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Instituto deSalud PúblicaMinisterio de Salud

Vigilancia de enterotoxinas en cepas de Staphylococcus aureus y de Bacillus cereus aisladas de alimentos, Chile 2011 – 2017.

BOLETÍN VIGILANCIA DE LABORATORIO

VOL. 7, NO. 8, AGOSTO 2017.

3Instituto de Salud Pública de Chile.

Vigilancia de enterotoxinas en cepas de Staphylococcus aureus y de Bacillus cereus aisladas de alimentos,Chile 2011 – 2017.

BOLETÍN VIGILANCIA DE LABORATORIO

1. ANTECEDENTES

Staphylococcus aureus, Corresponde a una bacteria Gram positiva, de morfología cocácea, catalasa positiva, que pertenece a la familia Staphylococcaceae, inmóviles, anaerobios facultativos, no formadores de esporas (1).

Es un agente etiológico frecuente de las intoxicaciones de origen alimentario (2), este microorganismo coloniza preferentemente la nasofaringe, piel y mucosas de hombres y animales, su presencia en los alimentos se asocia inadecuada manipulación o a materias primas contaminadas (3).

Algunas cepas de S. aureus producen enterotoxinas estafilocócicas (Staphylococcal Enterotoxins: SEs) (4), se han descrito 23 tipos de SEs distintos basados en su antigenicidad, los que se conocen como SEA a SElY. Estas toxinas son termoestables, resistentes ciertas a condiciones ambientales (pH bajo, congelación, secado) (5) y de rápida acción, pueden causar enfermedad en tan sólo 30 minutos después de ingerir alimentos contaminados, pero los síntomas generalmente se presentan entre 1 - 6 horas. Dentro de la sintomatología, se describen náuseas, vómitos, calambres estomacales y diarrea. La enfermedad no se transmite de persona a persona y generalmente persiste entre 1 a 3 días, en solo pocos casos los síntomas puede continuar y desarrollar una condición grave (6). Los alimentos identificados con mayor frecuencia como fuente de los brotes son carnes, productos cárnicos, huevos, productos de pastelería rellenos con crema, leche y productos lácteos (7). SEA frecuentemente está implicada en los brotes de intoxicación alimentaria, debido a que en una concentración de 100 ng son suficientes para causar sintomatología (8).

Al igual que S. aureus, otro microorganismo que se asocia con enfermedades transmitidas por alimentos es Bacillus cereus. Éste patógeno es Gram positivo, anaerobio facultativo y móvil debido a la presencia de flagelos peritricos; además, forma esporas resistentes a condiciones adversas del medio, como altas temperaturas, deshidratación y radiación, y produce diversas toxinas que contaminan gran variedad de alimentos. Las esporas son resistentes a bajas condiciones de humedad y a tratamientos térmicos como la pasteurización o procesos de cocción de los alimentos y el ácido clorhídrico presente en el estómago, lo que constituye un peligro potencial para la salud humana (9). B. cereus se encuentra frecuentemente contaminando alimentos con alto contenido de almidón debido a que produce enzimas del tipo amilasas, los alimentos más susceptibles de ser contaminados este agente incluyen harinas, carnes, leches, quesos, verduras, pescados, arroz y sus derivados (10).

Se han descrito al menos 4 toxinas en el género Bacillus, las cuales han sido relacionadas con cuadros de intoxicación alimentaria en humanos (11). La toxina cereulida, es un péptido cíclico, termoestable y resistente a cambios de pH, provoca un cuadro emético, con un periodo de incubación de 1 a 5 horas, caracterizado por vómitos y nauseas, que no se extiende por más de 24 horas, asociado predominante al consumo de arroz contaminado (12,13).

Instituto de Salud Pública de Chile.

VIGILANCIA DE ENTEROTOXINAS EN CEPAS DE Staphylococcus aureus Y DE Bacillus cereusAISLADAS DE ALIMENTOS, CHILE 2011 – 2017.

4

Dentro del grupo enterotoxinas que se relacionan con el cuadro diarreico se encuentran las enterotoxinas HBL, NHE y citototoxina K. La enterotoxina HBL es una hemolisina que se compone de tres proteínas, tiene efecto dermonecrótico y activa la permeabilidad vascular. Ha sido la enterotoxina más asociada con cuadros de diarreas y se considera el principal factor de virulencia de B. cereus. La enterotoxina NHE es denominada así debido a que no es hemolítica, pero que de igual forma se compone por tres proteínas. La citotoxina K es un monómero proteico, a diferencia de las otras enterotoxinas triméricas, la cual pertenece al grupo de toxinas que desarrollan poros en las membranas (12,13).

El Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) en su rol de Laboratorio de Referencia realiza la detección de enterotoxinas de S. aureus y B. cereus. Desde el año 2016, esta detección se realiza a través de técnica de biología molecular. Las cepas son recibidas desde los Laboratorios Ambientales de las Secretarias Regionales Ministeriales de Salud (SEREMI), que corresponden a aislamientos realizados desde alimentos; ya sea en el marco de la investigación de brotes de intoxicación alimentaria o proveniente de los programas de vigilancia de cada región.

De acuerdo a lo anteriormente descrito, el presente Boletín tiene como objetivo dar a conocer, mediante análisis descriptivo, las enterotoxinas presentes en cepas de S. aureus y de B. cereus aisladas de alimentos para fortalecer y complementar la información epidemiológica que aporte a la prevención y control de las enfermedades transmitidas por los alimentos.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizó la base de datos correspondiente a todas las cepas analizadas de S. aureus y B. cereus en la Sección de Microbiología de Alimentos del ISP, enviadas por los Laboratorios Ambientales de las SEREMIs de Salud del país entre enero de 2011 y junio de 2017.

En el caso de S. aureus las cepas fueron recibidas en tubos de conservación, reaisladas en agar Baird Parker con telurito de potasio para verificación de pureza, viabilidad, caracterización fenotípica y bioquímica.

Hasta el año 2014 se realizó la detección de solo cuatro enterotoxinas (SEA, SEB, SEC, SED) utilizando la técnica de aglutinación reversa pasiva en látex, SET-RPLA de detección de toxinas (DENKAS Seiken) y se confirmaron con pruebas de coagulasa y termonucleasa.

Desde el año 2015 la Sección modificó la técnica implementando la detección molecular de 9 genes de enterotoxinas a través de PCR convencional (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, y sej) correspondientes a las SEs A, B, C, D, E, G, H, I y J, respectivamente. Además se implementó la confirmación de especie identificando el gen polimórfico spa a través de PCR.

Las cepas recibidas se agruparon por categoría de alimento de acuerdo a la matriz desde la cual fueron aisladas, estableciendo: platos preparados (incluye emparedados, ensaladas preparadas y platos listos para el consumo), lácteos (incluye leche, helados y quesos), pescados y mariscos, tortas y pasteles, salsas y aderezos, y cecinas.

Se incluyeron en este análisis las cepas que indicaban si su aislamiento correspondía a programas de vigilancia o investigación de casos de intoxicación alimentaria, excluyendo 21 cepas que no contaban con esta información.

Las cepas de B. cereus se desarrollan en agar selectivo MYP en donde se verifica pureza y viabilidad. Para la confirmación de especie se realiza PCR del gen específico gyr. La detección de toxinas se realiza por la detección de los siguientes genes: ces para la toxina cereulida y hbl, nhe y cytK para la hemolisina BL, la enterotoxina no hemolítica y la citolisina K, respectivamente. La visualización de los productos PCR se realiza mediante electroforesis en gel de agarosa a 100V durante 60 minutos y luego se observa el gel de agarosa en un transiluminador UV.

Los análisis estadísticos fueron realizados en paquete Excel 2011 y utilizando el software estadístico Stata 13. Los resultados se representaron en tablas y gráficos.



3. LIMITACIONES

En este Boletín no es posible realizar inferencia estadística con los resultados obtenidos, dado que la unidad de análisis corresponde a las cepas aisladas de alimentos en los laboratorios de las SEREMI de Salud y no pertenecen a un plan de muestreo aleatorio del ISP.

El Reglamento Sanitario de los Alimentos (14), en su artículo Nº 173 establece los criterios microbiológicos para S. aureus y B. cereus en los alimentos, por lo que la información contenida en este Boletín referente a las cepas aisladas de muestras de alimentos, no necesariamente constituye un incumplimiento normativo.

4. RESULTADOS

4.1 Resultados vigilancia de SEs en S. aureus

En el periodo comprendido entre enero de 2011 y junio de 2017 se recibieron en total 743 cepas de S. aureus aisladas de muestras de alimentos, para la detección de enterotoxinas, de las cuales un 41,5% (308/743) resultó con presencia de enterotoxinas.

En el año 2012 se recibió el mayor número de cepas de S. aureus (182). Entre los años 2011 a 2015 el porcentaje de cepas confirmadas varió entre 21,2% (año 2015) y 42,9 (año 2012). A partir del año 2016 se comenzó a utilizar técnica de biología molecular para la detección de enterotoxinas, por lo que se observó un aumento, alcanzando porcentajes de 82,7% y 93,2%, en los años 2016 y 2017 respectivamente (Figura 1).



6

4.1.1 Cepas de S. aureus por procedencia (vigilancia o intoxicación).

De las 743 cepas de S. aureus recibidas para el análisis de enterotoxinas, 231 (31,1%) provenían de casos de intoxicación alimentaria y 512 (68,9%) fueron aisladas de alimentos del programa de vigilancia.

Intoxicación alimentaria:

Se analizaron 231 cepas provenientes de casos de intoxicación alimentaria, en el año 2012 se recibió la mayor cantidad de cepas de S. aureus (88 cepas). Entre los años 2011 a 2015 el porcentaje de cepas confirmadas con presencia de enterotoxinas varió de 0% (año 2014) a 63,6% (año 2012). Hasta junio de 2017, se registró un 100% (12/12) de cepas con enterotoxinas, asociado al cambio de técnica a partir del año 2016 (Figura 2).

Programa de Vigilancia:

Las cepas de S. aureus aisladas de alimentos del programa de vigilancia, se observó un aumento de las cepas recibidas desde el 2011 hasta el 2014, siendo este último el año en que se recibió el mayor número de cepas (129). Entre los años 2011 a 2015 el porcentaje de cepas confirmadas con presencia de enterotoxinas varió de 21% (año 2015) a 43,1% (año 2011). En el año 2016 este porcentaje fue de 91,3 y hasta junio 2017 de 87,5% (Figura 3).



4.1.2 Cepas de S. aureus por laboratorios de procedencia.

Es importante destacar que la información presentada, corresponde sólo a las cepas enviadas por algunos laboratorios de las SEREMI de Salud y por lo que no representa la realidad nacional, siendo necesario fortalecer la vigilancia de laboratorio y envío de cepas al laboratorio de Referencia.

Del total de cepas de S. aureus recibidas para el análisis de enterotoxinas en el periodo de estudio, un 74,2% (551/743) provenían de la SEREMI de Valparaíso.

Las cepas recibidas de casos de intoxicación alimentaria provenían, en orden de frecuencia, de las SEREMI de Salud de Valparaíso (Laboratorio de Viña del Mar, Aconcagua y Valparaíso), Coquimbo, Biobío (Laboratorio de Chillán), O’Higgins, Iquique, Los Lagos (Laboratorio de Puerto Montt) y Magallanes.

Las cepas aisladas de alimentos del programa de vigilancia provenían de las SEREMI de Salud de Valparaíso, Los Lagos, Arica, Araucanía e Iquique (Figura 4).



8

4.1.3 Cepas de S. aureus por tipo de alimento.

En el total de cepas de S. aureus recibidas para el análisis de enterotoxinas, los alimentos de origen más frecuentes fueron los platos preparados con 70,1% (521/743) de las cepas, lácteos con el 14,3% (106/743) y pescados y mariscos con el 5,4% (40/743).


El 71,9% (166/231) de las cepas recibidas correspondientes a investigación de intoxicación alimentaria fueron aisladas a partir de platos preparados, el 12,6% (29/231) de lácteos y el 6,5% (15/231) de salsas y aderezos (Figura 5).




El 69,3% (355/512) de las cepas aisladas de alimentos correspondientes a programas de vigilancia fueron aisladas a partir de platos preparados, el 15,0% (77/512) de lácteos y el 5,5% (28/512) de pescados y mariscos (Figura 6).



10

4.1.4 Enterotoxinas detectadas en cepas de S. aureus según procedencia (intoxicación o vigilancia)

En las 312 cepas confirmadas de S. aureus con presencia de enterotoxinas, las toxinas más frecuentes fueron la enterotoxina B 41,3% (129/312) y la enterotoxina A 23,7% (74/312).


De las cepas provenientes de casos de intoxicación alimentaria, en el 69,5% (73/105) se detectó SEB, en un 10,5% (11/105) SEA, SEA y SEH simultáneamente en el 9,5% (10/105) y SEE en el 5,7% (6/105). SEC, SEA-SEB y SEA-SEE-SEH representaron frecuencias inferiores al 2% (Figura 7).


En las cepas provenientes del programa de vigilancia, SEA fue más frecuente con el 32,9% (68/207), seguida por la SEB con el 27,1% (56/207) y presencia conjunta de las SEA-SEB en el 11,6% (24/207).

Además, se observó la presencia de SEA junto con las variantes B, D, G, H e I y para la SEB con las variantes C, D, H, I, G y J (Tabla 1).



Tabla 1.Cepas confirmadas de Staphylococcus aureus procedentes de vigilancia por genes de enterotoxina y año. Chile 2011 - 2017*.

Genes de enterotoxinas 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017* Total

A 13 13 5 18 6 10 3 68

B 11 4 35 6 0 0 0 56

C 0 3 0 0 0 0 0 3

D 0 0 0 3 0 0 0 3

E 0 0 0 0 0 0 2 2

G 0 0 0 0 0 0 3 3

A, B 1 2 8 12 0 1 0 24

A, D 0 0 0 0 1 0 0 1

A, G 0 0 0 0 0 0 3 3

A, H 0 0 0 0 1 2 0 3

A, G, I 0 0 0 0 0 1 1 2

B, C 0 0 0 11 2 0 0 13

B, D 0 0 0 0 2 0 0 2

B, H 0 0 0 0 0 3 1 4

B, I, G, J 0 0 0 0 1 0 0 1

E, G 0 0 0 0 0 4 0 4

E, H , I 0 0 0 0 0 0 1 1

G, I 0 0 0 0 0 0 13 13

H, I 0 0 0 0 0 0 1 1

Total 25 22 48 50 13 21 28 207

*Datos hasta junio de 2017.Fuente: Sección Microbiología de Alimentos: Instituto de Salud Pública de Chile.



12

4.2. Resultados vigilancia de toxinas emética y diarreicas en B. cereus

Entre los años 2014 y junio de 2017, se confirmaron 51 cepas de B. cereus aisladas por los laboratorios de las SEREMI de Salud a partir de muestras de alimentos.

Del total de cepas, 6 correspondían a intoxicación alimentaria, todas provenientes de la SEREMI de O’Higgins, aisladas a partir de leche en polvo. Se identificó el perfil toxigénico ces-, hbl-, nhe-, cytK+ (1 cepa), ces-, hbl+, nhe-, cytK+ (4 cepas) y ces-, hbl+, nhe–, cytK- (1 cepa) (Tabla 2).

Tabla 2.Perfil genético de enterotoxinas de las cepas de B. cereus (intoxicación).

Año ces-, hbl- nhe- cytK+ ces- hbl+ nhe- cytK+ ces- hbl+ nhe- cytK-

2016 0 2 1

2017 1 2 0

Total 1 4 1

Fuente: Sección Microbiología de Alimentos: Instituto de Salud Pública de Chile.

De las 45 cepas correspondientes a vigilancia, el 80% (36/45) provenientes de la SEREMI de Biobío (Tabla 3), El 77,8% (35/45) de las cepas fueron aisladas a partir de formula láctea preparada (Tabla 4).

Tabla 3.Número de cepas confirmadas (vigilancia) de B. cereus por SEREMI de procedencia y año.

Región 2014 2015 2016 2017 Total

Biobío 2 0 29 5 36

Metropolitana 0 0 3 1 4

Valparaíso 0 0 1 0 1

O’Higgins 0 0 0 4 4

Total 2 0 33 10 45




Tabla 4.Número de cepas confirmadas (vigilancia) de B. cereus por tipo de alimento y año.

Tipo de alimento 2014 2015 2016 2017 Total

Platos preparados 2 0 2 6 10

Formula láctea pre-parada 0 0 31 4 35

Total 2 0 33 10 45


Se detectó la presencia de los genes cytK y hbl. En ninguna de las cepas confirmadas a la fecha se ha identificado los genes ces ni nhe, que codifican para la producción de toxina emética y diarrea hemolítica, respectivamente (Tabla 5).

Tabla 5.Perfil toxigénico de las cepas de B. cereus (vigilancia).

Año ces-, hbl-, nhe-, cytK+ ces-, hbl+, nhe-, cytK+

2014 2 0

2015 0 0

2016 13 20

2017 5 5

Total 20 25




14

4. CONCLUSIONES

En el periodo enero 2011- junio 2017 se recibieron 743 cepas de Staphylococcus aureus para detección de enterotoxinas. Un total de 231 cepas provenían de casos de intoxicación alimentaria y 512 provenían del programa de vigilancia alimentos. A partir del año 2016, se registró el aumento del porcentaje de cepas confirmadas de S. aureus con enterotoxinas, asociado al cambio de técnica de biología molecular, la que permitió aumentar la sensibilidad.

Las cepas correspondientes tanto a intoxicación alimentaria como a programas de vigilancia, fueron aisladas mayoritariamente de platos preparados.

Las enterotoxinas detectadas con mayor frecuencia fueron las toxinas B y A, con porcentajes de 41,3% y 23,7% respectivamente para el periodo en estudio.

Entre enero de 2014 y junio de 2017, se confirmaron 51 cepas de Bacillus cereus aisladas por los laboratorios de las SEREMI de Salud a partir de muestras de alimentos, 6 correspondientes a intoxicación y 45 a vigilancia. A la fecha no se han identificado los genes ces ni nhe, que codifican para la producción de toxina emética y diarrea hemolítica, respectivamente.

La información presentada en este Boletín corresponde sólo a los resultados de las cepas recibidas por el ISP, siendo necesario fortalecer a nivel nacional la vigilancia de laboratorio de S. aureus y B. cereus y el envío de cepas al Laboratorio de Referencia para la confirmación de la presencia de enterotoxinas.

5. BIBLIOGRAFÍA

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