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一般研究用キット

製品添付用データシート

本品は、研究目的にのみご使用ください。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないでください。本マニュアルをご精読のうえ、研究目的にのみご使用ください。

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Bovine Milk Exosome ELISA Kit

Cat. No. EXBMEL

ウシ由来ミルクエクソソーム ELISA キット

2017 年 12 月 12 日作成

内　容 容　量 数量 保存温度 危険表記および取扱上の注意

固相化抗体 ( ×100) 100 µL 1 本

4℃～ 10℃

成分は労働安全衛生法に非該当ですが、取扱う際には眼鏡・手袋などの保護具を着用の上、人体の接触を避けるよう十分に配慮してください。

固相化抗体希釈液 10 mL 1 本

96well プレート 8-well x 12 strips 1 枚

プレートシール 3 枚

アッセイバッファー 50 mL 1 本

洗浄液（×10） 50 mL 1 本

ミルクエクソソーム原液（450 μg/mL） 200 µL 1 本

ビオチン化・抗 CD81 抗体（×100） 50 µL 1 本

HRP 標識アビジン（×100） 100 µL 1 本

発色基質溶液 12 mL 1 本

【Ⅰ -1 】背景と測定原理【Ⅰ】キットについて

【Ⅰ -2 】キットの特長

　Exosome( エクソソーム ) は、ほとんどの細胞で分泌される直径 50 nm ～ 150 nm 程度の膜小胞で、生体内では唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の体液中で観察され、また培養細胞から分泌されていることも確認されています。このエクソソームは、miRNA や mRNA、タンパク質、マイクロペプチドなどを内包し、由来する細胞や組織から離れた別の標的細胞や組織へと情報を伝達する役割を担うことが示唆されている１）ものの、その標的指向性はまだ完全には明らかになっていません。一方で、エクソソームによる情報伝達を CD9、CD63 といったエクソソーム表面抗原特異的な抗体で中和することにより、がん転移を抑制できることがわかっています。2)

ヒト、ウシ、ラットなどの広範な動物の乳中にもエクソソームが存在し、miRNA や mRNA、タンパク質などを内包し、標的細胞へ取り込まれることによってそれらが機能することが示唆されています。3）

さらに最近の研究では、前述のようなエクソソームの性質を利用して、ドラッグデリバリー担体 (DDS) としての研究もおこなわれており、とくに、牛乳由来のエクソソームは、抗がん剤の経口投与手段としても注目されています。4）

　本製品は、抗ミルクエクソソーム抗体をキャプチャー抗体とし、エクソソーム・マーカーのひとつである抗 CD81 モノクローナル抗体を検出用抗体としたサンドイッチ ELISA キットです。健康な牛から採取された生乳から超遠心分離法により調製したエクソソーム画分を標準エクソソームとして、ウシミルクやウシ血清といった検体中のエクソソームを定量することができます。

◆　ウシミルク、ウシ血清などに含まれるエクソソームを直接定量可能◆　特殊な装置は不要、通常のプレートリーダーで測定可能 ( 波長 : 450nm)◆　超遠心精製法により分画したウシ由来ミルクエクソソームを標準品として添付

【Ⅰ -3 】キット構成品本製品は 96 検体を測定できます。

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【Ⅰ- 4 】ご準備いただくもの（その他必要なもの）　●　マイクロピペット (10 ～ 1000µL)●　マルチチャンネルピペット●　リザーバー●　プレートシェーカー●　プレートリーダー

【Ⅱ - 1 】固相化抗体溶液の調製

【Ⅱ - 2 】洗浄液の調製

【Ⅱ - 3 】ミルクエクソソーム標準液の調製

【Ⅱ - 4】検体の調製

【Ⅱ】測定方法

固相化抗体を固相化抗体希釈液にて 100 倍希釈します。

洗浄液 ( ×10) を精製水で 10 倍希釈します。

以下の表に準じてミルクエクソソーム標準液 (A ～ H) を調製します。　

・ウシミルクおよびウシ血清の場合 ウシミルクあるいはウシ血清 100 μL にアッセイバッファー 100 μL を加えて撹拌後、アッセイバッファーで 5 倍希釈系列を調製し、ELISA 測定の結果が標準曲線の中心付近の吸光度になるところを採用してください。

・キット内のミルクエクソソーム原液 100μL にアッセイバッファー 350 μL を加え (4.5 倍希釈）、よく混合した溶液を A とします。この A 溶液 210μL にアッセイバッファー 210μL を加え (2 倍希釈 ）、よく混合した溶液をB とします。以下、同様に２倍希釈系列を調製します。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

・上表に準じて調製されたミルクエクソソーム標準液は各濃度とも１well 分 50μL とし 4 well 分あります。希釈調製された標準液は 4 ℃で 2 週間保存可能です。　　　　　　　　　　　　　　　　　

濃度 ( μg/mL) 液量 アッセイバッファー 希釈率

ミルクエクソソーム原液 450

A 100 原液を 100 μL 350 μL 4.5

B 50 A を 210 μL 210 μL 2

C 25 B を 210 μL 210 μL 2

D 12.5 C を 210 μL 210 μL 2

E 6.25 D を 210 μL 210 μL 2

F 3.125 E を 210 μL 210 μL 2

G 1.5625 F を 210 μL 210 μL 2

H 0 　　　　　　　　 210 μL

内容 容量 数量 保存温度 　　　　　　　　　　　危険表記および取扱上の注意反応停止液 12 mL 1 本 4℃～ 10℃ （成分として硫酸を 2.9％含む）

労働安全衛生法 第 57 条および第 57 条の 2 に該当　警告　・吸入すると有害（気体、蒸気、ミスト）　・皮膚刺激　・強い眼刺激　・呼吸器系の障害のおそれ　・長期にわたる、又は反復ばく露による呼吸器系の障害のおそれ

警告

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【Ⅱ -5 】 ビオチン化・抗 CD81 抗体溶液の調製

【Ⅱ -6 】 HRP 標識アビジン溶液の調製

【Ⅲ】 測定フロー

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・ビオチン化・抗 CD81 抗体 ( × 100) をアッセイバッファーで 100 倍希釈して使用ください。

・HRP 標識アビジン ( × 100) をアッセイバッファーで 100 倍希釈して使用ください。

・必要な数の well を準備してください。測定はすべてデュプリケイトで行ってください。

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図 1. 標準曲線の例

2 次曲線回帰（左記グラフ）で近似曲線を作成する。

【II -1】で調製した固相化抗体溶液を 100 μL / well 入れてください。→ プレートシールをして、室温にて 1 時間インキュベートします（固相化）。

標準液および検体を 50μL / well 入れ、次いで【II-5】で調製したビオチン化・抗 CD81 抗体溶液を 50μL/well入れます。プレートシールをしてプレートシェーカーで撹拌 (800rpm)しながら室温で1時間インキュベートします。

【II-6】で調製した HRP 標識アビジン溶液を 100μL/well 入れます。プレートシールをして、プレートシェーカーで撹拌 (800rpm) しながら室温で 1 時間インキュベートしてください。

発色基質溶液を 100μL / well 入れ，プレートシールをして、室温で 15 分間インキュベートします。

アッセイバッファーを 200 μ L / well 入れてください ( ブロッキング）。プレートシールをして、プレートシェーカーで撹拌 (800rpm) しながら室温で 1 時間インキュベートします。

洗浄液（300 μ L / well）で 3 回洗います。→ 洗浄 3 回目の溶液を捨てずにおき、標準液および検体の調製 (【II-3】および【II-4】) を行います。

固相化抗体を捨ててください。

洗浄液（300 μL/well）で 3 回洗います。

洗浄液（300 μL/well）で 3 回洗います。

反応停止液を 100μL / well 入れ、波長 450nmで測定してください。

【II-2】で調製した洗浄液（300 μL/well）で 3 回洗います。

アッセイバッファーを捨ててください。

y = -0.0001x2 + 0.0227x + 0.0613R² = 0.9978

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 20 40 60 80 100

ABS

(450

nm)

Milk Exosome (μg/ml)

本商品をご利用になられた文献、発表データを募っております。本商品をご利用いただいて投稿された論文、学会発表パネルなどを送付いただきましたお客様に粗品を進呈させていただきます。ご提供いただきました論文などは、WEB やカタログ、技術資料を通じて多くの研究者の方への技術情報として利用させていただく場合がございます。是非皆様のご協力をお願いいたします。

〒047-0261　北海道小樽市銭函 3丁目 513 番 2コスモ・バイオ株式会社　札幌事業所 宛

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【Ⅵ】参考文献

【Ⅲ】測定例

【Ⅶ】関連商品

メーカー略号 品番 品名 包装 希望販売価格 (税抜)

CACSHI-EXO-M03 Anti CD81, Human (Mouse) 100 µL (1mg/mL) 65,000 円

EXO-AB-01 Anti Bovine Milk Exosome 0.1 mg 30,000 円

CSREXBM100L

牛乳由来エクソソーム100 µL × 10 本 30,000 円

EXBM1000L 1 mL × 10 本 100,000 円

図 2. ウシミルク中のエクソソームの測定例図 3. ウシ血清中のエクソソームの測定例

ウシミルク間でエクソソーム含量に違いあることが分かった。

エクソソーム濃度は成牛血清濃度が高く、超遠心でエクソソームを除去すると低くなった。これに比べ牛胎児血清はエクソソーム含量が低いことが分かった。

[1] Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis, Hoshino A, et al., Nature. 2015 Nov 19; 527(7578): 329-35.[2] Disruption of Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Therapeutic Strategy against Cancer Metastasis, Nao Nishida-Aoki, et al., Mol Ther. 2017 Jan 4; 25(1): 181-191.[3] Bovine milk exosomes contain microRNA and mRNA and are taken up by human macrophages, Hirohisa Izumi, et al., J Dairy Sci. 2015 May; 98(5): 2920-33[4] Milk-derived exosomes for oral delivery of paclitaxel, Ashish K.Agrawal et al., Nanomedicine. 2017 Jul; 13(5): 1627-1636.

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エクソソーム

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成牛血清

超遠心でエクソソームを

除去した成牛血清

超遠心でエクソソームを

除去した牛胎児血清

牛胎児血清

エクソソーム　（µg/ml）

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