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BUENAS PRACTICAS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES
Serie de seminarios web sobre Buenas Practicas Instrumentales de Agilent
Jose Juan RiveroEspecialistas de producto
Agilent Technologies, Spain
14 de abril de 2020
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b
La cromatografíaes un métodode separaciónfísico.
En cromatografía de gases, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil .
Los componentes se separan debido a la diferencia de afinidadcon la faseestacionaria.
La fase móvil introducelos analitos en la columna y a través del sistema.
Como fáse móvil se utilizan gases inertes (gas portador).
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Técnica que separa mezclas en componentes individuales.
Objetivo: Identificar componentes y medir sus concentraciones
Es una separación en el tiempo: este tiempo de separación es característico del compuesto.
El Area o la Altura de este pico da idea de su concentración
B
Separación de
compuestos, y
Flujo
A
C
D
Requirimientos de la muestra en cromatografía de gases
Suficiente Volatilidad:
Las macro moléculas generalmente no tienen suficiente volatilidad (no pasan a fase gas
en las condiciones instrumentales).
Libre de residuos:
Esta es una extensión del primer requerimiento. Las impurezas no
volátiles en la matriz de la muestra puede derivar en contaminación
del inyector y columna que degradará rápidamente la
cromatografía.
Estabilidad térmica:
Los compuestos de interés no se deben degradar cuando se
introducen en el inyector a alta temperatura (por encima de 300°C) o en la columna (por
encima de 350°C).
• El 10-20% de todos los compuestos son adecuados para análisis por GC
Cromatografía de gases❑ Tipo de gas portador❑ Tipo de inyector de la muestra❑ Tipo de columna❑ Tipo de detector
La muestra determina la configuracióndel instrumento, es decir:
Gases
Sistema para introducción de la muestra
Columna
Detector
Adquisición de datos
Componentes de un cromatógrafo de gases
GASES PORTADORES
Para la utilización del gas comprimido con seguridad: Seguir las normas de seguridad del Dpto. de seguridad de la empresa
o las suministrada por el proveedor local
Los gases portadores más comunes son:
• Elegirse considerando el tipo de detector utilizado
• Ser inertes
• Secos
• Puros
Los gases deben:
Gases portadores y de soporte del detector
Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.
Tipos de gases portadores
Antiguamente se utilizaban controladores manuales
Actualmente se utiliza Controladores electrónicos de la presión:
•Mayor precisión en la presión
•Trabajo más sencillo
Control del gas portador
INYECTORES
Slide 11
Función: Introducir la muestra en el cromatógrafo de manera repetitiva y reproducible.
La inyección debe ser rápida, para evitar ensanchamiento del pico y la discriminación
La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambiosquímicos.
Tipos de inyectores:
•Split/Splitless
•Empaquetadas con purga (Purged Packed)
•Refrigeración en columna (Cool on-column)
•Vaporización a temperatura programada PTV y MMI
• Interfase de volátiles
Inyectores
Inyector “Split/Splitless” (con/sin división)
Modo “Split”
Análisis de comp. principales
Modo “Splitless”
Análisis de trazas de comp.
(ENTRADA)
(SEPTUM)
SALIDA DE SPLIT
FLUJO TOTAL
COLUMNA
= GAS PORTADOR
= MOLECULAS DE MUESTRA
= MOLECULAS DISOLVENTE
SALIDA DE PURGA
VALVULA DE PURGA
La vaporización tiene lugar cuando se
transfiere suficiente energía térmica a la
muestra. Esto puede ocurrir en el gas
portador, pero es más probable durante el
contacto con una superficie sólida, como el
liner o el medio de mezcla.
Típicamente los inlets se mantienen a temperaturas
elevadas (>175°C hasta350°C dependiendo de la
temperatura de vaporización de la muestras
SP
LIT
MO
DE
Para que el concepto de SPLIT RATIO (Relación
de Split) sea válido, la muestra (disolvente +
analito) debe mezclarse con el gas portador y
generar una mezcla homogénea.
Al fondo del puerto de inyección, una pequeña
parte de esta mezcla se transferirá a la columna,
mientras el exceso de la mezcla salga del
cromatógrafo por la Salida de “SPLIT”
Split
1:20
Splitless
•La válvula de purga está cerrada durante la inyección (no hay flujo enla válvula de split)•En un tiempo específico después de la inyección, la válvula de purga se abre para eliminar vapores remanentes en el inlet.
SP
LIT
LE
SS
MO
DE
Solvent Effect:
SOLVENT BOILING POINT INITIAL OVEN TEMP
( ºC) ( C)o
DICHLOROMETHANE
CHLOROFORM
CARBON DISULFIDE
DIETHYL ETHERPENTANEHEXANE
ISO-OCTANE
40
61
46
35
36
69
99
10-30
25-50
10-35
10-25
10-25
40-60
70-90
S
SS
SS S
S S SS
S S
SS
S SS S
S
S
S
S
S
S SS
SS
S
S
S
SS
SS
S S SS
S
SSS
S
S
S
S
S
S
S
S SS
S SS
S
S
SS
S
AA
A AA
A
A
A AAA
A
A
AA
A = ANALYTE
S = SOLVENT
Temperatura inicial del horno se mantiene
CONSTANTE por debajo del punto de ebullición del
disolvente para condensar y FOCALIZAR la muestra
Cuando se requiere Máxima
Sensibilidad ➔ Trabajar en
modo “Splitless”
(Trace Component Analysis)
Inlet Modo “Splitless” (sin división)
Volumen del liner normalmente menor de 900 microlitros.
Si el volumen de expansión del disolvente excede este volumen tendremos problemas de reproducibilidad.
Liners
https://www.agilent.com/en/support/gas-chromatography/sslinerselect
Expansión de disolventes comunes
Solvent Vapor Volume Calculator
https://www.agilent.com/en/support/gas-chromatography/gccalculators
Procedimiento:
• Elegir el disolvente
• Elegir el liner
• Jugar con:
• Volumen de inyeccion
• Temperatura inyector
• Presion de inyector
Capacidad de programación de temperatura
Flexibilidad en los volúmenes de inyección
Análisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección para compuestos con alto peso molecular
Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen
Disminuye pasos de preparación de muestra
Mayor productividad
Compatibilidad con Tecnología de flujo Capilar
Venteo de disolventes y uso de Backflush
Otros tipos de inyección: Inyector Multimodo (PTV)
Mismas precauciones que SSL
COLUMNA
El Corazon de la cromatografía
Eficiencia de columna (N, número deplatos teóricos) Más eficiente, picos másestrechos
Resolución de columna Una columnade alta resolución separa los picos hastala línea base. La columna largaproporciona más resolución (pero mástiempo y más costo).
Selectividad de columna. Depende dela columna
Objetivo principal de la columna
Producir picos estrechos y bien separados en una mezcla compleja
Columna
Empaquetadas Capilares
Recubiertas
PACKED MEGABORE 530 NARROW BORE
Length (m) 0.5-10 5-100 5-100
I.D. (mm) 2-4 0.53 0.1-0.25
Tubos rellenos
Tipos de columna
Polysiloxane polymers: ex: HP-5. Separa
apolares y moderadamente
polares
(Separacion porpuntos de ebullidcion)
Polyethylene glycol: WAX columns. Separacompuestos polares, acidos, alcoholes, etc
(Columnas polares)
PLOT Columns: Columnas para separaciones
especiales, gases a temperatura ambiente
Fases estacionarias
http://selectgc.chem.agilent.com/
Temperatura y FlujoPoder
programar cambios de
flujo.
Poder trabajar a flujo
constante
Columna 25m*0.2mm - He 141 Kpa
• flujo a 50ºC: 1.0 ml/min
• flujo a 150ºC: 0.6 ml/min
• flujo a 300ºC: 0.4 ml/min.
Poder reducir tiempos de
análisis
Trabajando a flujo constante o incrementando flujo
El sistema EPC ofrece la posibilidad de autoprogramar cambios de
presión de acuerdo con la programación de temperatura para
mantener flujo constante.
Mejorar la sensibilidad
de picos muy retenidos
Salen antes y por consiguiente más finos y con mayor altura.
Poder cromatografiarproductos más
pesados
Incrementando el flujo en la zona final.
La separación depende mucho de la temperatura de la columna. Se realizan rampas para acelerar el análisis.
La columna tiene una temperatura máxima: isotérmica y programada.
No dejar la columna más de 10 minutos de la tempprogramada
PV=nRT
DETECTORES
Un detector es un dispositivo que modifica un
comportamiento a la presencia de un
componente diferente del gas portador, y convierteesa información en una
señal eléctrica.
Detector de conductividad térmica (TCD)
Detector de ionización de llama (FID)
Detector de captura electrónica (ECD)
Detector de nitrógeno - fósforo (NPD)
Detector fotométrico de llama (FPD)
Detector de conductividad electrolítica (ELCD, HALL)
Detector de fotoionización (PID)
Detector selectivo de masas (MSD)
Detector de infrarrojo (IRD)
Detector de emisión atómica (AED)
Detector
Sensibilidad:
• Respuesta por cantidad de muestra, es decir, la pendiente de la curva respuesta/cantidad. La cantidadmínima en la curva se define como el nivel mínimo detectable (MDL).
Selectividad:
• Es una medida de que categorías de compuestos darán respuesta del detector.
Rango dinámico:
• El rango de concentraciones de la muestra para las que el detector puede suministrar una cuantificaciónprecisa.
Respuesta del detector
pptrillón ppb ppm ppmil porcentaje
1 ppm = 1 ng
1 Lm
1 mg
Litro
1 L m
Litro= =
NPD (P)
10-15
fg
10-12
pg
10-9
ng
10-6
m g
10-3
mg
TCD
FID
ECD
NPD
(N)
MSD (SIM)
FPD (S)
Tipos de detectores
El rango dinámico es una medida de la Respuesta vs.
Cantidad. La respuesta es la señal producida por la muestra
La respuesta no lineal, mientras sea reproducible, puede
tratarse utilizando técnicas de calibración no lineal.
Cantidad
Cantidad
Respuesta
Respuesta
Rango dinámico
La respuesta aumenta repetidamente a
medida que aumenta la cantidad.
Rango dinámico lineal
La respuesta aumenta
proporcionalmente a medida que
aumenta la cantidad.
Rango dinámico
Condiciones operativas para los detectores
Detector Muestras típicas Rango sensibilidad Vel. Flujo gas (ml/min.)
Portador + Hidrógeno Aux.
FID Hidrocarburos 10-100 pg 20-60 30-40 200-500
10 ppm-99%
TCD Cualquier otra 5- 100 ng 15-30 n.a n.a.
que gas portador 100 ppm-100%
ECD Organohalógenos 0.05-1 pg 30-60 n.a. n.a.
Disolventes clorados 50 ppt-1 ppm
& pesticidas
NPD Organonitrógeno & 0.1-10 pg 20-40 1-5 70-100
Organofósforo
Resolución de problemas y Mantenimiento en Cromatografía
de Gases (GC)
Resultados Cromatográficos ¿Cómo?
Tener un GC con la configuración
adecuada
Realizar un Mantenimiento
periódico controlado del equipo.
Optimización meticulosa de los
Métodos.
Agilent GC Series
GC6890 A /
Plus / NGC7890 A
GC7890 B
GC7820
GC9000
“Intuvo”
GC6850
GC8890 GC8860
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Modos de interacción en la nueva era de la Cromatografía
Mantenimiento de los inyectores
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Uso Inyector Automático (ALS)
Cambiar Periódicamente Septum
Cambiar Periódicamente “Liner”
Cambiar Periódicamente los Filtros de Gases
Gold Seal
Split Vent Trap
Inyector de Capilares o Split/Splitless (S/SL)
Cambio de Septum
Bajar Temperatura del Inlet
Acceder al Septum, quitando Septum Retainer Nut.
Con la ayuda de unas pinzas cambiar el septum, para evitar contaminación.
No apretar en exceso este punto.
Tuerca del
septum
Septum
El anillo debe estar 1 mm
por encima de la tuerca;
más está demasiado
apretado.
Realizar la mejor vaporizacion: Consejos sobre el liner
El inserto de vidrio o Liner proporcionaun espacio inerte donde las muestras
líquidas se pueden vaporizar de manerauniforme y pasar a la columna.
El cambio de fase líquida a gas implica un importante aumento de volumen.
El volumen de expansion depende de:
• Tipo de disolvente
• Presión en cabeza de columna
• Temperatura del portal de inyección
Disolvente Volumen Expansion(1mL, ambiente) (mL a 250°C y 20 psi)
n-Hexano 140
Acetona 245
Acetonitrilo 350
Metanol 450
Agua 1010
Una inyección de disolvente de gran expansión de volúmen puede provocar una sobrecarga del liner del portal de inyección. Esto puede resultar en pérdida de muestra
por la VALVULA DE PURGA así comocontaminación de la línea de gas portador
entrante.
Evitar la sobrecarga del Inlet
Si la muestra vaporizada no cabe en el “liner” :
1.Perdida de repetibilidad cuantitativa.
2.Contaminación (carryover).
Liner sobrecargado
GC Calculators: Vapor Volume Calculator
La muestra vaporizada NOdebe ocupar más del 80% del
volumen del Liner
Liners Recomendados
¿Usar soporte solido?
Expansion de la muestra
en caliente
Problemas:
• Mala resolución entre compuestos
• Línea de base irregular
• Mala simetría en el pico
• Baja respuesta
Resolucion
• Inspeccionar el Liner con frecuencia y reemplazarlopara evitar suciedad retenida.
• Manipularlo con guantes y con pinzas.
• Cambiar el liner una vez hemos bajado la temperature del Inlet.
• Cambio O-Ring del liner.
Liner Troubleshooting y mantenimiento
Muchos problemas cromatográficos pueden ser el resultado de un Liner contaminado
Puntos para evitar fugas en el Inlet
¿Cómo saber cuándo hacer mantenimiento?Filtro de gases
Filtros de limpieza de Gas
con Sensor inteligente
Verde
Naranja
Pureza mínima de los gases superior a 99,999%
Instalación
Filtro de gases
Material de filtro
Material indicativo por colores
ConexionesAire In/Out Carrier In/Out H2 In/Out
Charcoal Oxygen Moisture Charcoal
Presione la válvula para
purgar la línea de gas de
oxígeno y humedad.
Los Gold Seal están diseñados para un
solo uso. La reutilización puede provocar
la superposición de los anillos de sellado,
lo que puede provocar una fuga.
Gold Seal (Sello de oro)
Reemplazar anualmente, como mínimo.
Cambiar con más frecuencia si la muestra es sucia y/o el ratio de split es Elevado.
El kit para el cambio de trampa incluye 2 o-ringsy la trampa.
Split Vent Trap
Consideraciones de los Inyectores automáticos
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SISTEMAS DE INTRODUCCIÓN DE MUESTRAS
HeadSpace Purge&Trap ThermalDesorption
SPME/ARROW/
TWISTER
Cometido de un autosampler
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Función: Introducir la muestra en el cromatógrafo de manera repetitiva y reproducible.
La inyección debe ser rápida, para evitar ensanchamiento del pico y la discriminación
La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambios químicos.
Modo de toma de muestra
Precauciones:
Lavados:
•Usar al menos dos disolventes y de polaridades contrapuestas
•No usar disolventes que sequen.
No exceder del 50% de la capacidad de la jeringa
No bajar por debajo del 10% de la capacidad.
Usar jeringas biseladas
Subir a 2 - 3 segundos para disolventes con una cierta
viscosidad
Solvente A : Metanol, Tolueno, Iso-octano, o mezcla miscible con disolvente inyección.
Evitar “Dry Solvents” : Acetona, Diclorometano o Hexano. Acortan la vida de la jeringa
Solvente B : disolvente de la muestra utilizado en la inyección
ALS (Automatic Liquid Sampler)
Mantenimiento de los Detectores
Si se cambia a menudo de
columna, mejor usar férulas
vespel-grafito vs 100% grafito
Al intercambiar los jets apretar sin forzar en
exceso
Limpiar el jet sólo cuando se
requiera
Mantenimiento de Detector de Ionización de Llama (FID)
Mantenimiento rutinario del FID
Controlar la señal de fondo
Comprobar presiones y flujos
Limpiar o cambiar el jet
Inspeccionar el encendedor (ignitor)
Limpiar el colector
COLUMNA
“No es lo que tu columna pueda hacer por tí, sino lo que tu puedas hacer por tu columna"
Mantenimiento Básico de la Columna GC
Acondicionar la columna antes de usarla
Cortar cuando se requiera (p.e. por colas en picos) un trozo de cabeza de columna (p.e. 50cm). Típico en “splitless”. ¡Uso de RTL!
Los cortes en los extremos de la columna deben ser adecuados
Limpiar térmicamente o con disolvente cuando se requiera
Cortar con cuidado el recubrimiento de poliimida.
No intentar cortar el vidrio.
Herramientas recomendadas:
• Lápiz con punta de diamante o de carburo,
herramienta de zafiro para cortes o cortador
cerámico
• Protección ocular
No usar: Tijeras, lima, etc.
Instalacion de columna Agilent 7890
Para el MMI ajustar a 14
mm entre la punta de la
férrula y la columna
IMPORTANTE
. Instalación de columnas capilares
- Colocar septum, tuerca y ferrula a través de la columna.
- Cortar 2 cm de columna
- Ajustar la distancia entre punta de férrula y extremo de columna
- Apretar manualmente la columna en el inyector
- Ajustar con ½ vuelta más las tuerca usando llave
Después de largos períodos de inactividad de la columna o si ésta no está
limpia convendrá aumentar considerablemente el tiempo de acondicionado.
Acondicionado de la Columna
Incrementar la temperatura de la
columna hasta 20-25 ºCpor encima de la
temperatura máxima de trabajo (sin llegar a
superar la temperatura máxima de la columna) y mantenerla durante 15-
30 min.
Abrir gases del detector y empezar a calentar inyector y detector.
Dejar durante 10-20 minutos la columna a temperatura ambiente
con el gas portador abierto y asegurarse que éste fluye a través de la
columna.
Si el cromatógrafo estaba parado: para
eliminar el oxígeno de su interior,
Las impurezas del gas portador se preconcentran en la columna cuando ésta se mantiene a “bajas” temperaturas durante periodos de inactividad
Causas Comunes de la Degradación del Rendimiento de una Columna
Deterioro del recubrimiento de poliamida
Daño térmico
Oxidación (deterioro por O2)
Daño químico debido a muestras
Contaminación
Dónde encontrar más información:
Conclusiones
Es importante conocer nuestro cromatógrafo de gases: Componentes y función.1
2Estar familiarizado con las variables de dichos componentes y como pueden afectar a los
resultados.
Tener capacidad crítica para modificar dichas variables y poder obtener métodos
analíticos robustos y optimizados.
4Identificar el origen de los problemas asociados a nuestra cromatografía y como pueden
estar afectados por los componentes y variables de nuestro cromatógrafo de gases
3
Gracias por su atención
…por su atención
Teléfono de atención
902116890