniería
para digerir contaminantes o grandas
cantidades de materiales peligrosos.
El plásmido Ti
• Investigadores reemplazan
genes que causan tumores por genes beneficiosos
• Los plásmidos transfieren estos genes a celulas vegetales en cultivo
foreign genein plasmid
plant cell
Figure 16.11Page 261
Ingieniería de plantas
• Plantas de algodón pueden hacerse resistentes a hierbicidas
• Plantas de aspen pueden producir menos lignina y más celulosa
• Plantas de tabaco pueden producir proteínas humanas
• Células de la planta de mostaza pueden producir plástico biodegradable.
Primeros mamíferos manipulados genéticamente
• Usaron ratones deficientes en hormona del crecimiento (enanos)
• Los huevos fertilizados de ratón fueron inyectados con el gen de rata para la hormona del crecimiento
• Gen se integróal ADN del ratón• Ratones modificados fueron 1,5 veces mas
grandes que sus hermanos no modificados
Clonando a Dolly
1997 - Una oveja fué clonada a partir de una célula
de adulto.
– Un nucleo de una célula de la glándula mamaria
fué insertado en un ovulo sin núcleo
– El embrion fué implantado en una madre sustituta
– La oveja obtenida es una copia genética del
animal del cual se obtuvieron las celulas de las
glándulas mamarias
Diseñando Ganado
• Embriones de ganado vacuno se pueden hacer crecer en cultivo y modificados genéticamente para
- crear resistencia a enfermedades
– Hacerlos producir albúmina humana u otras proteinas de uso médico.
Proyecto del Genoma Humano, U.S.A.Human Genome Organization HUGO, 1988
• 1990 planeado para 15 años:• Mapear y secuenciar el genoma humano.• Desarrollar tecnologías y métodos.
• Mapear y secuenciar genes de 5 organismos modelos: E.coli, Saccharomyses cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster y el ratón.
• Estudiar las implicaciones éticas y legales del proyecto (Subproyecto ELSI).
Anormalidadescromosómicas
CLONES Enfermedades
ADNc ADNg Familias
LigamientoHíbridos celularesFISHClones contiguosetc.
MAPA DEL GENOMA HUMANO
Mapa físicoMapa genético
Secuenciación Identificación de genes
MapaRATON
Polimorfismos
Proyecto del Genoma Humano
• Se hizo en centros con capacidad industrial de secuenciar:
• Wellcome Trust Sanger Institute en Reino Unido.• The Whitehead Institute y el Institute of
Technology of Massachussetts.• Washington University• DoE Joint Genome Institute.• Baylor College of Medicine• Y una red de pequeños laboratorios en todo el
mundo
08_01.jpg
Proyecto Genoma Humano
Proyecto del Genoma Humano
• Se desarrollaron grandes bases de datos de acceso gratuito por Internet, para los datos obtenidos con fondos públicos:
• Datos de mapeo y secuenciación de ADN y proteínas. Ej Genome database (GDB). Estos pueden ser accesados y analizados desde cualquier parte del mundo.
• Datos de interés local obtenidos por cada laboratorio.
Fechas importantes en el Mapeo y Secuenciación del Genoma Humano
• 1977: Fred Sanger: metodo de secuenciación usando dideoxinucleótidos.
• 1980: Bolstein et al propuso mapear con RFLPs• 1981: Sanger publicó la secuencia mitocondrial completa• 1987: El departamento de energía de los Estados Unidos ve
la necesidad de hacer el proyecto del genoma humano• 1988: Se crea el Centro Nacional para el estudio del
Genoma Humano adscrito a los Institutos Nacionales de Salud. USA.
• 1990: lanzamiento oficial del proyecto• 2001: Publicación del primer borrador de la secuencia del
genoma humano (90%), por parte de Celera Genomics.• 2003: Secuencia completa del genoma Humano
Proyecto del Genoma Humano
• se necesitaron más de 10 años, más de 1.000 científicos y aproximadamente 2.000 millones de dólares, de los cuales solamente entre un 3-5% se han destinado al subproyecto ELSI, el cual financia investigaciones sobre los aspectos éticos, legales, y sociales asociados al nuevo conocimiento.
Beneficio vrs riesgos• Como cualquier conocimiento científico o
avance tecnológico, éste puede traernos gran cantidad de beneficios, si se maneja con una visión humanista y solidaria, obedeciendo valores fundamentales como el respeto a la vida, a la privacidad, el derecho a la salud y de aspirar cada día a una mejor calidad de vida; y el derecho de proteger la identidad genética.
• Por el contrario si es usado en forma inescrupulosa, con fines comerciales o raciales podría conducirnos a una sociedad cada día más deshumanizada.
Temores• Los ciéntificos y el público en general han manifestado
preocupaciones: el posible irrespeto a la dignidad humana, la discriminación contra personas con desbalances genéticos, o portadoras de alguna mutación que les confiere un riesgo mayor de llegar a desarrollar alguna enfermedad degenerativa, incapacitante o que les acorte la vida. Esta discriminación se podría traducir en
• 1. Pago de mayores primas en seguros de salud o total ausencia de cobertura, en los países donde la salud es asegurada por empresas privadas (afortunadamente, todavía no es el caso de Costa Rica).
Temores 2. Obstáculo para obtener un trabajo, etc. • Los expertos del subproyecto ELSI
recomendaron legislar urgentemente con el fin de proteger la información genética de los individuos porque los temores mencionados tienen fundamento, y porque los incentivos económicos para cometer discriminaciones aumentarán, conforme aumente la investigación genética y bajen los costos del tipeo genético de los individuos. Por lo que se deben penalizar las acciones de discriminación.
Desafíos• Existen aspectos éticos que están en discusión
y que atañen a toda la sociedad, se pueden señalar: el uso de la información, la privacía y confidencialidad, quién es el dueño de la información, el impacto sicológico y la estigmatización social, el tamizaje genético individual (por pertenecer a una familia con historia de enfermedad genética) o poblacional (recién nacidos, prematrimonial y ocupacional), aspectos reproductivos, derecho a la reproducción, terapia génica, intervenciones genéticas, disponibilidad del uso de las tecnologías genéticas, acceso y financiamiento, aspectos clínicos, comercialización,. implicaciones filosóficas y conceptuales.