UNIVERSIDAD NACIONAL“SANTIAGO ANTUNEZ DE MAYOLO”

FACULTAD DE CIENCIAS DEL AMBIENTEESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

PRACTICA DE LABORATORIO N° 01 BIOENSAYO EN CEBOLLAS

ASIGNATURA :BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

DOCENTE :Dr. PALOMINO CADENAS Edwin Julio

INTEGRANTES :- OBISPO PADILLA Yeny- RIOS LEIVA Dani.

HUARAZ - JUNIO - 2014

INDICE

2

I. INTRODUCCION………………………………………………………………....3

II. MARCO TEORICO-CONCEPTUAL………………………………………...…4

II.1 BIOENSAYO…………..………………………………………………..…..4

II.2 BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA TOXICIDAD DEL AGUA………………………………………………………………

II.3 LA ESPECIE ALLIUM CEPA COMO BIOINDICADOR.………5II.4 BIOENSAYOS CON CEBOLLAS………………………………..5

III. METODOLOGIA…………………………………...…………………………..…7

III.1 PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES ANTES DE LA PRUEBA……………..7

III.2 ENSAYO DE TOXICIDAD CON ALLIUM CEPA (CEBOLLA) MEDIANTE LA

EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO PROMEDIO DE

RAÍCES DE CEBOLLA…………………………………………………………….

IV. RESULTADOS………………………………………………………………...…..8

V. DISCUSIÓN…….…………………………………………………………….....…9

VI. CONCLUSIONES…………………………..………………………….…...……10

VII. RECOMENDACIONES………………………..…………………….......…..….11

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA……………...………………………….…..12

IX. ANEXO………………………………...…………...………………………....…..13

3

I. INTRODUCCIÓN

Este informe trata acerca de los bioensayos con, que constituyen un conjunto de

técnicas analíticas que permiten comprender las respuestas biológicas de los

organismos respecto a la toxicidad que sobre ellos provocan determinados

contaminantes o sustancias. Las plantas son los organismos más utilizados para

este tipo de pruebas. La finalidad de todo bioensayo es establecer los límites

permisibles para diferentes sustancias o productos, porque los análisis físicos y

químicos de estas no son suficientes para comprender su toxicidad, ni para evaluar

el potencial contaminador de cualquiera de ellos sobre la biota.

En esta oportunidad utilizamos la cebolla, donde evaluamos los efectos tóxicos

que le provocan ciertos compuestos.

La prueba se basó en la determinación de los efectos de intoxicación en la cebolla

observados una semana después de haberlos sometido a algunos desinfectantes y

contaminantes. Durante este ensayo se expuso la parte terminal de cada cebolla

(donde se hallan las raíces) a diferentes concentraciones de las muestras tóxicas.

Los resultados de cada cebolla fueron de acuerdo a las características finales que

adquirieron sus partes terminales, por ejemplo, el crecimiento de nuevas raíces o

la ausencia de estas.

Los resultados obtenidos de los bioensayos permiten el establecimiento de

criterios de calidad.

4

II. MARCO TEORICO-CONCEPTUAL.

2.1. BIOENSAYO.

El bioensayo es una técnica de análisis, que consiste en identificar e

interpretar las respuestas biológicas de los organismos cuando son expuestos

a diferentes concentraciones de sustancias, ya sea contaminantes (aguas

residuales, lixiviados, relave, etc.) o productos comerciales (desinfectantes,

xenobióticos, etc.), los cuales se encuentran alterando la vida en nuestro

ambiente.

Los bioensayos de toxicidad, en esencia, son utilizados con el objeto de

evaluar en forma efectiva y eficiente los efectos tóxicos agudos y crónicos

de sustancias sobre los organismos vivos. Asimismo, permite establecer los

límites permisibles para diferentes sustancias o productos que se desechan,

porque los análisis físicos y químicos de estas no son suficientes para

comprender la toxicidad de cualquier producto, ni para evaluar el potencial

contaminador de cualquiera de ellos sobre la biota. Los resultados obtenidos

de los bioensayos, facilitan el establecimiento de criterios de calidad

diferentes usos del agua, y en algunos casos estos son adoptados como

normas sociales en diferentes países.

Esta técnica cuantifica la relación concentración-efecto de compuestos

químicos conocidos o mezclas complejas, por medio de respuestas

biológicas medidas bajo condiciones controladas y estandarizadas.

Según FAO (1981), citado por Reish y Oshida (1987), se entiende por

bioensayo "una prueba en, que un tejido, organismo o grupo de organismos

vivos se usan como reactivo para determinar la potencia de cualquier

sustancia fisiológicamente activa, cuya actividad se desconoce".

Los efectos en los organismos son muy diversos y pueden manifestarse con

inhibición o magnificación, es decir: muerte, crecimiento, multiplicación,

cambios morfológicos, fisiológicos o histológicos, etc.

2.2. TIPOS DE BIOENSAYOS

POR EL TIEMPO DE DURACIÓN.

Las pruebas pueden durar varios periodos de tiempo, pero las de 96 horas

son las más comunes. Los individuos son expuestos a concentraciones

5

crecientes del tóxico para determinar cambios en el organismo. En

general la muerte es el criterio más utilizado en la prueba de 96 horas.

- Bioensayos de corta duración.- Estas pruebas pueden ser

estáticas, de renovación o flujo continuo, dependiendo de los

organismos de prueba, los objetivos, el equipo, el agua

suministrada y el tóxico. Estas pruebas se usan para dar una idea

de la toxicidad de efluentes, desechos o materiales para

organismos acuáticos específicos. Sirven de base para la selección

de concentraciones del efluente o material de desecho que se

usará en bioensayos a largo plazo.

- Bioensayos de duración intermedia.- Estos bioensayos también

pueden ser estáticos o de flujo continuo, con duración de 15 a 90

días. Estas pruebas pueden tener una duración de 24 h con

efluentes de baja toxicidad o que son de actividad lenta, pero se

pueden continuar hasta 30 días, que es la duración general.

- Bioensayos de larga duración.- Estas pruebas son con amplia

exposición sobre todos los estadios del ciclo de vida que sea

posible, para determinar la máxima concentración del efluente,

desecho material que no produce efectos dañinos con exposición

continua. Este tipo de pruebas se utilizan para determinar efectos

sobre crecimiento, reproducción, desarrollo de productos

sexuales, maduración, logro de la nidada, crecimiento y

supervivencia de diferentes estados de vida, conducta y

bioacumulación.

POR SUS EFECTOS.

- Bioensayos de toxicidad aguda.- Ocurren dentro de un periodo

corto (minutos, horas o algunos días) en relación con el periodo

de vida del organismo de ensayo. Las pruebas agudas cuantifican

las concentraciones letales de un xenobiótico a una especie en

particular. El valor calculado se denomina concentración letal

media (CL50) y corresponde a la concentración de un xenobiótico

que causa la muerte al 50% de la población experimental al cabo

de un tiempo determinado, generalmente en 48 o 96 h.

6

- Bioensayos de toxicidad crónica.- Ocurren durante un periodo

relativamente largo de exposición (una porción significativa de la

vida del organismo >10%). Las pruebas crónicas estiman la

concentración–efecto media (CE50) de la sustancia de prueba que

causa un efecto al 50% de la población experimental, al cabo de

un tiempo determinado, depende de la estadía de vida considerada

o del ciclo de vida del organismo empleado.

Alternativamente, un ensayo definitivo puede utilizarse para estimar el

tiempo requerido para producir un efecto al 50% de los organismos

(TE50), a una concentración específica.

POR LA APLICACIÓN DE SUS TRATAMIENTOS.

- Bioensayos estáticos.- Se efectúa sin la renovación continua del

flujo constante de las diluciones sometidas al ensayo. Son pruebas

dirigidas en laboratorio para determinar los efectos de toxicidad

sobre algunas especies de organismos acuáticos, sometiendo los

ejemplares de prueba a condiciones más o menos arbitrarias; la

toxicidad evaluada no está asociada con la demanda de oxígeno y

es debida a sustancias relativamente estables. Los bioensayos

estáticos se usan para organismos de prueba de fitoplancton,

zooplancton y peces, porque no es necesario renovar su solución a

prueba antes de 96 h.

- Bioensayos con renovación periódica.- Los especímenes se

someten a una preparación fresca de la misma concentración

inicialmente empleada, periódicamente (generalmente cada 24

horas). Los bioensayos a corto plazo de renovación o flujo

continuo son usados con macro invertebrados y peces. Pueden

realizarse con organismos en diferentes estados de su ciclo de

vida. Determinan la toxicidad comparativa de diferentes desechos

o efluentes, así como la sensibilidad de los organismos a un

material dado, determinan también los requerimientos en corto

plazo de oxígeno, pH, temperatura y otros factores ambientales.

7

- Bioensayos de flujo continuo.- Circula continuamente una

corriente de sustancia de prueba nueva en contacto con los

individuos experimentales. Se realizan con la renovación continua

o casi continua de las diluciones sometidas al ensayo, con el fin

de mantener casi constantes las concentraciones de las sustancias

tóxicas activas (FAO, 1981), teniendo así una dinámica del agua y

del tóxico.

2.3. LA ESPECIE ALLIUM CEPA COMO BIOINDICADOR.

La especie vegetal denominada Allium cepa conocida vulgarmente como

“cebollas” cumple los requisitos para ser considerada un buen bioindicador

de calidad de agua: es una especie que muestra sensibilidad en el desarrollo

de las raíces, muestra un rápido crecimiento, es de fácil manejo en el

laboratorio y es sensible a la presencia de contaminantes.

2.4. BIOENSAYOS CON CEBOLLAS

Los bioensayos con plantas vasculares constituyen una excelente

herramienta de diagnóstico para la evaluación del riesgo ambiental.

El objetivo de nuestro trabajo consistió en emplear una metodología sencilla

y de bajo costo para la detección de contaminación en el agua. Para ello

analizamos el posible efecto contaminante de diferentes concentraciones de

algunos productos de uso cotidiano sobre: 1) el desarrollo de las raíces de

cebolla (Allium cepa); 2) la germinación de 3 variedades de arroz (Oryza

sativa) y 3) el crecimiento de raíces del repollito de agua (Pistia stratiotes).

En segundo término, sobre la base de las siguientes condiciones:

sensibilidad a los tóxicos, importancia ecológica, abundancia, alta tasa de

crecimiento y facilidad de manejo en el laboratorio, evaluamos la

posibilidad de emplear algunas especies de nuestro medio como

bioindicadoras.

Finalmente, aplicamos estos bioensayos en la evaluación del grado de

contaminación en un ecosistema acuático de nuestra región donde se vierten

efluentes de una planta textil.

A través de la aplicación estos bioensayos y de la detección de nuevas

especies que puedan ser empleadas para evaluar la calidad del agua de

8

nuestros ambientes acuáticos, pretendemos contribuir al cuidado del medio

ambiente y al mejoramiento de la calidad de vida.

Resumen

Una de las necesidades más relevantes en el manejo y la gestión ambiental,

es el desarrollo de métodos de monitoreo para la evaluación de los efectos

tóxicos sobre los seres vivos como consecuencia del uso y el vertido de

contaminantes provenientes de la actividad agro-industrial y del desarrollo

de grandes centros urbanos. Entre la metodología existente, la aplicación de

bioensayos de toxicidad con plantas vasculares, está siendo considerada de

manera creciente en baterías de ensayo para el diagnóstico ecotoxicológico.

En el presente trabajo se analiza el efecto de productos de uso cotidiano

sobre el desarrollo de algunos vegetales, se evalúan algunas especies de

plantas que crecen en el Nordeste de Argentina como posibles

bioindicadores y se emplean bioensayos para determinar el grado de

contaminación en un ecosistema acuático de la región

A tal efecto se evaluó el efecto de diferentes concentraciones (25%, 10% y

5%) de productos de uso cotidiano (detergente, shampoo, jugo concentrado

y vinagre) sobre: 1) el desarrollo de las raíces de cebolla (Allium cepa); 2)

la germinación de 3 variedades de arroz (Oryza sativa) y 3) el crecimiento

de raíces del repollito de agua (Pistia stratiotes). Además se empleó el test

de Allium cepa para evaluar el nivel de contaminación de un curso de agua

donde se vierten efluentes de una planta textil.

Los productos probados afectaron marcadamente el desarrollo de las raíces

de cebolla. El arroz y el repollito de agua también fueron sensibles a dichos

productos. Estas dos últimas especies cumplen con las siguientes

condiciones: sensibilidad, abundancia, importancia ecológica y fácil manejo

en el laboratorio. Sin embargo, el arroz debido a la lentitud del proceso de

germinación, no constituiría un material adecuado para ser utilizado en

bioensayos. De modo contrario, el repollito de agua podría emplearse como

herramienta de diagnóstico. Con relación a los ensayos para la detección de

contaminación en un ecosistema acuático de la región, se comprobó que los

desechos vertidos por el establecimiento textil alteran el ecosistema

estudiado ya que el agua evaluada presentaba toxicidad aguda.

9

3. METODOLOGÍA.

3.1. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES ANTES DE LA PRUEBA.

Para las pruebas de bioensayo se prepararon las siguientes soluciones:

- Agua San Carlos- Detergente, 5 gramos en un litro de agua destilada.- Etanol, 70% para un litro de agua destilada.- Pinesol, 15.6ml en un litro de agua destilada.- Lejía, 48ml en un litro de agua destilada.- Relave, 20 gramos en un litro de agua destilada.- Bicloruro de mercurio, 1 gramo en un litro de agua destilada

3.2. DESARROLLO DE LA PRUEBA.

- Se utilizó a las cebollas como organismo de bioensayo (muestra biológica), que fueron sometidos a las diferentes soluciones preparadas.

- En cada solución de prueba se introdujo las cebollas (la parte meristemal).

- Después de una semana observamos los efectos, identificando ciertas características físicas.

10

4. RESULTADOS.

4.1. BICLORURO DE MERCURIO

Análisis individual:

4.2. ETANOL

Se observa, la ausencia del crecimiento de los meristemos.

Cebolla 01

Coloración negrusca en la parte final de la cebolla.

Cebolla 02

El interior de la cebolla comienza a tornarse amarrilla.

Cebolla 03

No se observó el

crecimiento de raíces en la

cebolla.

11

4.3. DETERGENTE

CEBOLLA 1

DATOS DE LA CEBOLLA N° 1Raí

zTamaño (cm) Raí

zTamaño (cm) Raíz Tamaño (cm)

1 0.3 12 0.5 23 0.12 0.3 13 0.3 24 0.33 0.2 14 0.3 25 0.34 0.4 15 0.3 26 0.15 0.2 16 0.2 27 0.26 0.4 17 0.3 28 0.157 0.4 18 0.4 29 0.28 0.5 19 0.3 30 0.19 0.5 20 0.3 31 0.2

10 0.4 21 0.2

La cebolla se emblanqueció debido a que

absorbió el etanol como mecanismo de

reacción.

12

11 0.2 22 0.2

CEBOLLA 2

DATOS DE LA CEBOLLA N° 2Raíz

Tamaño (cm) Raíz

Tamaño (cm) Raíz

Tamaño (cm) Raíz

Tamaño (cm) Raíz

Tamaño (cm)

1 0.4 11 0.3 21 0.4 31 0.6 41 0.252 0.6 12 0.4 22 0.5 32 0.4 42 0.53 0.3 13 0.3 23 0.5 33 0.4 43 0.24 0.5 14 0.2 24 0.4 34 0.2 44 0.55 0.5 15 0.2 25 0.5 35 0.3 45 0.36 0.3 16 0.2 26 0.4 36 0.2 46 0.57 0.3 17 0.5 27 0.5 37 0.4 47 0.28 0.2 18 0.2 28 0.5 38 0.3 48 0.59 0.2 19 0.4 29 0.5 39 0.25 49 0.2

10 0.3 20 0.2 30 0.5 40 0.2

OBSERVACIÓN: Cambio el olor del agua.

CEBOLLA 3

En la cebolla 3 tiene mucosa y no se encontró meristemos.

4.4. AGUA DE MESA SAN CARLOS

CEBOLLA 1

DATOS DE LA CEBOLLA 1Raíz Tamaño (cm)

1 2.12 1.23 1.94 1.55 1.46 0.97 1.98 1.69 1.1

10 0.7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tamaño de Raíz

C1

13

CEBOLLA 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28-0.5

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

Tamaño de raíz

C2

CEBOLLA 3

DATOS DE LA CEBOLLA 3Raíz Tamaño (cm) Raíz Tamaño (cm) Raíz Tamaño (cm)

Raíz Tamaño (cm) Raíz Tamaño (cm) Raíz Tamaño (cm)

1 1.9 11 5.5 21 4.9 31 2.0 41 4.7 51 4.02 3.7 12 2.2 22 5.2 32 2.2 42 5.7 52 4.63 3.2 13 5.2 23 4.5 33 0.7 43 5.0 53 5.3

DATOS DE LA CEBOLLA 2Raíz Tamaño (cm) Raíz Tamaño (cm)

1 0.4 15 3.02 2.9 16 5.53 3.2 17 2.54 4.7 18 1.15 6.0 19 0.46 2.6 20 2.57 3.0 21 0.98 4.0 22 2.49 4.9 23 6.0

10 5.3 24 2.811 0.8 25 5.312 4.3 26 0.513 0.9 27 1.514 0.5 28 4.0

14

4 2.4 14 4.9 24 3.2 34 0.2 44 6.0 54 4.85 4.7 15 4.4 25 2.6 35 1.0 45 5.56 4.4 16 4.0 26 4.4 36 1.0 46 3.47 1.6 17 0.5 27 3.0 37 3.5 47 1.08 3.5 18 0.6 28 4.5 38 3.1 48 0.59 3.6 19 4.1 29 4.8 39 3.4 49 5.9

10 4.2 20 5.4 30 4.7 40 4.1 50 4.5

Datos generales:

C1 C2 C3# de Meristemos 10.0 28.0 54.0

Prom 1.4 2.9 3.6Desv. Est. 0.5 1.8 1.6

4.5. PINESOL

CEBOLLA 1

DATOS DE LA CEBOLLA 1Promedio 0

Desviación estándar 0

15

CEBOLLA 2

DATOS DE LA CEBOLLA 2Raíz Tamaño (mm)

1 22 3

Promedio 2.5Desviación estándar 1.53

1 20

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

2

3

MUETRA N° 2TA

MAÑ

O D

E LO

S M

ERIS

TEM

OS

CANTIDAD DE MERISTEMOS

CEBOLLA 3

DATOS DE LA CEBOLLA 3Raíz Tamaño (mm)

1 42 33 44 35 36 27 58 59 4

10 511 41213 514 415 316 517 418 319 520 321 5

16

Promedio 3.95Desviación estándar 0.94

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 200

1

2

3

4

5

6

MUESTRA N°3

CANTIDAD DE MERISTEMOS

TAMAÑO DE LOS MERISTEMOS

4.6. SAPOLIO

CEBOLLA 1

Raíz tamaño (mm)1 32 2.53 24 25 26 37 2.58 29 2

10 2.811 2.512 1.513 1.514 215 216 117 1.118 0.519 0.520 0.521 0.622 123 1.224 1.325 126 0.927 0.5

17

28 129 0.830 0.731 0.532 0.633 134 0.735 136 1.237 1.338 0.639 0.840 0.7

Prom 1.358Des. est 0.764

CEBOLLA 2

Raíz tamaño (mm)1 32 33 1.54 1.55 2.56 1.57 1.28 1.29 2

10 111 1.212 213 1.514 215 116 117 118 119 120 1.221 0.822 0.723 1.124 0.725 126 1.327 128 0.929 130 1.2

Prom. 1.367Dev.est 0.609

18

CEBOLLA 3

Raíz tamaño (mm)1 3.52 43 34 35 26 27 28 2.59 3

10 2prom 2.7

devest 0.715

N° de meristemoscebolla 1 40cebolla 2 30cebolla 3 10Promedio 26.66666667

Desv. Estand. 15.27525232

4.7. RELAVE

La cebolla se quemó. No hubo crecimiento de raíces.

19

4.8. LEGÍA

Como mecanismo de reacción la cebolla generó sulfuros (color negro).

No hubo crecimiento de raíz.

La cebolla se blanqueó

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5. DISCUSIÓN.

- En el agua San Carlos, que es una sustancia sin ningún efecto tóxico, creció

muchas raíces.

- La legía y el etanol blanquearon a la cebolla, ya que esta la absorbió como

mecanismo de reacción.

- El relave fue letal para la cebolla, ya que la quemó. La cebolla generó sulfuro

como mecanismo de reacción.

6. CONCLUSIONES.

- Los bioensayos que se realizan en laboratorio nos proporcionan una información valiosa para comprobar la toxicidad de las soluciones que se prueban.

- Las plantas, como la cebolla, son uno de los mejores indicadores biológicos que se pueden emplear debido a su rápida y notoria reacción. Además es un procedimiento muy económico.

- Cada solución sometida a prueba tuvo efectos distintos sobre las distintas cebollas (efectos leves y letales).

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7. RECOMENDACIONES.

- El objetivo primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cómo afectaría a los organismos vivos en su medio natural y para ello sería apropiado hacer una investigación de esta afectación de las plantas.

- Con las técnicas de bioensayos se podría llegar a establecer normas convenientes, cuyos criterios nos permitan determinar índices de toxicidad que se encuentren en el medio ambiente acuático y que ocasionan una afectación en la vida de los organismos a corto, largo y mediano plazo.

- Con datos cuantitativos podríamos hacer una evaluación estadística para los resultados de la concentración.

22

8. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA.

- FAO. (1981): Manual of methods in aquatic environment research. Part 4.

- GONZALEZ, M. (1978): Bioensayos sobre los efectos del tetracloruro de

mercurio.

- WANG D.Y. AND B.Q. HUANG. 1999. TBT (Tributyltin) Toxicity to the

Visual and Olfactory Functions of Tigerperch (Terapon jarbua Forsskål).

Zoological Studies 38(2):189-195.

- Iannacone, J., Alvariño, L., Caballero C. y J. Sánchez. 2000. Cuatro

Ensayos Ecotoxicológicos para Evaluar Lindano y Clorpirifos. Gayana 64(2):

139-146.

- http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/573/cap8.pdf

- http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/573/cap9.pdf

- http://www.bvsde.paho.org/bvsaca/fulltext/manual/parte2.pdf

- http://www.uaemex.mx/Red_Ambientales/docs/memorias/Extenso/TA/EO/

TAO-57.pdf

- http://www.scielo.org.pe/pdf/rpb/v12n1/v12n1a18

- http://www.eula.cl/doc/CONA%20Bioensayos.pdf

- http://www.oceandocs.net/bitstream/1834/2610/1/TesisMaestria_GSA.pdf