cap 6 recuento en suelo nmp rev 2013

8/18/2019 Cap 6 Recuento en Suelo NMP Rev 2013

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MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA - Tomo II: Microbiología Ambiental IIManacorda A. M., Álvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P. Año 2013

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Capítulo 6

RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETEROTROFOS TOTALESEN SUELO

Objetivo

Determinar el tamaño de la población de diferentes tipos de suelo mediante la Técnicade Recuento del Número más Probable (NMP).

Introducción

El suelo representa uno de los hábitats microbianos más significativos, tanto en términos debiomasa como de actividad microbiana. El suelo alberga gran riqueza de especies vegetales,animales y microbianas. Los microorganismos del suelo son los que mantienen activo el ciclode los nutrientes de los compuestos químicos más importantes – C, N, S, P – que las plantasrequieren para su crecimiento. Entre los organismos del suelo se establecen interacciones quecontribuyen en las características propias del suelo.

La actividad microbiana del suelo refleja las reacciones bioquímicas que suceden dentro deeste complejo y heterogéneo sistema. Los mismos tienen funciones claves en el equilibrio delecosistema.

Este ambiente alberga una gran cantidad de microorganismos que se nutren de los exudadosradiculares, ricos en aminoácidos, ácidos orgánicos y factores de crecimiento, como asítambién favorece distintos tipos de interacciones biológicas. Los microorganismos sonfundamentales en los procesos biológicos y como promotores del crecimiento vegetal.

La distribución de los microorganismos en el suelo siguen patrones de agregación y es muydinámica. En ella influyen factores intrínsecos (relacionados con características de cadamicroorganismo) y factores extrínsecos (aquellos que proceden del ambiente). Esto factores

que regulan la distribución de los microorganismos desde el ambiente son: estructura del suelo,disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, el potencial redox y la disponibilidad de materiaorgánica.

La rizósfera es la región del suelo cercano a las raíces de las plantas, y es considerado unambiente apropiado para el desarrollo de los microorganismos por la presencia exudadosradicales y humedad, como dos principales características. En la rizósfera ocurren importantesinteracciones microbianas que implican el intercambio o la competencia por nutrientes y hábitat. Algunas son relaciones simbióticas, por ejemplo entre bacterias u hongos con las raíces de lasplantas (micorrizas, nódulos para la fijación de nitrógeno) y otras son relaciones antagónicas,como ser predación (protozoos – bacteria), amensalismo (producción de antibióticos) yparasitismo (hongos que atacan las raíces de las plantas).

La composición de los microorganismos del suelo es muy diversa, encontrándose bacterias,hongos, actinomicetos, protozoos y algas. La población bacteriana heterótrofa aerobia estácompuesta principalmente por géneros gram positivos, siendo la mayoría de los génerosClostridium, Bacillus, Arthobacter . La población gram negativa generalmente está compuestapor los géneros Pseudomonas, Flavobacterium, Rizobium, Azospirilum, entre otros. Losactinomicetes característicos del suelo pertenecen al género Streptomices y Nocardia, tienenfunciones importantes en la descomposición de materia orgánica y producción de antibióticos.Los hongos contribuyen en gran medida a la biomasa microbiana del suelo, en cuanto a tamañode la población, diversidad y funciones. Los géneros más comunes son Penicillium, Aspergillus,Fusarium, Cladosporium, Mucor , entre muchos otros.

Es importante, además, tener en cuenta que cuando microorganismos indeseables penetran enel suelo pueden cambiar sus propiedades, desequilibrando la distribución y el orden de la

comunidad nativa. La presencia de microorganismos patógenos implica un riesgo para la salud,por la posible transmisión de enfermedades por el contacto con dicho suelo


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El reconocimiento de esta diversidad de microorganismos en el suelo, y el estudio de susfunciones contribuye al conocimiento global del ambiente, incluyendo su interacción con laatmósfera y ecosistemas acuáticos, lo que reviste un pilar fundamental para lograr ecosistemassustentables.

Técnica de Recuento del Número Más Probable

Las técnicas del Número Más Probable (NMP) se basan en el concepto de que el nivel dedilución de la muestra original necesaria para obtener un resultado negativo en un medio decultivo particular está relacionado con el tamaño de la población en la misma. El número demicroorganismos obtenido está determinado por fórmulas de probabilidad, un cálculo de ladensidad media de microorganismos heterótrofos en la muestra.

En este caso el interés está puesto en los microorganismos con un metabolismo heterótrofo porlo tanto el medio de cultivo particular a utilizar es el caldo Nutritivo. Por las características desus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en susrequerimientos nutricionales.

caldo Nutritivo

Pluripeptona 5 grExtracto de carne 3 gr Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 6,9 ± 0,2

Procedimiento

Se pesa 1 g de la muestra de suelo a examinar y se diluye en un tubo de ensayo que contenga9 ml de agua destilada (A.D) estéril. A dicho tubo se lo rotulará “10 -1“. Esto corresponde alprimer nivel de dilución (1:10).Se agita en el vórtex la primer dilución y se toma 1 ml del sobrenadante con una pipeta estéril,agregando dicho volumen a un segundo tubo con A.D estéril. Este tubo será rotulado como 10 -2 (1:100), correspondiente al segundo nivel de dilución.

Se procede realizando las diluciones sucesivas hasta obtener una dilución 1:10.000.000.000,que será la dilución 10 -10.De esta manera se espera que los primeros tubos tengan mayor concentración microbiana yque en los últimos tienda a cero.Una vez que se dispone de las diluciones de las muestras, estos 10 tubos conteniendo lasolución del suelo, se procede a sembrar una alícuota de cada uno de ellos en caldo nutritivo(fig 1). Se toma con una pipeta automática 0,1 ml de cada dilución, el procedimiento se realizapor triplicado. En este caso se siembran tres tubos para cada dilución aunque se pueden utilizartambién cinco réplicas de cada uno de ellos, lo que disminuye el desvío.Los tubos sembrados se incuban durante 7 días a 20 ºC. Finalizado este tiempo se procede arealizar el recuento.


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Fig. 1: Diluciones seriadas y siembra en caldo nutritivo por triplicado

Cálculo del Número mas Probable

Al cabo de una semana se leen los resultados, tomándose como positivos a aquellos tubos condesarrollo (se ven turbios debido a la proliferación de microorganismos).Se toma nota, para cada dilución, del número de tubos positivos (+) y se obtiene un númeroca rac teríst ic o representado por tres cifras. El primer dígito del número característicocorresponderá al menor nivel de dilución en el que todos los tubos sean positivos.

Una vez que se ha obtenido el número característico, con el mismo se ingresa en la tabla y selee el número más probable de microorganismos. En este caso, en el que el inóculo de partidaes un gramo de suelo, se refiere el número final al peso seco de la muestra. Para ello se deberácalcular la humedad de la misma (ver “Nota”). Al número obtenido se lo multiplica por la inversa de la dilución (dilución de donde se obtuvo el primer dígito del número característico).

En la tabla de Mc Crady figuran todas las combinaciones posibles para las que se ha calculado,mediante un método estadístico, el número más probable de microorganismos presentes en lamuestra.

Tabla de Mc Crady (para tres réplicas por dilución)

Númerocaracterístico

Número deM.O.*


Número deM.O.*


Número deM.O.*

000 0,0 201 1,4 302 6,5

001 0,3 202 2,0 310 4,5010 0,3 210 1,5 311 7,5

Nota: debe tenerse en cuenta que la muestra utilizada siempre tiene cierto nivel dehumedad, por lo tanto los resultados obtenidos están en relación con un gramo de pesohúmedo y deberán referirse a un gramo de peso seco. Para ello se toman 5 g de la muestrasembrada, se lleva a estufa, a 100 ºC durante 48 hs., y se toma el nuevo peso de dichaporción. Con estos datos se calcula el porcentaje de humedad de la muestra de suelo paraluego corregir el número de bacterias hallado.


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011 0,6 211 2,0 312 11,5020 0,6 212 3,0 313 16,0100 0,4 220 2,0 320 9,5101 0,7 221 3,0 321 15,0102 1,1 222 3,5 322 20,0110 0,7 223 4,0 323 30,0

111 1,1 230 3,0 330 23,0120 1,1 231 3,5 331 45,0121 1,5 232 4,0 332 110,0130 1,6 300 2,5 333 140,0200 0,9 301 4,0 * M.O : microorganismos

En la siguiente tabla se indican, a modo de ejemplo, los resultados obtenidos para dos siembrasdistintas con tres repeticiones para cada nivel de dilución.

Nivel de dilución 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - Ejemplo 1 +++

(3)

+++

(3)

+++

(3)

+++

(3)

+--

(1)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)Ejemplo 2 +++(3)

++-(2)

++-(2)

---(0)

---(0)

---(0)

---(0)

---(0)

---(0)

---(0)

Ejemplo 1: número característico 310 (para la dilución 10 -4)Ejemplo 2: número característico 322 (para la dilución 10 -1)

Número característico N.M.P de microorganismosEjemplo 1 310 4,5Ejemplo 2 322 20

A este número obtenido de la tabla debe multiplicárselo por la inversa de la menor dilución en

la que se han hallado 3 (+), es decir que corresponde a la dilución de la primer cifra del númerocaracterístico.

Ejemplo 1: 4,5x10 4 bacterias/g de suelo húmedoEjemplo 2: 20x10 1 bacterias /g de suelo húmedo

Además, como se señaló anteriormente, a este valor se lo debe corregir en función delporcentaje de humedad de la muestra.

Bibliografía

American Public Health Association (APHA), American Water Works Association & WaterPollution Control Federation. 1989. Standard Methods for the examination of Water andWastewater. 17th ed. APHA, Washington, D.C.USA. Part 9000.

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