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CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 1
Capítulo 12. Terapia Génica.
Componentes de un sistema de terapia génica y vías de administración.
Naturaleza del ácido nucleico terapéutico. Tipos de vectores y su
utilización en distintas estrategias de transferencia génica. Aplicaciones
clínicas actuales de la terapia génica.
Componentes de un sistema de terapia génica y vías de administración
El desarrollo de la genética molecular durante los últimos años, y especialmente toda la información
derivada del Proyecto Genoma Humano, han propiciado que podamos afrontar la modificación directa de
las alteraciones genéticas o la utilización de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos. La terapia
génica es una nueva modalidad terapéutica surgida a finales de los años 80, y que puede definirse
como la transferencia de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) con fines terapéuticos.
Toda estrategia de terapia génica se basa, por tanto, en la transferencia de ácidos nucleicos
(transferencia génica) al interior de un grupo de células. Estas células pueden ser las células enfermas –
cuyo daño se pretende reparar–, o bien un grupo de células normales que se modifican genéticamente
para que sean las efectoras de una acción terapéutica, por ejemplo sintetizando una proteína concreta.
Por lo tanto, todo sistema de terapia génica es análogo a un sistema de transporte, en el que hay un
agente que es transportado y un vehículo de transporte. En nuestro caso, el agente transportado es un
ácido nucleico y el vehículo encargado de llevarlo al interior de las células diana se denomina vector.
Según el modo de hacer llegar el vector (conteniendo el agente terapéutico) a las células diana, es ya
clásica la distinción entre terapia génica ex vivo y terapia génica in vivo. En el primer caso, la
administración del vector se realiza fuera del cuerpo: se obtiene una biopsia del órgano de interés, se
expanden las células mediante cultivo celular y se ponen en contacto con el vector mientras están siendo
cultivadas. Esto hace posible seleccionar las células que hayan sido modificadas genéticamente y re-
introducirlas en el paciente. En la administración in vivo, el vector terapéutico se administra
directamente al individuo enfermo por
cualquiera de las vías habituales (intramuscular,
oral, intravenosa, intraportal, subcutánea),
escogiendo aquella que nos permita alcanzar la
máxima eficacia terapéutica.
La Figura 12.1 ilustra los
componentes de un sistema de
terapia génica y las vías de
administración.
Naturaleza del ácido nucleico terapéutico
Según el efecto biológico que pretendemos obtener, el agente terapéutico será de distinta naturaleza. En
general, podemos clasificar los ácidos nucleicos terapéuticos en tres grupos, dependiendo de si
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buscamos la corrección directa de una mutación, la suplementación génica, o la inhibición de la
expresión.
a) En los últimos años se ha conseguido corregir específicamente defectos a nivel del ADN de
distintos modos. Uno de los primeros sistemas en ser desarrollados fue el de los quimeraplastos,
moléculas quiméricas (híbridas) formadas por ADN y ARN que son capaces de reconocer
específicamente una mutación y corregirla. Este tipo de tecnología funciona con cierta eficacia
cuando se aplica a células en cultivo (in vitro), y es de esperar que en el futuro se pueda utilizar
también in vivo. Los quimeraplastos son oligonucleótidos formados por una molécula lineal de ADN
que contiene un tracto de 5 desoxi-ribonucleótidos complementarios a la secuencia genómica que se
quiere corregir. Es importante que esta región correctora esté flanqueada por fragmentos de 10
ribonucleótidos (ARN). El oligonucleótido se empareja específicamente con la región mutada y los
sistemas de reparación celulares llevan a cabo la reparación de la mutación tomando como molde la
base correspondiente del oligonucleótido terapéutico. Teóricamente, es posible diseñar
oligonucleótidos ARN/ADN para corregir directamente las mutaciones puntuales que causan las
enfermedades hereditarias
más frecuentes.
Figura 12.2
Estructura de un
quimeraplasto.
En los últimos años se ha avanzado mucho en el desarrollo de nucleasas con dedos de zinc,
conocidas como “tijeras moleculares”. Son unas proteínas compuestas por un dominio de unión a ADN
(formado por varios dedos de Zinc) fusionado con un dominio de rotura de ADN (habitualmente procede
del enzima de restricción FokI). Los dedos
de zinc pueden diseñarse para la unión
específica a una región del genoma, tras la
cual se genera una rotura de doble cadena
del ADN. Dicha lesión es reparada después
mediante recombinación homóloga u otro
sistema de reparación del ADN, con lo que
se introduce una mutación específica.
Una modificación reciente que ha mejorado
todavía más esta tecnología ha sido la
aparición de las nucleasas TALEN
(Transcription-Like Effector Nucleases), que
tienen un dominio de unión a ADN (TAL-
effector) con 33-34 aminoácidos muy
conservados, excepto los aminoácidos 12 y
13 que son muy variables. Usando distintas
combinaciones en estas posiciones, se
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pueden conseguir dominios de unión muy específicos para regiones concretas del genoma. Al dominio
TALE se le suele unir el mismo dominio de rotura del ADN procedente de FokI.
La Figura 12.3 ilustra el funcionamiento de nucleasas de dedos de zinc. En
este video se explica el funcionamiento de las TALEN.
b) En el caso de mutaciones que simplemente producen pérdida de función, puede ser suficiente la
suplementación génica, es decir, suplementar las células con copias normales del gen sin
preocuparnos de corregir las mutaciones presentes en el ADN genómico. Lo más habitual en estos
casos es que el agente terapéutico sea una unidad de expresión en la que la transcripción del gen
en cuestión viene regulada por promotores virales potentes, por promotores regulables o por
promotores específicos de un tipo celular concreto.
La Figura 12.4 muestra un plásmido de expresión para suplementación
génica.
c) Cuando el defecto genético que tratamos de corregir origina una ganancia de función, como suele
suceder en mutaciones con efectos oncogénicos, lo lógico es intentar inhibir la expresión del gen
que está causando el fenotipo aberrante. Los agentes terapéuticos más utilizados en estas
circunstancias son las moléculas antisentido o los ribozimas. Los oligonucleótidos antisentido
pueden inhibir directamente la expresión de un gen al unirse a la doble hélice de ADN mediante
enlaces tipo Hoogsteen, formado una triple hélice que impide la transcripción mediada por la ARN
polimerasa II. Estos oligonucleótidos suelen estar modificados químicamente para aumentar su
estabilidad y eficacia, siendo las principales modificaciones los grupos fósforo-tioato en el esqueleto
desoxi-ribosa-fosfato de los oligonucleótidos, o bien los ácidos nucleicos en los que el enlace fosfo-
diéster viene substituido por un enlace peptídico (denominados Acidos Nucleicos Peptídicos, PNA).
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Los ARNm antisentido son capaces de emparejarse con los ARN sentido y formar moléculas
bicatenarias de ARN que no pueden ser traducidas y son digeridas por la RNAsa H celular. Los
ribozimas, pequeñas moléculas de ARN con actividad catalítica, pueden ser diseñados para
reconocer un ARNm específico y degradarlo merced a su actividad endonucleolítica específica. En
general, la utilización de moléculas antisentido y ribozimas está limitada por la baja eficacia que
muestran todavía en modelos in vivo.
La Figura 12.5 muestra los distintos tipos de moléculas utilizadas para
inhibir la expresión génica.
Hoy en día, las mejores perspectivas de inhibición eficaz y específica de la expresión génica se
basan en la interferencia de ARN, un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional
descrito en plantas y C. elegans que consiste en la degradación de ARN mensajeros endógenos por
la presencia de moléculas pequeñas de ARN de doble cadena homólogas al mensajero que se
destruye. Este proceso depende de una RNAasa tipo III llamada DICER, responsable de la formación
de los ARN pequeños, y de un complejo llamado RISC (RNA Induced Silencing Complex) que
contiene unas proteínas del complejo ARGONAUTA y los ARN pequeños que dirigen el complejo a la
diana. Se ha visto que este mecanismo también juega un papel importante en la regulación génica
en humanos, ya que el análisis del genoma ha revelado la presencia de genes que codifican ARN
pequeños (aproximadamente 75 nucleótidos) que forman horquillas y que son procesados por
DICER y proteínas del complejo Argonauta para generar ARN intereferentes pequeños, de unos 21-
22 nucleótidos. Estos genes endógenos se denominan miRNA (microRNA), para diferenciarlos de
los siRNA que provienen de moléculas bicatenarias de ARN de procedencia externa. Actualmente se
piensa que ambos tipos de moléculas (miRNA y siRNA) tienen la misma vía efectora, que actúa
impidiendo la traducción (si la homología de la molécula interferente con el ARN mensajero no es
total), o bien eliminando los mensajeros si la homología es total. Sorprendentemente, también
se ha visto que las repeticiones centroméricas y los transposones, cuando se transcriben, dan lugar
a ARN interferentes pequeños que utilizan este mecanismo para modificar la cromatina,
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induciendo metilación en las histonas ó en el ADN y provocando la formación de heterocromatina o
el silenciamiento transcripcional. En los últimos años se ha demostrado que se pueden utilizar
siRNAs ó microRNAs para inhibir la expresión de genes endógenos, generando moléculas
interferentes específicas para un gen concreto. Por ejemplo, se ha conseguido silenciar genes
endógenos en células humanas mediante siRNAs dirigidos específicamente frente a promotores
concretos. Dicho silenciamiento se lleva a cabo por metilación de los dinucleótidos CpG de esos
promotores y por metilación de la lisina 9 de la histona H3 de esa región.
El avance más espectacular usando esta tecnología tuvo lugar en 2004, cuando un grupo consiguió
reducir hasta un 40% los niveles de colesterol en ratón, usando unos siRNA sintéticos
conjugados con colesterol que fueron inyectados directamente en la vena de la cola de los animales.
Los siRNA fueron captados eficazmente por receptores del hígado, intestino y otros órganos y
provocaron la degradación de los ARNm endógenos de apolipoproteína B, con el consiguiente
descenso en los niveles de LDL y colesterol total.
Figura 12.6 El video ilustra el funcionamiento de los microARNs.
Tipos de vectores y su utilización en distintas estrategias de transferencia
génica
Los ácidos nucleicos terapéuticos han de ser vehiculizados al interior de las células diana por medio de
vectores adecuados. Se distinguen dos tipos fundamentales de vectores: los basados en virus
(vectores virales) y los vectores sintéticos (vectores no virales) que intentan emular la capacidad natural
que tienen los virus de introducir ácidos nucleicos en las células.
1. Los vectores virales fueron los primeros en ser utilizados, dada su alta eficacia como vehículos de
ácidos nucleicos. Los virus están compuestos por un ADN ó un ARN rodeado de una cápside proteica y,
en algunos casos, una envuelta lipoproteica. El ciclo biológico de los virus pasa por la introducción del
genoma viral en determinados tipos celulares, habitualmente por la presencia de receptores en la
membrana de las células. Para poder utilizar un virus como vector en terapia génica, es preciso insertar
el ácido nucleico terapéutico en el genoma viral, y conseguir al mismo tiempo que el virus no se replique
y por tanto no sea patogénico. Por esto, los virus utilizados en terapia génica se denominan virus
recombinantes y defectivos (carecen de alguna función necesaria para su propio ciclo replicativo). A
continuación se repasan los principales vectores virales utilizados actualmente en terapia génica.
a) Vectores retrovirales. La familia Retroviridae está compuesta por las subfamilias Spumaviridae,
Lentiviridae y Oncoviridae. Los vectores retrovirales utilizados en terapia génica están derivados de los
oncovirus murinos del tipo C, especialmente los que son anfitrópicos (que pueden infectar tanto células
murinas como humanas). Recientemente se han desarrollado vectores derivados de lentivirus,
especialmente del HIV-1.
Los retrovirus son virus ARN que tienen una envuelta fosfolipídica, con glicoproteínas que determinan el
tropismo del virus al ser reconocidas por receptores celulares específicos. Dentro de esta envuelta hay
una cápside proteica de estructura icosaédrica que contiene 2 copias del genoma viral, la transcriptasa
inversa (RT), y la integrasa. El genoma de un retrovirus es una molécula de ARN de polaridad positiva
en la que se distinguen 3 tipos de genes: genes gag (que codifican las proteínas de la cápside), genes
pol (que codifican las enzimas necesarias para el ciclo viral, como la proteasa y la integrasa) y genes env
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(que codifican las glicoproteínas de la envuelta). El genoma está flanqueado por dos repeticiones
terminales largas (LTR, Long Terminal Repeat), y contiene también una señal de empaquetamiento
PSI mediante la cual las moléculas de ARN se unen a las proteínas de la cápside y son empaquetadas
eficazmente. El LTR izquierdo contiene una región (U3) para el comienzo de la transcripción, y un primer
binding site (pbs) para el comienzo de la retrotranscripción. El LTR derecho contiene una secuencia de
poli-purinas (ppt) para la replicación de la segunda cadena.
El ciclo replicativo de los retrovirus comienza cuando el virus es reconocido por receptores celulares, lo
que lleva a la fusión de la envuelta viral con la membrana celular y a la internalización del nucleoide. A
continuación tiene lugar la retrotranscripción del ARNm para formar un ADNc bicatenario (este
proceso tiene lugar dentro de la nucleocápside, antes de su llegada al núcleo de la célula), y después se
desensambla la cápside al llegar a la membrana nuclear. El genoma viral se integra en el genoma de
la célula huésped (integración mediada por la propia integrasa del virus), y entonces comienza la
transcripción a partir del promotor U3 que está en el LTR izquierdo. Se producen distintos tipos de
ARNm, fundamentalmente un transcrito que contiene gag y pol y otros transcritos que codificarán las
proteínas de la envuelta. Los ARNm son exportados al citoplasma y traducidos, dando lugar a
poliproteínas gag-pol y a las proteínas de la envuelta. Estas últimas viajan a la membrana celular,
mientras que las poliproteínas gag-pol forman nuevas nucleocápsides al unirse a la señal de
empaquetamiento de los ARNm positivos. Tras el empaquetamiento, que tiene lugar en el citoplasma,
las cápsides salen de la célula por gemación, quedando rodeadas de nuevo por una envuelta compuesta
por la membrana celular y las glicoproteínas codificadas por el virus que habían llegado anteriormente a
la membrana. Las nuevas partículas retrovirales se activan cuando la proteasa rompe la poliproteína
gag-pol dentro de la propia partícula viral y da lugar a moléculas independientes de proteasa, integrasa
y retrotranscriptasa.
La Figura 12.7 muestra la estructura del genoma de un retrovirus.
Es importante señalar que el nucleoide de un oncovirus es incapaz de atravesar la membrana nuclear,
por lo que es necesario que la célula sufra al menos una mitosis para que el genoma viral entre en
contacto con el genoma de la célula huésped. En cambio, los retrovirus de la familia de los lentivirus sí
que pueden atravesar la membrana nuclear, por lo que pueden infectar células que no están en división.
Esta es una propiedad muy importante a la hora de valorar las posibles aplicaciones de estos tipos de
vectores.
Para generar un retrovirus recombinante defectivo, es necesario sustituir los genes de las proteínas
virales por el gen terapéutico que se quiere utilizar. Lógicamente, para producir estos virus defectivos
debemos usar una línea célular (célula empaquetadora) que aporte los genes virales en trans. Estas
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células empaquetadoras tienen los genes virales insertados en el genoma celular, de modo que
expresan establemente las proteínas virales. Sin embargo, las copias de los genes virales que están
integradas en el genoma celular carecen de la señal de empaquetamiento, por lo que sus transcritos no
pueden empaquetarse en las nuevas partículas virales. De este modo, una célula empaquetadora en
condiciones normales no produce viriones completos, sino sólo partículas vacías. En cambio, cuando
transfectamos estas células con un plásmido recombinante que contenga el ADN terapéutico flanqueado
por los LTR y por la señal de empaquetamiento (además de otros elementos necesarios en cis como el
primer binding site, y el tracto polipurínico necesario para la síntesis de la segunda cadena) se
generarán partículas retrovirales recombinantes y defectivas, que pueden ser purificadas y concentradas
a partir de los sobrenadantes del cultivo celular. En este proceso es muy importante evitar la aparición
de retrovirus con capacidad replicativa, que podrían generarse por recombinación homóloga entre las
secuencias virales que están presentes en nuestro plásmido con las secuencias virales presentes en el
genoma de la célula empaquetadora. Por este motivo, se utilizan células empaquetadoras que tienen los
genes virales separados entre sí, de modo que serían necesarias varias recombinaciones independientes
para generar un virus replicativo, algo altamente improbable.
Figura 12.8 En este video se explica el ciclo replicativo de un
oncoretrovirus, así como el proceso de producción de retrovirus
recombinantes defectivos.
Los retrovirus recombinantes defectivos han sido muy utilizados en terapia génica. Por las limitaciones
propias del tamaño del genoma viral, el ADN terapéutico no puede ser mayor a 7-8 kb. Son vectores con
buena infectividad, un tropismo amplio, pero son bastante lábiles (lo que dificulta su purificación) y sólo
transducen eficazmente células que están en división. Además, son inactivados en el torrente sanguíneo
por el sistema del complemento, por lo que su principal uso ha estado reservado a estrategias de terapia
génica ex vivo. Su capacidad integrativa les permite alcanzar, en teoría, una duración muy larga de la
expresión incluso en células que estén dividiéndose activamente. Sin embargo, los promotores virales
suelen silenciarse por metilación, por lo que la expresión no es tan prolongada como cabría esperar. Se
está investigando la posibilidad de modificar el tropismo de estos vectores, mediante la creación de
proteínas de la envuelta quiméricas que incluyan algún scFv (anticuerpo monocatenario) u otros ligandos
de receptores celulares conocidos.
Como se ha mencionado, recientemente se han desarrollado vectores retrovirales basados en
lentivirus, aprovechando la circunstancia de que el HIV-1 es uno de los virus mejor estudiados. El
genoma de este virus contiene algunos genes (tat y rev, por ejemplo) que no están presentes en los
oncoretrovirus y que son esenciales para la expresión de los genes virales. Algunas de las proteínas
virales tienen señales de localización nuclear y facilitan la entrada del virus por los poros nucleares, de
ahí la capacidad que tienen estos virus de infectar células que no están en división. Aunque los
problemas de seguridad de los lentivirus están prácticamente superados, todavía hay que mejorar los
sistemas de producción para poder utilizarlos en pacientes con total seguridad. Su principal aplicación
está en la transferencia de genes a células del sistema nervioso in vivo, y a progenitores
hematopoyéticos ex vivo, siendo esta última una propiedad especialmente interesante por su inmenso
potencial terapéutico, y porque estas células son prácticamente intransfectables por otros medios.
b) Vectores adenovirales: Se conocen gran cantidad de serotipos de adenovirus humanos, pero los
más utilizados en terapia génica han sido los serotipos 2 y 5. Los adenovirus son virus ADN sin
envuelta, responsables de las principales enfermedades de vías respiratorias altas (el “catarro” común),
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con muy buen tropismo por células humanas. La nucleocápside de un adenovirus consta de una cápside
icosaédrica que está compuesta por 720 proteínas hexona y 60 proteínas pentona. De las pentonas
parte la proteína de la fibra (una proteína trimérica) que termina en una proteína “botón” (knob)
mediante la cual el adenovirus se une a receptores celulares específicos.
Figura 12.9 Estructura de una partícula adenoviral, con las hexonas,
pentonas y fibras. Tomada del sitio educativo de los premios Nobel.
El genoma adenoviral es un ADN de doble cadena de aproximadamente 35 kb de tamaño, flanqueado
por repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-140 nucleótidos y una señal de empaquetamiento
(psi) cerca del ITR izquierdo. Contiene gran cantidad de genes, que se agrupan en regiones tempranas
(early) y tardías (late), según el momento en que se transcriben después de la infección. Así, las
regiones tardías se transcriben tras la replicación del genoma viral, y contienen los genes que codifican
las proteínas estructurales del virus. En cambio, las regiones tempranas se transcriben antes de la
síntesis del ADN viral, y cumplen varias funciones:
las proteínas codificadas en E1 incluyen, por ejemplo, E1A (proteína necesaria para transactivar la
transcripción de los demás genes virales) y E1B 55kd (que se une a E4). Además, estas proteínas
interfieren con las funciones de la célula huésped: E1A es una oncoproteína, E1B 19kd inhibe la
apoptosis mediada por p53 y E1B 55kd promueve la degradación de p53.
la región E2 codifica proteínas necesarias para la replicación viral: ADN polimerasa, proteína
terminal, etc.
la región E3 codifica algunas proteínas que ayudan al adenovirus a escapar al sistema immune,
como la proteína gp19kd que inhibe la presentación de fragmentos antigénicos con moléculas de
clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad.
la region E4 codifica diversas proteínas que silencian genes endógenos, regulando el transporte de
ARN mensajeros fuera del núcleo.
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Figura 12.10 Estructura del genoma de un adenovirus.
El ciclo replicativo de un adenovirus es más sencillo que el de los retrovirus. El adenovirus se une a un
receptor de membrana específico denominado CAR (CoxackieAdenovirusReceptor) mediante el botón de
la fibra, y a continuación la pentona se une por un motivo RGD (arginina-glicina-aspártico) a integrinas
cercanas para después ser internalizado por endocitosis. La propia cápside adenoviral es capaz de
desestabilizar el endosoma, que se rompe y libera las partículas virales al citoplasma. Las nucleocápsides
llegan a la membrana nuclear y son capaces de introducir el genoma viral a través de los poros
nucleares.
Para generar adenovirus recombinantes defectivos (es decir, que lleven el ADN terapéutico pero no
puedan replicarse) se sigue una estrategia similar a la que veíamos para los retrovirus: substituir algún
gen viral por el gen terapéutico. Lo más habitual es delecionar el genoma viral en la región E1, para lo
que necesitaremos una célula empaquetadora que exprese de manera estable los genes contenidos en
esa región. La línea celular más utilizada como célula empaquetadora para construir adenovirus
recombinantes se denomina célula 293. Para conseguir el adenovirus recombinante, se cotransfectan
células 293 con dos plásmidos distintos: un plásmido en el que el gen terapéutico está flanqueado por
parte del gen E1, la señal de empaquetamiento y los ITR virales, y otro plásmido que contiene todo el
genoma viral excepto la señal de empaquetamiento y la región de E1 que está presente en trans en el
genoma de las células 293. Una vez dentro de la célula, los mecanismos de recombinación son capaces
de generar un genoma viral recombinante que llevará el gen terapéutico dentro del genoma viral (al que
le falta E1). Como el gen terapéutico va unido a la señal de empaquetamiento PSI, únicamente estos
transcritos se empaquetarán correctamente en las nuevas cápsides virales, mientras que los genomas
virales producidos endógenamente carecen de la señal PSI y por tanto no producen viriones infectivos.
Los adenovirus delecionados en E1 permiten insertar genes terapéuticos con un tamaño máximo de 5
kb, por lo que posteriormente se han generado vectores que llevan además deleciones en E3 y E4, para
conseguir llegar a una capacidad de 7-8 kb. La última generación de vectores adenovirales consiste en
los llamados adenovirus gutless (vacíos), en los que todo el genoma viral ha sido delecionado y por
tanto tienen una capacidad teórica en torno a las 30 kb de ADN exógeno. Para producirlos hay que
aportar en trans todas las funciones adenovirales necesarias, mediante plásmidos helper ó por
estrategias que utilizan el sistema Cre/loxP.
Figura 12.11 El proceso de producción de adenovirus recombinantes
defectivos se muestra en este video.
Los adenovirus comenzaron a usarse en terapia génica más tarde que los retrovirus, pero rápidamente
ganaron en popularidad y hoy en día son los vectores más utilizados para aplicaciones in vivo. Infectan
gran variedad de células, son relativamente estables y fáciles de purificar y concentrar, y son eficaces
tanto sobre células quiescentes como sobre células en división. Como el genoma del vector no se integra
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en el genoma de la célula huésped, la duración de la expresión en células en división es limitada. Su
principal inconveniente es la toxicidad que producen a dosis altas, y la fuerte respuesta inmune celular y
humoral que sigue a su administración, con la consiguiente disminución de eficacia terapéutica. Los
nuevos vectores adenovirales “vacíos” superan algunos de estos inconvenientes.
c) Vectores Virales Adenoasociados: Se trata de Parvovirus que infectan al hombre pero no son
patógenos. Pertenecen al grupo de los Dependovirus, virus ADN sin envuelta que necesitan de funciones
helper para completar su ciclo replicativo completo. Estas funciones helper las aporta un adenovirus o un
herpesvirus que sobreinfecta las mismas células que previamente habían sido infectadas por un
dependovirus. El genoma de un virus adenoasociado es un ADN monocatenario con un tamaño de 4,8
kb y una estructura muy simple, con dos regiones codificantes: cap, que codifica las tres proteínas de la
cápside, y rep, que codifica 4 proteínas necesarias para la replicación viral. El genoma está flanqueado
por dos repeticiones terminales invertidas (ITR), que forman unas estructuras en horquilla y que son los
únicos elementos necesarios en cis para poder llevar a cabo el ciclo vital del virus.
Figura 12.12 Estructura del genoma de un adenoasociado.
La infección por un virus adenoasociado comienza por la unión del virus a receptores celulares y su
entrada en la célula. El genoma viral es capaz de entrar en el núcleo incluso en células que no se
dividen, y una vez allí se convierte a doble hebra y se integra en un locus específico localizado en el
brazo largo del cromosoma 19 humano (banda 19q13). Todas estas funciones están mediadas por
proteínas de la célula huésped, pero además se ha comprobado que las proteínas virales Rep78/68 son
necesarias para la integración específica del genoma viral en una secuencia llamada AAVS1 que está en
19q13. En ausencia de funciones helper, el genoma viral integrado permanecerá como un provirus, en
forma latente. Ante una sobreinfección por adenovirus ó herpesvirus, el adenoasociado comienza su fase
lítica con la transcripción de los genes virales, la replicación del genoma viral y el empaquetamiento en
las cápsides para dar lugar a nuevos viriones. Para obtener virus adenoasociados recombinantes
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como vectores en terapia génica, se construye un plásmido recombinante que contiene el gen
terapéutico flanqueado por los ITR virales. En el método clásico de producción de estos vectores, se
cotransfectan células 293 con el plásmido recombinante y con otro plásmido que aporta en trans las
funciones cap y rep, y después se infectan esas mismas células con un adenovirus. El problema de este
procedimiento es que los preparados virales tienen una fuerte contaminación por adenovirus, por lo que
es necesario inactivar este adenovirus contaminante mediante tratamiento con calor. Los métodos
actuales de producción evitan este problema al aportar las funciones helper del adenovirus en un tercer
plásmido que se cotransfecta con los otros dos, de forma que la generación de adenovirus maduros es
prácticamente imposible.
Figura 12.13 El siguiente video muestra el ciclo replicativo de un AAV y la
estrategia para la producción de AAV recombinantes defectivos.
Los vectores adenoasociados están ganando popularidad rápidamente por sus extraordinarias
características: buena infectividad, integración en el genoma de la célula huésped, muy baja toxicidad y
ausencia de respuesta inmune celular frente a las proteínas virales. Por desgracia, la especificidad de la
integración en un locus concreto se pierde en los virus adenoasociados recombinantes, ya que no se
produce Rep68/78 (que es absolutamente necesaria para que tenga lugar esta integración específica).
En consecuencia, la integración se realiza al azar, como en el caso de los retrovirus. Los virus
adenoasociados pueden transducir células mitóticas o células en división, y están especialmente
indicados en aplicaciones in vivo en las que se requiere una expresión prolongada del gen terapéutico.
d) Otros vectores virales que actualmente están ganado en popularidad son los Herpesvirus, basados
en el virus del herpes simplex (HSV), que tienen un marcado tropismo neuronal y por eso se emplean
fundamentalmente para la transferencia de genes al sistema nervioso. Los HSV son virus envueltos con
un genoma lineal de 152 kb de ADN bicatenario, en el que se han identificado más de 80 genes. El
genoma está dividido en dos regiones únicas (Larga y Corta) que están flanqueadas por repeticiones
terminales (TR) y repeticiones internas (IR). El virus se une a glicosamino-glucanos celulares y a
receptores celulares específicos (por ejemplo, el receptor HveC, que pertenece a la superfamilia de las
inmunoglobulinas y se expresa a alto nivel en el sistema nervioso). Tras la entrada en la célula, el virus
avanza por transporte retrógrado y llega al núcleo, penetrando por los poros nucleares. Después de
entrar en el núcleo se expresan los genes inmediatos tempranos, que activan la expresión de los genes
tempranos (necesarios para la síntesis de ADN viral) y de los genes tardíos (proteínas estructurales).
Una característica importante es que uno de los genes inmediatos tempranos (ICP4) es absolutamente
necesario para la replicación viral, por lo que basta eliminarlo del genoma para obtener virus defectivos.
En los vectores actualmente en uso se han delecionado todos los genes inmediatos tempranos, por lo
que son totalmente apatogénicos.
Otra característica importante de estos virus es que cuando no se replican entran en un periodo de
latencia en el que se transcriben únicamente unos transcritos asociados a latencia (LATs), aunque no se
expresen los genes inmediatos tempranos. Por tanto, incluyendo la unidad transcripcional en la región
de latencia se pueden obtener virus defectivos que expresan de forma persistente un gen terapéutico.
Además, se trata de vectores de gran capacidad porque permiten acomodar hasta 50 kb de ADN
exógeno.
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Figura 12.14 Estructura del genoma de un virus del herpes simple.
2. Los Vectores no-virales representan un intento de imitar las funciones de los virus como vehículos
de transferencia génica mediante sistemas sintéticos, de forma que en principio son vectores mucho
más seguros desde el punto de vista de su peligrosidad biológica y su patogenicidad. En este sentido,
los vectores no-virales no se diferencian conceptualmente de los fármacos a los que estamos
habituados. La principal limitación de este tipo de vectores es que, en la actualidad, su eficacia in vivo es
mucho menor que la de los vectores virales. Esto se debe a la inestabilidad propia de sistemas sintéticos
complejos y a las diferentes barreras que han de superar:
Los complejos entre el ácido nucleico y los demás componentes de estos sistemas han de ser
estables tras su administración, y no desintegrarse antes de alcanzar las células. Por otra parte, la
biodistribución de estos preparados hace que la concentración efectiva en las células diana sea baja,
por lo que es importante que lleven en su superficie algún tipo de ligando para receptores
específicos de las células a las que lo queremos enviar.
Habitualmente, estos complejos entran en las células por endocitosis, de manera que quedan
expuestos al ataque de las enzimas lisosomales. Para evitar esto, se intenta incluir en estos
vectores algún tipo de molécula que altere el pH del endosoma y consiga romperlo antes de su
fusión con los lisosomas y liberar así el complejo intacto al citoplasma. Estas moléculas suelen ser
péptidos o proteínas virales que cumplen esta misma función en algunos tipos de virus. Una vez en
el citoplasma, estos complejos han de ser lo suficientemente estables como para llegar hasta el
núcleo, pues si el ácido nucleico se libera muy pronto será degradado por nucleasas citoplasmáticas.
Pero si son demasiado estables, el ácido nucleico no conseguirá liberarse y por tanto no podrá
entrar en el núcleo de la célula. Este compromiso entre protección y liberación es quizás uno de los
retos más importantes que tienen que superar los vectores no virales para aumentar su eficacia
actual.
En cierta medida, la inclusión en estos complejos de alguna molécula capaz de dirigirlos al núcleo
celular serviría para acelerar su tránsito citoplasmático. Por tanto, otro componente habitual en los
CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 13
vectores no virales son las moléculas con señales de localización nuclear que además permitan la
entrada del ácido nucleico a través del complejo del poro nuclear, pues de lo contrario sólo serán
capaces de ser efectivos en células que estén en mitosis.
Como se ve, la tarea de construir un vector no-viral “ideal” equivale a intentar reconstruir en el
laboratorio lo que los virus consiguen de manera natural, lo cual no es en absoluto sencillo. En cualquier
caso, son uno de los campos de investigación más activa, sobre todo por parte de empresas
farmacéuticas y de biotecnología, y es previsible que los próximos años vean avances significativos en
este terreno. Actualmente, los vectores no-virales más utilizados son los siguientes:
a) Inyección Directa: Lógicamente, lo más sencillo es injectar directamente el ácido nucleico (ADN
desnudo) en el órgano de interés. Aunque poco eficaz, este procedimiento funciona razonablemente en
ciertas aplicaciones y en algunos órganos. Por ejemplo, el músculo esquelético es uno de los órganos
que más eficazmente incorporan un plásmido inyectado, alcanzando niveles de expresión suficientes
para conseguir inmunización frente a proteínas virales, tumorales, etc. En ocasiones se utiliza la
inyección de ADN formulado con diversos polímeros (sobre todo poli-vinil-pirrolidona) que lo protegen
de la acción de las nucleasas y prolongan su vida media tras la administración. También se utiliza el ADN
encapsulado en microesferas de polímeros biodegradables (por ejemplo, copolímeros de ácido láctico y
glicólico), que pueden inyectarse en un órgano y proporcionar liberación sostenida del ácido nucleico
terapéutico durante un periodo de tiempo más o menos prolongado, dependiendo del tipo de polímero
utilizado. Otra variedad es la transferencia génica balística (pistola génica o “gene gun”), en la que el
ácido nucleico terapéutico se adsorbe sobre la superficie
de una bolas microscópicas de oro u otro metal inerte,
que son disparadas a presión sobre el órgano diana. Es
una vía de administración utilizada en la piel (para
inmunización génica) o a veces sobre otros órganos, pero
las bolas no tienen un gran poder de penetración
(raramente superior a unos pocos milímetros).
Figura 12.15 Transferencia génica por
inyección intramuscular directa.
b) Complejos formados por el ácido nucleico terapéutico y otros componentes: son los sistemas más
complicados de elaborar y optimizar, pero los más eficaces dentro de los vectores no-virales. El principio
que subyace a todos los sistemas de este tipo es la complejación del ADN (molécula grande con alto
número de cargas negativas) con polímeros de naturaleza catiónica (con cargas positivas), de manera
que la neutralización de cargas da lugar a complejos más o menos estables, de pequeño tamaño, en los
que el ADN está protegido de la acción de nucleasas. Suele distinguirse entre lipoplexos (cuando el
ADN se compleja con lípidos catiónicos) y poliplexos (ADN complejado por policationes, habitualmente
poli-lisina o poli-etilén-imina). Sobre la estructura básica de un lipoplexo o un poliplexo pueden añadirse
otro tipo de moléculas que actúen como estabilizadores, ligandos para receptores específicos, moléculas
desestabilizadoras del endosoma, señales de localización nuclear. Por ejemplo, se ha utilizado poli-
etilén-glicol para aumentar la estabilidad de lipoplexos en el torrente sanguíneo y evitar la inactivación
por el suero. Asimismo, ha sido muy utilizada la unión de poli-lisina a transferrina o a orosomucoide,
para conseguir unión específica a receptores hepáticos. Otra estrategia utilizada con bastante éxito ha
sido la formación de lipoplexos que además incluyen partículas del virus hemaglutinante del Japón
CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 14
(virus Sendai) inactivados, lo que proporciona una entrada en las células muy eficaz (por la
fusogenicidad del virus Sendai) y buen escape endosomal.
Figura 12.16 Este video muestra la combinación de vectores virales y no
virales, con un ejemplo tomado del virus hemaglutinante del Japón (virus
Sendai).
La siguiente Tabla resume las principales características de los vectores que se han mencionado:
Como resumen de todo lo dicho acerca de vectores, podemos concluir diciendo que el vector “ideal” de
terapia génica debería ser fácil de preparar, tener gran capacidad para aceptar genes terapéuticos de
gran tamaño, funcionar tanto en células en división como en células quiescentes, ser totalmente
inocuo e “invisible” para el sistema inmune, fácilmente dirigible a distintos tipos de células diana, ser
capaz de persistir en las células durante periodos prolongados y poseer elementos reguladores de la
transcripción del gen terapéutico que sean fácilmente regulables para poder variar los niveles del
producto terapéutico según sea necesario. Hay numerosos ejemplos de cómo se han conseguido mejorar
los distintos tipos de vectores para dotarlos con alguna de estas propiedades. Por ejemplo, los retrovirus
se han podido pseudotipar con las proteínas de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular para
modificar su tropismo. Igualmente, se ha modificado la proteína “botón” de la fibra de los adenovirus
mediante anticuerpos bi-específicos o por modificación genética. Los vectores no virales se han
glicosilado para ser selectivamente reconocidos por receptores específicos presentes en distintos tipos
celulares. También se han construido sistemas de transcripción regulables muy efectivos, que se pueden
incorporar en los distintos tipos de vectores.
Aplicaciones clínicas de la terapia génica
Desde el caso de la niña Ashanti Da Silva, primer paciente de la historia tratado mediante terapia génica
en 1989 por sufrir Inmunodeficiencia Combinada Severa (déficit del enzima adenosín-desaminasa), el
número de ensayos clínicos llevados a cabo en todo el mundo ha aumentado rápidamente, de manera
que en la actualidad hay varios miles de enfermos incluidos en protocolos clínicos de terapia génica.
Como las estrategias utilizadas son variadísimas, a continuación se resumen las más utilizadas hasta el
momento:
Retrovirus Adenovirus AAV No virales
Tamaño máximo teórico 7-8 kb 7-8 kb (30 kb) 5 kb No límite
Títulos alcanzados durante la preparación (partículas/ml)
108/ml 1012/ml 1011/ml No límite
Administración preferente Ex vivo Ex/in vivo Ex/in vivo Ex/in vivo
Integración en el genoma Si No Si/No Mínima
Duración expresión in vivo Corta Corta Larga Corta
Inmunogenicidad Poca Mucha Poca Nada
Inmunidad previa Improbable Si Si No
Problemas de seguridad Mutagénesis Inflamación Toxicidad
Mutagénesis Ninguno
CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 15
Terapia génica del cáncer: la estrategia más utilizada es, sin duda, la utilización de los llamados
genes suicidas. Se trata de transferir a las células tumorales un gen que codifique una proteína capaz
de activar un pro-fármaco inactivo a su forma activa. Es muy popular la utilización del gen de la timidín-
kinasa del virus del Herpes Simplex (HSV-tk), que codifica una timidín-kinasa capaz de fosforilar el
ganciclovir a ganciclovir-trifosfato. El ganciclovir tri-fosfato es la forma activa capaz de interferir con la
replicación del ADN y provocar la muerte de las células que están dividiéndose activamente. Por tanto, si
somos capaces de transferir el gen de la HSV-tk a las células de un tumor, que tienen una alta tasa
replicativa, la administración sistémica de ganciclovir conseguirá matar selectivamente las células
tumorales. Una ventaja añadida es el llamado efecto espectador (bystander), mediante el cual la timidín-
kinasa producida en unas células puede pasar a las células vecinas, de forma que aunque no todas las
células tumorales hayan incorporado el gen terapéutico, el efecto citotóxico es bastante homogéneo en
todo el tumor. Esta estrategia se ha empleado en tumores cerebrales, usando vectores retrovirales para
transducir sólo células tumorales (en división) pero no neuronas (que no se dividen). También se ha
empleado con éxito en tumores hepáticos, usando en este caso vectores adenovirales.
Otra estrategia utilizada en terapia génica del cáncer se basa en la suplementación de las células
malignas con genes supresores tumorales (p53, por ejemplo). Se ha utilizado también la
transferencia al tumor de genes que inhiben la angiogénesis (endostatina, angiostatina, etc) para
eliminar el tumor por falta de aporte vascular. Por último, una de las estrategias que han tenido más
éxito y que ofrecen mejores perspectivas de futuro es la inmunopotenciación, es decir, favorecer la
puesta en marcha de una respuesta inmune frente a las células tumorales. En este sentido, se han
transferido los genes de gran variedad de citoquinas o moléculas inmunopotenciadoras (IL-2, IL-12, GM-
CSF, IFN- , TNF , etc.) tanto a células tumorales como a células presentadoras de antígeno (células
dendríticas), o bien se han transferido a las células tumorales los genes de moléculas co-estimuladoreas
del complejo mayor de histocompatibildad (por ejemplo, B7.1) para favorecer la presentación de los
antígenos tumorales.
El video de la Figura 12.17 muestra algunos ejemplos de utilización de
terapia génica frente al cáncer.
Terapia génica de enfermedades hereditarias: la mayoría de las enfermedades metabólicas debidas
a mutaciones inactivantes en genes que codifican proteínas con actividad biológica (un enzima, un factor
de coagulación, una hormona, etc) pueden abordarse mediante una estrategia de suplementación génica
que restaure los niveles de la proteína deficiente. Por ejemplo, se ha utilizado la transferencia génica al
músculo para conseguir la producción local de distrofina en casos de distrofia muscular de Duchenne. De
manera similar, se han transferido genes al músculo o al hígado para que estos órganos secreten al
torrente circulatorio un factor que está ausente. En este sentido, ha tenido especial resonancia el éxito
alcanzado con la transferencia mediada por virus adenoasociados del gen del factor IX de la coagulación
al músculo esquelético, para producir niveles plasmáticos de este factor que puedan corregir los defectos
en la coagulación que sufren animales hemofílicos. En los últimos años, hemos asistido a importantes
avances en este campo, como la curación de dos niños con adrenoleucodistrofia, la restauración de la
visión tricromática en monos daltónicos, la curación de un paciente adulto con talasemia, la reparación
de una mutación causante de hemofilia mediante nucleasas de dedos de zinc, o la curación de 13 “niños
burbuja”.
CAPÍTULO 12: TERAPIA GÉNICA 16
Inmunización frente a enfermedades infecciosas mediante transferencia génica, con el fin de que las
células sinteticen péptidos inmunogénicos y estimulen al sistema inmune hasta eliminar el agente
patógeno. Se están ensayando inmunizaciones génicas frente a virus (virus B y virus C de la hepatitis,
virus de la gripe) u otros agentes, como el parásito de la malaria. Es bastante eficaz la inyección directa
de un plásmido en músculo o la transferencia intradérmica mediante pistola génica. En general, la
eficacia de estos tratamientos reside en la capacidad de producir localmente una proteína que sea
liberada y capturada por macrófagos y otras células presentadoras de antígenos, que procesan esas
proteínas a pequeños péptidos y los presentan con moléculas de clase II del sistema mayor de
histocompatibilidad (MHC) para estimular las células CD4+ (linfocitos T helper). Además, si las células
transfectadas expresan moléculas de clase I del MHC también podrán presentar los péptidos recién
sintetizados y estimular células CD8+ (linfocitos T citotóxicos).
Tras más de 20 años de trabajo, la terapia génica está comenzando a demostrar su utilidad clínica en
humanos, como se ha visto en los párrafos anteriores. De todas formas, aún será necesario esperar a los
resultados de los ensayos clínicos que están en marcha en todo el mundo. En 2012 había 1843 ensayos
clínicos activos, el 79% de ellos en fase I (estudio de toxicidad) ó fase I/II. El resto son ensayos en fase
II (estudio de eficacia terapéutica) o en fase III, y dos están ya en fase IV. Las tablas siguientes,
tomadas del sitio web del Journal of Gene Medicine, agrupan estos ensayos por tipos de enfermedad,
vector o molécula terapéutica:
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