biotecnologia

Actualización Profesional en Manejo de Recursos

Naturales, Agricultura Sostenible y Pobreza Rural

Introducción a laBiotecnología Vegetal

William M. Roca, Ph.D.

Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)

Hernando Ramírez, M.Sc.

Universidad Nacional de Colombia

Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc.

CEDAF

Octubre, 2000

Introducción a la Biotecnología CEDAF

William M. Roca / Hernando Ramírez

© Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc. (CEDAF), Santo Domingo, República Dominicana. Octubre del 2000.

Derechos exclusivos de edición en castellano reservados para todo el mundo: CEDAF. Calle José Amado Soler No. 50, EnsancheParaíso. Apartado Postal 567-2. Santo Domingo, República Dominicana.

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Hecho el depósito que prevé la ley 418. Impreso en la República Dominicana.

Cita correcta:

William M. Roca, Hernando Ramírez. 2000. Introducción a la Biotecnología Vegetal. Coordinador de la Producción deDocumentos Originales: Vicente Zapata S., Ed. D., Cali , Colombia. 174p.

Palabras Claves:

1. Biotecnología 2.Cultivo de Tejido 3. Marcadores Moleculares 4. Genética de Plantas 5. Perspectivas Futuras.

ISBN: 99934-821-4-5

Octubre del 2000

Santo Domingo, República Dominicana

CEDAF Introducción a la Biotecnología


Tabla de Contenido

Presentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i

Agradecimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii

Autoevaluación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v

Autoevaluación - Información de retorno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi

Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

Estructura General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii

Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

Sección 1 Una Introducción a la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1 ¿Qué es la Biotecnología? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Breve Historia de la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 La Nueva Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Sección 2 Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo De Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34




Sección 3 Tecnología del DNA Recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43


Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45


3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genética? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genética . . . . . . . . . . . . . 47

3.3 Aislamiento de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4 Secuenciación del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58


Sección 4 Marcadores Moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69


Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71


Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.1 El genoma y la variabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.2 Los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85



Sección 5 Transformación Genética de Plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91


Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93


Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.1 ¿Porqué transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.3 Transformación genética de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . . 98

5.4 Transformación por introducción directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

5.5 Logros de la ingeniería genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

5.6 Ejercicio 5.1 Transformación genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Sección 6 Perspectivas Futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.1 Relaciones institucionales y la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

6.2 Costo - beneficio de la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

6.3 Propiedad intelectual y comercialización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

6.4 Producción de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . 125

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

Originales para trasparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127



Anexos

Anexo 1. Evaluación final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno . . . . . . . . . . . . . 138

Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana. . . . . . . . . . . . . . . . . 146

Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

Presentación

Numerosos diagnósticos aseveran un grave deterioro de la base de recursos naturales de la República Do-minicana. Estos estudios indican que la cobertura forestal, de cuestionable calidad y uniformidad, no pasadel 12 por ciento y que una parte importante de los 2.8 millones de hectáreas con aptitud forestal en el paíshan sido y están siendo utilizadas inadecuadamente. Al igual que en la mayoría de los países tropicales, elmal manejo de los suelos y de los sistemas de cultivo ha resultado en una acentuada perdida de su fertili-dad, estructura y materia orgánica; así como en erosión y contaminación. El resultado ha sido una dismi-nución de la productividad agrícola y un incremento significativo en los costos de producción.

Se han logrado avances significativos en las regiones tropicales en el desarrollo de tecnologías adecuadaspara mejorar la productividad agropecuaria en sistemas sostenibles. Sin embargo, estos resultados rarasveces llegan al campo, debido principalmente a deficiencias en el entendimiento de las relaciones entrelos componentes de los sistemas agrícolas tropicales por aquellos que dirigen el sector, incluyendo profe-sionales agropecuarios y extensionistas. En el orden institucional, se observan organismos del sector pú-blico débiles y con duplicidad de funciones, con escasos recursos para atender problemas que sobrepasansus capacidades. Más aún, faltan liderazgos institucionales que coordinen la formulación e implementa-ción de las políticas.

Quizás, el mayor de todos los problemas que enfrenta la sociedad dominicana es la falta de entendimientode la profundidad y complejidad de problemas relacionados con el deterioro de los recursos naturales delpaís. Ese entendimiento podría variar si científicos, administradores, profesionales y líderes tuvieran laoportunidad de discutir, informar y persuadir a la comunidad en general acerca de la necesidad de enfren-tar los problemas ambientales en general y en particular aquellos relacionados a la sostenibilidad de losrecursos naturales y la agricultura. Brindar esa oportunidad es precisamente lo que pretende el ProyectoÁgora.

El Proyecto Ágora es, en esencia, un cambio del enfoque tradicional de un proyecto piloto para promovercambios sistemáticos. El mismo propone un atajo: agricultores claves, líderes y tomadores de decisionesen los sistemas alimentario y agropecuario, expertos, políticos, periodistas y ONG son convocados y apo-yados técnicamente, para que lleguen a un entendimiento de consenso en temas claves relacionados almanejo de los recursos naturales, la sostenibilidad de la agricultura y el combate de la pobreza rural. Basa-do en ese entendimiento, ellos guiarán o dirigirán sus propias instituciones o negocios para que sean máscompromisarios a las necesidades de un mejoramiento sostenible de la calidad de vida de los pobladoresrurales. El componente Actualización Profesional de Ágora busca dotar al profesional dominicano de co-nocimientos actualizados sobre aspectos conceptuales de desarrollo reciente y sobre tecnologías de puntade uso potencial en el país. Por esta razón se han elaborado los documentos de capacitación que ponemosa disposición del país.

Altagracia Rivera de Castillo

Directora Ejecutiva del CEDAF

William M. Roca / Hernando Ramírez i


Agradecimientos

La estrategia para la elaboración de los documentos de la Serie Proyecto Ágora ha sido muy interesante yardua. Después de muchos meses identificando autores dominicanos para la elaboración de los documen-tos, nos dimos cuenta que no disponían de tiempo para escribirlos. De ahí vino la idea de Vicente Zapata,Gerente de La Organización que Aprende de Colombia, de contratar especialistas colombianos para ela-borar los documentos y a expertos dominicanos que colaborarían con éstos en el suministro de informa-ciones y datos dominicanos así como en la revisión de los contenidos. Por eso debemos agradecer al Dr.Vicente Zapata por la idea, por diseñar la metodología para la elaboración de los documentos y por la co-ordinación general de los trabajos. De la misma manera debemos reconocer y agradecer el esfuerzo delos autores William M. Roca, del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), y Hernando Ra-mírez, de la Universidad Nacional de Colombia.

En diferentes momentos varios especialistas dominicanos aportaron sus ideas y recomendaciones sobreel documento. Entre ellos debemos agradecer a Rafael Ortiz Quezada de la Universidad Nacional PedroHenríquez Ureña (UNPHU), a Rafael Pérez Duvergé del CEDAF, y a Bienvenido Cabral del Instituto Su-perior de Agricultura (ISA) por sus aportes iniciales y sugerencias en la estructura del documento. Agra-decemos además a Bernarda Castillo, del Centro de Biotecnología Vegetal de la Secretaría de Estado deAgricultura y Expedito Diloné, del Jardín Botánico Nacional, por su participación y sugerencias en lasetapas avanzadas de edición.

Todo el personal del CEDAF ha participado de alguna forma en la elaboración, revisión, digitación e im-presión de los documentos que ha originado el Proyecto Ágora. A todos ellos muchas gracias por su dedi-cación y cooperación.

Finalmente, queremos agradecer a todas las personas, incluyendo a profesores y técnicos que ofrecieronsus sugerencias sobre los documentos durante los talleres y reuniones que para esos fines se celebrarondurante los casi dos años de trabajo que duró el proceso completo de elaboración y edición de los docu-mentos.

Gracias a todos.

Teófilo Suriel E.

Coordinador Proyecto Ágora

ii William M. Roca / Hernando Ramírez


Introducción

La agricultura moderna se basa en la utilización de variedades mejoradas (generalmente híbridos) encombinación con paquetes tecnológicos de producción agrícola, como fertilización, protección de plantasy técnicas de riego y cosecha. Esta alta tecnología agrícola ha tenido gran éxito, especialmente en los paí-ses desarrollados. Sin embargo, aún se presentan altas pérdidas en los cultivos, debido principalmente alataque de enfermedades y plagas y por estreses abióticos, como salinidad, acidez y toxicidad por metalespesados. Estos problemas son la principal causa del aumento en el uso de los agroquímicos, lo cual hacontribuido al incremento no sólo del costo de la producción agrícola sino también al deterioro del medioambiente.

Mientras tanto, aumenta la demanda de alimentos, especialmente en los países en desarrollo, que tienenuna alta tasa de crecimiento poblacional, por lo cual se requiere con urgencia incrementar la productivi-dad agrícola.

Para lograr este objetivo se precisa la obtención de variedades mejoradas con menor requerimiento de in-sumos, reduciendo significativamente los costos de producción y el daño ambiental.

En aproximadamente 25 años los avances en biología molecular y celular se han traducido en una tecno-logía emergente (la biotecnología) que encuentra aplicación en diversos sectores de la actividad humana.La salud humana, la agroalimentación, la producción de energía y la protección del medio ambiente sonlos sectores más importantes que utilizan la biotecnología. Hasta el presente la biotecnología aplicada a lasalud humana ha tenido el desarrollo más rápido. Unos cuarenta medicamentos y vacunas se han aproba-do y más de cien están en fase avanzada de estudio y/o pendientes para su aprobación. Gracias a la bio-tecnología, disponemos o están a punto de comercializarse productos terapéuticos para tratar deficienciasde la sangre, enfermedades autoinmunes, cardiovasculares, inflamatorias, algunos tipos de cáncer, o paracombatir agentes infecciosos como el virus de la hepatitis B, el HIV, o el virus del papiloma.

En el ámbito de la agricultura, la producción de semillas resistentes a plagas, a herbicidas, o que mejoranla calidad del fruto ya son realidad. Las ventajas de estas nuevas variedades son evidentes para los secto-res productivos, incluyendo, en algunos casos, al consumidor.

Será preciso que los consumidores tengan la información necesaria para poder elegir basados en la cali-dad y/o el precio y la seguridad de los productos.

El desarrollo de la biotecnología está en sus inicios y el crecimiento previsto para la primera década del si-glo XXI significará duplicar el valor de sus ventas cada cinco años. Se prevé un aumento significativo delas aplicaciones en la agricultura, ya que se estima un crecimiento anual cercano al 20%. Es evidente quesi no es posible aumentar el área de la tierra cultivable, y la población de los países en desarrollo crece alritmo actual, la agrobiotecnología se constituye en una solución para producir los alimentos que necesi-tará la humanidad en el futuro próximo.

William M. Roca / Hernando Ramírez iii


La biotecnología vegetal comprende una serie de técnicas que incluyen:

a. Las técnicas de cultivo de células y tejidos in vitro, muy utilizadas para la clonación de plantas y latransformación genética;

b. Las técnicas de DNA recombinante, que permiten hacer las construcciones genéticas para latransformación de plantas;

c. Los marcadores moleculares que permiten "marcar" los genes de interés; para la construcción demapas genéticos y para estudios de caracterización y filogenéticos.

El objetivo de este módulo, Introducción a la Biotecnología Vegetal, es presentar a los participantes, enforma clara y amena los principios básicos de la Biotecnología Vegetal y su aplicación en la obtención demateriales mejorados.

Este módulo ha sido concebido de tal forma que el participante, al finalizar su lectura, no sólo tendrá unconcepto actualizado de la biotecnología vegetal, sino que tendrá nuevos elementos de juicio para ser uti-lizados en el desarrollo agrícola.

iv William M. Roca / Hernando Ramírez


Autoevaluación

1. Elabore una definición de lo que usted considera es biotecnología.

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2. ¿Por qué cree usted que la cerveza, el vino el queso y el pan son productos biotecnológicos?

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3. Defina qué es el cultivo de tejidos vegetales

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4. ¿Qué aplicación práctica le vería usted a esta técnica?

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5. ¿Qué conoce usted de la ingeniería genética?

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6. ¿Qué es un gen?

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7. ¿Qué es un genoma?

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8. ¿Qué entiende por marcador molecular?

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9. ¿Qué son plantas transgénicas?

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10. ¿Usted cree que es posible introducir un gen de una bacteria a una planta? Explique.

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11. ¿Qué entiende usted por bioseguridad en biotecnología?

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12. ¿Usted considera que el consumo de cultivos transgénicos representan un peligro para la salud humana?

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William M. Roca / Hernando Ramírez v


Autoevaluación - Información de Retorno

Respuestas

Para la pregunta 1

Biotecnología es la aplicación de principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de materiales por medio deagentes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes biológicos se refieren principalmen-te a microorganismos, celulares de animales y plantas, enzimas, material genético aislado y clonado.

Para la pregunta 2

La cerveza, porque se obtiene por un proceso de fermentación.

El queso: es un producto obtenido por un proceso enzimático.

El vino: Se obtiene por un proceso de fermentación.

El pan : en su elaboración interviene un proceso de fermentación.

Para la pregunta 3

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que consiste en aislar una porción de una planta (tejido, órgano o célula), lla-mado explante, para cultivarlo en un medio nutritivo en condiciones físicas y químicas artificiales, para regenerar una plan-ta completa.

Para la pregunta 4

El cultivo de tejidos vegetales puede ser útil para la recuperación de cultivos que estén en vía de extinción, o para la propa-gación masiva de plantas ornamentales, como el caso de rosas, orquídeas, etc.

Para la pregunta 5

La Ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permiten la manipulación del DNA y del RNA. Gracias a la Ingenie-ría genética se pueden aislar y modificar genes que luego son utilizados para producir animales y plantas transgénicas.

Para la pregunta 6

Un gen es un pequeño segmento de DNA que contiene información para una característica genética. Unidad básica de laherencia.

Para la pregunta 7

Genoma es el contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por el contenido genéticodel DNA mitocondrial, del cloroplasto y del DNA nuclear.

Para la pregunta 8

Un marcador molecular es un segmento específico de DNA que está ligado a una característica genética y se utiliza para elmonitoreo de esta característica en un programa de mejoramiento.

Para la pregunta 9

Las plantas transgénicas son plantas a las que se les ha introducido un gen "extraño", el cual les confiere ciertas ventajas so-bre las que no lo tienen, como por ejemplo, resistencia a una enfermedad, plaga, herbicida, o el aumento en la producciónde un producto de uso comercial.

Para la pregunta 10

Sí es posible. Algunos genes que confieren resistencia al ataque de insectos en las plantas son aislados de bacterias. Elcaso más conocido es el de los genes de Bt, que confieren resistencia a algunos insectos lepidópteros.

Para la pregunta 11

La Bioseguridad consiste de políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnología delDNA recombinante en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.

Para la pregunta 12

No. En una planta transgénica sólo se introduce uno o pocos genes cuyos productos han sido cuidadosamente evaluadosantes de ser introducidos a las plantas para descartar cualquier riesgo en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.

Mientras que en el mejoramiento tradicional se introducen muchos genes, de los que se desconocen sus productos y su po-sible riesgo para la salud, medio ambiente y biodiversidad.

vi William M. Roca / Hernando Ramírez


Objetivos

• Presentar a los participantes los principios básicos de la biotecnología vegetal en la obtención demateriales mejorados.

Sección 1

• Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general.

• Conocer algunas etapas de su desarrollo.

• Diferenciar algunos tipos de biotecnologías.

Sección 2

• Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

• Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas.

Sección 3

• Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante.

• Describir las herramientas más importantes de esta tecnología.

• Conocer algunas de sus aplicaciones.

Sección 4

• Entender los principios básicos de los marcadores moleculares.

• Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal.

Sección 5

• Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas.

• Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas.

• Conocer algunas aplicaciones de esta tecnología.

Sección 6

• Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes.

• Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción decultivos transgénicos al campo.

• Entender por qué los cultivos transgénicos son seguros.

William M. Roca / Hernando Ramírez vii


Estructura general

Explicación

Este flujograma muestra la interacción de las diferentes metodologías de la Biotecnología Vegetal (mar-cadores moleculares, ingeniería genética o DNA recombinante, la técnica de cultivo de tejidos y la trans-formación genética de plantas), que en forma lógica permiten la obtención de un cultivo transgénico,desde la caracterización del germoplasma para la búsqueda de genes útiles, hasta la introducción de estosgenes a los cultivos, que luego son sometidos a todo un proceso de valuación antes de ser comercializa-dos.

viii William M. Roca / Hernando Ramírez


Marcadores y Mapas

Moleculares

Ingeniería Genética

Marcadores y Mapas Molecular

Cultivo de Tejidos y Trans formación

Genética

Cultivo de

Tejidos

• Marcadores

Moleculares

• Cruzamientos

• Caracterización de la biodivers idad• Identificación de genes útiles• Mapeo de caracte res comple jos (QTLs)

Clonación y modificaciónde genes

Introducción y expres iónde genes

Plantas Transgénicas

Mejoramiento Multiplicac ión

Ens ayos de Evaluación

Originales para transparencias

William M. Roca / Hernando Ramírez ix


x William M. Roca / Hernando Ramírez


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Una Introducción a la Biotecnología

William M. Roca / Hernando Ramírez 1


Sección 1

Sección 1 . Una Introducción a la Biotecnología

2 William M. Roca / Hernando Ramírez


Tabla de Contenido

Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1 ¿Qué es la Biotecnología? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Breve Historia de la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 La Nueva Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Estructura de la Sección

Objetivos

• Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general.

• Conocer algunas etapas de su desarrollo.

• Diferenciar algunos tipos de biotecnologías.

Preguntas Orientadoras

1. ¿Algún participante nos puede explicar que es biotecnología?

2. ¿Algún participante puede dar ejemplos de productos biotecnológicos?

3 ¿Sabían ustedes que el queso, el pan la cerveza son productos biotecnológicos?



Primera

Generac ión

Fermentación

• Bebidas

• Alimentos

• Combus tibles

Práctica empírica

Poco conocimiento

c ientífico

Segunda

Generac ión

Fermentación

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• Fármacos

• Alimentos

• Proces amiento

de des echos

Conocimiento

c ientífico y de

ingeniería

Tercera

Generac ión

Técnicas deFermentación y

bioprocesos Cultivo in vitrode cé lulas y

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recombinante ytrans formación

gené tica

BIOTECNOLOGÍA

1.1 ¿Qué es la Biotecnología?

La biotecnología se puede definir como: "la aplica-ción de principios científicos y de ingeniería parael procesamiento de materiales por medio de agen-tes biológicos con el objetivo de producir bienes yservicios, en donde los agentes biológicos se refie-ren principalmente a microorganismos, células deanimales y plantas, enzimas, y material genéticoaislado y clonado" (Sasson, 1989).

El concepto de biotecnología fue ampliado a partirde 1970, cuando se inician las tecnologías que per-miten la manipulación de la molécula del DNA,dando origen a la ingeniería genética y con ellanace la "nueva biotecnología".

La biotecnología comprende un conjunto de técni-cas aplicables a diversas actividades de la socie-dad, cuya base fundamental es multidisciplinaria,con disciplinas básicas como la biología celular,la biología molecular, la bioquímica, la genética,la microbiología, la inmunología, la ingenieríaquímica y la ingeniería de procesos.

1.2 Breve Historia de la Biotecnología

Históricamente el desarrollo de la Biotecnologíapuede ser dividido en tres generaciones o etapas:

La biotecnología de primera generación se basó enla fermentación como proceso básico para la pro-ducción de bebidas, alimentos y combustibles.Esta práctica era esencialmente empírica, se hacíaen pequeña escala, y estaba caracterizada por elmínimo conocimiento científico y de ingeniería.

La biotecnología de segunda generación se carac-terizó por la utilización de los conocimientos cien-tíficos y de ingeniería para la obtención deprocesos a escala industrial. Estos procesos esta-ban basados en la aplicación integrada de la micro-biología (usando procesos de mutación y de

selección), bioquímica e ingeniería química. Estasegunda generación incluye: la utilización de fer-mentaciones (bioconversiones y biocatálisis) parala producción de fármacos, combustibles, alimen-tos y procesamiento de desechos. En esta segundafase también se incluye el desarrollo de algunastécnicas recientes, como las de inmovilización deenzimas y las de cultivo de tejidos vegetales yanimales.

La biotecnología de tercera generación, tambiéndenominada "Nueva Biotecnología" surge a co-mienzos de 1970 y se inicia con el descubrimientode la tecnología del DNA recombinante. Esta ge-neración se basa en la biología molecular, la cualtuvo un acelerado desarrollo después del descubri-miento de la estructura del DNA en 1953. Esteevento y el posterior descubrimiento de las enzi-mas de restricción dieron origen a la ingeniería ge-nética y con esta nace la nueva biotecnología.Estas nuevas tecnologías dieron origen a empresasbiotecnológicas, que explotan las técnicas de inge-niería genética para "cortar" y "confeccionar" losgenes que son colocados en microorganismos,como bacterias o levaduras, para que "fabriquenpor encargo" productos químicos y farmacéuticosde interés.

1.3 La Nueva Biotecnología

Los inicios de la biotecnología se caracterizan porun lento progreso de los conocimientos. La rápidaexpansión llegó con el descubrimiento de la es-tructura del DNA. La comercialización de mu-chos de estos descubrimientos ha abierto unmercado de gran envergadura, que incluye no sólola medicina y la genética, sino también, la indus-tria alimentaria, la agrícola, la zootecnia y espe-cialmente la farmacéutica, con un aumento de lapropiedad intelectual.



Los eventos más importantes del desarrollo de labiotecnología incluye:

� 1944

Avery, McCarty y McLeod demuestran que elDNA puede transfer i r una caracter ís t ica he-redi tar ia de una cepa bacter iana a otra .

� 1948

Beadle y Tatun establecen que el papel de losgenes es especif icar la información necesar iapara la producción de proteínas .

� 1951

Wilkins y Frankl in obt ienen las primeras imá-genes de un cris ta l de DNA.

� 1952

Hershey y Chase confirman que el DNA es elmater ia l genét ico.

� 1953

Watson y Crick establecen la estructura de ladoble hél ice , proponiendo un modelo tr idi-mencional en el que las cuatro bases del DNAse acoplan entre sí , s iguiendo reglas muy pre-cisas .

� 1957

Kornberg ident i f ica la DNA polimerasa, enzi-ma que permite la dupl icación de la doble hé-l ice del DNA.

� 1958

Steward logra la regeneración de una plantacompleta a part i r de células somáticas delf loema de la zanahoria , mediante la embrio-génesis somática.

� 1961

Jacob y Monod proponen un modelo de regu-lación de los genes basado en la act ividadinhibidora de cier tas proteínas .

� 1966

Khorana y Nirenberg descifran el lenguajedel código genét ico: la lectura del DNA seproduce en grupos de tres bases ( t r ipletas) .

� 1970

Khorana sintet iza de forma química el pr imergen.

� 1970

Smith y Wilcox descubren las enzimas de res-t r icción.

� 1973 -1974

Berg produce la primera molécula de DNA re-combinante (un plásmido) mediante el corte yposter ior unión de dos fragmentos dis t intosde DNA.

� 1975

Sanger , Maxam y Gilber t desarrol lan técnicaspara la secuenciación del DNA.

� 1975

En Asilomar, Cal i fornia , se real iza la prime-ra conferencia sobre la bioseguridad en el usodel DNA recombinante y los organismos ge-nét icamente manipulados.

� 1977

Se descubre que no todo el DNA de un gensirve para la síntesis de una proteína, la cualocurre sólo en los "exones", es decir , las par-tes que son transcr i tas en el RNA mensajero.Los "intrones" son el iminados del RNA.

� 1978

La compañía Genetech (EE. UU.) ut i l iza bac-ter ias para la producción de insul ina humanarecombinate , que se comercial iza cuatro añosdespués.

1982

Palmiter y Brinster crean el pr imer animaltransgénico, introduciendo la hormona decrecimiento de rata en un ratón.

� 1982

La compañía Calgene (EE.UU.) clona el genresponsable de la resis tencia a un herbicida.

� 1982

VanMontagu y Schel l producen la primeraplanta transgénica ( tabaco) usando el plásmi-do Ti del Agrobacter ium tumefaciens.

� 1983

Mull is pone a punto la técnica de la reacciónen cadena de la pol imerasa (PCR), que permi-te amplif icar (mult ipl icar) secuencias deDNA.



� 1984

Sanford logra transformar tej idos de plantasmediante el bombardeo de part ículas (biol ís-t ica) .

� 1985

Jeffreys descubre que el DNA de cada indivi-duo produce fragmentos caracter ís t icos alser t ra tados con enzimas de restr icción. Porlo tanto sirven como "huel las dact i lares" mo-leculares .

� 1985

Se aprueba el patentamiento de plantas trans-génicas en EE. UU.

� 1986

Tanksley crea los primeros mapas genét icosmoleculares usando RFLPs.

� 1987

La compañía Cetus Corporat ion (EE. UU.)automatiza la técnica del PCR.

� 1988

Se patenta oficialmente en EE.UU. el pr imeranimal transgénico, el "oncoratón".

� 1988

Se inicia el proyecto del "Genoma Humano",con el f in de ident i f icar todos los genes queconforman el DNA del hombre.

� 1990

Will iams desarrol la la técnica de RAPD parala marcación y mapeo de genes.

� 1991

Se anal izan los componentes genét icos(QTLs) responsables de caracter ís t icas com-plejas usando marcadores moleculares .

� 1993

Se desarrol la la biotecnología de biorreacto-res para el cul t ivo de células y tej idos vegeta-les de forma masiva.

� 1994

La compañía Calgene recibe la aprobaciónpara comercial izar tomates transgénicos demaduración retardada.

� 1995

Se desarrol lan los primeros secuenciadoresautomatizados de DNA.

� 1996

Nace la oveja "Dolly" , la pr imera oveja clo-nada: el núcleo de una célula somática de unaoveja adul ta donante fue introducido en unóvulo enucleado.

� 1996

Se siembran los primeros cul t ivos comercia-les de plantas transgénicas (EE.UU.): 3 mi-l lones de hectáreas .

� 1998

La siembra de cul t ivos transgénicos comer-ciales cubren 30 mil lones de hectáreas , pr in-cipalmente en EE.UU., Canadá, Argent ina,China y Mexico.

� 1998

Se fabrican sis temas automatizados (robots)para la extracción, dis t r ibucción y plaqueo demuestras de DNA y otras act ividades de biolo-gía molecular .

� 1998

Se producen los l lamados "chips" de DNA:matr ices diminutas de plást ico para f i jar grannumero de muestras de DNA para el tamizadoy/o lectura masiva de expresión de genes.

� 1999

Se inicia la "nanobiotecnología" (miniatur i -zación del anál is is , detección y separaciónde mater ia l genét ico de manera masiva) .

� 1999

Se da impulso a la bioinformática: la obten-ción , acumulación, anál is is , comparación eident i f icación de datos moleculares / genét i -cos que son ut i l izados para la ident i f icaciónde nuevas secuencias y genes.



Un aspecto importante de la nueva biotecnologíaes que es extensiva en el uso del conocimientocientífico. En el período anterior a Pasteur, la bio-tecnología se limitaba a la aplicación de una expe-riencia práctica que se transmitía de generación engeneración. Con Pasteur, el conocimiento científi-co de las características de los microorganismoscomienza a orientar su utilización práctica, pero lasaplicaciones industriales se mantienen fundamen-talmente como artesanales, con la excepción deunas pocas áreas en la industria química y farma-céutica (como los antibióticos), en las cuales se ini-cia la actividad de investigación y desarrollo en elseno de la corporación transnacional. En todos es-tos casos, la innovación biotecnológica surgió en elsector productivo; en cambio, los desarrollos de lanueva biotecnología se originan en los centros deinvestigación, generalmente localizados en el senode las universidades.

Las nuevas biotecnologías pueden agruparse entres categorías básicas:

1. Técnicas para el cultivo in vitro de células y tejidos,incluyendo el cultivo de microorganismos.

2. Técnicas de fermentación y bioprocesos, incluyendotécnicas de inmovilización de enzimas.

3. Técnicas para la identificación, mapeo, clonación,manipulación y transferencia de genes.

Aún cuando los tres grupos se complementan en-tre sí, existe una diferencia fundamental entre losdos primeros y el tercero. Los primeros se basanen el conocimiento de las características y compor-tamiento de las células y microorganismos y en eluso deliberado de estas características (de cada or-ganismo en particular), para el logro de objetivosespecíficos en materia de nuevos productos y pro-cesos. Mientras que el tercer grupo se caracterizapor su potencialidad para manipular la genética ylas características estructurales y funcionales delos organismos y de la aplicación práctica de esta

capacidad para superar ciertos límites naturalespara el desarrollo de nuevos productos o procesos.

Entre los eventos claves de la nueva biotecnologíaque permitieron el desarrollo de la biotecnologíavegetal se incluyen:

a. La regeneración de plantas completas a partir de par-tes de plantas (explante), cultivadas in vitro;

b. Técnicas para identificar y mapear genes y para de-tectar diferencias entre individuos comparando di-rectamente sus genomas ;

c. Técnicas para aislar, modificar y clonar genes;

d. Técnicas que permiten la transferencia de estos ge-nes a plantas. Estas metodologías serán explicadasmás adelante.

Las aplicaciones a corto plazo de la nueva biotec-nología en la agricultura incluyen: el manejo yconservación de recursos genéticos; la propaga-ción masiva de plantas; los métodos para detec-ción de plagas y enfermedades y la construcciónde mapas moleculares para agilizar los programasde mejoramiento tanto animal como vegetal; la in-troducción y expresión de genes para obtener re-sistencia a insectos; patógenos, herbicidas; o parael mejoramiento de la calidad de proteínas, car-bohidratos y aceites o grasas.

A largo plazo: la manipulación de caracteres com-plejos, lo cual requiere de un previo entendimientode los mecanismos bioquímicos y genéticos de lascaracterísticas poligénicas de interés.

Por esta razón, las actuales investigaciones en bio-tecnología vegetal están encaminadas al aisla-miento y caracterización de genes de importanciaeconómica, sobre todo de secuencias reguladoras,tales como: floración, fotosíntesis, fijación bioló-gica de nitrógeno, etc. Mientras tanto, las aplica-ciones más importantes incluyen:

a. El uso de mapas genéticos y marcadores molecula-res para la identificación de genes de resistencia aplagas y enfermedades;



b. Transferencia de caracteres de interés de especiessilvestres a cultivadas mediante cruces interespecí-ficos o distantes;

c. Producción de plantas transgénicas usando genessimples de resistencia a virus, insectos y herbicidas,de calidad de proteína de semillas, contenido de al-midón y para retardar la maduración del fruto;

d. Utilización de marcadores moleculares para el estu-dio de la diversidad genética de plantas, animales ymicroorganismos. La Tabla 1.1 presenta algunasaplicaciones de la nueva biotecnología en la produc-ción vegetal.

Un paso crucial para la aplicación de la biotecno-logía en la solución de problemas de la agriculturaes la identificación de problemas recalcitrantes auna solución por métodos convencionales, segui-do de un análisis de costo/beneficio de la aplica-ción biotecnológica.

La biotecnología tradicional y la nueva biotecnolo-gía ofrecen también una amplia aplicación no sóloen la industria alimenticia y farmacéutica, sinotambién en muchos procesos industriales (Tabla1.2).

Tabla 1.1 Aplicaciones de la nueva biotecnología.

Fuente: Roca, W. 1986.

1. En la Producción Vegetal:

• Recursos genéticos

ConservaciónCaracterizaciónUtilización

• Mejoramiento genético

Cruzamientos distantesHaploidíaMapas y marcadores molecularesTransformación genética

• Control biológico

Biopesticidas

• Biofertilizantes

• Agroindustria

Propagación masivaControl de calidadValor agregado

2. En el Manejo (Reciclaje) de Productos Agrícolas

• Bioconversión

3. En la Protección del Ambiente (Aguas y Suelos)

• Biorremediación

Tabla 1.2 Aplicaciones de la biotecnología en el sector

industrial. Fuente: Bull et al. 1982.

Química Producción de:

• Orgánica • Etanol, Acetona, Butanol, Acidosorgánicos

• Enzimas

• Perfumes

• Polímeros (principalmente polisacáridos)

• Inorgánica • Bioacumulación y Lixiviación

Farmacéutica Producción de:

• AntibióticosAgentes para diagnóstico(enzimas, anticuerpos)

• Inhibidores de enzimas

• Esteroides

Vacunas

Energía Producción de:

• Etanol (gasohol)

• Metanol (biogas)

Alimentos Producción de :

• Lácteos, productos de pescado y decarne

• Bebidas (alcohólicas, té y café)

• Levadura para panadería

• Aditivos para alimentos (antioxidantes,colorantes, saborizantes, estabilizadores)

• Producción de champiñones

• Aminoácidos, vitaminas

• Producción de almidón

• Glucosa y jarabe de alta fructosa

• Modificaciones funcionales de proteínas,Pectinas

Remoción de toxinas.

Agricultura Producción de:

• Alimentos para animales

• Vacunas para animales

• Ensilaje y procesos de descomposición

• Pesticidas microbianos

• Rhizobium y otros inoculantesbacteriológicos para la fijación denitrógeno

• Inoculantes de micorrizas

ServiciosIndustriales

• Purificación de agua

• Tratamiento de afluentes

• Manejo de desechos

• Recuperación de aceites



1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la

Biotecnología Vegetal

Objetivos

• Elaborar el concepto de biotecnología y susaplicaciones.

• Diferenciar productos biotecnológicos de usocotidiano.

Orientaciones para el Instructor

Con el siguiente ejercicio se busca reafirmar elconcepto de Biotecnología, a través de la identifi-cación y clasificación de productos elaborados me-diante procesos biotecnológicos.

La idea es crear un escenario donde los participan-tes puedan tener contacto directo con productos deuso cotidiano, muchos de los cuales obtenidos porprocesos biotecnológicos, para motivar una discu-sión sobre su obtención y las aplicaciones de algu-nos productos biotecnológicos, muchos de loscuales hacen parte de nuestra vida cotidiana.

Para la realización de este ejercicio se recomiendaque el Instructor lea atentamente las siguientes ins-trucciones:

• Suministrar información sobre los objetivos delejercicio.

• Ubique en un salón cuatro mesas grandes. Encada una de ellas colocar los productos mencio-nados en la lista de recursos.

• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubiquecada grupo en cada una de las mesas (con losproductos).

• En cada grupo de trabajo, los participantes de-ben separar aquellos productos que ellos consi-deren son de origen biotecnológico.

• Hacer un listado de los productos selecciona-dos, argumentando por que consideran que sonproductos biotecnológicos en cada selección.

• Luego, solicite a los participantes que clasifi-quen los productos biotecnológicos selecciona-

dos en productos biotecnológicos de primera, se-gunda y tercera generación.

• Motive una discusión con base a las respuestasdadas al ejercicio.

• Proporcione la información de retorno, señalan-do los productos de origen biotecnológico y suclasificación de primera, segunda o tercera gene-ración.

Recursos necesarios

• Papelógrafo, papel, marcadores

• Cuatro mesas grandes

• Un sitio de trabajo ( un salón)

• Los siguientes productos: Queso, pan, cerveza,vino, papel, insulina, penicilina (antibiótico), ve-las (de parafina), un "tarro" de grasa, azúcar, sal,una planta de tomate, tomate (fruto), vinagre.

• Fotocopias de las instrucciones e información deretorno para los participantes.

Tiempo sugerido: 60 minutos.

Instrucciones para el participante

De acuerdo con la información suministrada en laSección 1, y mediante el reconocimiento de produc-tos de origen biotecnológico, los participantes ten-drán la oportunidad de desarrollar el concepto debiotecnología.

Pasos a seguir:

• Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdocon las instrucciones dadas por el instructor.

• Nombren un relator por grupo, el cual presentaráen plenaria los resultados obtenidos por el grupo.

• Realice un listado de los productos de origen bio-tecnológico. Argumenten sus selecciones.

• De los productos biotecnológicos selecciona-dos, realizar un listado de los que correspondena la primera, segunda o tercera generación. Ar-gumenten sus selecciones.

• Al finalizar, el Instructor les proporcionará lainformación de retorno.



Bibl iografía

Bull , A.T. , Holt , G. and Lil ly , M.D. 1982. Internat ionalTrends and Perspect ives in Biotechnology: A State ofArt , Par is , OECD.

Banco Interamericano de Desarrol lo (BID). 1988.Biotecnología: Perspect iva general y desarrol lo enAmérica Lat ina, p. 207-302. En: Progreso Económicoy social en América Lat ina. Informe 1988. Temaespecial : Ciencia y Tecnología .

Roca, W. 1993. El papel de la biotecnología en laagricul tura de los países en desarrol lo . Innovación yCiencia . Vol . 2 . 18-25 p.

Roca, W. 1990. La Nueva Biotecnología: Aplicaciones enla agricul tura de los países en desarrol lo , p . 1-11. En:Jaramil lo , J . y Agudelo, O. (eds.) . La NuevaBiotecnología , Fundamentos, usos y perspect ivas .Seminario real izado en ICA en Mayo 15-26 de 1989.Palmira , Colombia.

Roca, W. 1986. Biotecnología de plantas: Nuevasoportunidades para la agroindustr ia . En:Agroindustr ia 2000, SAG. Cali , Colombia. p. 107-116.

Sasson, A. 1989. Biotechnologies and DevelopingCountr ies : Present and Future, p. 23-46. In: Sasson,A. and N. Costar ini . (eds . ) . Plant Biotechnologies forDeveloping Countr ies . Proceedings of anInternat ional Symposium Organized by NalCTA/FAO, Luxemburg, 1989.



Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal - Información de retorno

Producto Clasificación Argumento

Queso Biotecnología1ra.Generación

Proceso enzimáticoPara elaboración de quesos

Pan Biotecnología1ra generación

Levadura y proceso enzimático.

Cerveza Biotecnología2da generación

Fermentación

Vino Biotecnología1ra generación

Fermentación

Insulina Biotecnología3ra generación

DNA recombinante

Penicilina Biotecnología2da generación

Bioprocesos

Grasa N O -------

Azúcar N O -------

Sal N O -------

Planta de tomatetransgénica Biotecnología3ra generación

Ingeniería genética

Fruto de tomateRetarda en madurar Biotecnología3ra generación


Vinagre Biotecnología1ra generación

Fermentación

Originales para Transparencias





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Cultivo de Tejidos Vegetales



Sección 2

Sección 2 . Cult ivo de Tej idos Vegetales



Tabla de Contenido

Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21


Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34



Objetivos

• Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales.

• Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas.


1. ¿Sabían ustedes que a partir de una célula somática del floema de la raíz de la zanahoria se puede desarrollar

una planta completa de zanahoria?

2. ¿Algún participante puede dar una definición de cultivo de tejidos vegetales?

3. ¿Sabían ustedes que las flores naturales que venden en floristerías y supermercados son producidas por cultivo

in vitro?



Cultivo demeristemos

Ápices y yemas

Cultivo de

ovulos yembriones

Cultivo deanteras

Cultivo desuspensióncelulares

Propagaciónmasiva

Eliminación de

enfermedades

Crucesinterespecíficos

Producción de

haploides

Metabolitos secundarios

Micropropagación Contribución al

fitomejoramiento

Cultivo de Tejidos Vegetales

Producción de protoplastos paratransformación o hibridación somática

Introducción

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica queconsiste en aislar una porción de una planta (tejido,órgano o célula), llamado explante, para cultivarloen un medio nutritivo en condiciones físicas y quí-micas artificiales. El objetivo es conseguir que lascélulas expresen su totipotencialidad, o sea, la ca-pacidad que tienen las células vegetales de regene-rar una planta completa cuando son separadas delorganismo. La totipotencialidad de las células ve-getales cultivadas in vitro fue establecida porSteward y colaboradores en 1958, quienes descri-bieron el desarrollo de una planta de zanahoria apartir de células somáticas del floema de la raíz dezanahoria. (Figura 2.1).

Cuando los explantes se cultivan en condicionesapropiadas, es posible inducir la formación de es-

tructuras organizadas y la formación de plantascompletas. Si la formación de la planta completase realiza mediante la formación de brotes o yemasadventicias y posterior enraizamiento de éstos, sedice que el proceso es de organogénesis. Pero si laregeneración se obtiene a través de estructuras se-mejantes a los embriones sexuales, se dice que lavía es embriogénesis somática.

Puede suceder que al cultivar in vitro un explantevegetal no se obtengan células diferenciadas o es-tructuras organizadas, sino la proliferación celularpara formar un tejido amorfo no diferenciado. Estetejido recibe el nombre de callo. El callo puede sersometido a agitación en un medio de cultivo líqui-do lo cual logra separar sus células constituyentespara formar un cultivo de células en suspención.

La técnica de cultivo de tejidos puede cubrir unamplio rango de aplica-ciones, tales como:

1. Investigación básica so-bre procesos bioquími-cos y morfológicos de ladiferenciación celular;

2. Investigación aplicada;

3. Desarrollo de técnicaspara la propagación clo-nal o para el mejora-miento genético deplantas.

El objetivo de este ca-pítulo es mostrar losfundamentos básicosde esta metodologíapara que el participanteconozca la importanciade esta herramienta dela Biotecnología Vege-tal.



Figura 2.1. Desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticasdel floema de la raíz. Fuente: Villée y Colaboradores, 1998.

2.1 Fundamentos del Cult ivo de

Tej idos Vegetales

En el cultivo in vitro n vitro de tejidos vegetales, unexplante (células, tejido, órgano), se cultiva asépti-camente en un medio de composición definida y encondiciones ambientales controladas. En la Tabla2.1 se presenta un cronograma de los eventos cien-tíficos y tecnológicos más importantes que contri-buyeron al desarrollo del cultivo in vitro de célulasy tejidos de plantas.

Tabla 2.1 Eventos científicos y tecnológicos claves enla evolución del cultivo in vitro de células y tejidosvegetales. Fuente: Villalobos (1990).

1665 Hooke Primera descripción de una célula.

1674 Leeuwenhoek Observación de la vida celular.

1835 Von Mohl Descripción de la vida; protoplasta.

1838 Schilden Conjunto celular de las plantas;totipotencia de la célula vegetal.

1839 Schwann Aplicación del concepto a animales.

1846 Nageli Células vegetales se forman pordivisiones de células existentes.

1855 Virchow Aforismo: Omnis cellula e cellula.

18881902

Haberlandt Pruebas de cultivo de células demesófilo; predicciones.

1922 Kotte Cultivo de ápices de raíces porpoco tiempo

1926 Went Descubrimiento de las auxinas.

1928 Kuster Trabajos con protoplastos obtenidosmecánicamente.

1934 White Cultivo de raíces con crecimientoactivo.

1934 Gautheret Cultivo del cambio de árboles.

1937 White Importancia de la vitamina B para elcrecimiento de las raíces.

1937 When & Thimann Trabajos intensivos con auxinas.

1939 Gautheret Uso de las auxinas en los cultivos;proliferación; potencialmentecrecimiento sin límites.

1939 Nobecourt Cultivo de raíces de zanahoria,proliferación de células.

1939 While Subcultivos sucesivos de Nicotiana.

1942 Van Overbeek Rescate de embriones en cruzasinterespecíficas.

1949 Camus Diferenciación vascular.

1952 Steward Agua de coco, embriogénesissomática.

1953 Muir Cultivo de suspensiones celulares;ailslamento de células individuales.

1953 Tulecke Cutivo de polén.

19531955

Skoog Descubrimiento de la cinética.

1956 Nichel Subcultivos durante 4 años desuspensiones celulares.

1957 Skoog & Miller Diferenciación del callo en vástagoy raíz.

1960 Bergmann Cultivo y pruebas de regeneraciónde células aisladas.

1960 Cocking Obtención de protoplastosempleando enzimas.

1962 Murashige & Skoog Medio MS.

1964 Morel Cultivo de meristemos, eliminaciónde virus.

1964 Nitsch Inducción de flores in vitro.

1964 Guha &Maheshwar

Plantas haploides a partir deanteras.

1965 Ledoux Introducción de DNA extraño encélulas.

1966 Lutz Totipotencia: uso de la célulaaislada.

1970 Backs – HusemannReinert

Técnicas de regeneración completaa partir de una célula.

19701971

Kao et al Pruebas de regeneración de plantasa partir de protoplastos.

1971 Tabeke Regeneración de plantas a partir deprotoplastos.

1972 Carison Et al. Función de protoplastos yregeneración de híbridos.

1978 Melchers Pomato. Topato.

Para el establecimiento del cultivo in vitro de unaespecie en particular se debe tener en cuenta unaserie de factores, de cuyo manejo depende el éxitodel cultivo.

Cada sistema de cultivo in vitro presenta caracte-rísticas particulares que permiten producir plantascompletas a partir de explantes. Estas característi-cas tienen que ver con: el explante, las normas deasepsia, los medios de cultivo y las condicionesambientales de incubación. La interacción de estosfactores es lo que determina la respuesta del ex-plante al cultivo in vitro.

La formación de plantas por medio del cultivo detejidos puede ocurrir como una continuación delcrecimiento y desarrollo de estructuras organiza-das, por ejemplo, meristemas apicales y axilaresdel tallo; o puede ser el resultado de un proceso de



formación de novo, a partir de células donde noexistía organización alguna; estas células puedenderivarse de los órganos vegetativos (somáticos) ode las estructuras sexuales (gaméticas) de la planta.(Figura 2.2).

La formación de plantas de novo puede ocurrir através de la diferenciación de embriones que se ini-cia en células individuales o en grupos de células(embriogénesis somática o asexual) o vía diferen-ciación de órganos vegetativos (organogénesis)que se inicia en grupos de células.

Como se mencionó antes, la regeneración de plan-tas in vitro depende de varios factores, siendo losmás importantes: la variedad de la planta (genoti-po), la clase de tejido a cultivar (explante), la com-posición química del medio de cultivo (factor

químico) y las condiciones ambientales de la incu-bación (factor físico).

Las técnicas de cultivo de meristemos, ápices y ye-mas pueden considerarse como clásicas dentro delcultivo de tejidos y su aplicación, en la propaga-ción clonal de plantas, la recuperación de la sani-dad, así como en la conservación e intercambio degermoplasma, están ampliamente diseminadas.Por otro lado, el cultivo de microsporas y de ante-ras para la producción de haploides es una herra-mienta importante para el mejoramiento genéticode plantas.

Para cultivar células, tejidos y órganos in vitro sedeben seguir los siguientes pasos:

1. Seleccionar y separar de la planta el explante quese desea cultivar.



1

2A

2

2B

Figura 2.2 Formación de plantas in vitro. 1. Cultivo de meristemos y yemas del tallo. 2. Regeneración deplantas. 2A. Vía organogénesis; 2B. Vía embriogénesis somática. Fuente: George y Sherrington, 1984.

2. Desinfectar el explante.

3. Sembrar el explante en un medio de cultivo apro-piado.

4. Cultivar el explante en condiciones ambientalescontroladas.

Entre los factores químicos que influyen en el cul-tivo in vitro están: los nutrientes (macro y microe-lementos y fuentes de carbohidratos) y algunoscompuestos orgánicos (vitaminas) y los regulado-res de crecimiento.

Entre los factores físicos están: la luz, la tempera-tura, el pH y la concentración de O2 y CO2. Estosfactores ejercen un papel importante en el desarro-llo y diferenciación celular.

El tipo de diferenciación que ocurre en un cultivoin vitro en general depende de la relación de dos ti-pos de reguladores de crecimiento: las auxinas ylas citocininas. Cuando la relación auxina/citoci-nina es alta se puede dar la formación de raíces, lainducción de embriogénesis y la inducción de ca-llos. Mientras que si la relación de auxina/citocini-

na es baja se puede dar el desarrollo de yemas axi-lares, o la inducción de brotes adventicios.Manipulando las combinaciones y concentracio-nes de los reguladores de crecimiento, es posibleregenerar plantas completas a partir de células, te-jidos u órganos.

2.2 Aplicaciones del Cult ivo de Tej idos

Vegetales

Las aplicaciones de esta técnica se dan básicamen-te en tres áreas fundamentales:

a. La micropropagación,

b. La contribución del cultivo in vitro en el mejora-miento vegetal y

c. La producción de metabolitos secundarios. (Tabla2.2).

2.2.1 Micropropagación

Uno de los mayores usos del cultivo in vitro de teji-dos es la propagación vegetativa de plantas, la cualse realiza en forma extensiva. Esta metodología



Tecnologías Aplicaciones Plazos parautilización

Cultivo de Meristemas, ápices,yemas, embriogénesis somática

1. Propagación masiva - Inmediato

2. Eliminación de enfermedades - Inmediato

3. Conservación de germoplasma - Inmediato

4. Intercambio de germoplasma. - Inmediato

Cultivo de embriones, cultivo deóvulos, fertilización in vitro

1. Obtención de híbridos entre especies de géneros distintos - Inmediato

Cultivo de anteras, Cultivo demicrosporas, Cultivo de embriones

1. Obtención rápida de líneas genéticamente puras - Inmediato

2. Obtención de variación genética nueva - Mediano

3. Aumento de heterosis

Cultivo de células, callos 1. Obtención de variantes somaclonales - Mediano

2. Acelerar mejoramiento genético intravarietal - Mediano

3. Selección de líneas resistentes a enfermedades, estrés, etc. - Mediano

4. Transformación genética - Largo

Funsion de Protoplastos 1. Obtención de híbridos asexuales. - Largo

2. Transferencia de genes citoplasmáticos - Largo

Tabla 2.2 Técnicas de cultivo in vitro de células y tejidos vegetales y sus aplicaciones en la agricultura. Fuente: Roca(1986).

permite la multiplicación masiva de plantas en es-pacio y tiempo reducidos, ganancia que es bastantesignificativa cuando se compara con los métodosconvencionales de propagación asexual.

En general, la micropropagación se puede conse-guir a través de tres vías:

a. Por medio de la proliferación de yemas axilares;

b. Por la inducción de yemas o brotes adventicios y

c. Por embriogénesis somática (Figura 2.2).

Las yemas apicales o axilares se pueden desarro-llar in vitro promoviendo el crecimiento de las ye-mas latentes o de las yemas activas. Un segmentode la planta que contenga una sola yema puede ori-ginar un solo tallo o puede producir tallos múlti-ples (Figura 2.3). A medida que el tallo o las ramasse desarrollan producen a su vez más yemas axila-res; por el subcultivo periódico se podrán producirtallos o ramas indefinidamente. Este método demicropropagación ha sido el más popular debido asu aplicabilidad a un mayor número de especiesvegetales y a su simple implementación.

Los brotes o yemas adventicias son estructuras quese originan de novo en áreas diferentes a los sitios

de formación de las yemas axilares o apicales. Losbrotes, raíces, bulbos adventicios y otras estructu-ras similares se pueden inducir en segmentos de ta-llo, hojas, tubérculos, cormos, bulbos, rizomas oestructuras florales. Normalmente el número depropágulos se incrementa por subdivisión de lospropios órganos inducidos in vitro. Esta vía puederesultar en un sistema de multiplicación mayor quela propagación por proliferación de yemas axila-res.

La embriogénesis somática es el sistema de mayorpotencial para la propagación clonal rápida. A tra-vés de este método es posible obtener miles de em-briones somáticos a partir de unos pocos gramos decallo o de pocos mililitros de una suspensión ce-lular. Durante este proceso cada célula o grupo decélulas es capaz de dividirse y diferenciarse en unembrión somático, que luego puede dar origen auna planta completa. Debido a su similitud con losembriones cigóticos, los embriones somáticos seutilizan para la producción de las llamadas semi-llas artificiales.

La ventaja de la embriogénesis somática, compara-da con los dos métodos de micropropagación men-cionados anteriormente, se debe principalmente almanejo de un alto volumen de material propagadoy a un bajo costo de producción. Sin embargo, elprincipal problema de este sistema es el reducidonúmero de especies que pueden ser propagadas poresta vía.

La micropropagación tiene una amplia aplicaciónen cul t ivos comerciales como plantasornamentales, frutales, forestales y especieshortícolas comestibles. En América Latina existenunos 180 laboratorios de micropropagación devariada capacidad. De éstos, sólo 50 desarrollanpropagación de plantas a nivel comercial. Sinembargo, son pocos los que alcanzan niveles de



MICRO-PROPAGACIÓN

I. INICIACIÓN II. ENRAIZAMIENTO

Figura 2.3. Cultivos de meristemos de yuca en dosetapas de micropropagación por cultivo de nudos.Fuent: Roca, W. 1980.

producción superior al millón de plantas al año(Tabla 2.3). Las plantas para las cuales se handesarrollado técnicas de micropropagaciónincluyen principalmente ornamentales, herbáceas,frutales y forestales, aunque la propagación masiva(a nivel comercial) es más utilizada con lasornamentales (Tabla 2.4).

Tabla 2.3 Laboratorios de micropropagacióncomercial.

País Número de laboratorios

Estados Unidos 105*

Australia 35*

Inglaterra 15*

Nueva Zelandia 15*

Francia 10*

China 10*

Brasil 10*

Israel 7*

Italia 6

Argentina 6

Holanda 5*

Canadá 5*

Rep. Dominicana 5*

México 5*

Colombia 5

Costa Rica 5*

Sur Africa 5

Filipinas 4

Tailandia 4

Indonesia 3

Singapur 3*

Venezuela 3

Kenya 2

Malasia 2

Taiwan 2*

* Producción mayor de 1 millón de plantas.

El mercado potencial para las plantasmicropropagadas es muy grande, siendo Holandael pr incipal país productor de plantasmicropropagadas, seguido por los Estados Unidosde América y por Israel.

Es importante anotar que no todas las especies ve-getales responden con facilidad a la micropropaga-ción, como es el caso de especies forestales. Sinembargo, se debe enfatizar que la micropropaga-ción es recomendable para la multiplicación rápidade materiales en vía de extinción y materiales va-liosos o de alto valor agregado para el comercio.

Tabla 2.4 Plantas propagadas in vitro. Fuente:Compilado por Roca, W., (1995).

Número de Variedades o Tipos

Tipo de planta Micropropagadas Propagaciónmasiva

Ornamentales

Herbáceas 189 85

Leñosas 96 9

Frutales 50 40

Forestales

Angiospermas 60 24

Gimnospermas 30 15

Hortalizas 60 10

Gramíneas 50 10

Orquídeas 37 28

Medicinales 43 5

Plantaciones 20 3

Oleaginosas 14 6

Fibras 17 1

Raíces y tubérculos 8 2

Total 672 238

% 100 35

Micropropagación comercial

Existen numerosas compañías comerciales queproducen millones de plántulas al año por micro-propagación. Compañías de este tipo se hallan lo-calizadas en EE. UU, Australia, Reino Unido, eIsrael principalmente, donde el principal mercadoson las plantas ornamentales de flores para corte(Tabla 2.3).

Eliminación de virus y otros patóge-

nos

Las plantas son susceptibles a muchos agentes pa-tógenos como bacterias, hongos, virus, viroides ynemátodos. Aunque la esterilización superficial delos explantes elimina agentes superficiales, estetratamiento no permite la eliminación de infeccio-nes sistémicas, de tipo bacteriano o víricas. Aun-que resulta relativamente sencillo eliminar lospatógenos de etiología fúngica o bacteriana portratamiento químico u otros medios, la eliminaciónde los virus representa un verdadero problema.



De la observación de que la distribución de las par-tículas virales en la planta es irregular y que existemenor número de partículas virales en los meriste-mos apicales, fue posible llegar a una solucióndeeste problema.

Los meristemas apicales son grupos de células lo-calizadas en el extremo del ápice de crecimiento yque normalmente se dividen activamente y demodo organizado. El meristema apical de brotesesterilizados superficialmente pueden ser cortadosconteniendo las células apicales y los primordiosfoliares adyacentes, y cultivados en un medio decultivo y condiciones de crecimiento adecuadospara obtener plantas completas.

Las plantas producidas por este procedimiento ge-neralmente no presentan infección viral, compro-bada por la técnica ELISA (prueba inmunológicapara detección de virus en tejidos vegetales) conindicadores o con sondas de DNA.

Para que este procedimiento sea eficiente se debentener en cuenta factores como: el tamaño del ápiceque se extrae para el cultivo, factores del medio ytratamientos químicos o térmicos antes o durante

el cultivo in vitro. De todos ellos, el factor más im-portante es el tamaño del explante; generalmente elporcentaje de obtención de plantas aumenta con eltamaño del explante, pero si el meristemo es relati-vamente pequeño, la proporción de plantas sin vi-rus será relativamente elevada. En algunos casosresulta efectivo el tratamiento térmico (por ejem-plo, durante 10 - 20 días a 35 - 38 oC) antes de quese efectúe la extracción del meristemo, ya que lamultiplicación viral es sensible a las temperaturaselevadas (Figura 2.4).

La técnica del cultivo in vitro de meristemos hasido efectiva para la propagación de plántulas li-bres de virus en por lo menos unas 65 especies deplantas.



PRUEBASDE

DETECCIÓN

MATERIAL

CLONAL

TERMOTERAPIA

Día: 35°C Noche: 35°C Día: 40°C Noche: 35°C

CULTIVO DE MERISTEMAS

SEMBRAR EN POTES

PRUEBAS DE DETECCIÓN

PROPAGACIÓN PLANTAS SANAS

PLANTAS SANAS

(-) (+)

CLONES INFECTADOS

DESTRUCCIÓNPLANTAS ENFERMAS

Figura 2.4. Procedimientos para la producción de plantas de yuca libres de virus mediante latermopterapia y el cultivo de meristemos. Fuente. Roca y Jayasinghe, 1982.

2.2.2 Contribución del cult ivo in vi tro

en el mejoramiento vegetal

Rescate de embriones zigóticos

Las barreras que se oponen al logro de la produc-ción de híbridos entre especies distantes taxonómi-camente pueden ser superadas mediante lastécnicas de cultivo in vitro. En aquellos casos enque la fecundación tiene éxito, pero el embrión noconsigue desarrollarse, es posible aislar los em-briones cigóticos inmaduros y cultivarlos en me-dios y condiciones apropiadas para regenerarplantas híbridas (Figura 2.5).

Producción de plantas haploides me-

diante el cult ivo de anteras y de ova-

rios

Las plantas haploides contienen el número gaméti-co de cromosomas, es decir la mitad del número to-tal de cromosomas de la planta. Son de gran

utilidad en los programas de mejoramiento, tantopara la producción rápida de líneas homocigóticas,como para la detección y selección de mutantes re-cesivos. La producción de haploides puede ocurrirpor medio de la regeneración de plantas a partir delcultivo de granos de polen inmaduros aislados(cultivo de microsporas) o contenidos en la antera(cultivo de anteras). En la cebada, por ejemplo,que posee del orden de 2 - 3x103 granos de po-len por antera y 60 anteras aprovechables por cadaespiga, existen potencialmente 105 microesporaspor espiga que pueden ser aprovechadas para elcultivo in vitro.

Mediante el cultivo de anteras es posible regenerarplantas haploides en más de 50 especies vegetales,siendo la mayoría de ellas de las familias Grami-nae, Solanaceae y Cruciferae. Estas familias inclu-yen muchas especies agrícolas de importanciaeconómica como el trigo, la cebada, el maíz, elarroz, el centeno, los pastos, las brassicas, la papa,el tomate y el tabaco.

Los factores más importantes para la produccióneficiente de plantas haploides son los siguientes:

1. El crecimiento de las plantas donantes en condicio-nes óptimas,

2. Una muestra adecuada de diferentes genotipos;

3. Elección del estadio adecuado del desarrollo delpolen ;

4. Condiciones del pretratamiento de las anteras, es-pecialmente el tratamiento por frío o por calor;

5. Efecto de los aditivos en el medio de cultivo, porejemplo, el nitrógeno orgánico, un aumento en elcontenido de sacarosa, carbón activado, etc.

En el mejoramiento tradicional son necesarias 5 - 6generaciones del material segregante para obtenerlíneas uniformes, las cuales nunca son 100% ho-mocigotas. Estas generaciones requieren ademásde tiempo y mano de obra intensa. El cultivo deanteras permite eliminar varias generaciones se-



P. vulgarisEmbrión

P. coccineusP. acutifoliusP. lunatus

Callo

Plantas

x

Figura 2.5 Producción de plantas híbridas de cruzas

interespecíficas mediante el rescate y cultivo in

vitro de embriones inmaduros. Fuente: Muñoz yColaboradores, 1990.

gregantes, economizando tiempo, espacio y cos-tos. El cultivo de anteras para la producción dehaploides es ya un proceso rutinario en muchoscultivos. Tal es el caso del arroz, que en 7 - 8 meseses posible obtener semilla totalmente homocigota,

que por el método tradicional tomaría 3 - 4 años(Figura 2.6).

La consecuencia genética del cultivo de anteras enel fitomejoramiento se presenta en la Tabla 2.5



Actividad

Selección de progenitores

Cruzamientos

Selección de plantas F .

Cultivo de anteras

Inducción de callos

Regeneración de plantas R .

Obtención de semilla R .

(homocigótica)

Evaluación de líneas R

calidad de grano, tipo de planta, resistenciaa enfermedades y tolerancias fisiológicas.

Ensayos de rendimiento con líneas R

Ensayos regionales en campos de agricultores con líneas R

Ensayos comerciales con líneas R

Liberación de la variedad

1

1

2

2.

3.

4

5

Número Aproximado

25-50 plantas/cruce

100 anteras/frasco; 100 frascos/cruzamiento(10,000 anteras/cruzamiento)

700-4000 callos/100 anteras7%-40%

50-700 plantas verdes/100 anteras0.5%, 0.7%

50% R son DH

25-350 líneas R /cruzamiento.

5-70 líneas R seleccionadas/cruzamiento

(aprox. 20% selección)

1

2

2

Duración calculada

3 meses

1.5 meses

1.5 meses

4 meses

6 meses

3-4 años

Figura 2.6 Procedimiento general para el mejoramiento de arroz mediante el cultivo de anteras. Fuente:Lentini y colaboradores, 1997.

para plantas autógamas. La determinación del be-neficio / costo del cultivo de anteras es un paso ne-cesario para la implementación del cultivo deanteras en un programa de mejoramiento (Tabla2.6).

Tabla 2.5 Consecuencia genética del cultivo de anteras.

Hibrido Gametos Cultivo deAnteras

PlantasHomocigotas

AB AABB

AaBb aB aaBB

Ab AAbb

ab aabb

Tabla 2.6 Análisis de costo-beneficio del cultivo deanteras para el mejoramiento de arroz: costo totalestimado para obtener una variedad de arroz usando elcultivo de anteras, y comparación con el método depedigrí. Fuente: Sanint, y colaboradores, (1.993).

Método Costo en Dólares

Indica Japonica

Método de pedigrí 203.791 348.483

Cultivo de anteras 121.385 195.438

Ahorro respecto al método de pedigrí 82.046 153.044

% de ahorro 29 44

Capacidad de operación óptima(número de anteras por semana)

60.000 5.500

2.2.3 Producción de metabolitos

secundarios usando cult ivo de

tej idos

Los metabolitos secundarios son compuestos queno tienen una función reconocida en los procesosfisiológicos de los organismos que los sintetizan.Estos compuestos, entre los que se incluyen los al-caloides, terpenoides, esteroides, antocianinas, an-

traquinonas y fenoles simples o polifenoles, tienende manera característica una distribución limitada.

Un gran número de compuestos químicos impor-tantes desde el punto de vista comercial provienendirectamente de plantas y estos incluyen los meta-bolitos secundarios. La aplicación de estos pro-ductos puede clasif icarse en cinco grupos:fármacos, aromas, perfumes, pigmentos y plagui-cidas.

La importancia biotecnológica de los metabolitossecundarios es triple:

1. Puede tratarse de compuestos químicos de valor co-mercial;

2. Algunos de ellos son tóxicos y deben eliminarse delos alimentos; y

3. Podrían actuar como agentes protectores, utilizadospor la planta contra agentes patógenos, insectos yanimales herbívoros.

Existen dos estrategias generales para la produc-ción a gran escala de metabolitos secundarios ve-getales. Éstas estrategias se basan en :

1. Sistemas de fermentadores en el que las células ensuspensión crecen libremente hasta una fase esta-cionaria en un proceso de una o dos etapas. Estasse cosechan para extraer el producto;

2. Sistema de células inmovilizadas, en los que las cé-lulas son embebidas o atrapadas en una matriz poli-mérica inerte, como gel, espuma o cartuchos defibra hueca. En este último sistema el objetivo esconseguir un proceso de producción continuo o se-micontinuo, que requiere a su vez que el productose libere naturalmente, o que la liberación pueda in-ducirse permeabilizando reversiblemente las célu-las.



2.3 Ejercicio 2.1 El cul t ivo de tej idos

vegetales

Objetivos

• Elaborar el concepto de cultivo de tejidos vege-tales y sus aplicaciones.

• Identificar el explante y la técnica de cultivo detejidos más adecuada para:

a. el rescate de germoplasma en vía de extin-ción,

b. la eliminación de patógenos de materiales"preciosos",

c. la multiplicación masiva de materiales co-merciales (flores) y

d. la producción de plantas haploides para serutilizadas en mejoramiento vegetal.

Orientaciones para el instructor

El siguiente ejercicio busca que los participantesseleccionen los explantes y técnicas de cultivo detejidos apropiados para el rescate de germoplasmaen vía de extinción, la eliminación de patógenos demateriales "preciosos", la multiplicación masivade materiales comerciales (flores) y la producciónde plantas haploides para ser utilizadas en mejora-miento vegetal.

Con este ejercicio, se busca que los participantesfijen el concepto de cultivo de tejidos vegetales ysus aplicaciones.

Para la realización de este ejercicio se recomiendaque el instructor lea atentamente las siguientes ins-trucciones:

• Suministre orientación general sobre los objeti-vos del ejercicio.

• Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo.

• Coloque en cada mesa las cuatro especies vege-tales recomendadas.

• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubiquecada grupo en cada una de las mesas de trabajo.

• En cada grupo, los participantes deben indicar:

a. El cultivo de más difícil propagación por víaconvencional;

b. El cultivo que podría ser usado como modelopara la eliminación de patógenos (virus);

c. el cultivo que podría ser usado como modelopara propagación masiva;

d. el cultivo que podría ser utilizado como mo-delo para la producción de plantas haploides.

• En cada caso seleccione el explante y la técnicade cultivo de tejidos más apropiada para cum-plir con cada uno de los objetivos planteados.

• Elaborar una lista del explante(s) y la técnica(s)de cultivo in vitro seleccionados para cada cul-tivo.

• Motive una discusión con base a las respuestasdadas.

• Proporcione la información de retorno, seña-lando los explantes y técnicas de cultivo in vitro

más apropiadas en cada cultivo para lograr elobjetivo planteado.

Recursos necesarios

• Papelógrafo, papel, marcadores.

• Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.

• Las siguientes plantas en materas pequeñas o enbolsas de plástico: Palma, yuca, rosa, y arroz.

• Fotocopia de las instrucciones e información deretorno para los participantes.





De acuerdo con la información suministrada en aSección 2, y mediante la selección del explante ytécnica de cultivo más apropiada para:

a. el rescate de germoplasma en extinción,

b. eliminación de patógenos en materiales "precio-sos",

c. la multiplicación masiva de materiales comercialesy

d. la producción de plantas haploides para ser usadasen mejoramiento vegetal, los participantes tendrán

la oportunidad de construir el concepto de cultivode tejidos vegetales.

• Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdocon las instrucciones dadas por el instructor.

• Nombrar un relator por grupo, el cual presenta-rá en plenaria los resultados obtenidos por elgrupo.

• Realizar un listado de los explantes y técnicasde cultivo in vitro para cada cultivo, de acuerdocon su objetivo particular.

• Al final el instructor les proporcionará la infor-mación de retorno.



EspecieVegetal

Caso particular Explante (s)Seleccionado(s)

Técnica deCultivo in vitro

Producto

PalmaMultiplicación Apices laterales Micropropagación Multiplicación rápida

YucaLimpieza clonal por ter-moterapia

Meristemos Micropropagación Plantas libres de virus

RosaPropagación masiva Yemas axilares Micropropagación Incremento en la produc-

ción de plántulas

ArrozProducción de plantashaploides

Anteras Cultivo de anteras Producción de plantas ha-ploides para ser usadasen un programa de mejo-ramiento

Bibl iografía

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Tecnología del DNA Recombinante



Sección 3

Sección 3 . Tecnología del DNA recombinante



Tabla de Contenido


Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45


3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genética? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genética . . . . . . . . . . . 47

3.3 Aislamiento de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4 Secuenciación del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58



Objetivos

Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante

Describir las herramientas más importantes de esta tecnología.

Conocer algunas de sus aplicaciones.


1. ¿Sabían ustedes que la insulina, hormona que regula los niveles de azúcar en la sangre es producida a nivel in-

dustrial por una bacteria que vive en su intestino?

2. ¿Algún participante puede decir que es la ingeniería genética?

3. ¿Sabían ustedes que pequeños segmentos de DNA pueden ser aislados secuencias modificados y transferidos de

un organismo a otro.?



Enzimas de restricción

• Enzimas modificadoras del DNA

• Vectores

• Hospederos

Generación defragmentos de DNA

Unión de losfragmentos a unvector molecular

Introducción delvector a una célulahospedante para la

amplificación

Utilizand o“sondas"

Utilizandoanticuerposespecíficos

Selección de unasecuencia (gen)

específica

Tecnología del DNA recombinante

Herramientas Clonación y aislamiento

de genes

•

3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genét ica?

En muchos laboratorios alrededor del mundo, ya esuna rutina el aislamiento de fragmentos específi-cos de DNA de un organismo para determinar susecuencia de bases y utilizar esta informaciónpara determinar su función. Lo que es realmenteinteresante es que es posible su acceso, a nivel ex-perimental básico, con muy poco equipo y a uncosto relativamente bajo.

Ingeniería genética es el término más utilizadopara referirse al conjunto de técnicas involucradasen la manipulación del material genético (DNA yRNA). La ingeniería o manipulación genética sebasa en la tecnología del DNA recombinante.

La tecnología del DNA recombinante básica-mente consiste en aislar segmentos específicos deDNA (genes) e introducirlos en vectores especia-les (plásmidos) para formar moléculas de DNArecombinantes. Este proceso es posible gracias aun grupo de enzimas que permiten la manipula-ción del DNA, tales como las enzimas de restric-

ción, que reconocen y cortan en sitios específicosla molécula de DNA, y las ligasas, que sellan per-manentemente los fragmentos insertados en el vec-tor. Los vectores recombinantes son introducidos auna célula hospedera (generalmente a la bacteriaEscherichia coli) para el mantenimiento y amplifi-cación (multiplicación) de las moléculas de DNArecombinante.

El proceso por el cual un segmento específico deDNA o un gen es amplificado en forma selectiva sellama clonación. En este caso, el DNA foráneo seinserta in vitro en un plásmido pequeño (por ejem-plo, al plásmido comercial pUC19). El plásmidorecombinante se introduce por transformación auna célula hospedera (la bacteria E. coli) en la quese mantiene mediante selección a través de un gen

de resistencia a un antibiótico presente en el plás-mido vector (Figura 3.1).

Hay cuatro áreas principales en las cuales la tecno-logía del DNA recombinante es de gran utilidad.

a. Investigación básica de la estructura y función de losgenes.

b. Identificación y mapeo de genes

c. Nuevos métodos de producción de proteínas útiles.

d. Producción de plantas y animales transgénicos.

La clonación genética es el aislamiento de una se-cuencia específica de DNA del genoma. La esenciade la clonación de genes se puede resumir en lascuatro etapas mostradas en la Figura 3.2, cuyo pro-ducto es el aislamiento de una secuencia específicade DNA la cual puede ser utilizada para varios pro-pósitos.



DNA de otro organismo

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AAGCTT

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Un gen de interés

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La mezcla hace que los extremoscomplementarios se apareen yque la DNA ligasa una estosextremos

Plásmidio bacteriano

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Figura 3.1 Principio básico de la tecnología del DNArecombinante. Fuente: Villée y colaboradores, 1992.

3.2 Aspectos Fundamentales y

Tecnológicos de la Ingeniería

Genét ica

3.2.1 Los ácidos nucleicos

Las características hereditarias que se transmitende los parentales a su descendencia se hallan loca-

lizadas en los cromosomas, cuyo principal consti-tuyente es la molécula del DNA. Los segmentosde esta gran molécula que codifican las diferentescaracterísticas de un individuo se denominan ge-nes.

Los genes de los organismos eucarióticos estánconformados básicamente de tres regiones: la es-tructural, la promotora y la reguladora. La región

estructural está constituida por secuencias codifi-cadoras, llamadas exones y secuencias no codifica-doras, denominadas intrones, las cuales sonremovidas del mRNA después de la transcripción.La región estructural está además flanqueada ensu extremo 5' por un sitio de iniciación de la trans-cripción y en su extremo 3' por un sitio de termina-ción. La región promotora contiene secuenciasespecíficas que interactúan con varios factoresproteínicos para regular la transcripción, y la re-

gión reguladora determina cuando el gen debe co-menzar a transcribirse. Estos reguladores son dedos tipos: los amplificadores, que incrementan lavelocidad de la transcripción y los silenciadores,que son los que la disminuyen. En la Figura 3.3, semuestran los componentes más importantes de losgenes de los organismos eucarióticos.



Generación de Fragmentos de ADN

Unión de los Fragmentos

a un Vector Molecular

Introducción del Vector a una Célula Hospedante,

para la Amplificación

Selección de una Secuencia Específica

Figura 3.2 Las cuatro etapas básicas para la clona-ción de genes.

Potenciador

Elementoscuesta arriba

Elementoscuesta arriba TATA

Exón Intrón

IntrónExón Potenciador

Sitio deiniciación dela transcripción

100 pares de bases Sitio deiniciación dela transcripción

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Exón Intrón Exón

Intrón Exón

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hnRNA

Figura 3.3 Componentes de un gen eucariótico. Fuente: Villée y colaboradores, 1992.

El flujo de la información genética es unidireccio-nal:

DNA � mRNA � proteína

El proceso que permite copiar la información ge-nética (a través de una molécula intermediaria de-nominada mRNA) se llama transcripción, y laconversión de la información genética en el pro-ducto final (una proteína) se denomina traduc-

ción. Este concepto del flujo de la información ge-nética es conocido como el Dogma Central de la

Biología. Dos excepciones que se deben agregaral dogma central de la biología son los siguientes:

1. La duplicación de material genético, que ocurre an-tes de la división celular, representada como DNA ⇒DNA, se denomina replicación y

2. La información genética de algunos organismos,como los retrovirus, se halla codificada en la molécu-la de RNA en vez de DNA. Estos virus contienenuna enzima llamada transcriptasa reversa que pro-duce una molécula de DNA de doble cadena a partirde la cadena simple del RNA genómico. En este casoel flujo de la información genética será en "reversa",comparado con la convención normal, de modo queel dogma central completo de la biología se esque-matiza en la Figura 3.4.

Los ácidos nucleicos son conglomerados en formade cadena (heteropolímeros) formados por unida-des (monómeros) llamadas nucleótidos; por estarazón una cadena de ácido nucleico se le conocecomo un polinucleótido. Las unidades o nucleóti-

dos estan formados por tres componentes: un azú-car (2-desoxirribosa para DNA y ribosa paraRNA), un grupo fosfato y una base nitrogenada.Las bases nitrogenadas son de dos tipos: las puri-

nas que presentan doble anillo y se llaman adeninay guanina, designadas por las letras A y G, respec-tivamente; y las pirimidinas, que presentan unsolo anillo, y se llaman timina, citosina y uracilo,designados por las letras T, C y U, respectivamen-te. La timina no se presenta en el RNA, en su lugarse encuentra el Uracilo.

La estructura del DNA tiene la forma de una doblehélice, donde las bases nitrogenadas se hallan en elinterior. Cada base se aparea con la base de la ca-dena complementaria a través de puentes de hidró-geno (H), que unen a la A con la T mediante dospuentes de hidrógeno y a la G con la C mediantetres puentes.

Hay tres tipos de moléculas de RNA en las células:RNA mensajero (mRNA), RNA ribosomal (rRNA) y RNA de transferencia (tRNA). El rRNA es elmás abundante de los tres (85% del RNA total) yestá asociado con los ribosomas, que son parteesencial de la maquinaria de traducción. El tRNA(10% del RNA total) se encarga de insertar ami-noácidos siguiendo un orden codificado por elmRNA. El mRNA (5% del RNA total), actúacomo transportador de la información genética



DNA mRNA

Transcripción Traducción

PRO TEINA

TranscripciónReversa

Replicación

Figura 3.4 El dogma central de la biología.

desde el DNA hasta el sitio de traducción (los ribo-somas), cuyo producto final son las proteínas.

El arreglo lineal de la secuencia de aminoácidos deuna proteína está determinado por la secuencia debases en el mRNA, cuyo orden es especificado porel DNA, de donde se copió o transcribió.

Una secuencia de tres bases que codifica para unaminoácido se llama un codon. Como hay cuatrobases diferentes entonces existen 64 codones posi-bles para los 20 aminoácidos esenciales diferentes.Tres de esos codones son utilizados como señalesde terminación de la traducción, el resto correspon-de a los aminoácidos. Por ejemplo, hay seis codo-nes para leucina, cuatro para treonina, uno parametionina, uno para triptofano, etc.

El ingeniero genético necesita cortar y unir seg-mentos de DNA de diferentes fuentes (Figura 3.1).Además, es necesario realizar ciertas modificacio-nes en el DNA en la diferentes etapas requeridaspara producir, clonar e identificar moléculas deDNA recombinante. Las herramientas que hacenposible todas esas manipulaciones son enzimas.Algunas de estas enzimas utilizadas en la ingenie-ría genética, son las siguientes :

3.2.2 Las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción permiten cortar el DNAde doble cadena por sitios específicos o secuenciasde reconocimiento (Figura 3.5). Estas enzimas sonextraídas de bacterias, en donde funcionan comoparte de un mecanismo de protección de la bacteriacontra la invasión de DNA extraño. Para prevenirla digestión o la hidrólisis del DNA de la propia cé-lula, una enzima (una metilasa) que modifica elDNA de la célula, metilando ciertas bases de la se-cuencia de reconocimiento, lo cual evita que la en-zima de restricción corte su propio DNA.

La mayoría de las enzimas de restricción usadas eningeniería genética presentan un modo de acciónrelativamente simple. Estas enzimas son nuclea-

sas y como cortan una sección interna del DNAson denominadas endonucleasas de restricción.

La nomenclatura para nombrar las enzimas de res-tricción se basa en algunas convenciones: Porejemplo,

Hind III: Se refiere a la tercera enzima de restriccióncaracterizada de la cepa Rd de la bacteriaHaemophilus influenzae.

EcoRV Se refiere a la quinta enzima de restriccióncaracterizada de la cepa RY13 de la bacteriaEscherichia coli



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DNA Ligasa

Eco RI

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Figura 3.5 Enzimas que cortan y ligan moléculasde DNA. a) La enzima de restricción EcoRI reco-noce y corta en la secuencia GAATTC, generandosegmentos con extremos pegajosos. b) En condi-ciones apropiadas, los segmentos con extremospegajosos complementarios se realinean y loscortes son reparados con la enzima DNA Ligasa.Fuente: Astec, 1993.

Cada enzima de restricción reconoce una secuen-cia específica de pares de bases en la molécula deDNA, siendo las secuencias más comunes las decuatro, cinco o seis pares de bases.

3.2.3 Otras enzimas importantes

para la ingeniería genética

DNA Ligasas

Estas enzimas catalizan la formación de enlacesentre dos nucleótidos contiguos en una cadena deDNA de doble banda, por lo que uno de los usos deesta enzima es para reparar "huecos" en una de lasbandas del DNA. Esta enzima también se usa paraunir fragmentos en un vector de clonación, origi-nando un vector recombinante (Figura 3.5).

DNA Polimerasas

Estas enzimas son las que permiten la formaciónde cadenas (polímeros) de DNA, como se puedeapreciar en la Figura 3.6. La síntesis es exclusiva-

mente en la dirección 5' ⇒ 3' con respecto a la ban-da que se está sintet izando. Cadadesoxirribonucleótido que es incorporado durantela polimerización es complementario al de la ban-da molde (dA es complementaria a dT y dG escomplementaria a dC).

La transcriptasa reversa

Es una DNA polimerasa que forma polímeros deDNA de cadena sencilla usando como molde unacadena de RNA. Esta enzima es utilizada para sin-tetizar cadenas de DNA a partir mRNA en el pro-ceso de producción de cDNA (DNAcomplementario), paso importante en la construc-ción de bancos de cDNA, los cuales son muy úti-les para el aislamiento de genes de interés.

La Taq polimerasa

Es una DNA polimerasa extraída de la bacteriaThermus aquaticus, que habita en los baños terma-les. Por esta razón, esta enzima no pierde su activi-dad catalítica cuando se incuba a una temperaturade 94oC. Debido a esta propiedad la Taq polimera-sa es utilizada en la técnica de la Reacción en Ca-dena de la Polimerasa (PCR) utilizado para lamultiplicación in vitro de DNA a partir de pocacantidad de éste.

3.2.4 Vector genético

Un vector genético es una molécula pequeña deDNA con un origen de replicación autónomo y queposee zonas que no son esenciales para su multipli-cación. Al eliminar estas regiones, éstas puedenser reemplazadas por DNA foráneo. Estos vecto-res actúan como portadores y multiplicadores deDNA exógeno, cuando el vector se replica dentrode la célula hospedera. En general, el DNA delvector es fácilmente separable del DNA genómico



Figura 3.6. Replicación del DNA, antes de la di-visión celular. Las dos cadenas del DNA se se-paran y sirven de moldes para la síntesis de dosnuevas cadenas. Fuente: Astec, 1993.

del hospedero, pudiéndose obtener buenas cantida-des del DNA exógeno insertado en el vector.

Los vectores más comúnmente utilizados en inge-niería genética son algunos plásmidos de Escheri-

chia coli y el bacteriófago Lambda (l).

3.2.5 Los plásmidos

Los plásmidos son pequeñas moléculas circularesde DNA de doble banda, que están presentes en al-gunas bacterias como elementos extracromosoma-les. Los plásmidos confieren a sus hospederosbacterianos una variedad de características fenotí-picas que no son necesarias para su reproducción,pero que pueden conferirle alguna ventaja, comopor ejemplo, la resistencia a un antibiótico.

Para que un plásmido pueda ser utilizado comovector en ingeniería genética debe poseer las si-guientes propiedades:

a. Tener una replicación autónomaen la célula hospedera;

b. Conferirle a la célula hospederaresistencia a uno o varios antibio-ticos, para identificar aquellasbacterias que lo contienen;

c. Poseer una región con secuenciasde reconocimiento y corte únicopara varias enzimas de restric-ción de manera que sea inactiva-do en los eventos de inserción delDNA exógeno, permitiendo laselección de los plásmidos re-combinantes;

d. Desde el punto de vista de biose-guridad, los plásmidos usadoscomo vectores no deben sertransmisibles ni móviles, y debentener hospederos específicos quesólo sobrevivan en medios decultivos específicos.

Dos vectores plasmídicos comúnmente utilizadosson el plásmido pBR322 y el plásmido pUC19 (Fi-gura 3.7).

3.2.6 Hospederos

Un hospedero ideal debe ser de fácil manipulacióny propagación. Debe estar disponible en un ampliorango de cepas definidas genéticamente, y debeaceptar un amplio rango de vectores. La bacteriaEscherichia coli reúne todos estos requisitos, porlo cual es utilizada en muchos protocolos de clona-ción.

La entrada de un vector al interior de un hospederose denomina transformación cuando el vector es unplásmido o transfección si el vector es un fago

como el fago λ.



AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT

400 420 440 460

EcoRI Sacl KpnlSmalXmal

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Gsul 1784

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Figura 3.7 Mapa de un vector comercial (el plásmido pUC19).Fuente: Ausubel y colaboradores, 1988.

Algunos vectores comerciales como los plásmidosde la serie pUC, presentan una región de clona-miento múltiple (polilinker) dentro de la secuenciaque codifica por la subunidad alfa de la enzima be-ta-galactosidasa, la cual se complementa con otrasubunidad codificada en el cromosoma del hospe-dero, para formar la enzima activa. La enzima be-ta-galactosidasa actúa sobre el sustrato X-gal,liberando el colorante azul índigo, tiñendo de azullas colonias bacterianas que expresan la enzima.Cuando se inserta un segmento de DNA foráneo enla región de clonamiento múltiple del vector, seinactiva la enzima y las colonias bacterianas pre-sentan su color blanco natural. Esta estrategiaofrece la posibilidad de identificar rápidamente lascolonias con plásmidos recombinantes a través deesta sencilla prueba.

3.3 Aislamiento de genes

Uno de los principales usos de la tecnología delDNA recombinante es el aislamiento y clonaciónde genes de interés de un organismo. Sin embargo,esta tarea es más complicada cuando se trata de ais-lar genes de organismos complejos, como son losanimales y plantas.

Existen algunas estrategias para aislar un gen espe-cífico de entre los miles presentes en el genoma ve-getal. Primero, hay que construir un banco de"genes", ya sea un banco genómico o un banco decDNA y seguir procedimientos específicos paraaislar el gen de interés de los bancos de genes.

3.3.1 Banco de DNA genómico

Un banco genómico es una colección de vectoresrecombinantes (en un hospedero como E. coli ) quecontienen segmentos de DNA, los cuales represen-tan el genoma del organismo.

En un banco genómico están presentes todas las se-cuencias del DNA genómico, como son los exo-nes, los intrones, y secuencias regulatorias. Elnúmero de clones requeridos para tener un bancogenómico completo depende del tamaño del geno-ma de la planta y del tipo de vector de clonaje utili-zado.

Los pasos básicos que se siguen para la construc-ción de un banco genómico son los siguientes: (Fi-gura 3.8).

• Aislamiento de DNA genómico de alta calidady de alto peso molecular.

• Digestión con una endonucleosa de restricción.

• Separación de los fragmentos por electroforesiso por cromatografía de columna.

• Selección de fragmentos del tamaño deseado.

• Unión de los fragmentos a un vector.

• Introducción del vector a un hospedero, para lamultiplicación de los vectores recombinantes.



Selección deColonias con Insertos

DNA Genómico

Fragmentos de Restricción

Separación por Electroforesis

Electroclución

Fragmentos de500-3000 bp

Lac Z

Lac Z

AMPPlásmidio

PlásmidioAbierto

AMP

Bacteria Competente

Figura 3.8. Pasos básicos para la construcción deun banco de DNA genómico.

3.3.2 Banco de cDNA

Un banco de cDNA es una colección de vectoresrecombinantes que contienen cDNAs de todos losmRNAs presentes en un tejido o célula, en un de-terminado estado de desarrollo, y en condicionesde crecimiento definido.

En un banco de cDNA no están representados to-dos los genes de un organismo, pues la proporciónde cada tipo de cDNA particular depende de:

a. Los genes expresados al momento de la toma de lamuestra;

b. Los genes expresados en el tejido utilizado par ex-traer el mRNA y,

c. La abundancia relativa de losmRNAs del tejido seleccio-nado.

Los pasos básicos para laconstrucción de un banco decDNA son los siguientes:

• Aislamiento del RNA to-tal del tejido selecciona-do.

• Aislamiento del mRNA .

• Síntesis del cDNA .

• Adición de adaptadoresal cDNA .

• Unión de los cDNA alvector.

• Introducción del vectorrecombinante a un hospe-dero para la multiplica-ción de los vectoresrecombinantes.

Los dos tipos de bancos (ge-nómico y de cDNA) son in-crementados en cepasbacterianas especiales. Deéstas se pueden aislar colo-nias; y en su turno, de éstas

se aislan los vectores recombinantes portadores delas secuencias presentes en cada uno de los ban-cos.

3.3.3 Identif icación y ais lamiento

de genes

Existen varios métodos para la identificación yaislamiento de secuencias de genes específicas, apartir de un banco genómico o de cDNA :

1. Hibridación de ácidos nucleicos, utilizando sondasconstruidas a partir de una secuencia parcial de laproteína codificada por el gen (Figura 3.9).

2. Utilizando anticuerpos específicos que pueden de-tectar la presencia del producto génico (proteína).



Colonias de un banco de cDNA

Transferencia de las colonias a unamembrana de nylon

Las cadenas de DNAse separan y se ligana la membrana

Sonda radioactiva

La sonda radioactiva sehibridiza a una secuenciacomplementaria en lamembrana de nylon

Autorradiografía

Identificación de la colonia conel "gen" en la caja madre

Película fotográficacolocada sobre lamembrana de nylon

Membranasumergida en unasolución con lasonda radioactiva

Membranasumergida ensolución alcalina

Lisis de labacteria y liberación

del DNA

Figura 3.9 Aislamiento de un gen a partir de un banco de DNA genómico.Fuente: Astec, 1993.

3.4 Secuenciación del DNA

Cuando se ha aislado un gen de interés es necesarioconocer la secuencia lineal de sus nucleótidos paraestudios sobre la estructura génica y las secuenciasque controlan su expresión. Este conocimientoademás permite la modificación necesaria para quedicho gen pueda ser transferido y expresado enotro organismo.

Existen dos técnicas para secuenciar segmentos deDNA:

1. El método enzimático (Método de Sanger) y,

2. El método químico (Método de Maxam y Gilbert).

El método más utilizado es el método enzimático(Figura 3.10). Este método consiste en sintetizaruna cadena complementaria a una cadena moldeque se quiere secuenciar, de tal forma que el creci-miento de la cadena complementaria se puede de-tener en posiciones específicas, lo cual se lograutilizando compuestos análogos a los cuatro deso-xinucleótidos (dNTPs) que conforman la moléculade DNA. Estos compuestos análogos son denomi-nados dideoxinucleótidos (ddNTPs).

La alta resolución de esta técnica permite separarpor tamaño segmentos de DNA que se diferencianen tan sólo un nucleótido. La secuencia del frag-



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Fragmento de la cadena sencilla de DNA cuya secuencia se determinará

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Todas las mezclas de reactivos contienendATP, dTTP, dGTP y dGTP y DNA polimerasa

A T G C T A T G C T C C

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FragmentosMayores

FragmentosMenores

Sentido de lasíntesis

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150

100

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(d) (e)

+ddATP +ddCTP +ddGTP +ddTTP

Productos de la reacciónen la mezcla condideoxiATP

Figura 3.10 Secuenciación de segmentos de DNA por el método enzimático.Fuente: Villée y colaboradores, 1998.

mento de DNA analizado se puede determinar deun modo directo mediante lectura del gel, visuali-zando las bandas que aparecen escalonadamenteleyendo el gel de abajo hacia arriba los cuatro "ca-rriles" de la autorradiografía.

Actualmente existen secuenciadores automáticosque permiten secuenciar hasta 96 muestras dife-

rentes de DNA en pocas horas. Dado que la resolu-ción de esta tecnología l lega hasta un solonucleótido, la secuenciación se ha convertido en laforma más precisa de medir la variabilidad y diver-sidad genética. La masificación también ha redu-cido signif icat ivamente el costo de lasecuenciación.

3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA

recombinante

Objetivos

• Desarrollar el concepto de DNA recombinante.

• Analizar e interpretar los patrones electroforé-ticos: a) de un segmento de DNA digerido condos enzimas de restricción; y b) de un plásmidorecombinante, digerido con una enzima de res-tricción.


El siguiente ejercicio consiste en el análisis de dia-gramas con muestras de un segmento de DNA di-gerido con dos enzimas de restricción y undiagrama de electroforesis de un plásmido sin in-serto, con inserto y de un plásmido recombinantedigerido con la enzima de restricción EcoRI. Eneste ejercicio se busca que los participantes fijen elconcepto de DNA recombinante y sus aplicacio-nes.

Para la realización de este ejercicio se recomiendaque el instructor lea cuidadosamente las siguientesinstrucciones:



• Colocar en cada mesa un juego de los diagra-mas de los geles suministrados.

• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubiquecada grupo en cada una de las mesas de trabajo.

• En cada grupo, los participantes deben analizare interpretar los diagramas de los patrones elec-troforéticos y responder las siguientes pregun-tas:

a. Los sitios de reconocimiento y de corte de lasenzimas de restricción EcoRI y Hind III en elsegmento de DNA son los mismos o diferentes.Explique.

b. ¿Cuántos sitios de reconocimiento y de cortese presentan en el segmento de DNA para cadauna de las enzimas de restricción del ejercicio?

c. ¿Por qué el segmento de DNA sin digerir mi-gra poco? Explique.

d. ¿Por qué el plásmido pUC19:

- Sin inserto,

- con inserto y

- con inserto y digerido con EcoRI presentan di-ferente patrón de bandas? Explique.

e. Haga un dibujo de un gel que presenta las si-guientes muestras.

1. Plásmido pUC19 sin inserto.

2. Plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb.

3. Plásmido pUC19 con inserto de 2Kb



4. Un inserto de 1Kb

5. Un inserto de 2Kb

• Motive una discusión a base de las respuestasdadas.

• Proporcione la información de retorno, con lasrespuestas de este ejercicio.

Recursos necesarios



• Diagramas de los patrones electrofréticos :

a. de un segmento de DNA digerido con EcoRIy Hind III, (Figura 1) y

b. de un plásmido recombinante digerido conEcoRI (Figura 2).

• Fotocopias con las Instrucciones e informaciónde retorno para los participantes.



De acuerdo con la información suministrada en lasección 3 y mediante el análisis e interpretación delos diagramas de geles con un segmento de DNAdigerido con las enzimas de restricción EcoRI yHind III y del gel con el plásmido pUC19:

a. sin inserto,

b. con inserto y

c. con inserto y digerido con Eco RI, los participantesdeberán desarrollar el concepto de DNA recombi-nante.

Pasos a seguir

• Conforme cuatro grupos de trabajo de acuerdocon las instrucciones dadas por el Instructor.

• Nombrar un relator por grupo, el cual presenta-rá en plenaria las respuestas dadas por el grupo.

• Analizar e interpretar los diagramas suminis-trados y contestar las siguientes preguntas.

a. Los sitios de reconocimiento y de "corte" delas enzimas de restricción EcoRI y Hind III enel segmento de DNA son los mismos o diferen-tes. Explique.

b. ¿Cuántos sitios de reconocimiento y de "cor-te" se presentan en el segmento de DNA paracada una de las enzimas de restricción del ejer-cicio?

c. ¿Por qué el segmento de DNA sin digerir mi-gra poco? Explique.

d. ¿Por qué el plásmido pUC19:

- Sin inserto,

- Con inserto y

- Con inserto y degerido con EcoRI presen-tan diferente patrón de bandas? Explique.

e. Haga un dibujo de un gel que presenta las si-guientes muestras.1. Plásmido pUC19 sin inserto.2. Plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb.3. Plásmido pUC19 con inserto de 2Kb4. Un inserto de 1Kb5. Un inserto de 2Kb

• Al finalizar el Instructor les proporcionará la in-formación de retorno.

Respuestas a las preguntas del ejercicio.

Para la pregunta a

Son diferentes.

• Primero, porque el número de fragmentos ge-nerados con EcoRI son 3, mientras que conHind III son 4.

• Segundo, porque el tamaño de los fragmentosgenerados con cada una de las enzimas son di-ferentes.



Para la pregunta b

Hay 2 para EcoRI y 3 para Hind III.

Para la pregunta c

El segmento de DNA sin digerir es un DNA degran tamaño y la migración en el gel (en la electro-foresis) es proporcional al tamaño. Fragmentosgrandes migran poco, fragmentos pequeños mi-gran mucho.

Para la pregunta d

El plásmido pUC19 sin inserto tiene un tamaño de

≈3Kb, el plásmido pUC19 con un inserto de 1Kbtiene un tamaño de 4 Kb y el plásmido pUC19 conun inserto de 1 Kb digerido con EcoRI libera el in-serto, presentando 2 segmentos de DNA uno del

plásmido de ≈3 Kb y el otro que corresponde al in-serto de 1 Kb.

En una electroforesis migración así:1. pUC19 (abierto)2. pUC19 + I (1 Kb)3. pUC19 + I (1 Kb)

digerido con Eco RI.

Para la pregunta e1. pUC192. pUC19 + I (1 Kb)3. pUC19 + I (2 pK)4. Inserto (1 Kb)5. Inserto (2 Kb)



Plásmido pUC19. 1) sin inserto, 2) con un sindertode 1 kb, y 3) con inserto de 1 kb y digerido con Eco-RI.

Segmento de DNA de 25 kb. 1) Sin digerir. 2) Dige-rido con EcoRI y 3) Digerido con Hind III.

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1 2

Marcadores Moleculares



Sección 4

Sección 4 . Marcadores Moleculares



Tabla de Contenido


Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71


Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.1 El genoma y la variabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.2 Los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85


Objetivos

• Entender los principios básicos de los marcadores moleculares.

• Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal.


1. ¿Sabían ustedes que cada uno de nosotros tiene un huella digital a nivel molecular llamada DNA fingerprin-

ting?

2. ¿Algún participante puede dar una definición de genoma?

3. ¿Sabían ustedes que los marcadores moleculares nos permiten detectar cualquier cambio en los genomas de los

individuos y nos permite diferenciar individuos idénticos fenotipicamente?



RFLPs

Microsatelites

RFLPsMicrosatelites

RAPDs

Microsatelites

RFLPs

RFLPs

RFLPs

Microsatélites

AFLPs

RFLPs

Microsatélites

Marcardores Molecurales

• Caracterizac ión y análisisde la variabilidad genética

• Identificación de acervos

genéticos

Mapeo de genes cualitativos ycuantitativos

Estrategias de fitomejoramiento

Majoramiento asistido pormarcadores moleculares

Clonación de genes con base amapas genéticos

Selección asistida por

marcadores moleculares

Identificación y transferencia de

QTLs de germoplasma silvestre

Introgresión de transgenes

Introducción

El estudio de la diversidad genética y la relaciónentre y dentro individuos de especies animales yvegetales es un tema de mucho interés no sólo paralos mejoradores sino también para otras disciplinasbiológicas, incluyendo ecología, medio ambiente ybiodiversidad.

La evaluación de la variabilidad genética entre in-dividuos de una misma especie puede realizarsemediante el uso de marcadores morfológicos (fe-notipo), marcadores bioquímicos (isoenzimas) ymarcadores moleculares basados en el DNA (ge-notipo). Los dos primeros permiten realizar el es-tudio indirecto del genoma, ya que ambos sonproducto de la expresión génica. Estos fueron de

gran utilidad en el desarrollo de los primeros siste-mas de clasificación y las primeras versiones demapas genéticos. Los marcadores moleculares sinembargo, permiten realizar la caracterización yevaluación directa de los genomas de los indivi-duos.

Un marcador molecular es un segmento específicode DNA correspondiente a regiones codificantes ono codificantes del genoma y cuya secuencia pue-de o no ser conocida.

El objetivo de esta sección es presentar en formadidáctica los principios y usos de los marcadoresmoleculares, más utilizados. En las Tablas 4.1 y4.2 se presenta un análisis comparativo de las ca-



Variable RFLPs RAPDs Microsatélites AFLPs

Modo de observación delpolimorfismo

Fragmentos de restricciónde DNA detectado porhibridización con una sondade DNA genómico o deDNA

Segmentos de DNAamplificadosaleatoriamente

Ampliación específica deregiones con secuenciasrepetitivas.

Segmentos amplificados víaPCR después de digestión con 2enzimas de restricción

Expresión genética Co – Dominante Dominante Co – Dominante Dominante

Número de alelos por locus Multialético 2 alelos (binarios) Altamente Multialético 2 alelos (binario)

Disponibilidad de marcadoresen el genoma

Prácticamente ilimitada Prácticamente ilimitada Prácticamente ilimitada Prácticamente Ilimitada

Distribución en el genoma Regiones con bajo númerode copias; medianterepetitivas en telomeros ycentromeros (minisatelite)

Más o menos en todo elgenoma



Transferencia de la ocurrenciade los marcadores

Intra – específica; alta paraespecies próximas

Intra– poblacional; mediaIntra – específica

Intra – específica; baja paraespecies próximas

Intrapoblacional y mediaintraespecífica

Pasos para su detección. · Extracción de DNA· Digestión con Enzima derestricción· Electroforesis (agoniza)· Transferencia membranaNylon· Hibridación con sonda· Autorradiografía

· Extracción del DNA. Amplificación vía PCR· Electroforesis (agarosa)· Tincion con bromuro deletidio· Visualización de bandascon luz U.V

· Extracción del DNA· Amplificación específica víaPCR· Electroforesis en gel depoliacrilamida o agarosa· Autorradiografía ocoloración con bromuro deletidio.

· Extracción de DNA· Digestión con EcoRI y MseI· Ligación de adaptadores· Amplificación vía PCR· Electroforesis (acrilamida)· Autorradiografía.

Información previa para laaplicación de la técnica

Construcción de banco deDNA genómico o de cDNAde la especie para obtenciónde las sondas

Utilización inmediato de“Primers” arbitrariosdisponibles en elmercado.

· Construcción de banco deDNA genómico· Selección de clones conmicrosatélites adecuados· Secuenciación de los clones.· Construcción de los primers· Ensayo del polimorfismocon estos primers

· Ensayos de combinaciones deenzima / primers con basesarbitrarias adecuados.

Accesibilidad Media Muy alta Muy baja Media

Costo de implementación /costo de operación

Medio / medio Bajo / bajo Muy alto / medio Bajo / bajo

Tabla 4.1 Análisis comparativo de los principales marcadores moleculares utilizados para el análisis genético deplantas. Fuente: Ferreira y Grattapaglia, 1995.

racterísticas de los cuatro principales marcadoresmoleculares utilizados en el mejoramiento genéticode plantas.Tabla 4.2 Análisis de la eficiencia de los marcadoresmoleculares en diferentes aplicaciones del análisis gené-tico. Fuente: Ferreira y Grattapaglia (1995).

RFLPs RAPDs MICRO-SATELITES

AFLPs

Identificación degenotipos

Alta Muyalta

Muy alta Muy alta

Evaluación degermoplasma

Alta Alta Alta Muy alta

Mapeo genético Alta Alta Muy alta Alta

Mapeo direccionadoa regionesespecíficas

Media Muyalta

Media Muy alta

Mapeo comparativo Muyalta

Baja Alta Baja

Genética deautógamas

Media Alta Muy alta Muy alta

Genética dealógamas

Muyalta

Muyalta

Muy alta Muy alta

Análisis filogenético Muyalta

media Alta Media

4.1 El genoma y la variabi l idad genét ica

El término genoma se refiere al contenido genéticototal de un organismo. En las plantas el genoma estáconstituido por el contenido genético nuclear y orga-nelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, eltérmino genoma casi siempre se utiliza para referirsea la información genética presente sólo en el genomanuclear. Los cromosomas de las plantas contienenuna gran cantidad de DNA y su organización es muycompleja (Figura 4.1). Presenta regiones codifican-tes (genes) separados por largas regiones de DNA nocodificante; éstas a su vez estan formadas por blo-ques de secuencias repetitivas denominadas VNTRs(del inglés variable number of tandem repeats), quefueron identificados por primera vez en el genomahumano. Además dentro de las regiones codificantes(genes) hay pequeñas regiones no codificantes (Intro-nes), que también están formadas por secuencias re-petidas (Figura 4.2).



Telómero

Satélites Variables

rDNA

Genes

Repeticiones en Tandem

Centrómero

Telómero

Genes

Figura 4.1 Distribución de la información en un cro-mosoma. Fuente: Tohme, J., (Comunicación perso-nal, 1998)

GEN GEN

DNAFlanqueador

DNAFlanqueador

DNACodificante

Figura 4.2 Organización del DNA en el cromosoma.El DNA en el cromosoma está organizado en genes yDNA espaciador. El DNA espaciador adyacente a los ge-nes se llama DNA flanqueador.El DNA codificante, codifica para proteínas y el DNAflanqueador regula la expresión de los genes. Por ejem-plo:· Secuencias de Iniciación· Secuencias de terminación· Promotores· Activadores· SilenciadoresFuente: Astec, 1993.

Existen además copias de genes no funcionales(seudogens) que son incapaces de expresarse debi-do a deleciones u otras alteraciones en su secuen-cia. En resumen, los genes de los organismoseucariotes pueden presentarse como copia única ocomo copias múltiples organizados en familias degenes, o dispersos en los diferentes cromosomas.

Durante la división celular cada organismo repro-duce una copia fiel de su genoma. Sin embargo,existen muchos mecanismos que pueden causar al-teraciones en el DNA durante la evolución y se-lección natural y / o artificial. Los cambios puedenser simples, es decir que afectan sólo un par de ba-ses (mutación puntual); o grandes cambios comoresultado de inversiones, translocaciones, delecio-nes o transposiciones. Si a esto le sumamos los in-tercambios genéticos que ocurren en los procesosde recombinación, durante la reproducción sexual,resulta una gran variabilidad en las secuencias delos genomas de los individuos. Esta variabilidades aprovechada en el mejoramiento genético deplantas y animales; y es fuente de genes para labiotecnología.

La variabidad genética puede ser detectada de di-ferentes maneras:

a. Usando marcadores morfológicos y marcadoresbioquímicos (isoenzimas) que son productos de laexpresión de los genes y

b. Usando los marcadores moleculares, que permitendetectar diferencias entre individuos directamentea nivel de las secuencias del DNA de su genoma.

Los marcadores visibles (fenotipo) como son lasmutaciones en genes con consecuencias en la mor-fología, por ejemplo, el color de los ojos en lamosca de la fruta (Drosófila melanogaster) hansido usados en estudios genéticos desde comienzosdel siglo XX.

En 1959, Market y Moller mostraron diferenciasgenéticas usando cambios en la tasa de migraciónde isoenzimas a través de un gel de almidón, en uncampo eléctrico (electroforesis).

Estos marcadores (morfológicos y bioquímicos)fueron útiles para la construcción de los primerosmapas genéticos de algunos organismos en la dé-cada del 70. Sin embargo, estos marcadores pre-sentan algunos inconvenientes para una buenaevaluación del genoma de un organismo:

a. Un reducido número de marcadores que no permitehacer un buen cubrimiento del genoma;

b. Efecto ambiental en la expresión de ellos;

c. "Enmascaramiento" de la expresión de los genesrecesivos;

d. Efectos epistáticos, etc.

Con el descubrimiento de las enzimas de restric-ción, el desarrollo de las técnicas del DNA recom-binante, y de la técnica de PCR (Reacción encadena de la polimerasa), se desarrolla una nuevaclase de marcadores, denominados marcadoresmoleculares, los cuales son el objetivo de esta sec-ción.

4.2 Los marcadores moleculares

Los marcadores moleculares (MM) son un grupode técnicas que permiten el estudio del genoma deun organismo a nivel del DNA. Los MM están ba-sados en el grado de polimorfismo (diferencias)que ocurre naturalmente en el material genético delos organismos eucarióticos superiores, debido a lagran complejidad en la estructura de sus genomas.

Para ser útil, un marcador molecular debe reunirlas siguientes propiedades:

a. Que sea altamente polimórfico, es decir, que permitaclaramente diferenciar dos indivíduos;

b. Que sea codominante, para que permita discriminarun individuo homocigoto de uno heterocigoto;

c. Que este distribuido a través del genoma;



d. Que no presente efecto pleiotrópico , es decir, que ungen no afecte más de una característica;

e. Que sea de fácil y rápida ejecución, con mira a unaposible automatización;

f. Que tenga alta reproducibilidad;

g. Que permita el fácil intercambio de datos entrelaboratorios.

Los marcadores moleculares permiten estimar :

• El número de genes responsables de una carac-terística.

• La localización cromosómica de genes, porejemplo, ¿cerca de qué marcador molecular?

• El efecto fenotípico, es decir, ¿cuánto afectacada gen la característica?

• La dosis génica (o acción génica): ¿un indivi-duo con dos copias del gen es diferente deaquel que presente una sola copia?

• La pleiotropía: ¿un gen afecta más de una ca-racterística?

• La sensibilidad ambiental: ¿la función de losgenes es similar en diferentes ambientes?

• La epistasis: ¿el efecto de un gen influencia elefecto de otros genes?

Es concepto de marcadores mo-leculares ha revolucionado lahabilidad de detectar regiones(segmentos) dentro del genoma,responsables de caracteres im-portantes (cuantitativos), y haacelerado el proceso de cons-trucción de mapas genéticos locual permite un mejoramientomás dirigido. Los MM son dis-cretos, codominantes, no deleté-reos, sin efecto ambiental, librede epístasis y pueden ser genera-dos en número ilimitado, permi-tiendo una cobertura saturadadel genoma.

4.3 Breve reseña de algunos

marcadores moleculares

4.3.1 Polimorfismo en la longitud de

los fragmentos de restricción

(en inglés RFLPs)

La presencia o ausencia de sitios de reconocimien-to para una determinada enzima de restricción pue-de variar en los genomas de los diferentesindividuos, lo cual puede generar un polimorfismo(Figura 4.3). Las diferencias en los sitios de reco-nocimiento para una enzima de restricción puedeser debido a la ocurrencia de : mutaciones puntua-les, inserciones, deleciones, o rearreglos en el ge-noma debido a translocaciones o inversiones,alterando asi la distancia entre los sitios de corte dela enzima. Esto genera segmentos de DNA (frag-mentos de restricción) de diferentes tamaños.Cuando el genoma es pequeño (por ejemplo, deuna bacteria o de un virus), estos fragmentos pue-den ser separados por electroforesis en un gel de



A __ __ ___________________________ __ __

B __ __ ________________________ __ __

A B A B

Sonda

1

2

ER

Figura 4.3 Base molecular del polimorfismo de los marcadores molecularesRFLPs. 1. Digestión de segmentos homólogos de DNA genómico de dos indi-viduos (A y B) con una misma enzima de restricción (ER). 2. Separación de losfragmentos por electroforesis. El polimorfismo se aprecia en la diferencia delos tamaños de los fragmentos de restricción. Fuente: Bernatzky, R., 1988.

agarosa y visualizados al "teñir" el gel con una so-lución de bromuro de etidio (Figura 4.4).

Cuando el genoma es grande (por ejem-plo, plantas o animales), los fragmentosgenerados son separados por electrofore-sis, transferidos a una membrana denylon (Southern blot), donde son fijadosa la membrana con luz ultravioleta. Lasmembranas se tratan con una solución al-calina para abrir las cadenas y luego sehibridiza con una sonda radioactiva o noradioactiva (hibridización). Finalmentela membrana se expone a una película derayos X que al revelar se obtiene una au-torradiografía que permite visualizar elpolimorfismo. (Figura 4.5).

Los RFLPs presentan ventajas que loshacen atractivos y útiles en programas

de mejoramiento. Algunas de éstas son: el númerode RFLPs es ilimitado, no presentan efectos pleio-trópicos ni epistáticos, la herencia de los fragmen-tos es mendeliana y estable, y son codominantes.(Figura 4.6). También los RFLPs pueden ser anali-zados en todas los tejidos y a cualquier edad fisio-lógica del individuo; las muestras de DNA puedenser almacenadas por largos períodos de tiempo; sepuede obtener un número ilimitado de combinan-ciones enzimas/sondas; los genes heterólogos pue-den ser usados como sondas y se puede analizarvarios loci con una sonda.



DNAGenómico

7kb3kb 5kb

10kb 1.5kb Fragmentosde Restricción

7kb

3kb5kb

10kb

1.5kb

0 (-)

(+)

Separación delos fragmentospor su tamaño

Digestióncon enzima de Restricción

Figura 4.4 Separación y visualización de losfragmentos de restricción utilizando la técnicade electroforesis en geles de agarosa.

Ezimas de restricción Pst 1

Fragmentos de DNA

Fragmentos de500 A 2500 bp

Plásmidioabierto

+Fragmento

Análisis

Transferencia a membranade nitrocelulosa

Sonda radiactiva

Fragmentosde DNA

(Muchas copias PstI)Hibridación

Plásmido confragmento

de DNA

Autorradiografía

Fragmentos de DNA

Extracción de DNA

Célulatransformadapor el plásmido

Ligamiento

Plásmido

Colonias dePlásmidos

Seleccionacolonias conplásmido quecontienen losfragmentos

Genoteca

CélulasCompetentes

Figura 4.5 Secuencia del proceso de detección de los RFLPs en ge-nomas grandes (por ejemplo, animales y plantas).Pst1= Endonucleasa de restricción obtenida de la bacteria Providen-cia Stuartii; bp= pares de bases. Fuente: Ramírez y colaboradores,1991.

4.3.2 Marcadores moleculares basa-

dos en la reacción en cadena de

la polimerasa (PCR)

La reacción cadena de la polimerasa (PCR) es unmétodo para la multiplicación in vitro de secuen-cias específicas de DNA. Se utilizan "primers" (ce-badores) que delimitan la región de interés en elDNA que se va a amplificar o multiplicar. El PCRfue descubierto por K. Mullis en la década de los80s. En 1988, Saiki y colaboradores aislaron unaDNA polimerasa de la bacteria termofílica Ther-

mus aquaticus, denominada "Taq polimerasa", lacual es termoestable a altas temperaturas. Este ha-llazgo permitió la automatización del PCR.

La técnica PCR consiste de una serie repetitiva deciclos (20-40), consistiendo cada una de tres eta-pas:

a. Desnaturalización del segmento de DNA que se va aamplificar, generalmente se utiliza una temperaturade 94oC;

b. Alineamiento de los "primers" a las cadenas delDNA patrón, a una temperatura muy cercana al Tm(temperatura a la cual el 50% del DNA estádesnaturalizado), generalmente entre 37-60 oC;

c. Extensión de los "primers": la Taq polimerasaincorpora desoxirribonucleótidos a la cadena nueva,produciendo una copia complementaria del DNApatrón, a una temperatura de 72 oC.

Las copias de DNA aproximadamente se duplicanen cada ciclo. En la práctica la amplificación no es100% eficiente, pues en 20 ciclos, la producción esde 105 a 108 veces la cantidad inicial de segmentosde DNA. Esta escala de amplificación permite ini-ciar el proceso con cantidades mínimas de DNA(del orden de picogramos o nanogramos), y termi-nar con grandes cantidades de una secuencia espe-cífica de DNA. (Figura 4.7).



F1

F2

6 kb

8 kb

6kb/6kb 8kb/8kb

6 kb

8 kb

8kb/6kb

6 kb

6kb/6kb

6 kb

8 kb

8kb/6kb

6 kb

8 kb

8kb/6kb

8 kb

8kb/8kb

R/Rr/r

R/r

R/R R/r R/r r/r

Figura 4.6 Análisis genético de plantas utilizando marca-dores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989.

DNA Original

Ciclo 1

Ciclo 2

Ciclo 3

Ciclo 4, etc.

Secuencia que se vaa amplificar

Figura 4.7. Principio de la reacción en cadena de la poli-merasa (PCR).Fuente: Weising y colaboradores, 1995.

La técnica del PCR es aplicable a muchas áreas bá-sicas y prácticas; por ejemplo: diagnóstico, investi-gaciones médicas, medicina forense, y es base parala utilización práctica de los marcadores molecu-lares como: RAPDs, microsatélites, AFLPs, etc.

4.3.3 Polimorfismo de DNA amplif ica-

do aleatoriamente (en inglés

RAPDs)

Esta metodología permite detectar polimorfismosde secuencias de nucleótidos, utilizando solamenteun "primer" (decanucleótido) de secuencia "arbi-traria" para la amplificación del DNA.

La mayor ventaja de esta técnica es que no se re-quiere información de la secuencia del DNA, ade-más el protocolo es relativamente rápido y fácil derealizar y no utiliza radioctividad. Como esta técni-ca esta basada en la amplificación de segmentospor medio del PCR, se necesita poca cantidad deDNA genómico (nanogramos

La naturaleza molecular del polimorfismo de losRAPDs no está totalmente conocida. Evidenciasexperimentales indican que diferencias de apenasun par de bases (mutación puntual) es suficientepara que no haya una perfecta complementaridaddel "primer" con el sitio de iniciación, impidiendola amplificación de este segmento.

El polimorfismo genético detectado por los marca-dores RAPD también son de naturaleza binaria,esto significa que un segmento amplificado (bandaen el gel) puede estar presente o ausente (Figura4.8).

Una limitación de los RAPDs (por ser marcadoresdominantes), es la dificultad de discriminar direc-tamente los genotipos homocigotos.

Además, los perfiles de amplificación pueden va-riar de un laboratorio a otro debido a diferencias enlos termocicladores utilizados.



3kb5kb

1.5kb

1.0kb

Primers

Separación de losfragmentos pore lectrofores is

1.5 kb 1.0 kb 3.0 kb 1.5 kb 2.5 kb 3.0 kb

Individuo A Individuo B

5´

Figura 4.8 Base molecular del polimorfismo de los RAPDs. Fuente: Adaptado por Ramírez, H., 1993.

4.3.4 Microsatél i tes

Los microsatélites o secuencias simples repetidas(SSR - Simple Sequence Repeats) son secuenciaspequeñas de 1a 4 nucleótidos que se repiten en blo-ques. En los genomas de los organismos eucarióti-cos, estas secuencias simples son más frecuentes,bién distribuidas y presentan loci genéticos alta-mente polimórficos.

Este tipo de secuencias varían entre animales y ve-getales. Por ejemplo, en mamíferos las secuenciasmás comunes son (GT)n y (CA)n, donde n repre-senta el número de veces que se repite la secuencia.En plantas, las secuencias más comunes son (AA)ny (AT)n. Wu y Tanksley encontraron en 1993 queen el genoma de maíz y arroz las secuencias máscomunes son (GA)n, (GT)n y las complementarias(CT)n y (CA)n.

Los microsatélites pueden ser amplificados indivi-dualmente vía PCR, utilizando un par de "primers"especialmente diseñados (de 20-30 bases), com-plementarios a las secuencias únicas que limitan(flanquean) los microsatélites. Los segmentos am-plificados son separados por electroforesis en ungel de agarosa y visualizados, después de la tincióncon bromuro de etidio, en una pantalla con luz ul-travioleta.

La base molecular del polimorfismo radica en ladiferencia del número de unidades repetidas en losdiferentes loci de microsatélites. Cada segmento,de tamaño diferente (amplificado generalmentedesde varias decenas hasta centenas de pares debases) representa un alelo diferente de un locus.

Los microsatélites amplificados vía PCR ofreceventajas como:

a. Su alto polimorfismo, y por consiguiente sonaltamente informativos;

b. Son codominantes, lo que permite diferenciarindividuos homocigotos y heterocigotos;

c. Disponibilidad de una buena colección de diferentesmicrosatélites, algunos de los cuales ocurren en altonúmero de copias;

d. Están más o menos dispersos a través del genoma;

e. La técnica puede ser automatizada.

Por estas características, los microsatélites sonideales para el mapeo genético y mapeo físico degenomas, para la identificación y discriminaciónde genotipos y para estudios de genética de pobla-ciones.

4.3.5 Polimorfismo en la longitud de

fragmentos amplif icados (en in-

glés AFLPs)

La técnica AFLP se basa en la amplificación selec-tiva, vía PCR, de fragmentos de restricción deDNA genómico. La técnica comprende cuatro eta-pas:

1. Generación de fragmentos de restricción de DNAgenómico.

2. Ligación de adaptadores específicos a losfragmentos.

3. Amplificación selectiva de un grupo de fragmentosvía PCR.

4. Separación de los fragmentos amplificados porelectrosforesis y análisis de los fragmentosamplificados.

La base molecular del polimorfismo de los AFLPs,al igual que el de los RFLPs, se debe a las diferen-cias en los sitios de reconocimiento de las enzimasde restricción utilizados en el estudio (en este casoEcoRI y MseI). Estos cambios se deben a mutacio-nes puntuales, inserciones, deleciones, o rearreglosen el genoma debido a translocaciones e inversio-nes, lo cual causa la pérdida o ganancia de secuen-cias de reconocimiento.

Los AFLPs, al igual que los RAPDs, son marcado-res dominantes, lo cual no permite diferenciar in-dividuos homcigotos de heterocigotos.



El poder de la técnica de AFLP se basa en las varia-ciones genéticas que existen entre especies, varie-dades o cultivares estrechamente relacionados.Estas variaciones en su secuencia del DNA son ex-plotadas por esta técnica para la obtención rutina-ria de "fingerprintings" (huellas dactilares) de ungenotipo en particular. Estos "fingerprintings" sonsimples RFLPs amplificados selectivamente víaPCR.

Desde su desarrollo, esta técnica ha sido utilizadapara discriminar genotipos, para mapeo genéticolocalizado (Bulk Segregant Analysis) y para laconstrucción de mapas genéticos.

4.3.6 Marcaje de secuencias expresa-

das (en inglés ESTs)

Los ESTs son secuencias cortas de DNA (200-500pb) de clones seleccionados al azar de un banco decDNA. El propósito de estas secuencias es realizarun monitoreo rápido de todos los genes que confor-man el genoma de un cultivo en particular, con elfin de "marcar" su localización en los cromosomas.

Una aplicación obvia de los ESTs es la identifica-ción, localización y aislamiento de nuevos genes,en donde la secuencia EST es utilizada como "son-da" para "pescar" el gen completo en un banco ge-nómico o en bancos de cromosomas artificialesYACs (yeast artificial chromosomes) o BACs(bacterial artificial chromosomes).

Los ESTs también se utilizan para identificar y ais-lar genes homólogos en cultivos relacionados. Enespecies no relacionadas, la comparación de losESTs permite la identificación de secuencias alta-mente conservadas que luego se utilizan para dise-ñar "primers" apropiados para aislar los genescompletos en bancos genómicos o de cromosomasartificiales de los respectivos cultivos.

Los ESTs son útiles para la construcción de "son-das" de genes específicos para el análisis de la ex-presión diferencial de familias multigénicas.Además se usan para el mapeo y secuenciación delgenoma, utilizando clones de cromosomas artifi-ciales (YACs o BACs).

En conclusión, los ESTs constituyen una valiosaherramienta que es muy útil en los programas demejoramiento animal y vegetal.

4.3.7 Minisatél i tes

Los organismos superiores presentan gran abun-dancia de DNA repetitivo, que podría comprendermás del 90% del DNA total en ciertos genomas deplantas. El término minisatélite designa a una fa-milia de secuencias repetitivas organizadas en blo-ques. Esta clase de DNA consiste de pequeñasunidades (10-60 pb) y presentan un bajo grado derepetición en locis determinados.

En 1985 Alec J. Jeffreys y su grupo, describieron lapresencia de minisatélites en el genoma humano yaislaron dos regiones conservadas: una llamada33.6 de 16 pb, y otra denominada 33.15 de 20 pb.Ambas regiones conservadas son conocidas comolas sondas de "Jeffreys".

Genomas humanos hibridizados con una sonda deJeffreys produce un patrón de bandas un pococomplejo. Este patrón de muchas bandas es lo queconstituye un "fingerprinting" de DNA el cual esúnico para cada individuo. Esto se debe a la granvariabilidad en los minisatélites dentro de la espe-cie Homo sapiens.

En los últimos años, no sólo se han descubiertomarcadores moleculares de gran poder de resolu-ción, sino que también se ha simplificado y masifi-cado su uso. Entre los usos más importantes de los



MM en el mejoramiento genético deplantas se encuentran:

1. En el manejo de germoplasma:caracterización y análisis de lavariabilidad genética, identificación deacervos genéticos y de parentales parael mejoramiento. Los marcadores másapropiados para estas aplicaciones sonlos RFLPs, y los microsatélites.

2. El mapeo de genes cualitativos ycuantitativos (QTLs). Los marcadoresmás usados: RFLPs, microsatélites yRAPDs.

3. En estrategias de fitomejoramiento:selección asistida por marcadores(marcador apropiado: microsatélites),identificación y transferencia de QTLsde germoplasma silvestre (marcador:RFLPs) e introgresión de transgenes(marcadores apropiados: RFLPs ymicrosatélites).

4. Mejoramiento asistido por marcadoresmoleculares (marcador: RFLP). (Figura4.9).

5. Clonación de genes con base a mapasgenéticos (marcadores apropiados:RFLPs, microsatélites y AFLPs).

Para realizar numerosas aplicaciones,la construcción de mapas genéticos mo-leculares es un paso previo necesario (Fi-gura 4.10). Actualmente existen mapasgenéticos basados en marcadores mole-culares para un número grande de espe-cies económicamente importantes.Entre estas se encuentran : maiz, tomate,arroz, soya, frijol, yuca, algodón, caña deazúcar, naranjo, tabaco, manzano, ceba-da, zanahoria, espárrago, alfalfa y gira-sol.



12

19

1116

48

6

2021

3

5

25

10

237

18

9

13

21

1415

17

24

Mapa Molecular con RFLPsEnsayo de Campo conPoblaciones de Interés

Correlación de datos de campo conmarcadores de RFLP

Los marcadores RFLPs con correlaciones positivasson útiles para el monitoreo de los caracteres

Un programa de mejoramiento con estas población puede teneréxito si se seleccionan los marcadores RFLPs apropiados

Figura 4.9 Utilización de un mapa molecular en un programa de mejora-miento vegetal. Fuente: Tohme, J. (comunicación personal, 1997).

Cromosoma 4

REC

Frac.

Diat

cM

Marcador

Id

Nombre

(45) RG 143

(10.3%) 10.4

(11) RG 463

(7.7%) 7.8 (23) RG214

(2.6%) 2.6 (36) RG864

(17.9%) 18.8

(2.8%) 2.8 (3) Pi (t)

(3.2%) 3.2 (25) B10700

(15) B8350

(16.9%) 17.6

(33) C15600

Figura 4.10 Ejemplo de un grupo de ligamiento construido con marca-dores moleculares. Fuente: Tohme, J., 1996.

4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores

moleculares

Objetivos

• Desarrollar el concepto de marcadores molecu-lares .

• Identificar individuos homocigotos y heteroci-gotos utilizando: a) marcadores morfológicos,y b) marcadores moleculares.

• Confirmar el poder de discriminación que tie-nen los marcadores moleculares.


Este ejercicio consiste en identificar en un diagra-ma, individuos homocigotos y heterocigotos utili-zando marcadores morfológicos y marcadoresmoleculares (RFLPs).

Con este ejercicio se busca que los participantes fi-jen el concepto de marcadores moleculares y susaplicaciones.

Para la realización de este ejercicio se recomiendaque el Instructor lea cuidadosamente las siguientesinstrucciones:



• Colocar en cada mesa 5 plantas con flores rojas( por ejemplo, claveles) y dos plantas con floresblancas.

• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubiquecada grupo en cada una de las mesas.

• En cada grupo los participantes deben respon-der las siguientes preguntas:

Si el color de la flor es un carácter monogénico(RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una planta deflor roja homocigótica (RR) con una planta de florblanca (rr) :

a. ¿De qué color serán las flores de las plantas de la F1?Explique.

b. Si se cruzan dos plantas F1, ¿de qué color serán lasflores de las plantas de la F2?

c. ¿En la F2 es posible diferenciar las plantas de floresrojas homocigotas de las plantas de flores rojasheterocigotas? Explique.

d. Utilizando marcadores moleculares, ¿cómo haríausted para diferenciar plantas de flor rojahomocigotas de plantas de flor roja heterocigotas?

e. Explique con un ejemplo, cómo se puede utilizar unmarcador molecular en un programa demejoramiento.

- Presentar por escrito las respuestas a laspreguntas de este ejercicio.

- Motive una discusión con base en lasrespuestas dadas.

- Proporcione la información de retornosuministrando las respuestas a las preguntas aeste ejercicio.

Recursos necesarios

- Papelógrafo, papel, marcadores.

- Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.

- 20 plantas con flores rojas (por ejemplo,claveles) y ocho plantas con flores blancas enmateras o bolsas de plástico.



Con la información suministrada en la Sección 4 ycon la identificación de un marcador molecularpara diferenciar plantas de flores rojas homocigóti-cas de plantas de flores rojas heterocigóticas, losparticipantes deberán construir el concepto demarcadores moleculares.



Pasos a seguir

• Conforme cuatro grupos de trabajo deacuerdo con las instrucciones dadas por elInstructor.

• Nombrar un relator por grupo, el cual pre-sentará en plenaria las respuestas dadaspor el grupo.

• Contestar por escrito las respuestas a lassiguientes preguntas:

Si el color de la flor es un caracter monogéni-co (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar unaplanta de flor roja homocigótica (RR) conuna planta de flor blanca (rr) :

a. ¿De qué color serán las flores de las plantas dela F1? Explique.

b. Si se cruzan dos plantas F1, ¿de qué colorserán las flores de las plantas de la F2?

c. ¿En la F2 es posible diferenciar las plantas deflores rojas homocigotas de las plantas deflores rojas heterocigotas? Explique.

d. Utilizando marcadores moleculares, ¿cómoharía usted para diferenciar plantas de flor rojahomocigotas de plantas de flor rojaheterocigotas?

e. Explique con un ejemplo, cómo se puedeutilizar un marcador molecular en unprograma de mejoramiento.

• Al final el instructor les proporcionará lainformación de retorno a las preguntasplanteadas.

Información de retorno

Respuestas a las preguntas realizadas en esteejercicio.

Si el color de la flor es un caracter monogéni-co (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar unaplanta de flor roja homocigótica (RR) conuna planta de flor blanca (rr) :

Respuestas

Para la pregunta a

Serán rojas, porque:

Porque el alelo R es dominante sobre el alelo r.

Para la pregunta b

Serán de flores rojas y de flores blancas en una propor-ción de 3 : 1.



P1RR

(roja)

P2rr

(blanca)X

Rr(roja)

F1

Rr(rojas)

Rr(rojas)

X

(rojas)

RR Rr Rr

(blancas)

rr

3 1:

F2

Porque:

Para la pregunta c

No es posible. Las plantas RR y Rr son de flores ro-jas porque el alelo R es dominante sobre el alelor.

Para la pregunta d

Para la pregunta e

En tomate, la resistencia a nemátodos es un carác-ter monogénico. Este carácter está asociado a unmarcador molecular (RFLP). A través de este mar-cador molecular, es posible seleccionar los mate-riales de tomate resistentes a nemátodos, en unprograma de mejoramiento para este carácter.

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R/Rr/r

R/r

R/R R/r R/r r/r

Figura 4.6 Análisis genético de plantas utilizando mar-cadores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989.



RF

LP

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Transformación genética de plantas



Sección 5

Sección 5 . Transformación genét ica de plantas



Tabla de Contenido


Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93


Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.1 ¿Porqué transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas . . . . . . . . . . . . . 95

5.3 Transformación genética de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens . . . . . . 98

5.4 Transformación por introducción directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

5.5 Logros de la ingeniería genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

5.6 Ejercicio 5.1 Transformación genética de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111


Objetivos

• Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas.

• Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas.

• Conocer algunas aplicaciones de esta tecnología.


1. ¿Sabían ustedes que es posible producir hormona de crecimiento humana en plantas de tabaco?

2. ¿Algún participante nos puede decir que es una planta transgénica?

3. ¿Sabían ustedes que el Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo, ha venido realizando ingeniería

genética desde hace miles de años?



Construcción

Genética

BBoommbbaarrddeeoo ddee

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Explante o protoplastos

Transformación

genética víaAgrobacterium

CO - cultivo

RReeggeenneerraacciióónn ddee ppllaannttaass eenn

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Plantas Transgénicas

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MercadoMejoramiento

convencional

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Introducción

La transformación genética de plantas se refiere ala introducción de genes modificados (llamadosgenes quiméricos) al genoma de las células vegeta-les, utilizando un método apropiado. Los métodosde transformación más utilizados son: medianteAgrobacterium tumefaciens y mediante el bombar-deo de partículas o biolística. El gen o genes intro-ducido (s) es (son) incorporado (s) al genoma de lacélula vegetal, al que debe integrarse de manera es-table y expresarse en la biosíntesis de proteínas es-pecíficas. La célula o tejido transformado secultiva in vitro para regenerar plantas normalesque expresen el transgen.

La transformación genética amplía grandemente elrango de genes disponibles para el mejoramientode plantas. En el mejoramiento convencional, losgenomas de dos parentales se combinan en altogrado, a pesar de que el mejorador esté interesadoen la transferencia de una sola característica, lacual podría estar controlada por un gen simple.Para eliminar las características indeseables del hí-brido resultante, deben realizarse varios ciclos deretrocruzamiento hacia el parental deseable, proce-so que toma varios años, para finalmente obtenerun material mejorado.

En contraste, con las técnicas de ingeniería genéti-ca de plantas, un gen de interés puede ser identifi-cado, aislado, clonado y transferido de una planta aotra en una forma directa, lo que significa que poresta vía el mejoramiento de un cultivo es más diri-gido. Por otro lado, en el método tradiconal los fi-tomejoradores solo pueden trabajar con plantasque sean compatibles (cruzables), mientras que poringeniería genética se puede transferir cualquiergen de interés sin importar su procedencia (virus,bacterias, hongos, animales o plantas).

El objetivo de esta sección en mostrar en formasencilla los dos métodos más utilizados para latransformación genética de plantas: La vía Agro-

bacterium y la vía biolística. Además, se presenta-rán algunos logros de esta metodología que estáncontribuyendo a la solución de algunos problemasagrícolas.

5.1 ¿Porqué transformar plantas?

Las plantas ocupan el primer eslabón de la cadenaalimenticia. A través de la fotosíntesis, utilizan laenergía lumínica del sol para producir carbohidra-tos que son la fuente del 90% de las calorías consu-midas por los humanos. Además, las plantasproporcionan el 80% de las proteínas que consumi-mos en nuestras dietas alimenticias.

Por miles de años, el hombre ha manipulado las ca-racterísticas genéticas de las plantas. Primero, porselección consciente o inconsciente de caracteresespecíficos; luego, por cruces dirigidos basados enlas leyes de la herencia.

Sin embargo, muchas características genéticas deinterés agronómico tales como: resistencia a enfer-medades y plagas, tolerancia a heladas, salinidad,sequía, etc., presentes en otras especies no puedenser transferidas por cruzamiento genético conven-cional debido principalmente a barreras de incom-patibilidad.

La ingeniería genética y la transformación de plan-tas constituye una poderosa herramienta para supe-rar estas barreras de cruzabilidad, permitiendo latransferencia de genes de interés a las plantas, cual-quiera que sea su procedencia. Esta alternativapermitirá un mejoramiento más dirigido, con unareducción significativa del tiempo en la produc-ción de nuevas variedades. Así, la transformación



genética contribuirá no solamente a la reduccióndel costo de la producción agrícola sino también auna mayor protección del medio ambiente comoconsecuencia de la disminución sustancial del usode los agroquímicos.

5.2 Un vector natural para introducir

genes foráneos a las plantas

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria delsuelo que infecta a un buen número de especies ve-getales, principalmente dicotiledones, producien-do la enfermedad denominada Agalla de la Corona(un tumor vegetal) (Figura 5.1). La producción deesta enfermedad es el resultado de un evento natu-ral de ingeniería genética en el que una región es-pecífica del plásmido Ti (inductor de tumores) dela bacteria, se integra al genoma de la célula infec-



Plasmido Ti

DNA-T

PLANTAS

Fotosintesis

CO2 + H2O Compuestos orgánicos

Genes para crecimiento tumorigénico

Genes para sintesis de opina

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Genes Catabolicos

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BACTERIA

aminoácidos oPINAS

Agalla de la corona

Proliferación decon Plasmido Ti Catabólicos y

Plasmido asociado Ti

Agrobacterium

Figura 5.1 Principios de colonización genética. Fuente: Calderón, A. 1990.

T-DNA

DNA cromosómico

Plasmido Ti Agrobacterium

DNA cromosómicode la planta

Integrado al genomade la célula vegetal

Herida

Agrobacteriuminfecta la herida

Agalla de la corona(tumor vegetal)

Figura 5.2 La bacteria Agrobacterium tumefaciens es lacausante de la enfermedad Agalla de la Corona. Fuente:Watson y colaboradores, 1992.

tada. Este proceso es el resultado de miles de añosde evolución de la bacteria. (Figura 5.2).

El plásmido Ti presenta dos regiones claves para elproceso de transformación: la región T-DNA quees la región que se transfiere desde el plásmido Tial genoma vegetal; y la región vir (región de viru-lencia) que presenta ocho operones (virA, virB,virC, virD, virE, virF, virG, y virH), cuyos pro-ductos procesan el T-DNA y coordinan todo elproceso de transferencia del T-DNA al genoma dela planta (Figura 5.3).

La región que se transfiere se llama T- DNA (DNAtransferible) y contiene genes responsables para labiosíntesis de dos hormonas vegetales una auxina(ácido indolacético) y una citoquinina (riboxido dezeatina). Estas son los responsables del sobrecre-

cimiento del tejido infectado. La región T-DNApresenta otros genes que promueven la síntesis deopinas (derivados de aminoácidos) que son utiliza-dos por la bacteria como fuente de carbono y de ni-trógeno. La región T-DNA esta compuesta portres elementos importantes: la secuencia de bordesdel T-DNA conteniendo secuencias repetidas, losgenes de biosíntesis de fitohormonas (región onc)y los genes de biosíntesis de opinas (región ops)(Figura 5.3).

Los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefacienshan sido explotados como vectores para la intro-ducción de DNA foráneo en las plantas. Para queestos plásmidos puedan ser utilizados como vecto-res de transformación, la región onc (oncogene)debe ser removida, para producir plásmidos Ti



Genes onc

Producción decitocininaSíntesis de opina

Borde derecho (24pb)

Transferenciaconjugativa

Producción deauxina

Región T

Borde izquierdo (24 pb)

Plásmido TiRegión devirulencia

Replicador

Catabolismo deopinas

Figura 5.3 Mapa genético de un plasmidio Ti de Agrobacterium tumefaciens. Fuente: Beijersbergen y Hooykaas,1993.

"desarmados", y en su reemplazo se coloca un gen quiméri-co, portando la secuencia de interés que se va a transferir algenoma de la planta. Además se colocan secuencias fácil-mente identificables en los tejidos transformados (genes re-porteros), como el gen de la b-glucuronidasa comúnmente

llamada gus. También es necesariocolocar en la región T-DNA un gen deselección, como el gen nptII que codifi-ca para la enzima neomicina fosfotrans-ferasa. Esta permite el crecimiento decélulas transformadas en medios de cul-tivo que contienen el antibiótico kana-micina (Figura 5.4).

Un gen quimérico de interés, es un gendonde el promotor, la secuencia codifi-cante y las secuencias de terminaciónprovienen de organismos diferentes. Unejemplo de un gen quimérico típico con-tiene: el promotor 35s del virus del mo-saico de la coliflor (CaMV35s), lasecuencia codificante CryIA(b), que co-difica para una d-endotoxina de la bac-teria Bacillus thurigiensis; y lasecuencia de terminación la región 3'nos del gen nopalina sintetasa de la bac-teria Agrobacterium tumefaciens. Ge-neralmente el promotor se identifica yse aisla de la planta que se pretendetransformar (Figura 5.5).

Existen dos clases de vectores derivadosdel plásmido Ti: vectores cis ó co-inte-



Figura 5.4 Proceso de transferencia de la región T-DNA del plásmidoTi del Agrobacterium al genoma de una célula vegetal. Fuente:Lindsey y Jones, 1992.

Figura 5.5 Mapa de una región de T-DNA de una construcción genética que contiene el gen CryIA(b), el gen reporterogus-intron y el gen de selección nptII que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. Fuente: Mancilla, L. 1997.(comunicación personal)

grados y vectores trans o binarios. En los vectoresco-integrados tanto el T-DNA como la región virestán presentes en el mismo plásmido; mientrasque en los vectores binarios el T-DNA y la regiónvir se hallan en plásmidos separados dentro de lamisma bacteria hospedera (Agrobacterium). Deestos dos tipos de vectores el más utilizado para latransformación genética de plantas es el sistemabinario (Figura 5.6).

5.3 Transformación genét ica de

plantas ut i l izando Agrobacterium

tumefaciens

La metodología general para la transformación ge-nética de plantas se presenta en la Figura 5.7. Latransformación de plantas con Agrobacterium tu-

mefaciens, básicamente consiste en cultivar con-juntamente los explantes ( tejidos, órganos, célu-las) con una cepa de Agrobacterium tumefaciensportadora de un vector apropiado con el gen de in-terés y los genes marcadores (reportero y de selec-ción), que se va a transferir al genoma vegetal.

El cultivo se incuba a 28 °C por un período sufi-ciente (24-48 horas) para garantizar la transferen-cia del T-DNA del vector (plásmido Ti) a lascélulas de la planta. La bacteria se elimina con unantibiótico y el tejido se coloca en un medio de re-generación (vía embriogénesis o vía organogéne-sis) en presencia de un agente de selección (porejemplo un antibiótico) para permitir el desarrollode sólo los tejidos transformados.



Célula de Agrobacterium

L ROncogenes Gen de síntesis de opina

Plásmido Titipo salvaje

200 kb

Oncogenes

L

R

Genes VIR

Origen dereplicación

Plásmido Tidesarmado

100 kb

PlásmidoT-DNAbinario25 kb

Gen seleccionable



L R

Gen extraño

Vir

Gen opina

L RGen seleccionable Gen extraño

Características:Producción de hormona vegetalFormación de tumorProducción de opinaNo se regeneran plantas

Características:Plásmido con amplio espectro de hospedadoresque puede ser construido enNo hay producción en exceso de hormonas vegetalessolo los transformantes seleccionados que contenganel gen extraño regenerarán plantas normales

E Coli

T-DNA transferido e integrado en el cromosoma vegetal

Figura 5.6 Sistemas de vectores empleados en la transformación genética de plantas vía Agrobacterium. a) Vectorcointegrado (plásmido Ti en estado silvestre). En este sistema la región T-DNA y la región vir están en el mismoplásmido. b) Vector binario. En este sistema, las regiones T-DNA y vir están en plásmidos separados. Fuente:Lindsey y Jones, 1992.

La selección de células transformadas debe cum-plir las siguientes características:

a .las células transformadas deben tener un alto nivel deresistencia al agente de selección;

b. las células no transformadas deben ser totalmenteeliminadas por el agente de selección;

c. los tejidos transformados deben ser fácilmente detec-tables para distinguir posibles "escapes" que pue-dan crecer a expensas de los tejidos transformados,degradando el agente de selección.

Después de la formación de callos a partir de lascélulas transformadas, éstos se transfieren a me-dios apropiados conteniendo el agente de selec-ción, para la inducción de brotes y luego plántulas.

En la etapa de enraizamiento se reduce el agente deselección (si éste es un antibiótico) para favorecerel enraizamiento de las plántulas.



CO-CULTIVO

EXPLANTEIntroducción a una Cepa deAgrobacterium

Construcción

Gen(s) de interés

Gen reportero

Gen de selección

Secuencia reguladoras

Regeneración de plantas enmedio de selección

Prueba de transgénesis Pruebas genéticasEnsayo agronómicos:

Bioseguridad

Integración del gen (s)

al genoma vegetal

Expresión del gen (s)

Nivel de RNA

Nivel De Proteína

Herencia del transgen

Resistencia/tolerancia/

biosíntesis

Invernadero

Campo

Mercado Mejoramientoconvencional

Figura 5.7 Secuencia de pasos para la transformación genética de plantas vía Agrobacterium.

5.4 Transformación por introducción

directa de DNA

En las gramíneas, y en concreto, en los cereales, latransformación vía Agrobacterium ha tenido pocoéxito. Debido a esto, se ha desarrollado métodosalternativos que permiten la introducción directade DNA al genoma vegetal (Figura 5.8). Algunosde estos métodos son:

a. Transferencia mediada por agentes osmóticos

b. Microinyección

c. Electroporación

d. Bombardeo de partículas o Biolística

5.4.1 Transferencia mediada por

agentes osmóticos

Fue el primer sistema desarrollado para la intro-ducción directa de DNA a protoplastos (células ve-getales a las cuales se les ha removido la paredcelular). Los protoplastos se tratan con el osmóticopolietilenglicol (PEG) con fostato de calcio, enpresencia del DNA foráneo.

El tratamiento PEG/Ca++ permite un aumento enla permeabilidad de la membrana del protoplastofacilitando así la entrada del DNA foráneo. Aun-que la incorporación de DNA a los protoplastos nodepende de la especie, la regeneración de plantascompletas a partir de protoplastos puede resultardifícil, lo cual constituye una gran limitación parael uso generalizado de esta metodología.

5.4.2 Microinyección

Esta técnica consiste en inmovilizar una célula enla punta de un microtúbulo, usando presión ne-gativa ligera para inyectar una solución de DNAusando un capilar de vidrio fino. Este atraviesa lamembrana citoplasmática de la célula y llega alnúcleo sin producirle ningún daño.

Utilizando esta metodología se ha logrado trans-formar algunas plantas como el tomate y la za-nahoria. Algunas desventajas de este métodoson: la baja viabilidad de las células inyectadas, elalto nivel técnico y experiencia requeridas, y elhecho de que sólo se pueda inyectar una célula ala vez. Todo esto hace que éste método sea pocoeficiente.

5.4.3 Electroporación

En esta técnica, protoplastos son sometidos a im-pulsos eléctricos de alto voltaje por fracciones desegundos. Este tratamiento permeabiliza la mem-brana induciendo la formación reversible de po-



Por tratamiento conPEG Y Ca

++

Por electrochoque

Por microinyección

Por biolística

A

B

C

D

Figura 5.8 Métodos utilizados para la introducción directa deDNA al interior de las células vegetales. A) Transferenciamediada por agentes osmóticos. B) Electroporación. C)Micro-inyección y D) Bombardeo de partículas o biolística.Fuente: Calderón y colaboradores, 1991.

ros que permiten la introducción demacromoléculas como el DNA. Este método hapermitido la transformación de especies como:arroz y maíz.

5.4.4 Bombardeo de partículas o

biol íst ica

Este método fue desarrollado por Klein y colabora-dores en 1987. Esta metodología utiliza un dispo-sitivo que dispara microproyectiles (esferasdiminutas de tungsteno o de oro, de 4 mm de diá-metro) recubiertos con el DNA foráneo que sequiere introducir en las células.

El proceso se basa en la aceleración de las micro-partículas, a través de un tubo en el cual se ha pro-ducido vacío, a velocidades tales que permiten supaso a través de la pared y membrana celulares, yla integración del DNA foráneo al genoma de lascélulas de los tejidos bombardeados (Figura 5.9).

De los métodos de transformación directa, el mé-todo biolístico es el más utilizado. Actualmente seha transformado un número grande de especies,muchas pertenecientes al grupo de la gramíneas.

5.5 Logros de la ingeniería genét ica de

plantas

En la actualidad se han transformado aproximada-mente 50 especies de plantas con características deinterés como resistencia a insectos, virus y herbici-das. Esto se debe a la disponibilidad de muy bue-nos sistemas de regeneración y de transformaciónpara muchos cultivos de importancia económica(Tabla 5.1). El carácter con mayor modificaciónpor ingeniería genética ha sido la resistencia a her-bicidas, seguido por la resistencia a insectos y a vi-rosis; y los cultivos más utilizados han sido lasoya, el maíz, la colza y el algodón.

Tabla 5.1 Siembras comerciales con cultivostransgénicos en 1997. Fuente: James ,1997.

Cultivo % Caracteres % Países %

Soya 40 Resist. herbicidas 55 EE.UU 65

Maíz 25 Resist. Insectos 30 China 14

Tabaco 13 Resist. Virus 15 Argentina 11

Algodón 11 Otras ≈ 1 Canadá 10

Canola 10 Australia <1

Tomate 1 México <1

Papa 1



Figura 5.9 Diseño del equipo utilizado para la transformación genética de plantas mediante el bombardeo de partículaso biolísticas. Fuente: Calderón, A. 1990.

Aunque la transferencia de características genéticasque dependen de muchos genes (poligénicas), estátodavía a nivel de investigación, la transferencia decaracterísticas monogénicas ya son procesos de ruti-na para muchos cultivos. La rapidez con que se ob-tienen plantas transformadas con característicasdeseables es bastante sorprendente, por ejemplo:tres meses en arroz, cuatro meses en soya, etc.

La meta es utilizar esta tecnología para el mejora-miento de características que no podrían ser mani-puladas por los métodos tradicionales (Tabla 5.2).Hay que reconocer que la transformación de plantasha sido uno de los mayores logros de la biotecnolo-gía y las aplicaciones futuras parecen estar limita-das sólo a nuestra imaginación.

Tabla 5.2 Algunas metas de la ingeniería genética deplantas. Fuente: Chrispeels y Sadava (1994)

1. Mejoramiento para el control de plagas y malezas

• Tolerancia a Herbicidas

• Resistencia a virus

• Resistencia a bacterias

• Resistencia a hongos

2. Mejoramiento de propiedades agronómicas

• Tolerancia a heladas

• Tolerancia al estrés hídrico

• Tolerancia a la salinidad

• Tolerancia a toxicidad por aluminio

3. Mejoramiento de la calidad postcosecha

• Retardar la maduración del fruto

• Retardar la senescencia floral

• Tomates con alto contenido de sólidos solubles

• Papas con alto contenido de almidón

• Hortalizas más dulces

4. Contribuyendo al mejoramiento vegetal

• Esterilidad masculina para la producción de semilla híbrida

5. Mejoramiento de la calidad nutricional

• Semillas con alto contenido de metionina y lisina

• Forrajes ricos en animoácidos sulfurados

6. Mejoramiento de Compuestos de Uso Industrial

• Aceites

• Almidón

• Plástico

• Enzimas

• Fármacos

7. Detoxificación de suelos contaminados

Los cultivos transgénicos de primera generación(resistencia a herbicidas, a insectos y a virus) es-tán impactando la agricultura, principalmente enpaíses desarrollados. El crecimiento del área cul-tivada a nivel comercial, con cultivos transgéni-cos ha sido espectacular en los últimos años: detres millones de hectáreas en 1990, pasó a 12 mi-llones en 1997 y a 30 millones de hectáreas en1998. De éstas, cinco millones se cultivaran enAmérica Latina: cuatro en Argentina y una enMéxico. Los cultivos más impactados han sido lasoya, el maíz, el algodón, la colza y la papa. Ade-más de la ganancia económica para los agriculto-res por el aumento en las cosechas y el menor usode pesticidas, un beneficio importante del uso decultivos transgénicos ha sido en la protección am-biental : En 1997, en México y Argentina, el usode insumos químicos se redujo entre el 50 al 90%,debido al cultivo comercial de transgénicos conBt resistentes a insectos.

A continuación se presentan algunos de los logrosde la ingeniería genética de plantas en la soluciónde algunos problemas que afectan los cultivosmodernos como es el ataque de enfermedades yplagas, el control de malezas, el manejo de post-cosecha, etc.

5.5.1 Resistencia a herbicidas

Los herbicidas son ampliamente utilizados en laagricultura para minimizar las pérdidas en los cul-tivos debido a la presencia de malezas.

Algunos de estos herbicidas actúan inhibiendociertos procesos como la fotosíntesis, otros inhi-ben vías biosintéticas por ejemplo de aminoáci-dos esenciales. Mediante la transgénesis, semodifica el genoma de la planta para que produz-ca una acción metabólica que lo proteja de un de-terminado herbicida.



Un herbicida bien conocido es el glifosato (N-fos-fonometil-glicina). Este herbicida inhibe la enzima5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato (EPSP) sinta-sa, bloqueando la vía biosintética de aminoácidosaromáticos. La producción de plantas transgénicasresistentes a este herbicida se puede conseguir através de dos vías:

a .Por la introducción al genoma de un gen de origenbacteriano (Aerobacter aerogenes) que codifica parala enzima EPSP sintasa, que inhibe la acción delherbicida.

b .Por la introducción al genoma vegetal del gen EPSPsintasa de origen vegetal bajo el control del promo-tor CaMV35s. El resultado es el incremento de 40veces la actividad enzimática de la EPSP sintasa.

En ambos casos la tolerancia al herbicida fue debi-do a una sobreproducción de la enzima, por la ex-presión del transgen.

Se obtuvieron plantas transgénicas de tomate ypapa utilizando la primera estrategia y plantastransgénicas de petunia, soya, maíz y otras, utili-zando la segunda estrategia.

Otro herbicida muy conocido es el Basta (fosfino-tricina o PPT), el cual es un análogo del ácido glu-támico y actúa inhibiendo la enzima glutaminasintetasa encargada del metabolismo del amonioen la planta. El efecto del herbicida es inhibido porla enzima fosfinotricina acetiltransferasa, codifica-da por el gen "bar" cuyo origen es el hongo Strep-

tomyces hygroscopicus (Figura 5.10).

Una planta transgénica resistente a este herbicidase obtiene por la introducción al genoma vegetaldel gen "bar" bajo el control del promotorCaMV35s, u otros promotores. Se produce altosniveles de la enzima fosfinotricina acetiltransfera-sa la cual inhibirá el efecto del herbicida.

Con este sistema se obtuvo plantas transgénicas re-sistentes al herbicida Basta en arroz y otros culti-vos.

5.5.2 Resistencia a insectos

Las pérdidas en la producción agrícola debido aenfermedades y plagas es bastante considerable.De los insectos plagas en la agricultura los más im-portantes son los Lepidopteros, siendo el costo porsu control, sólo los Estados Unidos de 400 millo-nes de dólares para el año de 1995. El alto costodel control químico de los insectos plagas, justificael desarrollo de plantas transgénicas resistentes, nosólo para reducir los costos de producción, sinotambién el deterioro del medio ambiente.

Una estrategia clásica para el control de insectosLepidopteros ha consistido en el uso de bioinsecti-cidas basados en cepas de Bacilus thuringiensis(Bt). El Bt produce una toxina que se liga a recep-tores específicos de las células epiteliales del intes-



FOSFINOTRICINA

• Modo de acción:

GLUTAMATO

NH4 L– GLUTAMINAGlutamato sintasa (GS)

Inhibición

FOSFINOTRICINA (PPT)

• Producto del GEN BAR:

Fosfinotricina Acetil Transferasa (PAT)

Acetil– CoA

Fosfinotricina(Activa)

PAT

AcetilFosfinotricina

(inactiva)

Figura 5.10 Tolerancia a la fosfinotricina.

Fuente: Adaptado por Roca, W. (1997)

tino medio de la larva, desencadenando una seriede eventos que conducen a la muerte de la misma.

Para la producción de plantas transgénicas resis-tentes a Lepidopteros, se transfiere al genoma de laplanta genes que codifican para las endotoxinas deBt (genes cry). El uso del promotor CaMV35s lo-gra una alta expresión del gen. Las plantas trans-génicas expresan constitutivamente la toxina, queal ser ingerida por las larvas producirá su muerte.

Otros genes usados para la producción de plantastransgénicas resistentes a Lepidopteros son losinhibidores de proteinasas (Inhibidores de Tripsinay de Quimiotripsina). Estos inhibidores bloqueanla actividad proteolítica de las enzimas digestivasde los insectos. Estos genes han sido aislados ytransferidos a tabaco reduciendo significativamen-te el desarrollo de larvas como Manduca sexta.

Otros genes como las proteínas insecticidas vege-tativas (ViPs), la colesterol oxidasa, las quitinasas,las peroxidasas, pueden ser utilizados para la ob-tención de resistencia contra los insectos plagas dela agricultura.

5.5.3 Resistencia a virus

Las enfermedades virales de las plantas constitu-yen un serio problema para la agricultura, ya queestos patógenos disminuyen significativamente elrendimiento de los cultivos.

Una de las estrategias utilizadas para la protecciónde las plantas contra el ataque de virus es la deno-minada protección cruzada. Al infectar una plan-ta con una cepa atenuada del virus, la plantaadquiere resistencia al ataque de la cepa virulentadel mismo virus. Aunque el mecanismo de la pro-tección no es muy claro, se cree que se debe a lasobreproducción de proteína de la cubierta del vi-rus causada por la infección con la cepa atenuada.

Esto impide la liberación del DNA de la partículaviral de la cepa virulenta.

Utilizando esta estrategia se han obtenido plantastransgénicas resistentes a ciertas cepas de virus,mediante la introducción al genoma de la plantadel gen que codifica para la proteína de la cubiertadel virus. Un ejemplo de esta estrategia son lasplantas transgénicas de tabaco con resistencia alvirus del mosaico del tabaco (TMV), plantastransgénicas de tomate y papa resistentes a un am-plio espectro de virus, incluyendo el virus del mo-saico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino ylos virus X y Y de la papa.

Otra estrategia para inhibir la infección de algunosvirus RNA en las plantas es a través de RNAs saté-

lites los cuales atenúan los síntomas de la enfer-medad en las plantas infectadas. Los RNAssatélites, son secuencias cortas de RNA no necesa-rias para la propagación de los virus con que estánasociados, pero son replicadas y encapsidadas con-juntamente con las partículas virales. Utilizandoesta estrategia se obtuvo plantas transgénicas de ta-baco resistentes al virus del mosaico del pepino(CMV).

Una tercera estrategia para reducir la infección vi-ral en plantas infectadas es mediante la técnica delRNA antisentido. Esta técnica se basa en la pro-ducción de un mRNAss (sin sentido) que es com-plementario al mRNAcs (con sentido) formandoun híbrido de doble cadena que impide la traduc-ción del mRNAcs (figura 5.11).

Plantas transgénicas que produzcan mRNAs sinsentido de alguna secuencia clave para la propaga-ción del virus, inhibirá su síntesis y por consi-guiente no se podrá formar la partícula viral.



5.5.4 Resistencia a hongos

Las pérdidas económicas de los cultivos debido alataque de hongos patógenos es alta y la aplicaciónquímica es la vía clásica usada para el control deestos patógenos.

Una estrategia transgénica empleada para produ-cir plantas resistentes al ataque de hongos patóge-nos es la introducción al genoma de la planta genesque codifiquen para enzimas que degraden la paredcelular del hongo. La pared celular del hongo con-siste de dos polímeros: el glucan y la quitina que

pueden ser hidrolizados por las enzimas glucana-sas y quitinasas, respectivamente. Sin embargo, laquitina de algunas especies de hongos puede seralgo diferente a la de otras especies, por lo que unaquitinasa en particular puede ser efectiva contrauna especie de hongo pero no necesariamente con-tra otra especie.

Por esta razón las plantas transgénicas con genesde quitinasa serán resistentes sólo a aquellas espe-cies de hongos cuya pared celular sea degradadacon la quitinasa específica.



AUGAUC (A) -3N

+

3 -(A) UACUAG1

N

Formación del RNA dedoble cadena queinhibe la expresióngenética a nivel de latraducción del mensajegenético

ATGATC

TACTAG

GATCAT

CTAGTA

mRNA Traducción

Producto Proteico

Transcripción

Gen que serácontrolado

Gen que codificapara el micRNA

Transcripción

RNA de antisentido(micRNA)

VIA

NO

RM

AL

VIA

CO

NT

RO

LA

DA

Transcripción

m RNA

Figura 5.11 Mecanismo de la inhibición de la expresión genética mediante la técnica del RNA antisentido. Fuente:Calderón y colaboradores, 1991.

5.5.5 Regulación de la maduración de

frutos

La maduración de los frutos esta asociada concambios fisiológicos como el ablandamiento, laconversión de almidón en azúcar, la pérdida de clo-rofila, la síntesis de pigmentos rojos y la síntesis decompuestos aromáticos. Todos estos procesos es-tán regulados por la fitohormona etileno. En labiosíntesis del etileno (Figura 5.12) hay dos enzi-mas claves que al ser bloqueadas se producirá suinhibición. Estas son: la ACC sintasa que catali-za la formación del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxilico (ACC) a partir de S-adenosilmetionina

y la ACC oxidasa que cataliza la formación de eti-leno a partir de ACC.

La estrategia transgénica utilizada para retardar lamaduración del fruto es bloquear la actividad de laenzima ACC sintasa, utilizando la estrategia deRNA antisentido.

Las plantas transgénicas expresan una versión in-vertida del gen ACC sintasa, produciendo un RNAsin sentido que forma un híbrido con el mRNA consentido de la ACC sintasa, lo cual bloquea la tra-ducción (Figura 5.8). Esta técnica fue aplicadacon éxito en tomate donde se observó una gran re-ducción en la síntesis de etileno y como conse-cuencia un retardo en la maduración del fruto.



METIONINA

S – ADENOSILMETIONINA

ACC SINTASA

ÁCIDO 1 – AMINO – CICLOPROPANO – 1 CARBOXÍLICO

ACC OXIDASA

Señales

C2H4

Estimula la

síntesis de

etileno

Degradación de

la pared celular

Producción de

carotenoides

pigmentados

Producción de

sabores y aromas

volátiles

ACC Sintasa

Y ACC oxidasa

CelulasaPoligalacturonasa

pectinesterasa

Fitoenosintasa

Desaturasa etc.

Percepción por receptor de C2H4

Figura 5.12 Regulación genética de la maduración del fruto del tomate. Fuente: Hobson y Grierson, 1993

5.6 Ejercicio 5.1 Transformación

genét ica de plantas

Objetivos

• Desarrollar el concepto de transformación ge-nética de plantas.

• Identifiar métodos que permitan detectar la pre-sencia y la expresión de un transgen en un culti-vo transgénico.


El siguiente ejercicio busca que los participantesrealicen un análisis sobre posibles metodologíasque se pueden utilizar para diferenciar plantastransgénicas de plantas no transgénicas en materia-les de una misma especie.

Con este ejercicio se busca que los participantes fi-jen el concepto de transformación genética deplantas y sus aplicaciones.




• Colocar en cada mesa dos plantas de tomate ro-tuladas A y B respectivamente.

• Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubiquecada grupo en cada una de las mesas.

En cada grupo los participantes deben responderlas siguientes preguntas:

La planta A es transgénica, con un gen que le con-fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y laplanta B, es una planta no transgénica.

a. ¿Las plantas A y B son fenotípicamente diferentes?Explique.

b. ¿Las plantas A y B son genotípicamente diferentes?Explique.

c. Cómo podría diferenciar las plantas A y B utilizando:

Un bioensayo.

Un método inmunológico.

Un método molecular.

• Presentar por escrito sus respuestas.

• Motive una discusión con base en las respues-tas dadas.

• Proporcione información de retorno, suminis-trando a los participantes las respuestas de esteejercicio.

Recursos necesarios



• ocho plantas de tomate en materas o bolsas deplástico.

• Fotocopias con las instrucciones e informaciónde retorno para los participantes.

Tiempo estimado : 60 minutos.


Con la información suministrada en la sección 5 ya través de la identificación de métodos biológicos,inmunológicos y moleculares para evaluar la inte-gración y expresión de genes en materiales trans-génicos, los participantes deberán construir elconcepto de transformación genética de plantas.

• Conformen cuatro grupos de trabajo de acuer-do con las instrucciones dadas por el Instructor.

• Nombre un relator por grupo, el cual presentaráen plenaria las respuestas dadas por el grupo.

• Presentar por escrito las respuestas a las si-guientes preguntas:


a. ¿Las plantas A y B son fenotípicamente diferentes?Explique.

b. ¿Las plantas A y B son genotípicamente diferentes?Explique.



c. Cómo podría diferenciar las plantas A y B utilizan-do:

Un bioensayo.

Un método inmunológico.

Un método molecular.

• Al final el instructor les proporcionará la infor-mación de retorno de las respuestas a las pre-guntas planteadas en este ejercicio.


Respuestas a las preguntas realizadas en este

ejercicio.


Para la pregunta a

No son diferentes fenotípicamente. Lo único que tiene

diferente la planta A es el transgen que le confiere resis-

tencia al cogollero (Tuta absoluta). La diferencia es fi-

siológica no morfológica.

Para la pregunta b

Sí son genotípicamente diferentes. El genoma de la

planta A presenta un gen adicional, que es el transgen

que le confiere resistencia al cogollero, el cual no está

presente en el genoma de la planta B.

Para la pregunta c

Un bioensayo

Infestando las plantas A y B con larvas del cogollero.

Las plantas sobrevivientes o menos afectadas serán

plantas A (transgénicas). Las plantas afectadas por el

cogollero serán plantas B.

Un método inmunológico

Si se tienen anticuerpos contra el producto génico (toxi-

na) marcados con el radioisótopo yodo 125, es posible

detectar in situ o a través de una electroforesis de pro-

teínas de un extracto crudo foliar de las plantas A y B.

Después de una autorradiografía se presentará una "se-

ñal" en el extracto crudo de proteínas de la planta A, in-

dicando la presencia del producto del transgen.

Un método molecular

Mediante extracciones de DNA genómico de las plan-

tas A y B. Se preparan filtros (Southernblots) con las

digestiones de estos DNAs con una enzima de restric-

ción. Los filtros son hibridizados con una "sonda"

construída con el transgen incorporado en la planta

transgénica. Después de una autorradiografía sólo en el

DNA de la planta A se presentará una "mancha" (ban-

da) indicacdo la presencia del transgen en la planta A.

Esta "señal" no se presentará en el DNA de la planta B.

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Perspectivas futuras de la

Biotecnología Vegetal



Sección 6

Sección 6 . Perspect ivas futuras de la Biotecnología Vegetal



Tabla de Contenido

Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.1 Relaciones institucionales y la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

6.2 Costo - beneficio de la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

6.3 Propiedad intelectual y comercialización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

6.4 Producción de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnología Vegetal . . . . . . . . . . . . . 125

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

Originales para trasparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127


Objetivos

• Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes.

• Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción de cultivostransgénicos al campo.

• Entender por que los cultivos transgénicos son seguros.

Preguntas orientadoras

1. ¿Sabían ustedes que en un futuro no muy lejano muchos de los productos como fármacos, vitaminas, vacunas

hormonas, etc., van a ser producidos en plantas las cuales serán utilizadas como bioreactores?

2. ¿Algunos de los participantes nos puede decir que es bioseguridad en biotecnología?

3. ¿Ustedes piensan que los cultivos transgénicos representan un riesgo para la salud humana, el medio ambiente

o la biodiversidad?



Bioseguridad

• Ensayos de Riesgo

Perspectivas Futuras de La Biotecnología Vegetal

Costo / Beneficio de la

BiotecnologíaPropiedad Intelectual

• Patentes

Introducción

No cabe duda de que estamos entrando al siglo dela biotecnología. El mapeo y secuenciación de ge-nomas está en rápida transición hacia la genómicafuncional. Esta se refiere al uso de la informaciónde la genómica estructural para identificar funcio-nes y secuencias que permitan descubrir y clonarfragmentos de DNA grandes en cromosomas arti-ficiales de bacterias (BAC). Por otro lado, cada vezes más factible las transformaciones oligogénicas,abriendo así paso a las modificaciones de caracte-res complejos (QTLs) de plantas. Debido al in-menso volumen de información y de datos que segeneran en los estudios genómicos, se han diseña-do sistemas electrónicos de manejo y comparaciónde datos para la masificasión de las operacionesgenómicas. Así, se produce una convergencia en-tre la biología y la computación, lo que se ha deno-minado "bioinformática". De igual manera, lafísica y la mecánica se han unido para dar paso aluso de la "robótica" en biotecnología.

Actualmente se han logrado avances con plantasmodelo. Una de estas plantas es la Arabidopsis,que es la planta floral con genoma más pequeño.La secuenciación del genoma de Arabidopsisavanza a una tasa de 200 genes por mes. Una vez setenga descifrado todo el genoma de Arabidopsis

(año 2001), se tendrá un catálogo completo de to-dos los genes que participan en todo el ciclo devida de una planta superior. La secuenciación delgenoma del arroz también avanza rápidamente.

En la actualidad se dispone de un buen número devectores para la transferencia de genes foráneos ala plantas. Los genes transferidos se integran al ge-noma de la planta donde se expresan y son hereda-dos de una generación a otra. Aunque en estemomento no es posible la transferencia de genes atodos los cultivos de importancia económica, mu-cha de la investigación está encaminada en encon-trar vectores apropiados para la transformacióngenética de dichos cultivos.

Existe una gran prioridad por la identificación degenes de importancia agronómica y/o económicapara ser introducidos a los cultivos que son la base

de nuestra alimentación y economía. También esimportante el estudio de la regulación de la expre-sión génica durante el desarrollo de la planta parasaber en que momento se pueden "activar" o "de-sactivar" genes, en el sitio apropiado de la planta yen el tiempo preciso. Con este conocimiento es po-sible modificar algunos procesos de desarrollo delas plantas tales como: floración, la formación desemilla, el tiempo de formación del fruto, etc.Además es posible manipular los procesos de for-mación gamética para la obtención de plantas an-droestériles cuando se desee, o alterar los factoresde la incompatibilidad para lograr la fertilizaciónentre especies no relacionadas.

Los efectos de genes indeseables podrán ser con-trolados mediante la técnica de RNA antisentidocomo en el caso del bloqueo de la biosíntesis deletileno para retardar la maduración de los frutos.

A mediano-largo plazo, la biotecnología ofrece he-rramientas para un mejor manejo de la agricultura,con el componente de sostenibilidad. Entre lasaplicaciones más notables se encuentran:

1. La reducción de insumos químicos, por medio de lageneración de biopesticidas, contribuyendo a estra-tegias de control biológico.

2. El mejoramiento de sistemas biológicos naturales,como la fijación biológica de nitrógeno, el aumentode la eficiencia del reciclaje de nutrientes en la ri-zosfera y el desarrollo de variedades tolerantes aproblemas de suelo como toxicidad por aluminio,deficiencia de fósforo y azufre, tolerancia a sequía ysalinidad.

3. Reforestación, mediante la multiplicación masiva deplantas para la siembra.

4. Recuperación de aguas y suelos contaminados, pormedio de la bioremediación (por microorganis-mos).

Considerando sólo a la bioingeniería estamos pa-sando por una rápida evolución de los productosgenerados, por ejemplo:

1. Entre 1995 - 2001 : Rasgos agronómicos como resis-tencias a insectos, virus y herbicidas.

2. 2002 - 2005 : Rasgos de calidad de alimentos: aceitesvegetales, carbohidratos (almidón, azúcares)



3. 2006 - 2010 : modificación de la arquitectura y pro-cesos fisiológicos de la planta (fotosíntesis).

4. 2011 - 2020: modificaciones para usar a plantascomo bioreactores para producir productos de altovalor agregado: fármacos, vitaminas, vacunas, etc.

La transformación genética de plantas ofrecen ungran potencial para la producción de productos deimportancia para la salud y la economía como:factores sanguíneos, hormonas de crecimiento,neuropeptidos, biopolímeros, etc. De igual mane-ra, muchos otros productos de la industria de ali-mentos y farmacéutica podrán ser obtenidos a másbajo costo.

Ahora que reconocemos que tales perspectivas sonposibles en un futuro muy cercano, es importanteconocer las implicaciones económicas, sociales ymedio ambientales de la biotecnología vegetal enlos países desarrollados y en los países en desarro-llo.

6.1 Relaciones inst i tucionales y la

Biotecnología

La biotecnología moderna ofrece gran potencialpara alterar, controlar y monitorear la genética delas plantas. Este poder tecnológico puede impactardirecta e indirectamente en la agricultura, el co-mercio, el medio ambiente y la biodiversidad.Como consecuencia se han generado preocupacio-nes biológicas y socioeconómicas en la sociedad,lo que se ha traducido en regulaciones de la investi-gación y desarrollo de la biotecnología.

6.1.1 Bioseguridad

Este término se refiere a las políticas y mecanis-mos que se establecen para prevenir posibles ries-gos de la tecnología del DNA recombinante y de latransformación genética de plantas en la salud, elmedio ambiente y la biodiversidad.

En 1975, apenas tres años después del descubri-miento de la tecnología del DNA recombinante,los científicos se autoimpusieron regulacionespara seguir prácticas seguras en la investigacióngenética molecular. Posteriormente las institucio-

nes oficiales de salud, alimentos, y ambientales, devarios países crearon regulaciones para evaluar po-sibles riesgos de plantas transgénicas, sobretodo alrealizar ensayos de campo.

6.1.2 Evaluación de riesgo

La evaluación de riesgo de las plantas transgénicasno se realiza porque éstas sean intrínsecamente pe-ligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente, o labiodiversidad. La razón fundamental para estaevaluación reside en la poca experiencia que tene-mos en el manejo de las plantas y alimentos trans-génicos. Por el contrario la ingeniería genética, encontraste al mejoramiento comercial, aumentagrandemente el factor precisión a lo referente a lacomposición genética que se usa en la transferen-cia a nivel de secuencias específicas del gen de in-terés, el promotor, las secuencias de iniciación yterminación de la lectura y los marcadores de se-lección. A mayor precisión, debemos esperar ma-yor predictibilidad del resultado de larecombinación genética mediante transformación,en contraste a la recombinación que se obtiene enel mejoramiento comercial.

Mientras que la evaluación de riesgo es un pasocientífico estratégico, el manejo del riesgo es insti-tucional y depende de cada país. La experienciaganada indica que la evaluación debe estar basadaen la naturaleza del organismo y el ambiente al quese introduce y el transgen en cuestión, y el grado defamiliaridad que se tiene para cada factor.

Entre los posibles factores a considerar en la eva-luación de riesgo de la introducción de cultivostransgénicos al campo, se encuentra:

a. Flujo de transgenes a parentales silvestres,

b. Toxicidad del transgen para humanos y mamíferos,

c. Adquisición de caracteres de maleza,

d. Efectos alergénicos de la planta / alimento transgé-nico,

e. Creación de nuevos patógenos por efecto del trans-gen (por ejemplo, virus),

f. Flujo del transgen a microorganismos del suelo, etc.



A continuación haremos una breve descripción delos posibles riesgos más importantes:

a. Flujo de transgenes a otros cultivos. Cultivos comoel maíz, trigo, fríjol, etc. han experimentado duranteel curso de su evolución, hibridizaciones con susparientes silvestres más cercanos. Dado que esoscultivos son altamente domesticados, es poco posi-ble que un solo trasngen, o unos pocos transgenes,sean capaces de convertirlos en malezas pernicio-sas. Se estima que el carácter maleza depende depor lo menos de la acción conjunta de 6 - 7 genes.En el caso de cultivos semidomesticados, el análisisdebería ser más cuidadoso.

b. Flujo de genes a plantas silvestres. Cuando los culti-vos transgénicos crecen muy próximos a parientessilvestres cercanos, es posible que ocurra la transfe-rencia del transgen por hibridización. En algunoscasos, el efecto podría ser un aumento de la agresi-vidad de la maleza, o la adquisición del razgo o ca-rácter, conferido por el transgen, por parte delsilvestre. La evaluación del riesgo debe incluir elanálisis caso por caso del flujo de genes y su posibleefecto o impacto en los silvestres y/ o malezas.

c. Plantas transgénicas conteniendo secuencias de vi-rus. Algunas de las preocupaciones expresadas in-cluyen:

• Las proteínas virales podrían desencadenarreacciones alérgicas si se encuentran en los ali-mentos. Dado que muchos alimentos se consu-men estando infectados por virus sin efectosdeletéreos en humanos, esta preocupación seestá descartando.

• Plantas resistentes a virus, pueden tener venta-ja competitiva en el campo, y ser fuente de ge-nes que se transfieren a malezas. Como sediscutió arriba, debe ser evaluado caso porcaso.

• Pueden crearse nuevos virus por recombina-ción entre el transgen y el virus que infectan si-multáneamente la planta. Se conoce quemuchas plantas son infectadas simultáneamen-te con virus múltiples. Sin embargo, en pocoscasos se ha confirmado la recombinación gené-tica entre virus diferentes. Pero no hay eviden-cia que la recombinación sea más frecuente en

plantas transgénicas que en situaciones típicasde infección viral.

• La proteína del virus producida por el cultivotransgénico podría combinarse con virus natu-rales y producir cepas más virulentas. Mientrasque esto puede ser teóricamente posible, el rie-go es demasiado bajo.

• Genes virales diferentes a los genes de la capaproteica. Los genes que codifican por RNAs yno proteínas pero que confieren resistencia,científicamente no presentan riesgo. Otros ge-nes virales que decrecen la infección de un vi-rus pero que aumenta la de otro, deberán sermutados para poder recibir aprobación.

d. Efecto de bioinsecticidas transgénicos en objetivosno intencionales. Las plantas transgénicas Bt sonlas más relevantes. Las proteínas Bt son altamenteespecíficas en su efecto tóxico, a nivel del grupo deinsectos, (por ejemplo: lepidopteros) y de su "blan-co", en el tracto digestivo de la larva. Algunas deesas proteínas han mostrado efecto negativo en losinsectos benéficos. Se ha demostrado también quelas proteínas Bt se digieren rápidamente en el tractohumano, por lo que no sería un riesgo para la saludhumana.

e. Adquisición de resistencia por el insecto plaga. Estaes una gran preocupación sobre todo referida al casode los genes Bt. Hay dos estrategias que se siguenpara minimizar esta posibilidad :

1. La siembra de cultivos transgénicos intercalados conno transgénicos en forma de mosaico, de tal maneraque ofrecen plantas "refugio" para los insectos sus-ceptibles y así bajar la presión.

2. Desarrollar construcciones genéticas conteniendodos o mas genes Bt con sitios de acción diferentes(receptores diferentes) en las membranas del intesti-no medio de las larvas del insecto. Estudios realiza-dos han mostrado que la resistencia adquirida por elinsecto en condiciones artificiales es recesiva, locual indica que se requerirá doble copia del alelo re-cesivo para ser efectiva. Las plantas refugio son unaestrategia para retardar la resistencia del insecto alas toxinas de Bt.

f. Flujo de transgenes a microorganismos. Muy pocose conoce sobre este tema, lo cual hace difícil laevaluación de este riesgo potencial. Se sabe que las



bacterias del suelo pueden obtener DNA de su am-biente y que el DNA puede permanecer adherido apartículas del suelo, pero esta posibilidad es pocoprobable. Cualquier riesgo potencial se elimina ha-ciendo construcciones que no pueden ser usadas porlas bacterias, por ejemplo, construcciones conte-niendo intrones. Es aún menos probable la transfe-rencia de DNA a hongos del suelo, dado que esmucho más difícil.

g. Efectos sobre la biodiversidad. Se refiere principal-mente a dos casos:

1. Flujo de transgenes de cultivos transgénicos a male-zas o silvestres emparentados. Como se discutióarriba, este posible riesgo debe ser evaluado casopor caso, dependiendo de la cercanía taxonómica,cercanía del cultivo a sitios de variabilidad nativa,grado de polinización cruzada, duración de vida delpolen después de la dehiscencia, sincronización dela floración, presencia de insectos u otro tipo de vec-tores, etc.

Es importante tomar en cuenta que este tema esmás relevante en los trópicos que en áreas tempe-radas. En el trópico, la biodiversidad es muchomayor y los cultivos son continuos, debido a queno se presentan las cuatro estaciones que ocurrenen las áreas temperadas.

2. Erosión genética. La preocupación va dirigida al he-cho de que las variedades transgénicas reemplaza-rían a las variedades utilizadas por el agricultor,disminuyendo de esta forma la biodiversidad. Aun-que esto es teóricamente posible, en la práctica seespera que las variedades transgénicas sean cultiva-das principalmente en áreas de agricultura comer-cial, donde tradicionalmente se cultivan lasvariedades mejoradas y material transgénico. Loimportante es incentivar a los agricultores para laconservación in situ de la biodiversidad.

6.2 Costo - beneficio de la

Biotecnología

Toda tecnología nueva debe ser evaluada en térmi-nos de sus beneficios y costos. Algunos de losproblemas que se presentaron hace 30 años con lallamada Revolución Verde, deberán ser enfrenta-dos una vez más en el caso de biotecnología agrí-

cola. Dos preguntas pueden hacerse en relación aeste tema:

1. El transgen incorporado cumplirá una función im-portante en el área geográfica escogida? Algunasevidencias demuestran que los genes utilizadospara el control de una plaga en un país temperado,no funciona en un país tropical. Por ejemplo, para ellogro de la resistencia al virus del anillado de la pa-paya vía transformación genética, las construccio-nes tuvieron que ser diseñadas con cepas locales delvirus. Un caso similar se presentó con el control delarvas de ciertos lepidopteros del algodón.

También se debe tener en cuenta el sistema agríco-la de la región. Por ejemplo, mientras que en cier-tos países temperados el agricultor adquiere lasemilla híbrida cada año, en algunos países tropi-cales sólo lo hacen cada tres años. Una resistenciatransgénica perderá su valor en un porcentaje con-siderable de la semilla híbrida después del segun-do y tercer año. Esto amerita una mayor inversiónde recursos para encontrar genes mas apropiados yun sistema más eficiente de distribución de la se-milla acorde con el lugar.

2. ¿Por cuánto tiempo el transgen continuará sirvien-do?. Este tema se refiere a la posibilidad de adapta-ción de insectos, patógenos, y malezas a lospesticidas y a las variedades que contienen el trans-gen. Este punto ya se discutió arriba en relación alcaso de genes Bt. Lo importante de las estrategiasactuales es lograr la disminución de los insectos re-sistentes mediante métodos y técnicas de manejo delcultivo y de la plaga. Es necesario recordar que lavariedad transgénica por si sola muchas veces no esla solución, sino que es un componente importantepara ser integrado en sistemas de manejo del cultivoy de la plaga.

La Tabla 6.1 muestra el aumento significativo deensayos de campo con plantas transgénica y el áreasembrada comercialmente con cultivos transgéni-cos tanto en países desarrollados como en desarro-llo. Se estima que para el año 2006, el 60% de losproductos derivados de soya y el 80% de los delmaíz tendrán su origen en cultivos transgénicos anivel global.



6.3 Propiedad intelectual y

comercial ización

Desde sus inicios en 1973 - 75 la biotecnología lla-mó la atención por su potencial de comercializa-ción. Lo interesante es que aún los experimentosmás básicos de laboratorio rápidamente encuen-tran un camino hacia la productividad y comercia-lización. Numerosas compañías de biotecnologíahan sido creadas, sobre todo en los países desarro-llados. La mayoría de estas compañías tenían ob-jetivos más tecnológicos que comerciales. Lasexitosas compañías pequeñas fueron rápidamenteadquiridas por multinacionales dedicadas a la co-mercialización de semillas y/o agroquímicos. Enotros casos, estas pequeñas compañías recibían ju-gosos contratos de las multinacionales para la ela-boración de productos o procesos específicos. Losúltimos años han sido testigos de asociaciones, ad-quisiciones, fusiones y compras de muchas de es-tas compañías biotecnológicas por parte demultinacionales de semillas, agroquímicos y fár-macos. La motivación más importante de estosprocesos ha sido la conquista y colonización delmercado mundial de los productos biotecnológi-cos, sobre todo el de semillas y fármacos. Para te-ner una idea de la importancia económica de laindustria biotecnológica, vale la pena mencionarque en 1998 el monto total de estas transaciones anivel global fue de 8 mil millones de dólares.

Una forma de asegurar el acceso a la tecnología y aproductos para su comercialización ha sido a tra-vés de arreglos de propiedad intelectual. A partedel clásico registro de variedades para asegurar elderecho de obtentor (UPOV), la biotecnología hagenerado una ola de patentamiento de genes, se-cuencias, mapas genómicos, sondas, tecnologías,y otros procesos. En países como EE.UU., sólohasta ahora fue posible el patentamiento de plantastransgénicas. Se estima que cada mes se registranentre 50 - 100 nuevas patentes en biotecnología anivel global.

6.3.1 Patentes

Entre 1992 - 96 , el 35% de todas las patentes ha-bían sido registradas en EE.UU., y un porcentajeigual en el Japón. Seguido se encuentran Europa(18%), Rusia (6%), y el resto del mundo (6%), conChina y Corea como las más importantes.

La carrera de patentamiento y otras formas de pro-tección de la propiedad intelectual ha traído consi-go cambios importantes en las estrategias deinvestigación, sobre todo en biotecnología: Porejemplo, antes de iniciar un trabajo de transforma-ción genética, es necesario determinar el númerode patentes y derechos distintos que existen en losdiferentes países al igual que de los procesos delplan de investigación. Es necesario llegar a arre-glos con los dueños de las patentes para obtener la



Tabla 6.1 Número de ensayos de campo con plantas transgénicas y áreas sembradas con cultivos transgénicoscomerciales. Fuente: James, C. (1998).

Número de ensayos de campo (evaluación de bioseguridad)

Periodo No. de países No. de cultivos No. de caracteres Total número de ensayos

1986 - 95 34 56 6 15,000

1996 - 97 45 60 10 10,000

Total 1986 - 1997 45 60 10 25,000

Area con cultivos comerciales transgénicos (millones de hectáreas)

1996 1997 1998

TOTAL 3 13 30 (*) (**)

* EE.UU. (70%), Canadá (15%), Otros (15%)** Países en Desarrollo: Argentina (4 millones hectáreas), México (1 millón hectáreas

libertad de operación necesaria. Otro aspecto es elque se refiere a las patentes que confieren derechosobre toda la estructura genética de la variedad,sobre todos los genes que se aíslen y aún aquellasque confieren derechos genéticos sobre una meto-dología y su aplicación. Sin embargo, ya existencasos de revisión por parte del poder judicial deaquellas patentes genéricas. El desafío que presen-ta el patentamiento en biotecnología es promoverla innovación a través de la incentivación del inno-vador y evitando monopolios, para facilitar inno-vaciones futuras. Para lograr este objetivo, elEstado debe cumplir un papel importante evitandola propiedad intelectual de procesos fundamenta-les, permitiendo solamente la propiedad intelec-tual de procesos y productos finales, con el fin deincentivar la innovación futura. El aumento sus-tancial de la inversión en fitomejoramiento y bio-tecnología depende mucho de las campañaspromocionales que motiven la cooperación entre elsector público y privado.

6.4 Producción de al imentos

La seguridad alimentaria depende del desarrollosocial, económico y tecnológico de un país o re-gión. Por lo tanto, el papel de la biotecnología, asícomo el de otras tecnologías de punta, debe ser vi-sualizado en el contexto de dicha realidad. Es ne-cesario tener en cuenta la posición del país en elcontexto de la economía regional y global, el desa-rrollo de su exportación/importación de productosagrícolas, la importancia de la pequeña, mediana ygrande agricultura en la economía del país, la capa-cidad de investigación y el potencial tecnológicode este, la existencia de instituciones y normas/re-gulaciones para estimular el desarrollo tecnológi-co. De esta forma, países con una tecnología fuertepueden utilizar la biotecnología para aumentar suagricultura hacia la diversificación de productos, sies un país buen agroexportador, o pueden aumen-tar su agricultura hacia la autosuficiencia, si se tra-ta de un país agro importador.

6.5 Ejercicio 6.1 Perspect ivas futuras

de la Biotecnología Vegetal

Objetivos

• Elaborar el concepto de bioseguridad.

• Identificar algunos factores que deben ser consi-derados en la evaluación de riesgo cuando loscultivos transgénicos son introducidos al campo.


Con este ejercicio se pretende que los participantesasimilen el concepto de bioseguridad a través de laidentificación de algunos factores que deben serconsiderados en la evaluación de riesgo debido a laintroducción de cultivos transgénicos al campo.


• Suministre información general sobre los objeti-vos del ejercicio.


• Colocar en cada mesa, una planta de tomate.

• Conforme cuatro grupos de trabajo y ubiquecada grupo en cada una de las mesas.

• En cada grupo de trabajo los participantes debenidentificar factores que ellos consideren debenser tenidos en cuenta en la evaluación de riesgocuando cultivos transgénicos de tomate son in-troducidos al campo.

• Elaborar una lista de los factores que fueron con-siderados para la evaluación de riesgo en culti-vos transgénicos de tomate.

• Motive una discusión con base a las respuestasdadas.

• Proporcionar la información de retorno, con lalista de algunos factores que deben ser conside-rados para la evaluación de riesgo para el cultivotransgénico de este ejercicio.

Recursos necesarios





• Cuatro plantas de tomate en materas o bolsas deplástico.

• Fotocopia de las instrucciones e información deretorno.



Los participantes tendrán la oportunidad de cons-truir el concepto de bioseguridad de acuerdo a la in-formación suministrada en la Sección 6 y mediantela identificación de algunos factores que deben serconsiderados para la evaluación de riesgo cuando seliberan al campo plantas transgénicas de tomate.

Instrucciones

• Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdoa las instrucciones dadas por el instructor.

• Nombren un relator por grupo, el cual presentaráen plenaria los resultados obtenidos por el gru-po.

• Realizar un listado de los factores que ustedespiensen deben ser considerados en la evaluaciónde riesgo cuando cultivos transgénicos de toma-te son introducidos al campo.

• Al final del ejercicio, el instructor le proporcio-nará la información de retorno.

Bibl iografía

James, C. 1998. Global Review of Commercial izedTransgenic Crops. 1998. ISAAA Briefs No 8. ISAAAIthaca, N.Y.

Persley, G. J . , Giddings, L. V. , and Juma, C. 1992.Biosafety: The Safe Applicat ion of Biotechnology inAgricul ture and the Environment . The WorldBank/Internat ional Service for Nat ional Agricul turalResearch (isnar) .

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Cultivo transgénico Factores de riesgo en la evaluación

Tomate 1 Flujo del transgen a parientes silvestres.

2 Toxicidad del transgen para la salud humana y animal.

3 Efectos alergénicos de la planta transgénica usada como alimento.

4 Flujo del transgen a microorganismos.

5 Flujo de polen (vectores), viabilidad del polen.

Originales para trasparencias





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Anexos



Anexos

Anexo 1. Evaluación final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno . . . . . . . . . . 138

Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana. . . . . . . . . . . . . . 146

Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

Anexo 1. Evaluación final de conocimientos

1. Defina en forma amplia el concepto de biotecnología.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

2. En el siguiente cuadro colocar las principales diferencias entre biotecnología de primera, segunda y tercera genera-

ción.

Biotecnología Características

De primera generación

De segunda generación

De tercera generación

3. ¿Qué eventos claves permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

4. La totipotencia es la capacidad que tienen las células somáticas vegetales de regenerar una planta completa cuando

son cultivadas en medios y condiciones adecuados. Explique como fue demostrado este fenómeno.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

5. En el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos vegetales generalmente se siguen cuatro pasos fundamentales. Expli-

que cuales son.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

6. La aplicación del cultivo de tejidos vegetales se da básicamente en tres áreas. Explique cuáles son.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________



7. ¿Qué es la ingeniaría genética?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

8. ¿Cuáles son las cuatro etapas básicas para la clonación de genes?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

9. Escriba el dogma central de la biología

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

10. Defina que es un gen.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

11. ¿Qué entiende usted por genoma?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

12. ¿Qué estrategias se utilizan para el estudio de la variabilidad genética de una especie?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

13. ¿Qué propiedades deben reunir un marcador molecular para que sea útil?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________



14. ¿Cuáles son los usos más importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético de plantas?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

15. ¿Qué es una planta transgénica?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

16. Si usted esta interesado en transformar tomate (especie dicotiledonea), ¿ que sistema de transformación eligiría? Ex-

plique.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

17. En la siguiente tabla presente tres ejemplos de cultivos transgénicos, indicando el tipo de gen introducido y la función

de este gen en el cultivo transgénico.

Cultivo transgénico Gen introducido Características del cultivo transgénico

1

2

3

18. ¿Qué es bioseguridad?

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________

19. Un tomate transgénico al cual se le ha introducido el gen Bt para conferirle resistencia a un insecto plaga, será noci-

vo para la salud humana? Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________



Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno

A continuación se presentan posibles respuesta a las preguntas formuladas en la evaluación final de cono-cimientos, estas pueden ser ampliadas por el instructor.

Respuestas

Para la pregunta 1

Biotecnología es la aplicación de los principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de mate-riales por medio de agentes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentesbiológicos se refieren principalmente a microorganismos, células de animales y plantas, enzimas y mate-rial genético aislado y clonado.

Para la pregunta 2

Biotecnología Características

De primera generación · Se basó en la fermentación como proceso básico para la producción debebidas, alimentos y combustibles.

· Practica esencialmente empírica y en pequeña escala.

·Había poco conocimiento científico y de ingeniería.

De segunda generación · Usa el conocimiento científico y de ingeniería.

· Procesos a escala industrial.

· Procesos basados en aplicación integrado de microbiología, bioquímica eingeniería química.

· Incluye: uso de fermentadores para la producción de fármacos, combustiblesy alimentos y procesamiento de desechos.

· También incluye: la técnica de inmovilización de enzimas y técnicas de cultivode tejidos vegetales y animales.

De tercera generación · También llamada: “Nueva biotecnología”.

· Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante.

· Se basa en la biología molecular.

· Dio origen a las empresas biotecnológicas que explotan la ingeniería genéticapara “cortar” y “confeccionar” genes que son colocados en microorganismospara que “fabriquen por encargo” productos químicos y farmacéuticos deinterés.

Para la pregunta 3

Los eventos claves que permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal fueron:

a. El desarrollo de cultivo in vitro.

b. El descubrimiento de DNA recombinante.

c. El desarrollo de los marcadores moleculares y el desarrollo de los sistemas de transformación genética deplantas.



Para la pregunta 4

La totipotencia de las células somáticas vegetales fue demostrada por Steward y colaboradores en 1958quienes describieron el desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticas del floema de laraíz de zanahoria.

Para la pregunta 5

Para cultivar in vitro células, tejidos y órganos vegetales se deben seguir los siguientes pasos:

a. Seleccionar y separar de la planta el explante que se desea cultivar.

b. Desinfectar el explante.

c. Sembrar el explante en un medio de cultivo apropiado.

d. Cultivar el explante en condiciones ambientales controladas.

Para la pregunta 6

La aplicación del cultivo de tejidos vegetales se da básicamente en tres áreas:

a. La micropropagación.

b. La contribución del cultivo in vitro en el mejoramiento vegetal.

c. La producción de metabolitos secundarios.

Para la pregunta 7

La ingeniería genética, es el térmico más utilizado para referirse al conjunto de técnicas involucradas en lamanipulación del material genético (DNA y RNA), y está basada en la tecnología del DNA recombinante.La tecnología del DNA recombinante básicamente consiste en aislar segmentos específicos de DNA (ge-nes) e introducirlos en vectores especiales (plásmidos) para formar moléculas de DNA recombinante.

Para la pregunta 8

Las cuatro etapas básicas para la clonación de genes son:

a. Generación de fragmentos de DNA.

b. Unión de los fragmentos a un vector molecular.

c. Introducción del vector a una célula hospedante, para la amplificación.

d. Selección de una secuencia específica.

Para la pregunta 9



DNA mRNA

Transcripción Traducción

PRO TEINA

TranscripciónReversa

Replicación

Para la pregunta 10

Un gen es un segmento de DNA que presenta una secuencia específica de pares de bases el cual contieneinformación para una característica genética del individuo.

Para la pregunta 11

Genoma es el contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por elcontenido genético nuclear y organelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el término genomacasi siempre se utiliza para referirse a la información genética presente sólo en el genoma nuclear.

Para la pregunta 12

La variabilidad genética de una especie puede ser detectada de diferentes maneras:

a. Usando marcadores morfológicos y marcadores bioquímicos (isoenzimas) que son productos de la expresión delos genes y

b. Usando marcadores moleculares, que permiten detectar diferencias entre individuos directamente a nivel de lassecuencias del DNA de su genoma.

Para la pregunta 13

Para que un marcador molecular sea útil debe reunir las siguientes propiedades:

a. Que sea altamente polimórfico, es decir, que permita diferenciar claramente, dos individuos.

b. Que sea codominante, para poder discriminar un individuo homocigoto de un heterocigoto.

c. Que esté distribuido a través del genoma.

d. Que no presente efecto pleiotrópico, es decir, que no afecte más de una característica.

e. Que sea de fácil y rápida ejecución.

f. Que tenga alta reproducibilidad.

Para la pregunta 14

Los usos más importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético de plantas son:

a. En la evaluación de germoplasma:

b. Caracterización y análisis de la variabilidad genética, identificación de acervos genéticos y de parentales para elmejoramiento genético.

c. En mapeo de genes cualitativos y cuantitativos (QTLs).

d. En estrategias de fitomejoramiento:

e. Selección asistida por marcadores moleculares, identificación y transferencia de QTLs de germoplasmasilvestre.

f. Mejoramiento asistido por marcadores moleculares.

g. Clonación de genes con base a mapas genéticos.

Para la pregunta 15

Una planta transgénica es una planta a la cual se le ha introducido un gen modificado (un gen quimérico),utilizando un método apropiado de transformación: mediante: ya sea , vía Agrobacterium tumefaciens o



mediante el bombardeo de partículas o biolística. El gen introducido es integrado en forma estable en elgenoma de la planta; es expresado y heredado de una generación a otra.

Para la pregunta 16

Las especies dicotiledóneas como tomate son susceptibles a varias cepas de Agrobacterium tumefaciens.Plásmidos Ti modificados de estas cepas pueden ser utilizados como vectores para transformar este culti-vo y en la práctica ésta es la vía elegida para transformar tomate.

Para la pregunta 17

Cultivo transgénico Gen introducido Características del cultivotransgénico

1 Soya EPSP Sintasa Resistencia al herbicidaglifosato

2 Tomate ACC Sintasa Antisentido Retarda la maduración delfruto

3 Tabaco Proteína de la cubierta ocápsula del virus TMV

Resistencia al virus delmosaico del tabaco (TMV)

Para la pregunta 18

Bioseguridad: Se refiere a las políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos dela tecnología del DNA recombinante y de la transformación genética de plantas en la salud, el medio am-biente y la biodiversidad. Las instituciones oficiales de salud, alimento y ambiental de varios países, hancreado regulaciones para evaluar posibles riesgos de las plantas transgénicas, sobre todo al realizar ensa-yos de campo.

Para la pregunta 19

Un tomate transgénico al que se le ha introducido el gen Bt de Bacillus thuringiensis expresa una delta-endotoxina que es altamente específica en su efecto tóxico sólo contra insectos lepidópteros. Se ha de-mostrado que estas toxinas no actúan en insectos benéficos y son digeridas en el tracto digestivo de los hu-manos, por lo que no representa ningún riesgo consumir tomate transgénico con Bt.



Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación

Apreciado participante:

Deseamos conocer sus opiniones sobre las actividades realizadas el día de hoy. No necesita firmar esteformulario; de la sinceridad en sus respuestas depende en gran parte el mejoramiento de esta actividad.

La evaluación incluye dos componentes:

a) La escala 0 a 3 sirve para que usted asigne un valor a cada uno de los aspectos que se evalúan:

0 = Malo, inadecuado

1 = Regular, deficiente

2 = Bueno, aceptable

3 = Muy bueno, altamente satisfactorio

b) Debajo de cada pregunta hay un espacio para comentarios de acuerdo con el puntaje asignado.Refiérase a los aspectos positivos y negativos y deje en blanco los aspectos que no aplican en el casode las actividades realizadas el día de hoy.

1.0 Evalúe el (los) objetivo (s) que se esperaba lograr el día de hoy.

1.1 ¿Correspondió o correspondieron a las necesidadesinstitucionales y personales y las expectativas que usted traía?

0 1 2 3

Comentarios:__________________________________________________________________________________

¿Cree que se logró o se lograron los objetivos propuestos? 0 1 2 3

Comentarios:__________________________________________________________________________________

2.0 Evalúel as estrategias metodológicas empleadas:2.1 Exposiciones de los instructores 0 1 2 3

2.2 Trabajos de grupo 0 1 2 3

2.3 Cantidad y calidad de los materiales entregados 0 1 2 3

2.4 Ejercicios realizados en el sitio del evento 0 1 2 3

2.5 Prácticas de campo 0 1 2 3

2.6 El tiempo dedicado a las diferentes actividades 0 1 2 3

Comentarios:__________________________________________________________________________________



3.0 Evalúe la coordinación de las actividades

3.1 Información preliminar recibida por los participantes 0 1 2 3

3.2 Cumplimiento del horario de esta actividad 0 1 2 3

3.3 Manera en que se dirigieron las actividades 0 1 2 3

3.4 Apoyo logístico disponible (espacios, equipos, etc.) 0 1 2 3

3.5 Alojamiento (en caso de que aplique) 0 1 2 3

3.6 Alimentación (en caso de que aplique) 0 1 2 3

Comentarios:__________________________________________________________________________________

4.0 Evalúe la aplicabilidad (utilidad) de lo aprendido en sutrabajo actual o futuro.

0 1 2 3

Comentarios:__________________________________________________________________________________

5.0 ¿Qué actividades realizará en el corto plazo en su institución para aplicar o transferir lo aprendidoen este día?

__________________________________________________________________________________

6.0 ¿Estaría interesado en que esta capacitación se llevara a cabo en su institución? ¿En qué forma?

__________________________________________________________________________________

¡Gracias por sus respuestas y comentarios!



Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor

Fecha:______________________________

Nombre del Instructor:_________________________________________________

Temas desarrollados:___________________________________________________

Instrucciones

Marque con una (X) el número que corresponda según lo que haya apreciado del instructor en eldesarrollo de los temas.

La escala evaluativa es la siguiente: 4= Muy bien 3= Bien 2= Regular 1= Mal

Exprese con sinceridad sus opiniones, no requiere firmar, los resultados serán utilizados para elmejoramiento en próximos eventos.

1.Organización y claridad del instructor

a. Presentó los objetivos de la actividad 4 3 2 1

b. Explicó la metodología a seguir 4 3 2 1

c. Tuvo claridad en las explicaciones 4 3 2 1

d. Presentó ayudas didácticas que permitieran la comprensión 4 3 2 1

e. Los contenidos facilitaron el aprendizaje 4 3 2 1

2. Dominio del tema

a. Mostró seguridad en su exposición 4 3 2 1

b. Respondió las preguntas a satisfacción 4 3 2 1

c. Relacionó la teoría con la práctica 4 3 2 1

d. Presentó ejemplos para ilustrar temas 4 3 2 1

3. Interacción del grupo

a.Inspiró confianza al grupo 4 3 2 1

b. Demostró interés en el aprendizaje de los alumnos 4 3 2 1

c. Formuló preguntas a los participantes 4 3 2 1

d. Escuchó con atención a los participantes 4 3 2 1

e. Proporcionó información de retorno 4 3 2 1

4. Dirección de las prácticas

a. Las prácticas estuvieron orientadas hacia los objetivos propuestos 4 3 2 1

b. Eligió los sitios adecuados para su realización 4 3 2 1

c. Evaluó la sesión práctica 4 3 2 1

d.Proporcionó información de retorno 4 3 2 1



Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación

La evaluación del material puede hacerse con la participación de:

• Expertos en el contenido (científicos, investigadores)

• Expertos en comunicación

• Técnicos, facilitadores de procesos, profesores, etc.

• Productores, agricultores, miembros de organizaciones comunitarias, etc.

• Para este efecto, los evaluadores pueden usar un formato como el siguiente:

Calidad del Contenido Si No

La información que se presenta es técnicamente válida en el contexto en que se utiliza

El contenido está dividido en segmentos que siguen un proceso claro y ordenado

El contenido se presenta objetivamente, es decir respetando principios y métodos válidos

El contenido es adecuado para el nivel de la audiencia (ver usuarios de la Guía)

El contenido está actualizado desde el punto de vista científico-técnico

Calidad de la Producción Si No

La calidad de la impresión es excelente

Las imágenes (dibujos, gráficas, cuadros) son claras

Las ilustraciones apoyan el mensaje escrito

Los iconos están bien seleccionados (de acuerdo con el significado del texto)

La distribución de la información (diagramación) en cada página es adecuada

Los dibujos y fotografías reflejan bien situaciones reales

Hay una buena correspondencia entre imágenes y textos

Calidad instruccional Si No

Los objetivos están claramente establecidos

El material favorece la participación de la audiencia en la capacitación

La relación objetivos-contenidos es excelente: el contenido refleja lo que se propone en losobjetivos

El material facilita los procesos de enseñanza y aprendizaje

Los ejercicios y prácticas son novedosos

Los ejercicios y prácticas ayudan en la comprensión de los temas.



Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana

Por: Bienvenido Cabral E., Ph.D.

Para: Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal (CEDAF)

Un análisis del programa agropecuario de la República Dominicana muestra que las oportunidades ofre-cidas por la Biotecnología Vegetal al país son obviamente prometedoras.

Según datos del Plan Nacional de Alimentación y Nutrición (PLANAN), publicado en Santo Domingo,D. N., por la Secretaría de Estado de Agricultura (SEA), en enero de 1998, la agropecuaria dominicana te-nía el potencial de proveer más de una tercera parte de divisas por concepto de exportación y bienes, y másdel 60% de los alimentos del consumo interno.

Los principales cultivos de exportación continúan siendo la caña de azúcar, el café, el cacao y el tabaco,los que ocupan más del 50% del volumen de las explotaciones; por otro lado, las pequeñas y medianas fin-cas proporcionan al país su seguridad alimentaria, siendo los principales cultivos café, cacao, arroz, taba-co, musáceas, habichuelas, así como también en algunas áreas de hortalizas, papas, raíces.

Los problemas fitosanitarios afectan considerablemente la producción de los cultivos en la RepúblicaDominicana. El ataque de plagas, enfermedades fungosas, bacterianas y las causadas por virus, reducensustancialmente la producción siendo esto un peligro para la seguridad alimentaria de los dominicanos.Además, hay que destacar que en la mayoría de los casos se emplean variedades tradicionales con muybajos niveles de productividad y resistencia a los factores antes mencionados. Tal es el caso de la Broca yla Roya en el café, las Sigatokas amarilla y negras en las musáceas, el ácaro y la Pyricularia en el arroz ylas virosis en los cultivos de tabaco, habichuelas y raíces comestibles Por otra parte, es oportuno recono-cer que la baja productividad de la agricultura dominicana está asociada en gran medida con problemasclimáticos y de suelos, siendo particularmente importantes las sequías, las cuales ocasionan daños consi-derables en los cultivos.

En la solución de estos problemas debe jugar un papel la política que se adopte de generación y transfe-rencia de tecnología, la cual debe considerar la reorganización del sistema de investigación, validación ytransferencia de tecnología, enfatizando la investigación en rubros que integran la canasta familiar en elmercado local, tales como plátano, arroz, habichuela y otros cultivos competitivos en el mercado interna-cional.

El rol y el aporte de la Biotecnología Vegetal al desarrollo de este proceso son prioritarios, sobre todo enlos actuales tiempos cuando se demanda una mayor productividad y competitividad de la agricultura do-minicana, ante los procesos de apertura y las nuevas reglas del mercado internacional.

Dado que en el mejoramiento genético convencional los ciclos de cultivo son amplios y se requieren degrandes extensiones de terreno para su evaluación, es necesario incorporar técnicas como las de cultivo in



vitro e ingeniería genética, para reducir el tiempo y el espacio necesarios para la obtención de mejores va-riedades.

Como sabemos, la Biotecnología Vegetal ofrece la posibilidad de producir variedades más tolerantes acondiciones desfavorables que teóricamente permitirían ampliar la superficie cultivable, elevar los rendi-mientos y disminuir las pérdidas producidas por enfermedades, plagas y estrés. Sin embargo, de la teoríaa la práctica existe un camino muy largo y con muchos obstáculos. El desarrollo de la Biotecnología Ve-getal en la República Dominicana requiere de un mayor apoyo que permita incrementar la infraestructuramaterial y humana; y disponer de financiamiento seguro y adecuado.

En términos generales, podemos considerar que el país tiene en la actualidad un potencial para desarrollary explotar la Biotecnología Vegetal. En el país existen cinco laboratorios que trabajan con técnicas debiotecnológicas. En la mayoría de éstos sus actividades se restringen al cultivo de tejidos con énfasis en lamicropropagación vegetativa comercial y, prácticamente, no se han dado los pasos para aprovechar otrasaplicaciones y técnicas para al mejoramiento genético vegetal. Tampoco se han explorado a profundidadotras oportunidades como son la producción de metabolitos secundarios muy demandados por la industriafarmacéutica y la perfumería, entre otros.

Por otro lado, ninguno de los laboratorios existentes cuentan con la infraestructura y equipos necesariospara la implementación de la tecnología del DNA recombinante, las técnicas de los marcadores molecula-res y la transformación genética de plantas.

Sin embargo hay que reconocer que en el área de cultivo de tejidos ya contamos con algunos avances. Enel Laboratorio Nacional de Biotecnología Vegetal de la SEA, se han desarrollado técnicas avanzadas dereproducción mediante el sistema de vitro, que han contribuido a la producción de plantas de mayor sani-dad y a disminuir los costos en la producción.

Este laboratorio aporta al país cerca de algunos 600,000 plantas/año, principalmente de plátanos y papas,que son cultivos en los cuales se concentra la demanda de los productores. Las necesidades de materialde siembra para estos cultivos no son abastecidas, ya que ésta se sitúa por los dos millones de plantas poraño. Otras especies multiplicadas son: yuca, ñame, piña, algunos vegetales y café. El laboratorio desarro-lla varios trabajos de interés como son los de multiplicación de variedades de café tolerantes a Roya, nue-vas variedades de ajo adaptadas a zonas bajas, rescate de germoplasma de piña, producción de materialde propagación de fresas, entre otros. En el cultivo de café se ensayan técnicas de embriogénesis somáti-ca, lo que representa una gran perspectiva.

El país dispone de uno de los laboratorios de Biotecnología Vegetal más grandes del área del Caribe (Luo-ma Vitrolab), el cual, según el nivel de demanda, ha logrado producir cerca de 5 millones de plántulas demusáceas por año.

En este laboratorio privado se han aplicado las técnicas de cultivos de tejidos para la multiplicación de ungran número de cultivos alimenticios así como especies forestales, frutales y ornamentales y, más aún,han logrado realizar la regeneración de las plantas no sólo mediante el cultivo de meristemos, sino tam-



bién vía organogénesis y embriogénesis somática. Además, han practicado el cultivo de sus suspensionescelulares.

Este laboratorio cuenta con un alto potencial investigativo y productivo, pero en la actualidad sólo se de-dica exclusivamente a la micropropagación clonal de plantas de especies ornamentales, como orquídeas,crisantemos, éster, gladiolos, anthurium, lilium, claveles, rosas y otros. Según sus directivos le resulta im-posible competir con los costos de producción del laboratorio estatal en la multiplicación de otros rubros.

Existe otro laboratorio privado en el país que se dedica exclusivamente a la producción en gran escala deorquídeas para la exportación. Los que pertenecen al Instituto Superior de Agricultura (ISA) y a la Uni-versidad Autónoma de Santo Domingo (UASD) realizan tareas de micropropagación de plantas en menorescala y no son empleados a plenitud en las funciones de investigación y enseñanza como es de esperar.Esto quizá ocurre porque todavía en el país no existe ningún pregrado o postgrado en el área de agrobio-tecnología. Tan solo ahora una universidad del país, el Instituto Superior de Agricultura (ISA), ha tomadola iniciativa de incluir en el pensum de las carreras de Ingeniería Agronómica e Ingeniería en Manejo deRecursos Naturales la asignatura biotecnología vegetal. Por otra parte, el Comité Interinstitucional delPrograma de Postgrados Tecnológicos de las Américas, en coordinación con el INDOTEC y el CEDAF,ha discutido la posibilidad de un proyecto de postgrado en biotecnología. Uno de los problemas que en-frentará este proyecto podría ser el de la insuficiencia de recursos humanos locales en esta área. En la ac-tualidad existen en el país solamente tres especialistas en Biotecnología Vegetal que poseen gradocientífico de Ph.D., dos con el grado de M.Sc. y un número muy reducido de técnicos con cursos realiza-dos en esta área.

No obstante esto último, debemos insistir que las investigaciones en esta importante área científico-técni-ca sólo se manifestarán cuando tengan la prioridad y el apoyo de los sectores vinculados a la administra-ción del desarrollo agropecuario nacional, tanto privado como estatal; de lo contrario, el potencial de labiotecnología vegetal permanecerá latente en la República Dominicana.



Anexo 7. Glosario

Ácido nucleico:

Polímero de nucleotidos (ver DNA y RNA).

Aminoácido

Unidades estructurales que forman las proteínas. Se encuentran unidos en una secuencia ordenada, lo quedetermina la estructura primaria, secundaria, y terciaria de la proteína.

Anteras

Parte masculina de una flor, en la cual se produce el polen. Porción del estambre que contiene el polen or-dinariamente bilocular.

Antibiótico

Sustancia producido por un organismo viviente que es tóxica para otros organismos.

Anticodón

Triplete de nucleótidos en la molécula del RNA de transferencia (tRNA) que es complementario con elcodón en el RNA mensajero. (mRNA), durante la síntesis de proteínas.

Autorradiografía

Técnica que permite la detección de moléculas marcadas radioactivamente, al superponer la muestra conuna película fotográfica.

Bacterias

Grupo de microorganismos unicelulares procariontes, es decir, sin membrana nuclear ni organelos defini-dos.

Bacteriófago

También llamado fago. Son virus que infectan células bacterianas provocando normalmente su lisis y ob-teniéndose una nueva progenie de virus. Algunos, como el fago lambda son muy utilizados en experimen-tos de DNA recombinante.

Base nitrogenada

Molécula orgánica de naturaleza purínica o pirimidínica que forma parte de los ácidos nucleicos. Princi-palmente son cinco: adenina, guanina, timina, citosina y uracilo. Esta última se encuentra sólo en el RNA.

Beta-Galactosidasa

Enzima que cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa.



Biotecnología

Conjunto de procesos industriales y de tecnologías, que implican el uso de sistemas biológicos. Algunosde estos procesos utilizan microorganismos manipulados genéticamente (ingeniería genética).

Callo

Conjunto de células vegetales provenientes de una sola célula vegetal inicial.

Cápside

Cubierta proteica externa de un virus. Posee una estructura altamente regular, que encierra el ácido nu-cleico del virus.

Célula

Unidad fundamental de la vida; el organismo más pequeño capaz de reproducción independiente.

Clon

En general, grupo de organismos genéticamente idénticos debido a que han sido producidos por algúntipo de reproducción asexual. Población de células que desciende de una sola célula madre.

Clonaje

Originalmente se refería al proceso por el cual se obtiene un grupo de células idénticas de una sola célula(clón). El término se ha extendido al proceso de obtener muchas copias de un gen a partir de una sola co-pia.

Cloroplasto

Organelo presente en las células vegetales, donde se produce la fotosíntesis.

Código genético

Relación entre la secuencia de nucleótidos en el DNA o el RNA y la secuencia de aminoácidos de una pro-teína. Cada triplete o conjunto de tres nucleótidos en el ácido nucleico determina un aminoácido específi-co. Por tanto, según la composición y frecuencia de nucleótidos, se obtendrán diferentes composiciones yfrecuencias de aminoácidos, es decir, diferentes proteínas.

Codón

Secuencia de tres nucleótidos en el mRNA, que codifica un aminoácido o la terminación de una cadenapolipeptídica.

Colonia

Grupo de células contiguas, normalmente derivadas de una misma célula original, que crecen en una su-perficie sólida.



Crecimiento

Incremento en la masa (peso seco y/o tamaño) de un organismo que acompaña los procesos de desarrollo,diferenciación y morfogénesis. El crecimiento usualmente involucra división y expansión celular.

Cromosoma

Estructura compuesta por ácidos nucleicos, en la que se encuentran los genes dispuestos en orden lineal.Su número es variable según la especie de que se trate, pero siempre es constante en una especie dada.

Cultivo celular

Crecimiento in vitro de células aisladas de organismos pluricélulares, animales o vegetales.

Cultivo en suspensión

Cultivo de células, tejidos u órganos sumergidos en un medio nutritivo líquido que requiere agitación.

Delección

Pérdida de un segmento de DNA. Puede variar desde solamente un nucleótido hasta un conjunto de ge-nes.

DNA (ácido desoxirribonucleico)

Es la forma molecular en la que se guarda y transmite la información biológica hereditaria.

Desoxirribonucleótido

Se obtiene al unirse un grupo fosfato a la pentosa de un desoxirribunucleósido.

Diferenciación

Fase de crecimiento durante la cual las células no especializadas se especializan en funciones particulares(por ejemplo, el meristemo).

Dogma central

La relación entre DNA, RNA y proteína. El DNA sirve como molde tanto para su autorreplicación comopara la síntesis del RNA. El RNA, a su vez es el molde de la síntesis de proteína.

Endonucleasa

Enzima que produce cortes internos en el DNA.

Enzima

Proteína funcional que cataliza una reacción química específica, pero sin intervenir en ella. Es un catali-zador biológico. Es específico, es decir, es un catalizador solo de una reacción o de un tipo de reacciones.



Enzimas de restricción

Son endonucleasas capaces de reconocer y cortar móleculas de DNA de doble cadena en sitios específicosy que intervienen en el sistema de restricción-modificación del DNA de algunas bacterias.

Embriogénesis

Capacidad de las plantas con flores para producir embriones. No se reduce el desarrollo del huevo fertili-zado, sino que también puede ser inducido en cultivo de tejidos vegetales. (Embriogénesis somática).

Escherichia coli

Bacteria del intestino humano. Durante muchos años fue el único hospedero utilizado en los experimen-tos de ingeniería genética.

Exón

Secuencia de bases del DNA eucarióptico que se transcribe a mRNA y que codifica una proteína.

Expresión genética

Síntesis de proteína a partir de un gen determinado (gen expresado), mediante transcripción y traducción.

Extremos cohesivos

Cortes "escalanados" en el DNA de doble cadena, dando lugar a terminales de cadena sencilla comple-mentarios entre sí. Permiten la circularización de la molécula de DNA de doble cadena.

Fenotipo

Conjunto de características visibles de un organismo como consecuencia de la interacción del genotipo ydel medio ambiente.

Fermentación

Proceso de transformación, mediante enzimas o microorganismos. Se utiliza a escala industrial para laobtención de productos como alcoholes, ácidos orgánicos, etc.

Gen 1.

Unidad básica de la herencia. 2. Secuencia de DNA que codifica una proteína específica.

Genoma

Conjunto cromosómico básico de un organismo. La suma total de sus genes.

Genotipo

Dotación genética de un organismo.



Haploide

Designa a cualquier núcleo célula u organismo que posee un juego simple de cromosomas impares. Nú-mero n o número reducido de cromosomas típico de la mayoría de los gametofitos.

Heterocigoto

Designa a un núcleo, célula u organismo diploide que contiene dos alelos diferentes por cada gen.

Híbrido

Producto de dos padres genéticamente diferentes. Primera generación de la descendencia de una cruza en-tre dos individuos que difieren en uno o más genes. Progenie de una cruza entre especies del mismo géne-ro o de géneros distintos.

In vitro

Designa a los procesos biológicos o a las investigaciones que se realizan fuera de los organismos vivos,tradicionalmente en tubos de ensayo.

Información genética

La información contenida en la secuencia de nucleótidos del DNA o RNA.


Tecnología usada a nivel de laboratorio para alterar el aparato heriditario de una célula viva, de forma quepueda producir más o diferentes productos o desarrollar funciones diferentes. Estas células, manipuladasgenéticamente, pueden utilizarse en la producción industrial.

Inserción

Mutación producida al intercalar una o varias bases nitrogenadas en la secuencia de una cadena de DNA.

Intrón

Secuencia de bases presentes en el DNA que aunque se transcribe no aparece en el mRNA final.

Nucleótido

Unidad fundamental de los ácidos nucleicos. Consta de una de las bases nitrogenadas unida a un grupopentosa-fosfato.

mRNA (RNA mensajero)

RNA formado a partir del DNA y que sirve como molde para la síntesis de proteínas.

Marcador genético

Mutación genética con un efecto observable sobre el organismo, lo que permite localizar su posición den-tro del cromosoma y seguir su transmisión.



Mapa genético

Colocación ordenada de los genes en un cromosoma, según se deduce de los experimentos de recombina-ción genética.

Medio nutritivo

Medio de cultivo empleado para iniciar, desarrollar o enraizar diferentes inóculos; está formulado conmacro y micronutrientes azúcar y reguladores de crecimiento.

Meristemo apical

Meristemo que se encuentra en el ápice de un brote o raíz.

Mutación

Cambio en la cantidad o estructura del DNA en los cromosomas, pudiendo ser génica o cromosómica.Una mutación génica consiste en el cambio de un gen de una forma alélica a otra; los cambios cromosómi-cos consisten en duplicaciones, inversiones, intercambios, etc.

Organogénesis

Formación de órganos (la caulogénesis es la iniciación de brotes y la rizogénesis es la iniciación de raí-ces).

Plásmido

Material heridatario extracromosómico. Es una molécula de DNA circular con replicación independiente.Gracias a su pequeño tamaño y simplicidad se usan frecuentemente en experimentos con DNA recombi-nante, sectores de DNA extraños y como vectores para la inserción de estos DNAs extraños en otros orga-nismos.

Polinucleótido

Secuencia lineal de nucleótidos.

Promotor

Región del DNA a la que se une la enzima RNA polimerasa para iniciar la transcripción.

Primordio

Grupo de células destinado a transformarse en una estructura particular, como lo es el primordio foliar,que va a dar origen a las hojas.

Proliferación

Crecimiento por multiplicación rápida de nuevas células.

Proteína

Polímero lineal de aminoácidos. Las proteínas son el producto de la expresión genética.



rRNA (RNA ribosómico)

RNA componente de los ribozomas. Distinto del mRNA y tRNA. Su función es la de mantener la uniónentre el mRNA y el tRNA durante la síntesis de proteínas.

Recombinación

Proceso de intercambio de material genético.

Recombinante

Célula o clón de células resultante de una recombinación.

Replicación del DNA

Mecanismo por el cual se producen copias exactas de un DNA que se toma como molde. Este mecanismoimplica la separación de las dos cadenas de DNA y la construcción a partir de cada una de ellas, de unanueva cadena complementaria, mediante el apareamiento de bases.

RNA (ácido ribonucleíco)

Polímero de ribonucleótidos. En sus tres formas de mRNA, tRNA y rRNA, transforma el mensaje conte-nido en el DNA en una secuencia de aminoácidos, es decir, en proteínas.

Subcultivo

Transferencia del inóculo a medio fresco.

tRNA (RNA de transferencia)

RNA capaz de combinarse con un aminoácido específico. Cada especie de tRNA tiene un triplete de nu-cleótidos (anticodón) que interacciona con un triplete complementario (codón) en el mRNA.

Totipotencialidad

Es el fenómeno por el cual las células somáticas provenientes de diferentes partes de la planta, dadas lascondiciones apropiadas, pueden desarrollarse en una planta completa.

Traducción

Síntesis de una proteína, cuya secuencia de aminoácidos esta especificada por los tripletes de nucleótidosdel mRNA.

Transcripción

Síntesis del RNA a partir de un DNA molde, basándose en la complementariedad de bases.

Transcriptasa inversa

Enzima capaz de catalizar la síntesis de DNA a partir de RNA. Sólo se ha encontrado en los retrovirus.



Transformación genética

Mecanismo por el que se introduce un fragmento de DNA en el interior de una célula. Gracias a este nue-vo fragmento la célula receptora puede adquirir nuevas funciones.

Vector genético

Vehículo para la transmisión de un fragmento de DNA de una célula a otra. En genética molecular, losvectores más utilizados son plásmidos y virus, que pueden llevar un DNA extraño a una célula receptora uhospedante.

Virus

Agente, de menor tamaño que una bacteria, que causa enfermedades infecciosas y que necesita una célulaintacta para su replicación. Contiene DNA o RNA como material hereditario, rodeado por una cubiertaproteica.

Yema (botón)

Pequeño abultamiento en el tallo de una planta; da origen a una rama, a una flor o a varias hojas.



biotecnologia

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