bloque bash (biotecnología animal y en salud humana) · 2013-09-25 · aislamiento de virus...

Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT

Bloque BASH (Biotecnología Animal

y en Salud Humana)

1 Sandra Ruzal CTBT 2013

VACUNAS

SANDRA RUZAL Departamento de Química Biológica

FCEN-UBA

IQUIBICEN-CONICET

[email protected]

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• VACUNAS → origen siglo XVIII, exposición

voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa.

Generaba Protección a reinfección

• Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico

→ memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico)

inventó en 1796 la primera vacuna

contra la viruela.

El experimento consistió en inyectar

a un niño de 8 años la vacuna

procedente de una pústula del

brazo de una ordeñadora

(contagiada x VACA) a través de

dos cortes superficiales en el brazo,

consiguiendo inmunizar al niño ante

la viruela humana.

Sandra Ruzal CTBT 2013

Sandra Ruzal CTBT 2013 3

Aparición principales vacunas de uso humano:

- 1796: Vacunación contra la viruela

- 1885: Vacuna contra la rabia Pasteur µorg atenuados

- 1925: Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa

- 1937: Vacuna contra la fiebre amarilla

- 1943: Vacuna contra influenza

- 1954: Vacuna inactivada contra virus polio

- 1956: Vacuna viva atenuada contra virus polio

- 1960: Vacuna contra el sarampión

- 1966: Vacuna contra la rubeóla

- 1975: Vacuna contra hepatitis B→subunidades

- 1980: Viruela erradicada

- 1986: Primera vacuna recombinante (hepatitis B)

- 1988: Vacuna contra H. influenzae B → conjugada

cultivo celular y

desarrollo de virus

humanos fuera del

organismo vivo

Edad de oro

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Qué son las vacunas Un preparado complejo

Formado por microorganismos completos

atenuado o inactivado o bien parte o fracción

del mismo

Capaz de inducir una respuesta inmune

protectora y duradera frente al mismo

microorganismo virulento u otros patógenos,

previniendo la infección y enfermedad que

estos causan

Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN


Antígeno: molécula Inmunogénica

Inmunogénica: molécula capaz de despertar una

respuesta en el sistema inmune y producir memoria

inmunológica

más efectivo y menos costoso


Respuesta secundaria 1-3 días

Mayor Intensidad IgG, IgA, IgE

Mayor Afinidad de los Ac

Respuesta primaria 5-10 días

Menor Intensidad IgM>IgG

expansión clonal de células T y/o B

específicas, dan lugar a formación

de población de células de memoria.


Respuestas inmunes que confieren protección:

Microorganismos extracelulares con una fase en sangre

crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia):

Respuesta Humoral

Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción

de IgA secretoria neutralizante

Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y

humoral.


modificados para que no puedan generar enfermedad

Patógenos muertos o inactivados

Sólo componentes

Las vacunas inactivadas, de subunidades y las de DNA se consideran seguras, debido

a que no involucran la inoculación de microorganismos vivos que pudieran ser peligroso

en mujeres embarazadas e individuos inmunocomprometidos o incluso en individuos

sanos debido a la posibilidad de reversión a la forma virulenta del microorganismo

subunidades

¿Que tipos de vacunas existen?


Componentes de una vacuna

Antígeno: molécula capaz de inducir una respuesta inmune (virus, parte

de virus, células infectadas).

Adyuvante: Sustancias que potencian la reacción inmune, presentan el

antígeno en forma gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica.

Estabilizantes: Sustancias que confieren protección frente a factores

que degradan el antígenos.

Diluyente: Soluciones a base de ¨buffers¨ que ajustan la concentración

antigénica a la dosis de uso o sirven para la reconstitución de liofilizados.

Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades?

imitan a la infección, son baratos de producir y

administrar vía oral, menor número de dosis requeridas

asemeja in vivo vacunación primaria a secundaria.

Desventajas: costos de almacenamiento y

conservación, deben mantener a 4°C, riesgo

afecte al personal, riesgo potencial que revierta

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VACUNAS Atenuadas: Microorganismos vivos que multiplican con

reducida patogenicidad (infección leve) inmunidad humoral y celular


Formas de atenuación de virus:

Aislamiento de virus patógenos de una especie pero que no lo son para otra (viruela

bovina, rotavirus bovino).

Pasajes sucesivos en cultivo celular o en embriones de pollo (sarampión, rubéola)

Pasajes en otro hospedador (Sabin se hace en células de mono)

Por mutagénesis química o térmica o manipulación por técnicas de ingeniería genética

Recombinación entre cepas virales

BCG

Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce

Ac pero sí una rta T CD4+ productora de IFN-. También

CD8+ y CD1. 11 Sandra Ruzal CTBT 2013

Bacillus Calmette Guerin

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VACUNAS Inactivadas o Muertas:

Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos

físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo

capacidad inmunogénica

Timerosal, mercurial, no muy efectivo, es tóxico, prohibido en humanos.

Betapropionolactona, efectiva en bajas concentraciones, alto costo.

Bromoetileimida (BEI), cancerígeno.

Inmunidad generada es sólo humoral, requieren adyuvantes

Ventajas: Son más estables que las vacunas vivas

Desventajas: Requiere grandes cantidades del Ag y/o mayor número de

dosis, pueden alterar epítopes Sandra Ruzal CTBT 2013


· Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados,

· Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi,

· N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares,

· Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos

capsulares,

· Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad

polisacárido incrementada unida a proteína transportadora,

· N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacáridos

capsulares conjugados con proteínas antigénicas

(meningococo, neumococo)

TOXOIDES: toxinas inactivadas con formol (tetánica, difterica)

Subunidades procedimientos de fermentación y

purificación que han permitido la producción de vacunas a

base de subunidades o antígenos purificadas


Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y vacunas

conjugadas, son débilmente inmunogénicas

Requieren Adyuvantes

Potencian la reacción inmune, presentan el antígeno en forma

gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica, estimulan la

producción de citoquinas.

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Combinadas: varias especies

• Doble bacteriana (dT): difteria + tétanos.

• Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria +

tétanos +pertussis.

• Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria +

tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b.

• Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa

+ Hib + poliomelitis inactivada.

• Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib +

hepatitis B.

Monovalentes: una

única especie un

antígeno

Polivalentes: única

especie de distintos

antígenos


En vacunas multi-componentes (más de un

antígeno) se debe probar que no existe

interferencia entre los componentes.

Otra interferencia común son los agentes

inactivantes de vacunas de virus inactivados

cuando se aplican con otras vacunas que

poseen antígenos vivos


Requisitos generales: pura, segura, potente y efectiva

Instalaciones adecuadas con personal capacitado

GMP (buenas prácticas de manufactura) uniformidad y consistencia

Registro del producto y control lote a lote.

PRODUCCIÓN DE VACUNAS

Factores a considerar:

•Diseño del producto (tipo de vacuna, modo de producción, eficiencia,

control)

• Registro, Semilla, banco maestro

• Materias primas, medios y soluciones, calidad del agua, suero y aditivos de

origen biológico.

• Sistemas de cultivo celular, Infección, Cosecha

• Concentración y/o purificación

• Inactivación

• Formulación

• Envase y acondicionado: Presentaciones

• Almacenamiento

• Control de calidad y cadena de frío

• Presentación ante organismos oficiales

• Seguimiento de la conformidad del cliente

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Instalaciones de producción

1) Diseñadas para garantizar la pureza del

producto en todas las etapas de producción

como también proteger la salud del

personal.

2) Fácil limpieza siguiendo normas

bioseguridad y contención de patógenos

para evitar contaminaciones cruzadas y

prevenir la contaminación del personal y los

equipos.

3) Cada proceso limitado a un área definida

4) Con adecuada ventilación y aire filtrado,

temperatura y suministro de agua.y drenaje

5) vestuarios y otras instalaciones para el

personal accesibles sin pasar a través de

áreas preparación de productos biológicos.

5) Diseño que evita contaminación

ambiental. Material utilizado en producción

tiene que hacerse seguro antes de salir de

la instalación. Sandra Ruzal CTBT 2013

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semilla inoculo

biorreactor

centrifugación

estabilizador liofilizada

encapsulado molienda


Los virus se cultivan tanto en las células primarias, como

huevos de gallina embrionados (x ej influenza, rabia,

sarampión), Producidas en órganos:

Cerebro de cordero (rabia),

Cerebro de ratón (encefalitis

japonesa)

Producidas en cultivos celulares: primarios, secundarios o

líneas celulares continuas, tales como cultivos de células

humanas (x ej hepatitis A). .

Producidas en organismos

recombinantes: bacterias,

levaduras.

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1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales

2. Estudios clínicos en humanos:

• Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área endémica.

evalúa la seguridad y potencia de la vacuna.

• Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios.

• Fase III: son pruebas “de campo”, se realizan con comunidades que habitan en

áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos vacunados.

3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir de los

resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación (licencia) y

registro de la vacuna.

4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años.

Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la transmisión y

se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo después de esta etapa se

considera o no la inclusión de la vacuna en los planes de vacunación de la región. Sandra Ruzal CTBT 2013

http://www.anmat.gov.ar/Medicamentos/Medicamentos.asp

Disposición ANMAT 705/2005 Requisitos para la inscripción de vacunas.

http://www.anmat.gov.ar/Medicamentos/Medicamentos.asp

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Bondades de una vacuna ideal

• Precio competitivo.

• De fácil producción y económica

• Ser inocua y segura, pocos o ningún efecto adverso.

• Estabilidad física y genética. Ideal a temperatura ambiente

• Posible inmunización simultánea contra múltiples

componentes protectores de diversos patógenos.

• Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía Oral

• Disparar una respuesta inmune de memoria.

• Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2 semanas.

• Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a

nivel sistémico.


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Problemas

i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en

las condiciones normales de cultivo

ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de

medidas de bioseguridad muy elevadas

iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles

por este tipo de vacunas;

iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la

vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o

muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la

vacuna;

v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar

completamente inactivados y mantener la toxicidad en la

vacuna final

El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas


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Soluciones

a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su

deleción en los agentes infecciosos creando clones

avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular

la respuesta inmune;

b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los

determinantes antigénicos de un patógeno específico o de

varios;

c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden

aislar los genes de las proteínas que contienen los

determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y

expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento

(bacteria o levadura)

El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas



vacunas recombinantes


La vacunología reversa consiste en

una búsqueda de secuencias de

genoma para la identificación de

putativos antígenos proteicos de

superficie que podrían utilizarse

como candidatos para vacunas

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•Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para

producir alguno de los componentes del patógeno


4 subtipos

El primer antígeno recombinante

comercial para humanos es el

de la proteína de la cápside del

virus de la hepatitis B (HBsAg).

Se produce en Pichia pastori y se

purifica con técnicas de

precipitación de proteínas y

columnas de afinidad con

Anticuerpos monoclonales,

también el antígeno L1 de HPV


Las vacunas recombinantes de tipo subunidad

producto del gen expresado en bacteria, es cosechado,

purificado y administrado como una vacuna

Antígenos recombinantes

producidas en

bacterias o levaduras,

en plantas.


proteínas L1 (capside mayor)

recombinantes forman partículas

“tipo-virus” (VLPs, virus-like particles),

carentes del genoma viral, y por lo

tanto no infectivas

Segunda generación

XBio-Leloir


Las vacunas recombinantes de gen deletado

vacunas con genes deletados asociados con la virulencia

o patogenicidad de una bacteria patógeno;

Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de

organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se

inserta un material genético específico de otro patógeno

Utilizan virus o bacterias vivos como vectores


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• Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):

• Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies

• Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él.

• Estudio de especificidad de especie

• Estudio de la posible instalación en el ambiente.

• Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo “salvaje”, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad.

• Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias.



Differentiating Infected From Vaccinated Animals

¨Marker vaccines¨

Problema: Recombinantes

Se deletean genes

no esenciales

inmunogénicos

permiten diferenciar

la respuesta a la

vacuna de aquellos

de animales

infectados

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inyectado directamente

en las célula muscular,

in vivo, donde luego es

traducido y expresado

induciendo la

respuesta inmune


•Efecto adyuvante

•5´-purina-purina-CG-

pirimidina-pirimidina-3´

• > Frecuencia en bacterias

•Metilados en C vertebrados

Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el

antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado

y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen


Gene-gun Inmunización

intradérmica

intramuscular

son plásmidos altamente purificados

producidos en alta cantidad (g/L) liofilizado

y luego inyectados codifican para

antígenos que se expresan in situ

El plásmido se mantiene por un tiempo

como episoma en citoplasma.

Vacunas ADN

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Existen riesgos asociados:

• Integración potencial del plásmido en el genoma de las células hospedadoras.

• Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del plásmido inyectado.

• Problema de conformación no nativa de proteínas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales.

• Liberación accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes

Existen beneficios asociados:

• Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración.

• estimulación de la respuesta humoral y celular.

• Solo expresan genes que inducen inmunidad.

• Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión en la forma nativa .

• Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas.

• Bajo Costo y menor tiempo de preparación



Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas

genéticamente que actúan como bioreactores de

antígenos

Experimental


Experimental

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Vacunas orales

Vehículos: células enteras LAB

o esporas Bacillus

sobrevivir aparato gastrointestinal

•retención de 2 a 3 días

•Vehículo de baja inmunogenicidad

•propiedades adyuvantes

•Sistemas genéticos (Food-Grade)

•No necesita aislamiento y purificación del antígeno

•producción IgA

•administración fácil, evita uso agujas

VACUNAS COMESTIBLES


Experimental


Por qué aún no es posible?


Por qué aún no es posible?

Transferencia Horizontal con bacterias intestinales

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