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BIOTECNOLOGIA
Es la aplicación de organismos vivos en
procesos analógicos para beneficios de
hombre.
La biotecnología es uno de los campos
multidisciplinarios que mayor expansión se ha
experimentado, considerándose prioritario
para el desarrollo tecnológico del país, dadas
las posibilidades que ofrece para producir
bienes y servicios a través de procesos
biológicos intensivos y controlados en lugar de
los tradicionales procesos biológicos y/o
químicos extensivos.
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Biotecnología:
Campo del conocimiento dirigido a la
producción de bienes y servicios mediante
sistemas biológicos y sus productos.
Aprovecha enzimas, microorganismos,
tejidos celulares, estructuras subcelulares,
etc.
Cultivo de tejidos
BIOTECNOLOGIA
Ingeniería genética
Es interdisciplinaria
Ciencia y tecnología de
alimentos
Ingeniería mecánica
Microbiología
Biología celular
Química Ingeniería
bioquímica
Informática
Genética
Electrónica
Bioquímica
BIOTECNOLOGIA
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CONOCIMIENTOS:
BIOQUÍMICA
FISIOLOGÍA
GENETICA
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CULTIVO DE TEJIDOS
Es una herramienta de gran utilidades la
biotecnología.
Esta técnica se basa en la totipotencialidad
celular; obteniendo de esta forma una
propagación rápida y masiva de plantas
idénticas a la original a partir de cualquier
parte aislada de la planta.
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Consiste en extraer bajo condiciones asépticas, órganos,
tejidos o células de cualquier parte de la planta y colocarlas en
medios nutritivos para luego cultivarlos en condiciones
ambientales controlados.
TRES FENOMENOS BASICOS
1) ORGANOGENESIS: Formación de órganos (diferenciación).
2) CAULOGENESIS: Formación de callo (no diferenciado,
solamente se acumulan no forman órgano ni nada).
3) EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a
partir de células no germinadas.
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TOTIPOTENCIA
Capacidad de cualquier célula somática para
dividirse y crear un individuo completo y
semejante de aquel que se toma la muestra,
bajo ciertas condiciones químicas y físicas
dados en el cultivo in vitro.
Tipos de cultivos
1. El Desarrollo de estructuras pre-existentes
2. Nueva formación a base de totipotencialidad
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Brote axilar o yema
Desarrollo de ovario
Injerto in vitro
Tuberización
Germinación de semillas
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Floración in vitro Rhizogenesis
Promotor de brotes
Desarrollo de bulbo
Embriogenesis
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APLICACIONES
- INDUSTRIA DE FERMENTACIÓN
- INDUSTRIAS AGROALIMENTARIAS
- INDUSTRIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
- PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS CON CONCENTRADOS DE
PROTEÍNA
- TRATAMIENTO Y VALORIZACIÓN DE SUBPRODUCTOS
AGRICOLAS Y SUS DERIVADOS.
- PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES Y PRODUCCIÓN DE
BIOGAS
- TRATAMIENTO DE MINERALES
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MECANISMO DE GERMINACIÓN EN SEMILLAS
PROCESO DE GERMINACIÓN: TRES ETAPAS
CONDICIONES: HUMEDAD, LUZ, OXIGENO, TEMPERATURA
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CULTIVO IN VITRO
Es una técnica que usa para propagar plantas a partir de
plantas madres por lo que las plántulas obtenidas son
idénticas entre si a la planta madre.
El cultivo de vegetales superiores se inicio hace mas de
medio siglo y es en esta época que alcanza importancia en la
agricultura, en la obtención de nuevas variedades y por la
multiplicación vegetativa a escalas industriales.
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Ventajas
1.- Es masiva y más rápida .
2.- Propagar especies difíciles de multiplicar en forma
tradicional; esto es posible al fenómeno de rejuvenecimiento.
3.- El crecimiento de las plantas in vitro es más vigoroso que el
de las clonadas in vivo; esto se debe sobre todo al
rejuvenecimiento y / o al hecho de que las plantas in vitro se
encuentran libres de enfermedades.
4.- Se consigue una multiplicación libre de enfermedades con
selección rigurosa del material inicial, o bien liberando el
material inicial de enfermedades.
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5.- Homogeneidad del material.
6.- Multiplicación todo el año. Porque se trabaja en
condiciones ambientales controladas.
7.- Ya que se necesita una cantidad de material
relativamente pequeña para iniciar un cultivo in vitro,
se puede realizar una cuidadosa selección del
mismo.
8.- Ahorro de espacio con respecto de los sistemas
tradicionales.
9.- Conservación del material genético.
10.- Fácil transporte e intercambio de material
vegetal.
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Desventajas
1.- En algunos sistemas de propagación in vitro la
estabilidad genética es débil.
2.- Las plantas producidas in vitro pueden mostrar
características poco convenientes in vivo: Excesiva
producción de ramas laterales y paso total a la fase juvenil.
3.- La aclimatación de las plántulas es un proceso difícil y
puede que muchas veces, los mayores porcentajes de la
pérdida se presenten en esa etapa.
4.- Difícil respuesta inicial de algunas especies y genotipos.
5.- Variación de respuesta entre los genotipos.
6.- Alto costo de establecimiento de un laboratorio, lo que
incide indirectamente en el precio final de la planta
producido de esta manera.
7.- Necesidad de una mano de obra especializada.
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ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO in vitro
ESQUEMA DE LA REALIZACIÓN DE CULTIVO “IN VITRO”
Material a sembrar
Aislamiento o explante
Esterilización del hipoclorito o Cl2Hg
Preparación del medio nutritivo
Esterilización en autoclave
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EQUIPO NECESARIO PARA EL CULTIVO IN VITRO
- Autoclave
- Cámara de flujo laminar
- Medio de cultivo
- Planta
- Cámara de cultivo
Presión de 1.5 atm y una temperatura hasta 120º.
- Cámara de flujo laminar
Es una mesa con una campana de extracción, para uno o dos
operarios en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para
esterilizar el aire.
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TECNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MANIPULACIONES
ASEPTICAS
ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO
ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE
ESTERILIZACIÓN POR MEDIOS QUÍMICOS
ESTERILIZACIÓN POR MEDIO NUTRITIVO
ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO
ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
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Ejemplos:
Avena sativa - 7 Hrs
Zea mays - 8 Hrs
Triticum aestivum - 15 Hrs
Phaseolus vulgaris - 5 Hrs
CLORURO DE MERCURIO
CLORAMINAT Y IODOSUCCIANAMIDA
ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
HIPOCLORITO DE CALCIO
TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN DE SEMILLAS EN
HIPOCLORITO DE CALCIO 3%
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-Medio de cultivo
Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de
ensayo, que se tapa con un tapón.
Dependiendo del material que se va a
propagar, el tubo se pone vertical o un poco
inclinado.
-Planta
El material vegetal de partida puede ser del
campo, pero esto conlleva un alto riesgo de
enfermedades y contaminación, aunque se lave
mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes
que crecen en condiciones controlada para que
halla menos infecciones.
-Cámara de cultivo
La cámara de cultivo es una habitación de
dimensiones muy variables, en la que se controlan
las condiciones de luz, temperatura, humedad,
variación día-noche, etc..
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Medio de cultivo
Es suma importancia
Estado del cultivo - Sólido o líquido
Componentes
La diferencia principal entre los medios surge por ser variables los
requerimientos nutritivos de las especies.
Debe ser específicos para la parte de la planta que se esté cultivando
y para la respuesta que se desea obtener.
Una vez preparado el medio de cultivo, se ajusta el pH, ya que su
valor final es importante pues puede afectar, entre otros, a los enzimas y
a algunos componentes del medio de cultivo.
Medio de Iniciación:
Rugini (MIR),
Olive Medium (OM),
Murashige y Skoog (MS),
Lloyd y McCown,
García-Berenguer,
Fiorino y Leva
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COMPONENTES DEL MEDIO NUTRITIVO
AGUA
SALES MINERALES
MACRONUTRIENTES (N, S, P, Ca, K, Mg)
MICRONUTRIENTES (Fe, Cu, Mn, Al, B)
COMPUESTOS ORGANICOS
CARBOHIDRATOS
SUSTANCIAS HORMONALES
AMINOACIDOS Y AMIDAS
COMPUESTOS ORGANICOS
BASES ORGANICAS
INOSITOL
ACIDO MALICO
COMPUESTOS NATURALES
SUSTANCIAS INERTES
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Reguladores de crecimiento
Aquellas substancias que son sintetizadas en un
determinado lugar de la planta y se translocan a otro,
donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando el
crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal.
Pueden ser de origen natural como sintetizadas en
laboratorio que determinan respuestas a nivel de
crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.
Las hormonas vegetales se clasifican en cinco grupos:
Auxinas
Citocininas o citokininas
Giberelinas
Etileno
Acido abcísico
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REGULADORES DE CRECIMIENTO
AUXINAS ACIDO-3- INDOLACETICO (AIA)
ACIDO-3-INDOLBUTIRICO (AIB)
ACIDO NAFTALENACETICO (ANA)
ACIDO-4- CLOROFENOXIACETICO (2, 4-D)
ACIDO -4-AMINO- 3, 5, 6 TRICLOROPICOLINICO
(TORDAN)
CITOCININAS 6-ISOPENTENIL AMINOPURINA (IPA)
ZEATINA
6-FURBURIL ADENINA (KINETINA)
6-BENCIL AMINOPURINA (BA)
GIBERELINAS GA, GA2, GA3.... GA40
GA3 = ACIDO GIBERELICO
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Las funciones de las auxinas:
1. Dominancia apical
2. Aumentar el crecimiento de los tallos
3. Promover la división celular en el cambio vascular y diferenciación del
xilema secundario
4. Estimular la formación de raíces adventicias
5. Estimular el desarrollo de frutos (partenocárpicos en ocasiones9
6. Fototropismo
7. Promover la división celular
8. Promover la floración en algunas especies
9. Promover la síntesis de etileno (influye en los procesos de maduración
de los frutos)
10. Favorece el cuaje y la maduración de los frutos
11. Inhibe la abscisión ó caída de los frutos
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Funciones de las citocininas:
1. Estimulan la división celular y el crecimiento
2. Inhiben el desarrollo de raíces laterales
3. Rompen la latencia de las yemas axilares
4. Promueven la organogénesis en los callos celulares
5. Retrasan la senescencia ó envejecimiento de los órganos vegetales
6. Promueven la expansión celular en cotiledones y hojas
7. Promueven el desarrollo de los cloroplastos.
Funciones de la giberelinas:
• Incrementan el crecimiento en los tallos
• Interrumpen el período de latencia de las semillas, haciéndolas
germinar y mobilizan las reservas en azúcares
• Inducen la brotación de yemas
• Promueven el desarrollo de los frutos
• Estimulan la síntessis de mRNA (RNA mensajero)
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Funciones Acido abcísico:
1. Promueve la latencia en yemas y semillas
2. Inhibe la división celular
3. Causa el cierre de los estomas
4. Antagónico de las giberelinas
5. Inhibe el crecimiento
Las funciones etileno:
1. Promueve la maduración de los frutos
2. Promueve la senescencia (envejecimiento)
3. Caída de las hojas
4. Geotropismo en las raíces
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Equipo para un laboratorio de cultivo de tejidos:
Cámara de flujo horizontal
Autoclave (20 litros)
Termómetro de máx. y min.
Conductimetro de bolsillo
Equipo de aire acondicionado
Microscopio compuesto
Binocular con sistema de
Estéreo microscopio
Cámara Digital
Agitador magnético con calefacción.
Tanque Eternit de 1100 Litros con
Electro bomba
Centrífuga
Reloj/ alarma
Estabilizador de Voltaje (1000 Wa)
Estabilizador de Voltaje (1KVa)
Autoclave (30 litros)
Autoclave (40 Litros)
Destilador (2 litros/hora)
Destilador de agua
pH-metro
Balanza analítica
Balanza analítica
Des-ionizador
Incubadora
Agitador
Pastilla magnética
Refrigerador
Cámara de termoterapia
Cocinilla eléctrica
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Material de laboratorio:
Pipetas Pasteur s
Pipetas de 1 ml
Frascos de 15 onzas
Probetas 50, 500, 1000 ml
Erlenmeyer de 1000, 500 , 250, 125 ml
Microtiter plate
Discos de Aluminio
Frascos Autoclavables
Recipientes plásticos para pesado
Pipetas 10, 5, 1 ml
Balón de destilación de 1000 y 15000 ml
Matraz quitazato
Placa petri chica y grande
Tubo de ensayo 15 x 150 y 25 x 150 mm
Tubo de ensayo grande 25 x 150
Refrigerante (incompleto)
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Pinzas de Acero inoxidable curva
Mangos de Bisturí
Gradillas 25 x 150
Hojas de Bisturí
Pabilo
Papel aluminios 822.8 m x 304 mm)
Mascarillas 23 unidades
Tijeras de Acero inoxidable
Espátula de acero quirúrgico
Espátula de bronce en curva
Espátula de bronce recta
Secador para material de vidrio
Embudo plástico
Guantes quirúrgicos
Cubre bocas
Baldes de 10 litros
Pizetas de plástico
Algodón 06,5 kg.
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CONDICIONES DEL CULTIVO IN VITRO
En la cámara de flujo laminar no puede entrar material
contaminado. El problema más importante en todo el proceso
son las contaminaciones.
No se pueden esterilizar en el autoclave determinadas
sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico,
sacarosa, enzimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco
recipientes que no soporten altas temperaturas.
El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no
suministre al medio sustancias contaminantes para la planta.
Los reguladores de crecimiento (hormonas) son
imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio
de cultivo.
Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.
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El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Valores bajos,
inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes
añadidos a los medios sólidos.
Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se
puede producir su licuación.
El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos
componentes del medio de cultivo.
El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados
nutrientes por parte del explante (p.e. la absorción de iones NO3-
aumenta con la acidez del medio).
El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y
como consecuencia a la actividad de muchos enzimas
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El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de
energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.
El medio de cultivo es específico, y se pueden tardar dos años en
prepararlo.
En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20
horas) y temperatura.
- Existen plantas que se desarrollan en la oscuridad.
- Lo normal son 22-26ºC, y en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y
también 28-30ºC para plantas tropicales.
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LAMPARAS
INCANDESCENTES
Producen la luz por fenómenos de incandescencia
del filamento calentado por el paso de la corriente
eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la
zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad
de calor y mucho consumo de electricidad.
LAMPARAS
FLUORESCENTES
Producen la luz por fenómenos de fluorescencia
del gas sometido a un arco voltáico. El espectro de
la luz producida es rico en la zona del azul, existen
fluorescentes especiales con un espectro rico en
la zona azul y roja. Consumen menos electricidad.
LAMPARAS DE
VAPOR DE
MERCURIO Y
SODIO
Producen la luz por efecto del paso de la corriente
eléctrica a través de gases calientes de mercurio
(azul y verde) y sodio (naranja). Son altamente
eficientes en el consumo de electricidad.
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Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación
también influyen determinadas características de la
planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de
explante, parte más juvenil o más adulta.
En cuanto a los recipientes, deben permitir el
intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo
que provocaría un aumento de la concentración de sales,
y por tanto la muerte de la planta. Importante el cerrar o
sellar.
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Explante es un fragmento cortado de un tejido o de un
órgano utilizado para iniciar un cultivo. Un explante
puede ser utilizado casi cualquier órgano o tejido, pero
para la micropropagación es conveniente partir de una
yema o ápice meristemático para garantizar la estabilidad
genética de sus células.
Inicio del cultivo in vitro
El material vegetal: Célula, tejido u órgano de la planta.
Partiendo de: fragmentos de tejidos somáticos, tallo, raíz,
hoja, meristemos, embriones; o de células o tejidos no
somáticos, anteras, polen, microesporas, óvulos, etc.
Según sea el explante utilizado se hablará de cultivo de
secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de polen,
de embriones, etc.
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Una regeneración de planta completa (morfogénesis o
órganogenesis) puede ser mediante la formación de raíces
(rizogénesis) y/o de tallos.
La morfogénesis parte del explante inicial por la formación de
raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal
(adventicias/os).
Morfogénesis indirecta:
Se produce después de la
formación de un callo.
Morfogénesis directa:
Se produce directamente
del explante sin que este
pase por fase de callo.
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Las condiciones de cultivo pueden dar origen a una
proliferación desorganizada de las células del explante
dando lugar a un callo o incluso a un cultivo de células
cuando se separan éstas del callo.
Se conoce como Caulogenesis a la formación de callo (no
diferenciado, solamente se acumulan no forman órgano ni
nada).
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El explante puede producir unas estructuras bipolares que
presentan las propiedades morfológicas de los embriones
zigóticos.
Estas estructuras se denominan embriones somáticos. Estos
pueden provenir directamente del explante o de un callo y se le
denomina Embriogénesis directa o indirecta.
EMBRIOGENESIS SOMATICA: Formación de embriones a partir de
células no germinadas.