Prof. Criado-Marrero2 de abril de 2011

Cultivo de tejidosRegeneracin de plantas completasMicropropagacin # elevado de clonesObtencin de plantas libres de patgenosCalidad & rendimiento

Cultivo de tejidosMedios semi- slidos o lquidos

PasosExtraccin de un explante protoplastos , clulas,tejidos u rganos Cultivo aspticoMedio artificial Incubacin condiciones ambientales controladas

Induccin de callosIdeal: explantes jvenes

MicropropagacinBrotacin de meristemaspices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes

Obtencin de hbridos

Obtencin de plantas de semillas con embriones simplesPueden ser semillasEj. Yerba MateEj. Orquideas

Obtencin de plantas haploidesAnteras

MotivosMicroorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes Fallas en los procedimientos de cultivo en el laboratorio.

Requisitos previosConocer el material vegetalAdecuada preparacin de la plantaDesinfeccin superficial de los explantes

BACTERIASPseudomonas, Xanthomonas,Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, MycobacteriumHONGOSAspergillus, Penicilium,Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora

Combinacin sales orgnicas y compuestos inorgnicosComposicinFuente de carbonoSacarosaNutrientes mineralesNitrgeno (amonio y/o nitrato) y potasioSustancias vitamnicasTiaminaSustancias reguladoras del crecimientoAuxinas y citoxinasAgente gelificante (en medios semislidos)Agargel, Transfergel, Phytagel, agarosa y Gelrite

MS: Medio Murashige y Skoog

N6: Medio de Chu, Wang, sun, Yin

B5: Medio de Gamborg

Temperatura Constante 25-28 CCiclo de luz/oscuridad 16/8horas (por lmparas fluorescentes)pH 6Humedad atmosfricaDebe ser elevada (80- 90%)

Ms usados: Auxinas 2,4-D (cido 2,4-dichlorofenoxiactico) & AIA (cido Indolacetico)CitoquininasBA (Benziladenina) y ZEA (zeatina)

Agente absorbente de fenolesCarbn activado etileno

1. Laboratorio 2. invernadero 3. campo

Opcin ms econmicaEmpleo de la luz naturalDisminuyendo irradiancia (20-50%) por mallas de sombreado (saram)

Embriognesis somtica Obtiene una estructura similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametosOrganognesisObtiene tallos, races o flores

Prunus spCodiaeum variegatum

BROTES EMBRIONESAMBAS en MSCherry BlossomCrotn

BROTES,RAICES& FLORESCALLO : Abelia sp.BROTES HOJAS:Prunus persica LGerbera jamesoniiHOJAS: Abelia sp.RAIZ : Abelia sp.

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GenotipoCondiciones qumicas seleccionadasComposicin salina del medio de cultivo (ej. MS)Reguladores del crecimiento (ej. Auxinas)Antibiticos (ej. Kanamicina y carbenicilina)Carbn activado (Remocin de exceso)Agar Atmsfera gaseosa (depende envase y cobertura)in vivo: 78 % nitrgeno; 21 % oxgeno y 0,035 % de CO2CO2 + Etileno (promotor e inibidor)

Condiciones fsicas seleccionadastemperatura, la humedad relativa y la luzExplanteTratamiento, condiciones, y rea designada Ej: Hojas de Camellia japonica

1 y 4: callo organognico2: embriognesis somtica directa. 3: regeneracin directa de races.

Consiste en propagar plantas en un ambiente artificial controlado

Mejoramiento de plantas

Totipotencia

Tres vas de regeneracin:brotacin de yemas adventicias preexistentes, produccin de yemas de nuevas y embriognesis somtica.

Etapa 0: Preparacin del material vegetaltipo de rgano, edad ontognica y fisiolgica, estacin del material vegetal, tamao y estado sanitarioEtapa 1: Establecimiento del cultivoViable y axnico (fuera de otros organismos)Tejidos meristemticos jvenes70% etanol por 1 minuto + hipoclorito de sodio + enjuague con agua destilada estril

Etapa 2: Multiplicacin2 fases: Induccin & Multiplicacin reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y cido giberlicoOrganognesis puede darse por induccin de yemas axilares o adventiciasMS + 3% sacarosa -Murashige & Skoog (1962)

Etapa 3: Enraizamiento y aclimatizacinformacin de races adventiciasMedios con baja concentracin salina MS y B6Reguladores de crecimientoA. naftalnactico (ANA )Benciladenina (BA)Tidiazurn (TDZ).

pH en una solucin 0.5 M de manitol y cloruro de calcio (CaCl2)

Adhesin y fusin de gametos es rpida~10 segundos

Seleccin de nuevas variedadesOptimizacin en el uso del agua y nutrientesTratamiento de suelosControl de plagasMejora procesamientoManipulacin de los productos vegetales

Cruzamiento o hibridacin

Mutacin y recombinacin genticaVariabilidad gentica

30 de abril de 2011

El cultivo de tejidosVariacin somaclonalHibridacin somtica

Uso de marcadores moleculares

Uso de marcadores moleculares Identificar genotipos:Polimorfismos de: longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP); nmero variable de repeticiones de tndem (VNTR); secuencias simples repetidas (SSRs) etcCultivo de anteras y polen homocigotos (lnea pura)Seleccin in vitroCaracteres de inters

Incremento del crecimiento vegetativoFijacin de nitrgenoGenes nif

Nodulos de leguminosas: Fijacion N

PoliolesGen de la manitol-1-fosfato-deshidrogenasa bacterianaMayor tasa de crecimiento, mayor vigor, resistencia estrs abiticoAaden volumen y textura a los alimentos

HormonasAuxinasIAA

Resistencia al estrs abiticoDisponibilidad de agua y nutrientesContaminantesOrganismos extremofilos

OsmoprotectoresSobre expresin Congelacin y heladasAFP (Protenas anticongelantes)Daucus carota (Zanahoria) Tabaco, Arabidopsis thalianaSupervivencia de hasta los -2CResistencia a metales pesadosBiosntesis de fitoquelatinasConversin de plantas C3 a C4C4 adaptadas a sitios ridos e alta insolacin

AFP

2. Introduccin de componentes exgenosCarotinoides y arroz doradoSobreexpresin de fiteno sintasa

Cereales y leguminosasAmino cidos

Modificacin grasas y aceites naturalesColza (Canola), soja, girasol, y algodn

Modificacin de edulcorantes (azucares no polmeros)Ej. PatataIntroduccin de taumatina : Thaumatococcus danielliProtena dulzor intenso, pero valor energtico reducidoVitaminasTocoferol (Vitamina E)Sobreexpresin de tocoferol metiltranferasa (- TMT)

Cultivos celulares en lugar de vegetalesTiempo & EspacioManejo (Costos)Produccin rpida y eficienteRecuperacin y purificacin Seguridad

Cultivos de racesAgrobacterium rizhogenes metablitos secundariosElevada tasa de crecimiento, estabilidad gentica, capacidad de sntesis

Inters biofarmacuticoAnticuerposCncer ScFvArroz: acumulacin en las hojasVirus del Herpes Simple 2 Anti-HSV2 (IgG)SojaVacunasComestibles

Fertilizantes Reduccin de contaminacin en suelos y acuferosFijacin de NitrgenoEj. Cianobacterias - Arroz

Fuentes de energas Arroz (Oryza sativa) origen asiticoTrigoDomesticacinAncestrales diploides

TrigoGenoma del Triticum sufri grandes cambiosMayor cultivados: Trigo Pan (Triticum aestivum) y el Trigo Pasta (Triticum durum)

Teosinte

Aplicacin particular del cultivo de tejidosEj. TriticaleCruce de Triticum durum (4n=28) con Cebada (Secale cereale) (2n=14)

gen cp4 epsps para obtencin de plantas transgnicas tolerantes a glifosato

Soja: promotor 2x35S / secuencia codificante cp4 epsps (1996). Canola: Promotor FMV (Figwort mosaic virus) / secuencia codificante cp4 epsps y promotor FMV / secuencia codificante gox (1996). Algodn: promotor FMV / secuencia codificantecp4 epsps (versin sinttica con optimizacin de uso de codones; 1997). Maz: promotor de actina 1 de arroz / secuencia codificante cp4 epsps y promotor2x35S / secuencia codificante cp4 epsps (2001).

Maz NK603 X MON 810

Algodn MON 1445 X MON531

Familia de las gramneas no silvestresZea mays

FlintGrano colorado, duro y brillanteCereales desayunosPisingallo (Pop-Corn o pochoclo)

MAV Maces de Alto Valor Aumento produccin aceite y las protenasAlimento para animales

Plagas Fitopatogenos

Control qumico: Herbicidas y pesticidas

Manejo integrado de plagas (MIP)Conjunto de estrategias alternativas ms sustentablesBiopesticidas, trampas, control de luz (repeler), etc

Desarrollo de plantas transgnicas Bt

BtGen Bt introducido en el DNA

InfectadosTransgnicos

Control de dispersinColorAntocianinas (pigmentos mayoritarios en las flores)DelfidinaRosas y claveles azuleslobelia (Lobelia erimus)gen de la F35H de lisiantusFraganciaClientes y polinizadoresSntesis de metil benzoato

Efecto del gen gai en plantas de crisantemo.A. rhizogenes infeccin enanismo

es inducido por la produccin de una hormona vegetalEtileno Anti-sentidoTomate & Melon

A vs C92 / 62

G vs T74

ISAAA, 2008

Tambin se sembraron superficies pequeas de papaya y zapallo resistentes a virus, lamos Bt y clavel azul.

TH: Tolerante a herbicidaBT: Resistente a insectos.

Permite aislamiento, purificacin y replicacin de fragmentos especficos de ADN.

Obtencin del ADN a clonarEleccin del vector de clonacinGeneracin del ADN recombinanteIntroduccin ADN recombinante en organismo hospedadorIdentificacin y seleccin de las clulas que contienen al ADN recombinante

Plasmidos

Bacterifagos o fagos

Cosmidos

Cromosomas artificiales

Extra-cromosmicos, circulares y pequeos (1-500 Kb)Entre 10-100 copias (Alta) o entre 1-4 copias (Baja) Replicacin autnoma (secuencia ori )Naturales y modificados (o comerciales)tiles para fragmentos de hasta 15 kbps aprox.

Molculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosmicas, presentes en las bacterias

El Opern Lac es usado a menudo en Ingeniera Gentica y sirve para reconocer las bacterias recombinantes mediante un mtodo de seleccin porcolor (blanco y azul).Consiste en utilizar los reactivos:IPTG - Isopropil-b-D-tiogalactsidX-gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside El IPTG es un inductor artificial del gen lacZ, el cual codifica para la enzima -galactosidasa.

Genoma de unos 45,000 bpFragmento central de ~15 Kbp no es esencial para la replicacin y puede ser eliminado.Empaquetamiento del DNA in vitro en partculas de fago.Transfeccin de clulas y propagacin.

Generar ssDNA para secuanciacion de ANDFilamentoso obtenido de E.coli

Pequeas molculas de DNA circular (5-7 Kbp).Marcadores de seleccin.Secuencia COS: permite el empaquetamiento como bacterifago para la infeccin en E. coli, pero se mantiene en la clula como un plsmido.Permite clonar fragmentos de hasta 45 Kbp.Apropiados como vectores en fases iniciales de proyectos de secuenciacin.

Insertos entre 100 y 300 Kbp.Resistencia antibitico.Estabilidad mediante ori.Una o dos copias por clula.Cepas de dbil pared celular (electroporacin).

MarcadoresPlanta transgnica de tabacoGen de lucifersa

Promotores especficosVirus del mosaico de la coliflor (CaMV)Subunidad ribosomica 35STranscripcin es consecutiva (Siempre se expresa)

Agrobacterium tumefaciensBajo costo, procedimiento sencillo

Agrobacterium rhizogenes

Transformacin de protoplastosSon clulas desnudas sin pared celularAislacion por cultivos de callos o celulas del mesofilo de la hojaElectroporacinPolietilenglicolBiolsticaMicro inyeccin en cigotosMediacion de laser Femtoinyeccion

Generating transgenic plants or plant cells transformed on their plastomeIntroducing into plant plastids a first and a second DNA molecule, wherein the first DNA molecule contains a first region homologous to a region of the plastome for directing plastome integration and a first sequence of interest, and the second DNA molecule contains a second region homologous to a region of the plastome and a second sequence of interest, whereby a sequence segment of the first sequence of interest is homologous to a sequence segment of the second sequence of interest, and selecting transformants having an integration sequence stably integrated in the plastome, whereby the integration sequence contains at least a portion of the first and second sequences of interest as a continuous sequence. The invention further provides plant cells, plants, and seeds of plants produced by such processes. These organelles still encode about 50% of the proteins required for their main function inside the plant cell, photosynthesis. Plastids also encode their ribosomal RNAs, the majority of their tRNAs and ribosomal proteins. In total, the number of genes in the plastome is in the range of 120 (Palmer, 1991). The vast majority of proteins that are found in plastids are, however, imported from the nuclear/cytosolic genetic compartment. A capability of transforming plastids is highly desirable since it could make use of the high gene dosage in these organelles that bears the potential of extremely high expression levels of transgenes. In addition, plastid transformation is attractive because plastid-encoded traits are not pollen transmissible; hence, potential risks of inadvertent transgene escape to wild relatives of transgenic plants are largely reduced. Other potential advantages of plastid transformation include the feasibility of simultaneous expression of multiple genes as a polycistronic unit and the elimination of positional effects and gene silencing that may result following nuclear transformation.

To date, two different methods are available, i.e. particle bombardment of tissues, in particular leaf tissues (Svab et al., 1990), and treatment of protoplasts with polyethylene glycol (PEG) in the presence of suitable transformation vectors (Koop et al., 1996). Both methods mediate the transfer of plasmid DNA across the two envelope membranes into the organelle's stroma.

Conventional methods for plastid transformation usually rely on the selection for the insertion of an antibiotic resistance marker cassette into the plastome such as an expression cassette containing the gene aadA (encoding the enzyme aminoglycoside adenyl transferase), which confers resistance to inhibitors like Spectinomycin or Streptomycin (U.S. Pat. No. 5,877,402) or aphA-6 (encoding the enzyme aminoglycoside phosphotransferase A-6) which confers resistance to kanamycin (Huang et. al., 2002).

The selection marker gene or the mutant plastid gene is included in the integrating region, which is flanked by homologous regions directing the plastome integration. Selection for plastid transformants is then achieved by cultivating transformed plant material on medium containing the appropriate inhibitor. As these marker genes are stably integrated into the genome together with the genes of interest, they will remain in the homoplastomic transgenic plants although they are not required for the function of the genes of interest. These remaining marker genes are a main issue of criticism of plant biotechnology. Construction of a selection system which does not result in a resistance gene in the transgenic plant is, therefore, highly desirable (lamtham and Day, 2000).

Plastid transformation vectors usually contain one or more gene(s) of interest flanked by two regions of the insertion site, which are necessary for the stable introduction of the engineered sequences into the plastome by homologous recombination events (U.S. Pat. Nos. 5,877,402, 5,451,513). However, substantial cloning work is needed to generate the transformation vector molecules which contain a large number of different fragments: two flanks, a marker gene, one or more gene(s) of interest and regulatory elements such as promoter, 5-UTR, 3-UTR or spacer elements. The cloning of transformation vectors is problematic in cases wherein (at least one of) the cloned gene(s) has a toxic effect on the bacteria used for cloning. Moreover, using the highly desirable potential to co-express a series of introduced transgenes is limited by the overall size of the transforming plasmid.

One major complication in achieving plastid transformation is the high copy number of the plastome. Following transfer of the vector DNA into the plastids only one or very few copies of the introduced molecules will recombine with the plastome. Thus initially only a small proportion of recombinant plastome molecules are generated in the background of a vast majority of wild type plastome molecules (heteroplastomic status).

By a very time consuming process of segregation under selective pressure it is possible to eliminate the original wild type copies of the plastome and achieve a homoplastomic recombinant status being characterized by the sole presence of recombinant plastome molecules. Achieving the homoplastomic status is supported by several cycles of regeneration on selective medium containing the appropriate antibiotics. Usually 3-5 of such cycles are necessary to obtain the homoplastomic recombinant status. The presence of remaining copies of wild type plastome can be monitored by molecular analysis like PCR or Southern Hybridization. As several weeks are needed for one regeneration cycle it takes several months to generate hormoplastomic plastid transformants.

The pCAMBIA vector backbone is derived from the pPZP vectors (constructed by Hajdukiewicz, Svab & Maliga, see References). While not perfect and having technical and IP limitations (see the BioForge GUSPlus Project , in which we're improving reporter genes and selection methods for more complete freedom to operate), pCAMBIA vectors offer:high copy number in E.coli for high DNA yieldspVS1 replicon for high stability in Agrobacterium small size, 7-12kb depending on which plasmidrestriction sites designed for modular plasmid modifications and small but adequate poly-linkers for introducing your DNA of interestbacterial selection with chloramphenicol or kanamycinplant selection with hygromycin B or kanamycin (phosphinothricin selection was discontinued at the request of the IP owner, Bayer, after the initial distribution in 1997)simple means to construct translational fusions to gusA reporter genes.

El Musa paradisiaca, mejor conocido como pltano, es un farinceo originario del sureste asitico. Su forma de propagacin es a travs del tallo y la yema y la maduracin de su fruto ocurre aproximadamente diez meses despus de la plantacin. Las condiciones apropiadas para su cultivo incluyen suelos profundos, de buen desage, sueltos y con un pH de 4.5 a 7.0. Sin embargo, el pltano puede crecer en los suelos cidos, de baja fertilidad e inclinados. En Puerto Rico se cultivan las variedades Maricongo (90 por ciento), el Enano comn y el Hartn (estos dos ltimos contribuyen juntos en un 10 por ciento de la produccin) (Daz, 2006). El pltano representa el cultivo de mayor impacto econmico en Puerto Rico. En el ao 2004, contribuy con $56.8 millones del Ingreso Bruto Agrcola (Corts, 2005).

Al igual que otros cultivos agrcolas, los platanares estn amenazados por enfermedades causadas por virus, bacterias y hongos. Recientemente, dos de las enfermedades que han afectado la produccin de pltanos en Puerto Rico son la Sigatoka amarilla: causada por el hongo Mycosphaerella musicola y la Sigatoka negra: causada por Mycophaerella fijiensis (Alamo, 2007). En Puerto Rico el 100% de los acres de pltanos se encuentran en riesgo de ser atacados por la Sigatoka negra, mientras que la Sigatoka amarilla afecta el 90% de los acres de pltano en Puerto Rico daando irremediablemente el 40% de stos (USDA National Information System for the Regional IPM Centers). Los signos de la infeccin para ambas enfermedades incluyen pequeas estras amarillo verdosas en la hoja, las cuales se alargan segn sus centros se tornan color marrn rojizo. Cuando la enfermedad es severa, las manchas se unen, ocurre muerte rpida de las hojas, permaneciendo un color amarillento alrededor de las manchas. La diferencia entre estas dos infecciones estriba en que la Sigatoka negra es generalmente ms severa y destructiva (cerca de 100%). Como consecuencia de la infeccin, se produce una maduracin prematura de los racimos, lo que no proporciona tiempo suficiente para que stos se desarrollen y adquieran el peso y tamao correspondiente. La dispersin del hongo es principalmente mediante las conidias y las ascosporas.

El objetivo de esta investigacin lo es el generar plantas de pltano con resistencia a Sigatoka.

Se propone emplear como modelo la variedad de pltano Maricongo al cual se le insertar el gen KP4 el cual es derivado del virus P4 de Ustilago maydis.

Este gen codifica para una protena de 11.045kD que posee el mismo nombre: KP4. La protena KP4, posee actividad anti-hongo y tambin es conocida como KP4 killer toxin, killer protein 4, fungal toxin KP4. La accin antifngica de KP4, ocurre mediante la inhibicin especfica de los canales de calcio dependientes de voltaje (voltage-gated). Este bloqueo resulta en una disminucin del transporte intracelular de calcio, inhibiendo as el crecimiento y divisin celular del hongo. Se transformarn las clulas del tallo mediante el mtodo de Agrobacterium, empleando el vector pCAMBIA que provee resistencia a Higromicina como marcador selectivo y GUS como gen reportero.

En Puerto Rico, el pltano es el producto agrcola de mayor importancia econmica. Sin embargo, la Sigatoka negra y la amarilla, amenazan los cultivos de nuestro pas. El propsito de este estudio es determinar el efecto antifngico de la insercin del gen KP4 en la variedad de pltano Maricongo luego de la transformacin con el dicho gen. Esta investigacin bien podra ser una ventana a futuras experimentaciones con el pltano y con otros cultivos importantes en Puerto Rico ya que en este pas no se ha fomentado con suficiente inters los beneficios de los cultivos transgnicos.

1. Optimizar los mtodos de transformacin del pltano Maricongo con el mtodo de Agrobacterium

2. Generar plantas de pltano con resistencia a los hongos Mycosphaerella musicola (Sigatoka amarilla) y Mycophaerella fijiensis (Sigatoka negra)

Se utilizarn clulas embrionarias de pltano a partir de la punta del tallo de plantas crecidas in vitro. Estas se colocarn en placas petri en medio segn Ganaphati (2001). Luego de seis (6) meses, se realizar la suspensin de las clulas embrionarias a partir del callo formado transferido a un medio liquido suplementado con cido 2,4-Diclorophenoxyacetico (1 mg/L), biotina (1 mg/L), l-glutamina (100 mg/L), extracto de malta (100 mg/L) y Sucosa (45 g/L). Luego sern subcultivadas cada 10 das descartando 4 mL del medio y aadiendo 4 mL del medio fresco (Cote et al. 1996). Luego, la suspensin se cultivar en Erlenmeyer con 25 mL del medio y en un shaker. Se subcultivar cada diez das en condiciones segn Ganaphati (2001).

Luego, la insercin y expresin del gen sern probados mediante GUS Assay para la expresin del gen reportero GUS; pruebas de resistencia a Higromicina para probar la insercin del vector pCAMBIA; PCR para detectar la insercin del gen KP4; y cultivo in vitro en medio con Mycosphaerella musicola para comprobar la expresin del gen KP4.

Do-it-yourself vectors pCAMBIA0380; pCAMBIA0390These vectors contain a range of restriction sites on either side of the pUC8 (0380) or pUC9 (0390) polylinker, making them suitable for advanced construction purposes with users inserting their own promoters, selection genes, reporter genes, etc. The only functional signals between the T-DNA borders are the start and stop codons, the histidine tag, and the NOS-poly(A) signal. All the standard features of the pCAMBIA backbone are present: kanamycin bacterial selection, high copy number in E. coli, and stable replication in A. tumefaciens.

Chloramphenicol, 100 g/mL for strain AGL1, 10 g/mL for LBA4404, 25 g/mL for EHA105 and for E. coli.Kanamycin, 50 g/mL for both Agrobacterium and E. coli. For selection of transformed rice plants we use hygromycin at 50 g/mL and 25 g/mL for tobacco.

Protoplastos: Cels extraidas de las pared celular*un esporofito = haploide *1.hipoclorito de sodio o calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1%- 1,5%).2. Excepciones se puede sumergir: sustancias antibiticas (ej sulfato de estreptomicina, ampicilina)3. soluciones biocidas que matan bacterias y hongos PPM (Plant Preaservative Mixture)4. instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados (o con 95% etanol)*auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, ZEA, 2iP, Thidiazurn).**LUZ: tipo luz da con una irradiancia de entre 50 y 200mol m-2s-1.

*Auxinas: elongacin celular, la formacin de callos y races adventicias Citoquinas: tejidos vegetales 2,4-D (herbicida), el AIA (cido indolactico) y el ANA (cido naftalenactico)- frutoagentes adsorbentes de fenoles: tales como el carbn activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el cido ascrbicoEvitndose la acumulacin de CO2 y de etileno (FIG. ejemplo de tapa perforada con tapn de gomaespuma)CO2 (antagonista del etileno)*Iluminacion, extractores, riego, sensor humedad*Ambas en medios MSCv. : Nombre comun croton Psp: Cherry blossom*D. Abelia*diferentes procesos morfognicos obtenidosa partir de la siembra in vitro de diferentes explantes.*Antibioticos:Transformacin con Agrobacterium tumefaciens uso de kanamicina y carbenicilinacarbn activado: se usa para adsorber compuestos txicos de la micro atmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimientoAgar: extrado de diversas algas marinasAtmsfera gaseosa: tapon de algodn, papel de aluminio, etcCO2: condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa mientras que en condiciones de luz, disminuye*Diferentes respuestas morfognicas obtenidas despus de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L.Tuvo previa inmersin en una solucin de IBA durante 20 minutos*Etapa 0: correcta eleccin y preparacin del explanto det. Calidad Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa (75%)*maduracin se adiciona ABA (cido absccico) + AG (cido giberlico)*Facil en herbceas pero complicado en len~osasMedios: incrementan el porcentaje de enraizamiento de vstagosAuxina ms utilizada es el IBA en herbaceasInduccin de vstagos, tanto en gimnospermas como en angiospermas, se requiere el empleo de citocininas. La ms usada es la N6-benciladenina (BA) o tambin llamada 6-bencil amino-purina (BAP) y el tidiazurn (TDZ).

*Los biorreactores son equipos que contienen aproximadamente 2 litros de medio de cultivo lquido estril y donde los embrionessomticos pueden regenerar y madurar. Permiten el cultivo a gran escala de los mismos.DESVENTAJA: declinamiento de las lneas celulares (clones) por efecto de la variacin somaclonal y sus altos costos*micropropagacin en plantas de paraso gigante

A) Huerto semillero de paraso gigante con ejemplares de seis aos de edad. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadaspara generar una poblacin de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparacin del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadascomo donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vstagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 das sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 M 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 M cido giberlico (GA3) + 0,25 Mcido 3-indolbutrico (IBA). D) Etapa de Multiplicacin: vstagos luego de 30 das sobre medio de multiplicacin (medio MS suplementado con 2,22 M BAP, estos vstagos fueron empleados como explantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la etapa de multiplicacin con problemas de vitrificacin y presencia de callo. F) Vstago enraizado en MS con concentracin salina reducida a la mitad, suplementado conIBA durante 2 das, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 das hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatizacin *Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en que el embrin es somtico (producido por el fenmeno conocido como embriognesis somtica) y no cigtico y que si tiene endosperma y cubierta, stos son artificiales(Fig.1a y b).

1. Etapas en la produccin de las semillas sintticas2. Induccin de la embriognesis somtica (a-d); seleccin de embriones somticos (e); inmersin de los embriones en alginato de sodio (f); acomplejamiento con nitrato de calcio (g); lavado (h); semilla sinttica (i)

*Variedad de especies vegetales, entre ellas: maz (Zea mays), trigo (Triticum aestivum), cebada (Hordeum vulgare), raygrass (Lolium perenne)y algunas brasicceas.

Aislar polen por choque elctrico, osmtico y/o de pH.Aislar gametas femeninas mediante microdiseccin

El tratamiento de las espigas, previo a la polinizacin con 2,4-D, que induce a la expansin del ovario*gen de corta estatura en la lnea A.*mejoramiento de numerososcultivos y plantas ornamentales, como arroz, geranio, caa de azcar, tomate, apio y banana*Osmoprotec: Inclusion genessobre expresion y toleranciaC4 (Enz carboxilacion fosfoenolpiruvato PEPC) + Fotosint. Alta + no es inibida por O2 + areas tropicales y aridas

*Cereales: Deficientes en lisinaDeficientes en amino acidos azufrados (Metionina y cisteina)

*Trigo:producido a gran escala y tremendamente alimenticio, puede ser almacenado y conservado durante un largo perodo de tiempo (7 pares de cromosomas: 2n =14) Ahora: tetraploide T.turgidum)Hexaploide: (pan): T.eastivum, con 42 cromosomas

*su adaptacin a climas templados*teosinte (originario de Mesoamrica), es el pariente ms cercano del maz. *nueva especie hexaploide*Maz MON810 (lepidpteros. ) introduccin del gen cry1A, impide el desarrollo de las larvas Maz NK603 tolerancia herbicida glifosato, enzima 3-enolpiruvil-shiquimato-5-fosfato sintasa (EPSPS), proveniente de la cepa CP4 Agrob. T.expresa dos protenas nuevas, la CP4 EPSPS y la Cry1Ab.

*teosinte, que todava crece en Mxico como planta silvestre, produce unas mazorcas muy pequeas con pocos granos. los granos permanecen unidos al marlo (perdieron los mecanismos de dispersin de semillas adecuadosflores masculinas y femeninas se encuentran en la misma planta (fecundacion cruzada, alogama)se propaga por semillas y depende del movimiento del polen por el viento. ACTUAL: se adapta a diferentes latitudes, alturas, temperaturas y condiciones de humedad

*Sus esporas contienen la Toxina Cry: activan en el sistema digestivo del insecto y se adhieren a su epitelio intestinal, alterando el equilibrio osmtico del intestino.

*A.Medio B. Micropropagacion C. bulbillos obtenidos D. planta transferida a tierra (aclimatizacion) E. planta adaptada a las condiciones ex vitro. F. plantas en suelo bajo jaula antifidos H. bulbos de ajo libre de virus

*Dispersion de polen: Controlar la floracion en arboles grandesCOLOR AZUL: ruta de biosntesis de estos compuestos es el intermediario DHK (dihidrokaempferol). Las enzimas FLS (flavonol sintasa), F3H (flavonoide 3- hidroxilasa), F35H (flavonoide- 3,5- hydroxilasa) y DFR (dihidroflavonol reductasa) utilizan este sustratoFRAGANCIA: report el incremento en la fragancia al regular negativamente la expresin del gen de la enzima F3H (como se mencion antes, involucrada en la biosntesis de antocianinas (Menos color, pero +++ olor)*genes rol A, rol B, rol C, y rol D, responsables de provocar alteraciones fenotpicas denominadas races en cabellera (hairy roots)*A: carcter de inters se mide en rboles no relacionados tomados de una poblacin.B: se determinan SNP en cada genotipo*Vector: la capacidad de autorreplicacin, tamao adecuadoAND Recom.: ER-cortar, ligasa, ATPgenes deResistencia a antibiticos y el fragmento funcional de lac Z, el gen de E. coli que codifica para la enzima -galactosidasa (-gal).tienen insertado un sitio mltiple de restriccin (polylinker), anulan la actividad de la -galactosidasa. X-gal, y se liberaun colorante azul (se insert en el polylinker y desactiv la -galactosidasa, no se producir pigmento azul )**BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI est dentro del gen de resistencia a la ampicilina. a) Sitio de restriccin mltiple que consiste en un corto segmento de ADN con varios sitios de restriccin, cada uno de ellos nico para elvector. b) representacin esquemtica del plsmido pBR322 con el origen de replicacin (Ori) y los genes marcadores de resistencia a tetraciclina (TETR) y ampicilina (AMPR) que contienen los sitios de restriccin de BamHI y PstI

*Marcador luminoso:GFP- proteina verde fluorescente de Aequorea victoriaMarcador cuantificable: Beta-glucuronidasa (gus) y cloranfenicol acetil transferasa) de E. coli (cat)*Electroporacion: apertura en membrana (produce recombinacion heterologa)Polietilglicol: agente fusagenico modifica fosfolip. Biolistica: microesfera de tungsteno u oroMediacion laserFetoinyeccion*