biorremediacion de ambientes costeros

Mariana Lozada, Magalí Marcos y Hebe Dionisi Laboratorio de Microbiología Ambiental

Centro Nacional Patagónico (CENPAT-CONICET)

LA BIORREMEDIACIÓN DE AMBIENTES COSTEROS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

2013

1

Biorremediación de Ambientes Costeros

TABLA DE CONTENIDOS

Página

PREFACIO.......................................................................................................................i

AGRADECIMIENTOS.................................................................................................ii

GLOSARIO....................................................................................................................iii

1- ¿QUÉ SON LOS HIDROCARBUROS? ............................................................... 3

2- ¿CÓMO LLEGAN LOS HIDROCARBUROS AL MAR? …………………...... 5

3- ¿QUÉ ACTIVIDADES PUEDEN INTRODUCIR HIDROCARBUROS EN LA COSTA PATAGÓNICA? ......................................................................... 6

4- ¿CÓMO AFECTAN LOS HIDROCARBUROS AL ECOSISTEMA MARINO? .................................................................................................................. 10

5- ¿QUÉ EFECTO TIENEN LOS COMPONENTES DEL PETRÓLEO SOBRE LA SALUD DE LA POBLACIÓN? ....................................................... 13

6- ¿CUÁL ES LA RESPUESTA INMEDIATA ANTE UN DERRAME IMPORTANTE DE PETRÓLEO? ......................................................................... 16

7- ¿QUÉ OCURRE CON EL PETRÓLEO UNA VEZ QUE LLEGA AL MAR? 20

8- ¿QUÉ ROL TIENEN LOS MICROORGANISMOS EN LOS PROCESOS NATURALES DE RESTAURACIÓN AMBIENTAL?............ 21

9- ¿QUÉ SE CONOCE DE LOS MICROORGANISMOS QUE DEGRADAN HIDROCARBUROS EN LA COSTA PATAGÓNICA? ....... 26

10- ¿CUÁLES SON LAS PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE UN AMBIENTE PRÍSTINO, UNO CRÓNICAMENTE CONTAMINADO Y UNO IMPACTADO POR UN DERRAME DE PETRÓLEO? ................... 47

11- ¿QUÉ SON LAS TECNOLOGÍAS DE BIORREMEDIACIÓN? .................... 50

12- ¿QUÉ TIPO DE ANÁLISIS DEBEN REALIZARSE EN EL SITIO CONTAMINADO? ................................................................................................... 52

13- ¿CÓMO SE DECIDE QUÉ TECNOLOGÍA UTILIZAR? ................................. 62

14. CONCLUSIONES....................................................................................................... 69

15- REFERENCIAS.......................................................................................................... 70

ANEXO: METODOLOGÍAS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS AMBIENTALES ................................................. 90

Foto de la portada: Caleta Córdova, Chubut, Argentina, 105 días luego del derrame de petróleo de Diciembre de 2007 (Fuente: los autores).

2 2


PREFACIO

Este libro está dirigido al público en general, con algo de conocimientos sobre

las ciencias biológicas adquiridos en la escuela media. Estudiantes de este nivel

educativo, estudiantes de carreras terciarias y universitarias e integrantes de las

oficinas de gobiernos interesados en esta temática fueron nuestra inspiración para la

selección de los temas tratados y para intentar hacer comprensible una temática que

a menudo puede resultar compleja. Nuestro objetivo para escribir este libro fue

difundir la problemática asociada con la contaminación de hidrocarburos en

ambientes costeros, en particular en la zona patagónica. Una de las principales

fuentes de impacto ambiental en las costas de la Patagonia es la contaminación por

hidrocarburos producto de las actividades de extracción y transporte de petróleo,

actividad económica de gran importancia para la región. Además, existe un impacto

sobre las zonas portuarias debido a las actividades de los buques de pesca, de

carga y de turismo. La contaminación crónica producto de estas actividades, y

accidentes de importante magnitud que pueden registrarse como consecuencias de

las mismas pueden producir daños en la salud de la población y del medio ambiente.

Este daño puede afectar a otras actividades de gran importancia para la economía

de la región, basadas en el turismo regional.

La transferencia de conocimientos a la sociedad es el último eslabón de la

cadena del conocimiento científico, el cual es generado mayormente con fondos

públicos. De esta manera, estos conocimientos vuelven a la comunidad, de forma de

que puedan ser aprovechados directamente por el sector público, o ser incorporados

al saber social. En el caso de la temática tratada en este libro, la opinión pública

tiene a menudo un rol clave (o debería tenerlo) en la toma de decisiones para la

limpieza de los sitios contaminados. En consecuencia, resulta imprescindible que

estos conocimientos lleguen a la población, para que ésta pueda tomar decisiones

informadas basadas en la comprensión de los efectos y posibles soluciones del

problema. Una población informada redunda en el bienestar común. Por otra parte,

los estamentos del gobierno habitualmente recurren a los científicos en el caso de

un derrame. En este caso, una comprensión sobre la temática colaborará en un

mejor diálogo entre ambos sectores, también favoreciendo la más rápida resolución

de la crisis ambiental.

3 3


Organizamos el libro en base a los distintos aspectos que deben tomarse en

cuenta ante un ambiente contaminado. Planteamos trece preguntas que intentamos

contestar aportando información no sólo precisa sino también sencilla de

comprender. A partir de estas preguntas, informamos sobre qué son los

hidrocarburos, cómo llegan hasta el ambiente marino, qué problemas pueden

generar, qué pasa con los hidrocarburos una vez que llegan al ambiente y cuál es el

rol de los microorganismos en su desaparición, qué tecnologías pueden utilizarse

para acelerar el proceso natural y qué herramientas químicas y microbiológicas

suelen utilizarse en el ambiente contaminado.

Un punto que nos pareció esencial tratar con profundidad es sobre las

investigaciones realizadas en la costa patagónica. Si bien todos estos estudios están

publicados en revistas científicas, la mayoría de ellos se encuentran en idioma inglés

y en revistas que no son de acceso gratuito. Por ello, realizamos un trabajo de

revisión que incluyó no sólo a las investigaciones generadas en el Laboratorio de

Microbiología Ambiental del Centro Nacional Patagónico (CENPAT-CONICET) al

cual pertenecemos, sino también a otros grupos de investigación trabajando en esta

problemática, con objetivos y áreas de estudio altamente complementarios, y a

menudo generando colaboraciones. También decidimos incluir un anexo explicando

las metodologías habitualmente utilizadas para realizar estos estudios, ya que esta

información resulta esencial para comprender la complejidad de los mismos y las

limitaciones impuestas por la metodología utilizada. Podrán encontrar más

información sobre las actividades de nuestro laboratorio en nuestra página web,

donde también se encuentra la información de contacto:

www.cenpat.edu.ar/fisicambien/LabMicroAmb.htm.

Mariana Lozada, Magalí Marcos y Hebe Dionisi

Laboratorio de Microbiología Ambiental

Centro Nacional Patagónico (CENPAT-CONICET)

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http://www.cenpat.edu.ar/fisicambien/LabMicroAmb.htm


AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer al Fondo Editorial de la Provincia del Chubut, República

Argentina, por su apoyo para la publicación de este libro. Este trabajo fue redactado

en el marco de un proyecto de investigación financiado por la Secretaría de Ciencia,

Tecnología e Innovación de la Provincia del Chubut, la cual siempre ha valorado que

nuestras propuestas contengan un importante componente de transferencia del

conocimiento científico. El Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y

Técnicas de la Argentina (CONICET) también ha tenido un rol clave para el

desarrollo de este trabajo, ya que ha estado presente en las distintas etapas de la

carrera de las autoras y financian al Centro Nacional Patagónico (CENPAT-

CONICET). También quisiéramos agradecer a todas las instituciones públicas o

privadas que han hecho posible las investigaciones en nuestro laboratorio:

CONICET, Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Secretaría de

Ciencia, Tecnología e Innovación de la Provincia del Chubut, Blacksmith Institute,

Departamento de Energía de los Estados Unidos, Centro Argentino Brasileño de

Biotecnología, PADI Foundation, Fundación Antorchas, GEF (Global Environment

Facility) Patagonia y Fondo Editorial Provincial (Chubut).

5 5


GLOSARIO

Anfípodos: Pequeños crustáceos. Muchas de las especies descriptas son marinas,

aunque también pueden ser de ambientes de agua dulce, o terrestres.

Anóxico: Que presenta una baja concentración de oxígeno disuelto.

ARNr 16S: El ARNr (ARN ribosomal) es una molécula que forma parte de los

ribosomas, los cuales están encargados de la síntesis de proteínas en un ser

vivo. Se encuentra presente en todos los organismos, y el estudio de los

genes que la codifican permite conocer las relaciones evolutivas entre los

mismos. El ARNr 16S forma parte de la subunidad menor de los ribosomas en

los organismos procariotas (bacterias y arqueas).

Asfaltenos: Compuestos polares de alto peso molecular que forman parte del

petróleo crudo.

Benceno: Hidrocarburo monoaromático, de fórmula molecular C6H6.

Bentónico: Referente al fondo de ecosistemas acuáticos (bentos).

Bioacumulación: Proceso de acumulación de compuestos químicos (tales como

hidrocarburos o metales pesados) dentro de los organismos vivos. A causa de

la bioacumulación, es posible encontrar concentraciones de estas sustancias

más altas en los tejidos de algunos organismos que en el medio ambiente.

Biodegradable: Que puede ser degradado por organismos vivos.

Biodiversidad/Diversidad biológica: Variedad y abundancia de especies en el sitio

de estudio. La diversidad biológica tiene dos componentes: la riqueza

(número total de especies) y la equitatividad, (relación entre las abundancias

relativas de cada una de estas especies).

Biofilm: Forma de crecimiento bacteriano en el que las células crecen unidas a una

superficie y embebidas en una matriz producida por ellas mismas.

Biología molecular: Es la disciplina científica que tiene como objetivo el estudio de

los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista

molecular. Se realiza mediante el estudio de la estructura, función y actividad

6 6


de las macromoléculas esenciales para la vida (ácidos nucleicos, lípidos,

proteínas).

Biomasa: Materia total de seres vivos.

Biomoléculas: Son las moléculas constituyentes de los seres vivos. Pueden ser

inorgánicas (agua, sales minerales) u orgánicas (lípidos, azúcares, ácidos

nucleicos, proteínas).

Bioprospección: Exploración de la biodiversidad con el propósito de obtener

recursos genéticos y bioquímicos de valor comercial.

Biorremediación: Explotación de actividades biológicas, generalmente de los

microorganismos, para detoxificar o remover contaminantes de un ambiente.

Biosurfactantes: Moléculas tensoactivas producidas por seres vivos, las que

pueden ser utilizadas para distintas aplicaciones biotecnológicas entre las que

se encuentra la biorremediación de sitios contaminados con hidrocarburos.

Biotecnología: Utilización de organismos vivos para obtener un bien o servicio útil

para el hombre.

Clonado: Técnica molecular que permite aislar genes específicos o fragmentos de

ADN. La técnica consiste en unir el gen de interés a un vector de clonación

(por ejemplo un plásmido) e introducirlo en un organismo hospedador donde

pueda replicarse.

Comunidad microbiana: Ensamble de microorganismos de múltiples especies que

conviven en un mismo tiempo y espacio e interactúan entre sí.

Consorcio microbiano: Asociación de dos o más poblaciones microbianas de

diferentes especies que actúan conjuntamente, donde todos se benefician de

las actividades de los demás, por ejemplo llevando a cabo los distintos pasos

de la degradación de un compuesto químico.

Cuencas petrolíferas: Zonas geológicamente favorables para la producción y

acumulación de hidrocarburos. Actualmente, Argentina cuenta con cinco

cuencas petrolíferas productivas.

Cultivo: Técnica microbiológica que permite aislar y multiplicar microorganismos

para poder ser estudiados individualmente. Consiste en proporcionar a los

7 7


microorganismos de una solución de nutrientes (denominada medio de

cultivo) que permita su crecimiento. Las técnicas dependientes del cultivo de

microorganismos permiten estudiar las capacidades metabólicas de las cepas

de interés en forma aislada. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos

aún no han podido ser cultivados en el laboratorio, en parte debido a que las

condiciones de los medios de cultivo difieren mucho de las características de

su entorno natural. En estos casos, es necesario recurrir a las técnicas

independientes del cultivo de microorganismos.

Cultivo de enriquecimiento: Selección de microorganismos específicos a partir de

muestras naturales mediante el uso de medios de cultivo y condiciones de

incubación que favorezcan el crecimiento de un solo tipo o grupo de

microorganismos.

DGGE: Siglas de Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, o electroforesis en gel

con gradiente de desnaturalización. Técnica molecular basada en la

separación de fragmentos de ADN de similar longitud pero de distinta

secuencia de nucleótidos. Los fragmentos de ADN con distinta secuencia de

nucleótidos migrarán en forma diferencial gracias al gradiente

desnaturalizante del gel, lo que permite su separación.

Dioxigenasas: Enzimas que participan en el primer paso de la ruta degradativa

aeróbica de algunos hidrocarburos. Los genes que codifican a estas enzimas

suelen ser estudiados cuando se desea conocer el potencial que presenta la

comunidad microbiana de un sitio contaminado para degradar estos

compuestos.

Dispersantes químicos: Compuestos químicos que disgregan la emulsión de

petróleo en pequeñas gotas, favoreciendo su degradación por parte de los

microorganismos. Actualmente, su utilización es controversial debido a que

muchos de estos compuestos son tóxicos por si mismos o al combinarse con

los hidrocarburos.

Ecorregión marina: Área con una composición de especies relativamente

homogénea y diferente a la composición que presentan sistemas adyacentes.

Estructura de la comunidad: Propiedad de la comunidad que consiste en su

composición de especies y sus abundancias relativas.

8 8


Fase exponencial de crecimiento: Etapa del crecimiento de un microorganismo en

la cual el número de células se duplica a períodos constantes de tiempo.

Gen: Fragmento de ADN que codifica para una proteína (vía ARNm), un ARNt o un

ARNr.

Gen biomarcador: Gen que se encuentra asociado a una actividad de interés, y por

lo tanto es elegido como blanco de estudios moleculares.

Género: Nivel taxonómico ubicado entre los niveles de familia y especie. Bajo un

mismo género se agrupa un conjunto de especies que comparten una o más

propiedades.

Genoma: Conjunto de todos los genes de un organismo.

Hidrocarburos: Compuestos orgánicos formados por átomos de carbono e

hidrógeno. Son los compuestos predominantes que constituyen el petróleo

crudo.

Hidrocarburos alifáticos: Hidrocarburos no derivados del benceno. Pueden

encontrarse formando cadenas lineales, ramificadas o formando estructuras

cíclicas.

Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs): hidrocarburos que presentan dos

o más anillos bencénicos fusionados en arreglos lineales, angulares, o

agrupados.

Intemperización: Cambios físicos, químicos y biológicos que sufre el petróleo

inmediatamente después de ser liberado al medio ambiente marino, y que

alteran la composición química y las propiedades físicas de los hidrocarburos

derramados.

Intermareal: Zona de la costa que queda sumergida durante la pleamar y expuesta

en bajamar.

Marcador filogenético: Gen que brinda información sobre la posición filogenética

(relación evolutiva con otros organismos) de los organismos en estudio. El

marcador filogenético más comúnmente utilizado es el gen que codifica al

ARNr 16S en procariotas, o 18S en eucariotas.

9 9


Metagenómica: Disciplina que estudia los genomas de todos los organismos de una

comunidad.

Olefinas: Hidrocarburos alifáticos del petróleo que presentan dobles enlaces

(alquenos).

PCR: Siglas de Polymerase Chain Reaction, o reacción en cadena de la polimerasa.

Técnica de biología molecular que permite multiplicar el número de copias de

un gen in vitro. La PCR hace uso de la enzima Taq polimerasa, la cual copia

las moléculas de ADN en cada ciclo de la reacción.

Población microbiana: Subconjunto de la comunidad microbiana que comprende a

todos los organismos de una misma especie, subespecie o variedad.

qPCR (PCR cuantitativa): Técnica que surge como una modificación a la PCR

tradicional para poder estimar la abundancia inicial de un gen en una muestra.

Redundancia funcional: Propiedad emergente de una comunidad, gracias a la cual

distintos taxa son capaces de llevar a cabo una misma función.

Resinas: Compuestos polares del petróleo que tienen un bajo peso molecular.

Riqueza de especies: Número total de especies presentes en una comunidad.

Secuenciación: Técnica que permite obtener el orden de los nucleótidos en un

fragmento de ADN.

Sedimentos: Material orgánico e inorgánico que se encuentra en el fondo de un

cuerpo de agua.

10 10


1- ¿QUÉ SON LOS HIDROCARBUROS?

El petróleo crudo

El petróleo crudo es una mezcla natural muy compleja, compuesta mayormente

por hidrocarburos, es decir, compuestos químicos formados únicamente por átomos

de carbono e hidrógeno [10]. Tanto la composición como las propiedades físicas del

petróleo varían de acuerdo al sitio de donde éste se extrae. Los compuestos más

abundantes del petróleo son los hidrocarburos alifáticos (Figura 1, izquierda), que en

promedio representan el 58% de la mezcla. Estos compuestos pueden estar

presentes en forma de cadenas lineales, ramificadas o formando estructuras cíclicas

(cicloalcanos o naftenos) [85]. Los hidrocarburos aromáticos, que constituyen en

promedio el 28% del petróleo crudo, les siguen en abundancia y se caracterizan por

presentar al menos un anillo bencénico. De acuerdo al número de anillos que

presenten las moléculas, estos compuestos se dividen en monoaromáticos (Figura

1, centro) y poliaromáticos, también denominados hidrocarburos aromáticos

policíclicos o HAPs (Figura 1, derecha). Aproximadamente el 14% de las moléculas

que constituyen el petróleo crudo son compuestos polares, que contienen átomos de

nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Los compuestos polares más pequeños son

conocidos como resinas, y los de mayor peso molecular son denominados

asfaltenos [12].

Figura 1. Estructura molecular de un hidrocarburo alifático (octano, izquierda), monoaromático (benceno, centro) y poliaromático (pireno, derecha). Los átomos de carbono se indican en verde, y los de hidrógeno, en blanco. Fuente: Biblioteca de moléculas, NYU (www.nyu.edu/pages/mathmol/library).

11 11


Los combustibles refinados del petróleo

Para poder ser utilizado como

combustible u otros productos

derivados, el petróleo crudo es

sometido a un proceso de refinado. Uno

de los procesos llevados a cabo durante

el refinado es la destilación fraccionada,

en la cual los distintos componentes del

petróleo se separan en fracciones

utilizando sus distintos puntos de

ebullición [50].

Figura 2. Refinería Buenos Aires, Shell Compañía Argentina de Petróleo S.A.

Fuente: http://cointec.wordpress.com

La proporción de los distintos hidrocarburos (saturados, aromáticos, resinas,

asfaltenos, olefinas) varía en los distintos productos derivados del petróleo crudo.

Los principales productos que se pueden obtener por destilación del petróleo crudo

se detallan en la Tabla 1.

Tabla 1. Productos refinados del petróleo

Producto Composicióna Uso

Gas natural C1 – C4 Combustible doméstico e industrial

Éter de petróleo C5 – C7 Solvente

Gasolina C5 – C9 Combustible para autos

Nafta C9 – C10Solvente de pinturas, combustible para

autos

Kerosene C10 – C16 Combustible de aviones, estufas

Diesel C15 – C18 Combustible para automotores

Fuel oil C17 – C30 Combustible para barcos e industrias

Lubricantes C17 – C20 Lubricantes

Parafinas C20 – C28 Fabricación de velas, betún

Asfalto ≥ C30 Construcción de rutas

aLa composición de cada fracción se indica como la cantidad aproximada de átomos de carbono que contiene la mezcla. Tabla modificada de [50]

12 12


2- ¿CÓMO LLEGAN LOS HIDROCARBUROS AL MAR?

Se estima que aproximadamente 1,3 millones de toneladas de petróleo ingresan

anualmente al medio ambiente marino, tanto a partir de filtraciones de origen natural

como de fuentes de origen antropogénico [12]. Las filtraciones naturales constituyen

aproximadamente la mitad de este volumen, y ocurren cuando el petróleo crudo

emana naturalmente desde los estratos geológicos. Las fuentes de origen

antropogénico se encuentran principalmente asociadas a actividades de extracción,

transporte y consumo de petróleo, y pueden incluir tanto derrames de petróleo crudo

como de combustibles refinados [12]. Si bien los grandes derrames de petróleo

crudo concentran la atención pública, representan sólo 1/8 de los hidrocarburos que

son volcados al ambiente [109]. Sin embargo, al tratarse de incidentes puntuales en

donde se liberan grandes volúmenes de petróleo en un corto espacio de tiempo,

generalmente ocasionan graves consecuencias para el ecosistema costero [55,

106]. En cambio, la contaminación crónica por hidrocarburos es la que se encuentra

más extendida, en particular en cercanías de los puertos. Este tipo de contaminación

se caracteriza por la ocurrencia de pequeños derrames producidos durante las

operaciones de los barcos, a menudo como consecuencia de violaciones del

Convenio Internacional para Prevenir la Contaminación por los Buques (MARPOL,

www.pfri.uniri.hr/~rudan/MARPOL.pdf). Debido a la baja solubilidad en agua y a la

alta persistencia de muchos de estos compuestos, los niveles de contaminación por

hidrocarburos alcanzados en sedimentos crónicamente expuestos a estos derrames

pueden ser elevados [70].

¿QUÉ ES UN SEDIMENTO?

Se define como sedimento al material orgánico e inorgánico que se

encuentra en el fondo de un cuerpo de agua. Puede estar constituido en

distintas proporciones por arena, arcilla, grava, conchillas, material

orgánico en descomposición, entre otros materiales.

13 13

http://www.pfri.uniri.hr/%7Erudan/MARPOL.pdf


3- ¿QUÉ ACTIVIDADES PUEDEN INTRODUCIR HIDROCARBUROS EN LA COSTA PATAGÓNICA?

El litoral Patagónico es considerado una ecoregión marina prioritaria para su

conservación, debido a su extraordinaria biodiversidad y a su alta vulnerabilidad [75].

Algunas zonas costeras de la Patagonia son particularmente sensibles a la

presencia de sustancias contaminantes, como las áreas de cría de mamíferos y aves

marinas, las áreas de reproducción de peces y crustáceos, y los sitios de descanso y

alimentación de aves marinas migratorias (Figura 3). Por ejemplo, la contaminación

con petróleo produce mortalidad de aves marinas en la región [34], y aún pequeñas

concentraciones de petróleo son capaces de reducir el éxito reproductivo de aves

como el pingüino de Magallanes [32]. Por lo tanto, hidrocarburos introducidos al

ambiente a partir de actividades como la explotación y el transporte de petróleo, la

pesca y el turismo, pueden tener un impacto negativo sobre la diversidad biológica

de región, si estas actividades no son manejadas adecuadamente [5].

14 14


Flamencos en la playa de la ciudad de Puerto Madryn

ormoranes de cuello egro en la reserva Punta

obos marinos de un pelo, reserva

igura 3. Aves y mamíferos marinos en l

CnLoma, Provincia del Chubut

LPunta Loma, Provincia del Chubut F as costas Patagónicas. Fotos: los autores.

15 15


Actualmente, existen cinco cuencas productivas de hidrocarburos en la República

Argentina: Noroeste, Cuyana, Neuquina, Golfo San Jorge, y Austral o de

Magallanes. Dos de estas cuencas, San Jorge y Austral, realizan actividades

productivas cerca de la costa. El transporte de petróleo crudo desde estas zonas de

explotación hasta las zonas de procesamiento y refinerías (ubicadas en la provincia

de Buenos Aires), o hacia el mercado externo se realiza exclusivamente por mar

(Figura 4, [69]). El combustible refinado destinado al consumo local de la región

Patagónica también es a menudo transportado por mar. Tanto el transporte de

petróleo crudo como de combustibles refinados genera riesgos de contaminación del

ambiente marino costero, tanto como consecuencia de maniobras operacionales

como por accidentes [31]. Además de esta contaminación concentrada cerca de la

fuente de los hidrocarburos, también es posible encontrar zonas afectadas alejadas

del origen del contaminante. Esto puede producirse como consecuencia de su

transporte por efecto de los vientos y las corrientes marinas, pudiendo llegar a

impactar costas con mayor sensibilidad ecológica [13, 14]. Otra fuente potencial de

contaminación costera es la exploración y explotación de petróleo costa afuera

(offshore), como lo ha demostrado el derrame ocurrido en el Golfo de México en

2010. Actividades de este tipo también se realizan en la Plataforma Continental

Argentina, particularmente en la Cuenca Marina Austral frente a las costas de Tierra

del Fuego y en la boca del Estrecho de Magallanes [69]. Además, en 2008 comenzó

una nueva etapa en la exploración offshore en el Golfo San Jorge [48].

En los últimos años, se han llevado a cabo importantes esfuerzos para disminuir

la contaminación y conservar la biodiversidad de los ambientes marinos de la región

Patagónica. Con el propósito de proteger este ecosistema altamente productivo y

biodiverso, desde hace algunos años se han promulgado leyes nacionales de

protección del medio ambiente marino acordes a la normativa internacional.

Además, se han ratificado los convenios internacionales más importantes orientados

a prevenir la contaminación del mar con hidrocarburos [69]. Entre otras acciones,

Prefectura Naval Argentina estableció nuevas rutas marítimas más alejadas de la

costa para los buques que transportan hidrocarburos, designó zonas de protección

especial en el litoral argentino por su importancia ecológica o socioeconómica en

donde se prohíbe descargar hidrocarburos y otros desechos, y reglamentó la

16 16


documentación que deben portar los buques para certificar que cumplen con las

normas de seguridad (Ordenanzas Marítimas N° 13/98, 12/98 y 1/86,

respectivamente). Finalmente, se implementaron mejoras en las operaciones de

carga y descarga, como por ejemplo en la Cuenca del Golfo San Jorge se renovaron

boyas, mangueras, tuberías, sistemas de amarre y se instalaron sistemas de

telemetría para el control y seguridad de las operaciones [69]. A pesar de todas

estas medidas, existen zonas en las que se ha detectado contaminación con

hidrocarburos originados por actividades humanas [13, 15]. Además, en diciembre

de 2007 se produjo un importante derrame de petróleo crudo en Caleta Córdova,

Golfo San Jorge.

Figura 4. Cuencas petrolíferas productivas de Argentina. Los porcentajes corresponden a la cantidad de petróleo producido en cada cuenca. Las flechas indican los puntos de carga y descarga de petróleo crudo (flechas azules) y combustibles refinados (flechas rojas). Fuentes: CEARE, www.ceare.org, Secretaría de Energía de la República Argentina, www.energia.gov.ar y [69].

17 17


4- ¿CÓMO AFECTAN LOS HIDROCARBUROS AL ECOSISTEMA MARINO?

Los efectos de los hidrocarburos del petróleo sobre el medio ambiente marino

pueden ser de tipo agudo o crónico. La toxicidad aguda es el resultado de la

exposición a una alta concentración de los compuestos tóxicos durante un breve

período, como ocurriría luego de un derrame [82]. Los organismos con mayor riesgo

de sufrir las consecuencias de toxicidad aguda son las aves y los mamíferos

marinos, quienes están frecuentemente en contacto con la superficie del mar, que es

donde se encuentran mayormente localizados los hidrocarburos [81]. El

recubrimiento de las plumas de las aves y el pelaje de los mamíferos con el petróleo

ocasiona la pérdida de su capacidad de aislamiento, y puede provocar la muerte por

hipotermia. Además, existe riesgo de asfixia, ahogo e intoxicación por la ingestión de

los hidrocarburos. Por otra parte, cuando el petróleo impacta en la costa, las algas e

invertebrados bentónicos resultan muy afectados y pueden sufrir mortalidad masiva

(Figura 5).

Figura 5. Derrame de petróleo crudo ocurrido en Caleta Córdova, Chubut, el 26 de Diciembre de 2007. Las fotos muestran el estado de la playa 26 días (izquierda, Foto: Teo Nurnberg, www.maraustralis.com/a080121petrol.html) y 105 días (derecha, Foto: los autores) luego de ocurrido el derrame.

La toxicidad crónica, en cambio, ocurre como consecuencia de una exposición a

bajas dosis de los contaminantes durante períodos prolongados. Sus efectos

incluyen el retraso de la madurez sexual, la pérdida de la capacidad reproductiva, o

18 18

http://www.maraustralis.com/a080121petrol.html


el desarrollo de enfermedades como cáncer, disrupciones endócrinas,

malformaciones y anormalidades en el desarrollo de los organismos que habitan el

ecosistema contaminado [81]. Además, pueden observarse efectos indirectos, como

por ejemplo debido a la acumulación de los contaminantes a través de la cadena

trófica o la pérdida de hábitats [82]. En términos generales, los efectos tóxicos que

se observen tanto a corto como a largo plazo dependerán no sólo de la

concentración de los hidrocarburos, sino también de su composición y de los

procesos físicos y químicos que hayan ocurrido sobre los hidrocarburos luego del

derrame [12].

Figura 6. Efectos de la contaminación por hidrocarburos sobre los organismos marinos. Fotos: www.diariocero.com.ar, www.patagoniapyp.com (toxicidad aguda) y los autores (toxicidad crónica).

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La toxicidad crónica, en cambio, ocurre como consecuencia de una

exposición a bajas dosis de los contaminantes durante períodos prolongados de

tiempo (Figura 6). Sus efectos incluyen el retraso de la madurez sexual, la pérdida

de la capacidad reproductiva y otras disrupciones endócrinas, o el desarrollo de

enfermedades como cáncer, malformaciones y anormalidades en el desarrollo de los

organismos que habitan el ecosistema contaminado [81]. Además, los

contaminantes pueden acumularse a través de la cadena trófica cuando los

organismos se alimentan de otros que han tenido contacto con los hidrocarburos.

Por otra parte, los organismos pueden verse afectados por la pérdida de hábitats

asociada al derrame [82].

Debido a los efectos negativos de los contaminantes sobre el ecosistema

marino, varios países han generado guías de calidad ambiental que son utilizadas

como criterios de referencia para la identificación de sitios contaminados [9]. Estas

guías son desarrolladas a partir de datos experimentales en donde se estudia la

relación que existe entre la contaminación y la respuesta negativa de los organismos

ante el contaminante. Consideran, además, aspectos teóricos como las diferencias

que existen en disponibilidad para los seres vivos entre los distintos compuestos [9].

Estas guías son específicas para cada ambiente, por ejemplo, existen guías para

agua de mar y para sedimentos marinos. Además, consideran los posibles efectos

de cada compuesto químico en particular, indicándose los rangos de concentración

del contaminante en donde existiría una alta probabilidad de que ocurran efectos

biológicos adversos [11]. Sin embargo, la mayoría de estos criterios han sido

desarrollados en países y con especies biológicas del hemisferio norte, por lo que no

pueden predecir con exactitud la toxicidad de estos compuestos en especies locales,

por lo que sería conveniente desarrollar guías de calidad ambiental específicas para

los distintos ambientes de la Argentina.

20 20


5- ¿QUÉ EFECTO TIENEN LOS COMPONENTES DEL PETRÓLEO SOBRE LA SALUD DE LA POBLACIÓN?

Las guías anteriormente mencionadas intentan estimar la calidad del

ambiente, y son confeccionadas a partir de resultados obtenidos en estudios

toxicológicos realizados utilizando organismos indicadores, como por ejemplo

anfípodos [11]. Otras guías son desarrolladas para evaluar los riesgos que ocasiona

la exposición a compuestos contaminantes en el medio ambiente marino para la

salud humana. Por ejemplo, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados

Unidos ha reportado valores de referencia luego del derrame del Golfo de México

(www.epa.gov/bpspill/health-benchmarks.html#benchmarktable).

Uno de los posibles escenarios de exposición de la población a los

contaminantes en los ambientes costeros es el contacto con el agua y/o sedimento

(Figura 7). Algunas actividades pueden ser clasificadas como de alta exposición,

como por ejemplo la recolección manual de mariscos o actividades recreativas en la

playa, o de baja exposición, como por ejemplo los deportes náuticos [27, 95]. Las

vías de exposición principales consisten en el contacto dérmico y la ingestión

incidental, aunque existen otras vías posibles como por ejemplo la inhalación de

partículas o de compuestos volátiles. Un segundo escenario de exposición es el

consumo de peces y mariscos que utilizan como hábitat los ambientes

contaminados. En estos casos, la ingestión de compuestos tóxicos o carcinogénicos

puede ser significativa debido a fenómenos de bioacumulación en los tejidos del

animal [36]. Por último, un tercer escenario de exposición está dado por el personal

y los voluntarios involucrados en las actividades de limpieza ante un derrame de

importancia [8, 60].

Los distintos compuestos presentes en el petróleo crudo pueden representar

un riesgo para la población luego de un derrame. Los hidrocarburos monoaromáticos

y los hidrocarburos alifáticos de cadena corta son volátiles, por lo que representan

un riesgo de exposición inmediata por sus efectos tóxicos agudos. Los compuestos

orgánicos volátiles pueden causar depresión del sistema nervioso central, irritación

de las mucosas y la piel, y efectos sobre el sistema respiratorio incluyendo ataques

21 21

http://www.epa.gov/bpspill/health-benchmarks.html#benchmarktable


de asma [37, 98]. Sin embargo, los riesgos sobre la salud de la población son en

general bajos dado que estos compuestos tienen una vida media muy corta y no se

bioacumulan [37]. Por otra parte, el petróleo puede liberar sulfuro de hidrógeno, el

cual presenta efectos neurotóxicos a corto y largo plazo [98]. Los dispersantes

utilizados en la limpieza de un derrame contienen detergentes, surfactantes y

destilados del petróleo, los cuales pueden tener efectos irritantes del sistema

respiratorio [98]. Otros efectos a corto y mediano plazo causados por el derrame

están relacionados con la disrupción de las actividades y el estrés psicológico de la

población, en particular debido al efecto negativo sobre el modo de subsistencia de

la población afectada, por ejemplo las pesquerías artesanales [1]. En estudios

realizados en este aspecto, los efectos tendieron a disminuir con el tiempo y

dependieron del apoyo social y económico recibido [1].

Figura 7. Distintos escenarios de exposición de la población ante un derrame de hidrocarburos. Fotos: los autores, http://prensanetnoticias.com.ar y www.elcomodorense.net.

22 22


El mayor riesgo ante un derrame está representado por los efectos

toxicológicos de largo plazo, en particular debido a la ingesta de peces y moluscos

conteniendo compuestos tóxicos bioacumulados [98]. Los hidrocarburos

poliaromáticos (HAPs) son altamente persistentes y pueden bioacumularse en altas

concentraciones en moluscos. Estos compuestos pueden causar cáncer y efectos

reproductivos y sobre el desarrollo [37]. Además, el petróleo contiene trazas de

cadmio, mercurio y plomo, los cuales pueden acumularse en organismos acuáticos y

representar un riesgo a la población que los ingiere [98].

Los estudios realizados luego de grandes derrames de hidrocarburos han

mostrado evidencia de la existencia de una relación entre la exposición al petróleo

derramado y la aparición de efectos físicos, psicológicos, genotóxicos y endocrinos

en los individuos expuestos [1, 37]. En base a estos resultados, resulta necesario

que los protocolos de intervención incluyan la implementación de mecanismos para

detectar y controlar los efectos nocivos del derrame sobre la salud física y

psicológica de la población [1]. El uso de equipamiento protector y entrenamiento

adecuados resultan fundamentales para prevenir efectos nocivos sobre la salud de

las personas que participan de la limpieza del derrame [98]. Con respecto a la

comunidad residente, se debe evitar el contacto directo de la piel con el petróleo y el

agua contaminada, y debe prohibirse el consumo de peces y moluscos provenientes

de áreas contaminadas [1]. Dado que los compuestos más peligrosos (los HAPs)

son altamente persistentes, el monitoreo de su concentración en sedimentos y

organismos bentónicos debe realizarse con continuidad luego de producido un

derrame. De igual forma, debe evitarse el consumo de moluscos capturados en

cercanía de los puertos, y se deben realizarse controles periódicos de los niveles de

contaminación en sedimentos y biota en estos sitios crónicamente expuestos a la

contaminación.

23 23


6- ¿CUÁL ES LA RESPUESTA INMEDIATA ANTE UN DERRAME IMPORTANTE DE PETRÓLEO?

La mayoría de los derrames de hidrocarburos ocurren en aguas costeras o en

los puertos, y por lo tanto la contaminación de la costa es un evento altamente

probable luego de un derrame [40]. En estos casos, se desarrollan inmediatamente

planes de contingencia para reducir los daños ambientales [85]. Entre las estrategias

utilizadas, se incluyen distintos métodos físicos y/o químicos para contener, remover

o dispersar la mayor cantidad posible de los contaminantes (Figura 8). El tipo de

respuesta elegido depende, entre otros factores, del tiempo que ha pasado desde el

derrame, las condiciones del mar (calmo, agitado, helado), el tipo de hidrocarburos

derramados (liviano, medio, pesado) y el volumen del derrame [39]. Prácticamente

todos estos métodos presentan algún grado de impacto sobre el ambiente, por lo

que la selección del mismo representa un compromiso entre los efectos del petróleo

versus los efectos de las tecnologías de remediación utilizadas [40].

Las técnicas de contención son utilizadas para evitar la dispersión de los

hidrocarburos en la superficie del agua, por ejemplo por medio del uso de barreras

que representen un obstáculo para el desplazamiento de la mancha de petróleo [39].

Las barreras no sólo se utilizan para represar el derrame, sino además son de

utilidad para evitar la llegada de los hidrocarburos a áreas sensibles de la costa,

desviando el derrame hacia zonas menos sensibles. Parte del petróleo contenido

puede ser recuperado de la superficie del agua por medio del uso de recolectores

(skinners), que utilizan diferentes mecanismos, como por ejemplo la succión.

Figura 8 (página siguiente). Métodos de contención y recuperación utilizados en derrames de hidrocarburos. Fuentes, de arriba hacia abajo: news.discovery.com/tech/tech-used-clean-up-oil-spill.html, www.alaska.boemre.gov/kids/shorts/oilspill/oilspill.htm, www.elcomodorense.net, www.oilspillnews.net

24 24


25 25


Otra de las estrategias que se utilizan como método inmediato de respuesta ante un

derrame es el uso de dispersantes químicos. Esta estrategia ha sido utilizada por

más de cuarenta años, e incluso jugó un rol muy importante (aunque discutido) en

los esfuerzos de restauración del derrame ocurrido en el Golfo de México en el año

2010 [33, 40]. Estos compuestos químicos no son capaces de remover el petróleo,

sino que aceleran el proceso de dispersión natural favoreciendo la formación de

gotas pequeñas de petróleo. Estas pequeñas gotas son degradadas con mayor

facilidad por los microorganismos [39]. La efectividad de los dispersantes depende

de muchos factores. Por ejemplo, su eficiencia se incrementa con la temperatura, y

su actividad se ve afectada por la salinidad por lo que un dispersante desarrollado

para agua dulce no puede ser utilizado en el mar. Además, estos compuestos

actúan con mayor eficiencia sobre el petróleo liviano, en particular cuando son

aplicados inmediatamente luego de ocurrido el derrame [40]. A pesar de que los

dispersantes pueden jugar un papel importante acelerando los mecanismos

naturales de degradación de los hidrocarburos, pueden presentar también altas

toxicidades para el ambiente. Por lo tanto, debe evaluarse en cada caso en

particular si resulta conveniente utilizar dispersantes, el tipo y concentración del

dispersante a utilizar, y el ambiente donde será incorporado [33]. Dado que la

posible toxicidad del dispersante no puede ser predecida a partir de estudios

realizados en otros ambientes, es necesario contar con estudios toxicológicos

previos realizados a nivel local [47].

Figura 9. Mapa de sensibilidad de una sección del Área Natural Protegida Península Valdés. Fuente: http://atlas.ambiente.gov.ar.

26 26


La respuesta ante un derrame de hidrocarburos depende del tipo de costa, el

grado de exposición que esta presenta a las olas, la energía de la marea, las

condiciones ambientales, la cantidad y tipo de petróleo derramado, y la productividad

y sensibilidad biológica del ambiente impactado [40, 94]. El conocimiento de los

factores que determinan el comportamiento de los hidrocarburos permite estimar

cuáles serán los ambientes costeros más afectados ante una situación de derrame.

Los ambientes más vulnerables deberán recibir protección en forma prioritaria al

diseñar planes de contingencia apropiados para cada sitio. Parte de esta información

suele estar recopilada en mapas o atlas de sensibilidad ambiental, los cuales

constituyen una herramienta muy útil para la protección de los recursos costeros.

Con respecto a las costas del Mar Argentino, se dispone de un Atlas de Sensibilidad

Ambiental, que fue elaborado con la participación de más de 50 científicos, y fue

financiado por el Fondo para el Medio Ambiente Mundial (GEF)

(http://atlas.ambiente.gov.ar, Figura 9).

En particular, el tipo de costa es una variable de suma importancia al

momento de elegir un método de respuesta al evento de contaminación, debido a

que las características de la costa influyen sobre su sensibilidad a la contaminación

[71]. Las costas rocosas expuestas constituyen generalmente los ambientes menos

vulnerables. El oleaje de alta energía en estas costas remueve rápidamente el

petróleo depositado sobre las rocas, favoreciendo su dispersión en el mar y por lo

tanto aumentando su velocidad de biodegradación [40]. En general, estos sitios

requieren de menos tareas de limpieza porque la persistencia de los hidrocarburos

en la costa suele ser breve. Por otra parte, las marismas, los manglares y los

arrecifes de coral representan los ambientes más vulnerables ante un evento de

contaminación [40]. En zonas de marismas y manglares, por ejemplo, el petróleo se

adsorbe a las partículas que se encuentran en suspensión en la columna de agua, a

los tallos y raíces de la vegetación y a los sedimentos, y la baja energía de estas

costas dificulta su remoción [71]. Entre las costas rocosas y los arrecifes de coral

existe una amplia variedad de costas con distintos grados de sensibilidad y posibles

respuestas ante un evento de contaminación [94].

27 27

http://atlas.ambiente.gov.ar/


7- ¿QUÉ OCURRE CON EL PETRÓLEO UNA VEZ QUE LLEGA AL MAR?

Cuando el petróleo es liberado en el medio ambiente marino, sufre

inmediatamente una serie de cambios físicos, químicos y biológicos denominados

intemperización (o weathering, en inglés). Estos procesos pueden alterar

significativamente la composición del petróleo y por lo tanto la efectividad de las

respuestas ante el derrame. Por lo tanto, las estrategias de remediación ambiental

deben contemplar dichos fenómenos [109]. Entre ellos, algunos de los más

importantes son la evaporación, la disolución, la fotooxidación, la dispersión, la

emulsificación y la biodegradación, los cuales se ilustran en la Figura 10 [12]. La

evaporación es responsable de la eliminación de la mayoría de los compuestos de

bajo peso molecular. La importancia de este proceso depende en gran medida de

las características del petróleo derramado y de las condiciones ambientales

existentes [16]. La disolución en agua es importante para que los procesos de

biodegradación ocurran eficazmente, pero también es responsable de la toxicidad de

estos compuestos para los organismos acuáticos. Los compuestos que presentan

una baja solubilidad en agua, como por ejemplo los HAPs de alto peso molecular,

tienden a adherirse a las partículas y de esta manera permanecen en el agua o en

los sedimentos [16]. La fotooxidación es un proceso por el cual los compuestos

complejos como los HAPs de alto peso molecular y compuestos polares sufren

descomposición por radicales libres a partir de la luz solar. La fotooxidación lleva a la

formación de compuestos más simples, incrementando su solubilidad y su

biodegradabilidad, pero también aumentando su toxicidad [54]. Por otro lado, la

dispersión da como resultado la formación de emulsiones de petróleo en agua, las

cuales favorecen su biodegradación por aumento de la superficie de contacto con

los microorganismos. Estas mezclas no son estables, pero pueden ser mantenidas

por agitación o el agregado de dispersantes químicos. Por el contrario, la

emulsificación es la formación de emulsiones agua en petróleo (comúnmente

llamdas chocolate mousses), las cuales afectan negativamente las operaciones de

limpieza y la tasa natural de biodegradación.

28 28


Figura 10. Comportamiento del petróleo en el medio ambiente. Modificado a partir de [109].

8- ¿QUÉ ROL TIENEN LOS MICROORGANISMOS EN LOS PROCESOS NATURALES DE RESTAURACIÓN AMBIENTAL?

Uno de los procesos más importantes de intemperización que ocurren cuando

ingresa el petróleo al medio

ambiente marino es su

biodegradación (Figura 10). La

biodegradación de los

componentes del petróleo crudo

ocurre como consecuencia de su

utilización por parte de los

microorganismos como sustrato

de crecimiento, lo cual posibilita

su eliminación del ambiente

contaminado [41]. Como

consecuencia de este proceso,

estas moléculas son a menudo

29 29

¿QUÉ ES UNA COMUNIDAD

MICROBIANA?

Los microorganismos, al igual que los seres

vivos macroscópicos, forman comunidades

dentro de los ecosistemas naturales, es

decir, conviven en un hábitat en particular

e interaccionan entre sí. Algunas de estas

interacciones ecológicas son beneficiosas

para los mismos, pero los microorganismos

también pueden sufrir interacciones

antagonísticas como por ejemplo la

competición por un mismo recurso, o la

predación de un microorganismos sobre

otro [56].


transformadas completamente en los compuestos inocuos dióxido de carbono y

agua. Sin embargo, la degradación completa no siempre resulta posible, y en

particular, algunos compuestos pueden ser muy difíciles de degradar, como por

ejemplo los hidrocarburos de alto peso molecular.

Dado que existe una gran variedad de compuestos en el petróleo crudo, se

requiere de distintas poblaciones de microorganismos para poder degradarlos [16].

La biodegradación del petróleo crudo es el resultado de la acción combinada de una

parte importante de la comunidad microbiana que habita el medio ambiente

contaminado, y muchos microorganismos se ven beneficiados tanto directa como

indirectamente por estos compuestos [21]. Las comunidades de microorganismos

pueden ser muy complejas, es decir estar formadas por miles de organismos

diferentes, como es el caso de los sedimentos marinos. En un ambiente prístino, se

encuentran presentes distintos microorganismos capaces de degradar las sustancias

contaminantes, si bien son muy poco abundantes [16]. Cuando ocurre un derrame

de petróleo, las poblaciones microbianas que tienen la capacidad de utilizar

hidrocarburos como sustrato para su crecimiento proliferan rápidamente [41] (Figura

11 - 1). Algunas de estas poblaciones pueden liberar compuestos biosurfactantes,

los cuales actúan en forma similar a un detergente solubilizando los compuestos

contaminantes. Esto facilita la biodegradación de los hidrocarburos al encontrarse

más fácilmente disponibles para su degradación (biodisponibles). Los

biosurfactantes no sólo favorecen a las poblaciones que los producen, sino también

a otras poblaciones degradadoras de hidrocarburos dentro de la misma comunidad

microbiana (Figura 11 - 2). El tamaño que pueden alcanzar las poblaciones

microbianas que degradan los componentes del petróleo se encuentra limitado por

distintos procesos. Entre los más importantes se encuentran la predación que sufren

estas poblaciones por parte de protozoos y la lisis de las mismas producida por virus

(Figura 11 - 3). Además, concentraciones limitantes de oxígeno y nutrientes (Figura

11 - 4) y la baja biodisponibilidad de los hidrocarburos pueden afectar el tamaño de

las poblaciones degradadoras y su actividad. Durante el proceso de degradación,

algunos microorganismos pueden generar compuestos intermediarios de la

degradación de los hidrocarburos, que pueden ser utilizados por otras poblaciones

de microorganismos (Figura 11 - 5). Cuando el sustrato de crecimiento se acaba, la

abundancia de estas poblaciones disminuye rápidamente [41]. Las poblaciones de

30 30


microorganismos que se encuentran relacionadas con la biodegradación de

hidrocarburos no afectan la salud humana.

• Métodos dependientes del cultivo: se cultivan los

microorganismos en el laboratorio, y posteriormente

aquellos que pueden ser cultivados se estudian en detalle

• Métodos independientes del cultivo: los microorganismos se

analizan por medio del estudio de sus biomoléculas,

utilizando metodologías de la biología molecular

Existen dos tipos de estrategias para estudiar a los microorganismos

ambientales:

¿QUÉ ES LA MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL?

La microbiología ambiental es la disciplina científica que se ocupa del

estudio de los microorganismos que habitan los ambientes naturales

o aquellos intervenidos por el hombre, como por ejemplo los barros

activados de las plantas de tratamiento de efluentes. Esta disciplina

estudia la diversidad de estas comunidades, cómo interaccionan los

microorganismos entre sí, y los distintos procesos de los cuales

forman parte.

¿CÓMO SE ESTUDIAN LOS MICROORGANISMOS AMBIENTALES?

31 31


Figura 11. Biodegradación de petróleo crudo por una comunidad microbiana. 1- Microorganismos degradando componentes del petróleo; 2- microorganismos productores de biosurfactantes; 3- depredación por protozoos y lisis por virus; 4- compuestos esenciales para el crecimiento de los microorganismos: C (carbono), N (nitrógeno), P (fósforo), O2 (oxígeno); 5- microorganismos consumiendo productos de degradación de los hidrocarburos (la flecha indica flujo de materia entre los microorganismos). Modificado de [41].

En ambientes que han estado expuestos a los hidrocarburos, la respuesta de

las poblaciones degradadoras de hidrocarburos ante un derrame es más rápida con

respecto a sitios prístinos. Esto es debido a que los sitios previamente impactados

contienen una comunidad de bacterias degradadoras establecida y diversa, la cual

es capaz de responder más rápidamente ante el derrame [16]. Se han aislado a

partir del medio ambiente marino distintos microorganismos capaces de degradar

hidrocarburos. Algunos de ellos utilizan hidrocarburos en forma casi exclusiva, por

ejemplo los géneros bacterianos Alcanivorax, Cycloclasticus u Oleispira [108].

Bacterias pertenecientes a los géneros Alcanivorax y Cycloclasticus han sido

detectadas en distintos ambientes marinos impactados con petróleo alrededor del

mundo, por lo que se ha sugerido que estos microorganismos serían relevantes para

32 32


la remoción de hidrocarburos alifáticos y aromáticos, respectivamente [41]. En

cambio, otros microorganismos aparentan estar restringidos a determinados

ambientes, como por ejemplo Oleispira antarctica, la cual hasta el momento sólo ha

sido hallada en ambientes fríos [38, 108].

Figura 12. Estrategias dependientes e independientes del cultivo para el estudio de los microorganismos ambientales.

A pesar de los grandes avances en el conocimiento logrados en las últimas

décadas, existen aún muchos interrogantes sobre qué microorganismos son los más

relevantes ecológicamente para la degradación de hidrocarburos en el medio

ambiente marino, qué mecanismos utilizan para degradarlos, y cuáles son los

factores que limitan la velocidad de biodegradación de estos compuestos. Esta

información es fundamental para poder predecir el comportamiento de estas

poblaciones microbianas ante un derrame de petróleo. Sin embargo, aún existe

mucho por conocer con respecto a los microorganismos degradadores de

33 33


hidrocarburos del medio ambiente marino. Existen dos tipos de estrategias que

pueden ser utilizadas para su estudio (Figura 12). La primera es cultivarlos en el

laboratorio utilizando medios de cultivo con el agregado de hidrocarburos como

fuente de carbono y energía. Una vez aislados, estas cepas son estudiadas en

detalle con el fin de identificarlas, conocer qué tipo de hidrocarburo pueden

degradar, sus requerimientos nutricionales, etc. Sin embargo, la mayoría de los

microorganismos no pueden ser cultivados en el laboratorio [17]. Por lo tanto, a

menudo se recurre al uso de métodos independientes del cultivo de

microorganismos, por medio del estudio de las biomoléculas presentes en los

microorganismos, por ejemplo ADN, ARN o proteínas. En el Anexo 1 se describen

estas dos estrategias con mayor detalle.

9- ¿QUÉ SE CONOCE DE LOS MICROORGANISMOS QUE DEGRADAN HIDROCARBUROS EN LA COSTA PATAGÓ

NICA?

Existen varios grupos de investigación

que han realizado estudios enfocados en los

microorganismos que degradan hidrocarburos y

las comunidades de microorganismos de las

cuales éstos forman parte en ambientes marinos

de la Patagonia. La Figura 13 muestra los sitios

que han sido estudiados hasta el momento

(puntos rojos). Si comparamos los sitios

analizados con la gran extensión del Mar

Patagónico, vemos que es muy poco lo que se

conoce sobre estos ambientes hasta el

momento. Además, estos estudios rara vez

analizaron los cambios que ocurren en un sitio a

lo largo del tiempo, o las variaciones que

existen en el espacio. Otro punto que

resulta evidente en la Figura 13 es que

todos los sitios estudiados se encuentran

localizados cercanos a la costa. Esto se

debe principalmente a la facilidad que

Figura 13. Sitios de la costa Patagónica en donde se han realizado estudios de las comunidades microbianas o de las poblaciones de microorganismos degradadores de hidrocarburos. Fuente de la imagen: www.marpatagonico.org.

34 34


existe para la obtención de muestras en estos ambientes. Sin embargo, es

importante conocer a los microorganismos que habitan los distintos ambientes del

Mar Patagónico, dado que los mismos son fundamentales para el funcionamiento del

ecosistema marino Patagónico. Por ejemplo, los microorganismos representan hasta

el 90% de la biomasa en los océanos, llevan a cabo la mitad de la producción

primaria del planeta (como por ejemplo la fotosíntesis), influencian la composición de

la atmósfera, tienen un rol importante en la regulación de nuestro clima, y presentan

un rol clave en el reciclado de nutrientes y en la capacidad para eliminar las

sustancias contaminantes del ambiente. En consecuencia, los microorganismos que

habitan estos ecosistemas cumplen funciones que redundan en beneficios tanto

directos como indirectos para el ser humano [18]. Debido a su importancia, resulta

de gran interés el conocer el efecto de disturbios ambientales, como por ejemplo la

contaminación por hidrocarburos, sobre las comunidades de microorganismos y los

procesos esenciales que ellas llevan a cabo [110]. Además, es de interés conocer

cómo estas comunidades de microorganismos pueden ayudar a disminuir dicho

impacto, por ejemplo mediante su participación en la biodegradación de compuestos

contaminantes.

Comunidades microbianas

Recientemente se ha realizado un censo mundial de microorganismos

marinos (http://icomm.mbl.edu/), en el marco de la iniciativa internacional del Censo

de la Vida Marina (http://www.coml.org). El objetivo de este censo fue estudiar

quienes son y cómo se distribuyen los microorganismos en los distintos ambientes

marinos del mundo, y se basó en el uso de metodologías independientes del cultivo

de microorganismos. En total se analizaron más de 1.200 muestras de todo el

mundo, incluyendo muestras de la costa patagónica. Este censo mostró que los

microorganismos que habitan en los océanos son extremadamente diversos. Entre

los distintos tipos de microorganismos que componen una comunidad microbiana,

las bacterias son las que presentan una mayor diversidad. Por ejemplo, se estima

que un litro de agua de mar podría tener 20.000 bacterias diferentes, y sólo un

gramo de sedimento podría contener entre 5.000 y 19.000 tipos de bacterias

(www.comlmaps.org/mcintyre/ch12). La diversidad de arqueas y de protistas sería

aproximadamente diez veces menor. Los estudios también mostraron que mientras

algunos tipos de bacterias son muy abundantes, la gran mayoría de ellos se

35 35

http://icomm.mbl.edu/

http://www.coml.org/

http://www.comlmaps.org/mcintyre/ch12


encuentran en muy bajas proporciones. En uno de los trabajos publicados a partir de

este censo, se compararon las bacterias presentes en más de 500 muestras de

distintos ambientes marinos del mundo, incluyendo 6 de la costa Patagónica [110].

En este estudio se encontró que los tipos de bacterias que habitan el agua de mar

en ambientes similares, aunque distantes geográficamente, eran remarcablemente

similares [110]. Por el contrario, las bacterias presentes en los sedimentos resultaron

ser más diferentes entre sí, en particular aquellas que habitan los ambientes

costeros. Esto es probablemente debido a que las costas reciben múltiples

influencias desde el ambiente terrestre, las cuales son particulares de cada sitio.

Las bacterias de sedimentos intermareales tanto prístinos como

contaminados con hidrocarburos de la costa Patagónica fueron estudiadas como

parte de esta iniciativa internacional [38, 62, 65]. Los sedimentos intermareales son

aquellos que se encuentran cubiertos durante la marea alta y descubiertos en marea

baja. En este estudio, se estimó que existen miles de géneros bacterianos en los

sedimentos intermareales de Patagonia, y se identificaron los grupos de bacterias

más abundantes [62]. En general, los sedimentos contaminados con hidrocarburos

tanto de Caleta Córdova (Chubut) como de Bahía Ushuaia (Tierra del Fuego)

presentaron una alta proporción de géneros bacterianos relacionados con la

biodegradación aeróbica de hidrocarburos, en comparación con sedimentos prístinos

obtenidos en el área natural protegida Península Valdés [62]. Sin embargo, el resto

de la comunidad bacteriana de sitios de la costa Patagónica crónicamente

impactados por la contaminación con hidrocarburos no varió drásticamente con

respecto a aquella de sitios prístinos [62]. Estos resultados sugieren que la función

de la comunidad no se ve impactada profundamente por la exposición constante a

bajas o moderadas concentraciones de hidrocarburos. Por el contrario, en los

sedimentos impactados por un derrame de petróleo crudo de importancia, se

observó un efecto drástico sobre la comunidad como consecuencia de la

contaminación. No sólo se detectó un menor número de tipos de bacterias en el

sedimento (disminución de la riqueza de especies), sino que además la comunidad

se encontraba dominada por bacterias pertenecientes a unos pocos géneros, en

particular Psychromonas y Vibrio [62]. Ambos géneros han sido asociados directa o

indirectamente a la contaminación por hidrocarburos.

36 36


37 37

• La concentración de sal puede aumentar debido a la evaporación del agua atrapada durante la marea baja

• Están expuestos a grandes cambios de temperatura

• En altas latitudes, estos organismos pueden sufrir alta exposición a la luz ultravioleta debido a la disminución de la capa de ozono de la atmósfera

• Sufren la acción de las olas, por lo que pueden ser desprendidos por la acción de las mismas

• Se encuentran rodeados de agua sólo en forma intermitente

Debido a los cambios en la altura del mar, los organismos que viven en la zona intermareal (ya sea microorganismos o macroorganismos), deben estar adaptados a sobrevivir bajo distintas condiciones adversas:

Punta Cuevas, Chubut

La zona intermareal (que significa zona “entre mareas”), también llamada zona litoral, es el área de la costa que se encuentra expuesta al aire durante la marea baja, y sumergida durante la marea alta. Por encima de la zona intermareal se encuentra la zona supralitoral, y por debajo la zona infralitoral, la cual nunca queda expuesta.

LA ZONA INTERMAREAL

• Marea baja o bajamar, es el momento en el que el mar alcanza su menor altura

• Marea alta, también llamada pleamar, es el momento en que el mar alcanza su máxima altura dentro del ciclo de las mareas

Las mareas son los cambios periódicos que sufre el nivel del mar, debidos a la acción gravitatoria que ejercen la Luna y el Sol sobre el agua de mar. El agua de mar está también expuesta a una fuerza centrífuga, que se produce como resultado del movimiento de rotación de la Tierra. El nivel del agua de mar es por lo tanto el resultado de la combinación de estas dos fuerzas, la fuerza gravitatoria y la fuerza centrífuga. La altura del mar cambia en forma periódica, dado que las mareas altas y las mareas bajas se alternan en un ciclo continuo que se repite dos veces cada casi 25 hs.

LAS MAREAS


Con respecto al agua de mar, investigadores de India y Francia estudiaron las

comunidades bacterianas en Bahía Ushuaia [83]. El objetivo de este estudio fue

evaluar los efectos de compuestos químicos tóxicos provenientes de actividades

humanas sobre este ambiente Subantártico. En este trabajo se estudiaron los

efectos de los hidrocarburos solubles en agua sobre la diversidad bacteriana del

agua de mar [83]. Los grupos mayoritarios de microorganismos encontrados en este

estudio coincidieron a grandes rasgos con aquellos encontrados en el estudio a nivel

global anteriormente mencionado [110]. Sin embargo, la composición de la

comunidad bacteriana del agua de mar cambió significativamente luego de una

exposición de sólo cinco días a la fracción soluble en agua de los hidrocarburos [83].

Un estudio reciente realizado utilizando sedimentos intermareales crónicamente

contaminados con hidrocarburos de Bahía Ushuaia también mostró una rápida

respuesta de la comunidad bacteriana ante un evento de contaminación con petróleo

crudo en experimentos de laboratorio, y una rápida biodegradación de estos

compuestos [38]. La rápida capacidad de respuesta de estas comunidades

microbianas de Bahía Ushuaia está probablemente relacionada con la exposición

crónica a hidrocarburos que sufre este ambiente, como consecuencia de una gran

actividad de buques y la operación de la planta de almacenamiento de combustibles

Orión [15, 28].

Al contrario de lo que ocurre en los sedimentos intermareales, es común que

en los sedimentos localizados por debajo de la línea de marea baja (sedimentos

submareales o infralitorales) el oxígeno se encuentre limitado, salvo en una pequeña

capa en la superficie de la columna del sedimento. Esto es debido a la falta de

contacto de los sedimentos profundos con el oxígeno presente en el agua de mar.

Además, dado que están expuestos a una menor energía de las olas en

comparación con los ambientes intermareales, estos sedimentos se oxigenan

pobremente. La disponibilidad de oxígeno es un factor es muy importante que afecta

los procesos biodegradativos, dado que la biodegradación anaeróbica de

hidrocarburos es un proceso mucho más lento con respecto al que ocurre en

presencia de oxígeno [16]. Otro factor limitante son las bajas temperaturas, ya que

afectan la actividad microbiana y disminuyen tanto la biodisponibilidad como la

solubilidad de los hidrocarburos. En consecuencia, tanto las bajas temperaturas

38 38


como la ausencia de oxígeno en el sedimento incrementan el tiempo de residencia

de los hidrocarburos en el ambiente [6].

Debido a la gran dificultad que existe para cultivar a los microorganismos

anaeróbicos, la biodegradación de hidrocarburos en condiciones anaeróbicas se

encuentra muy poco estudiada. Las comunidades microbianas que habitan los

sedimentos costeros infralitorales de dos sitios crónicamente contaminados de Bahía

Ushuaia (Muelle Comercial y Muelle de la planta de almacenamiento de

combustibles Planta Orión) están siendo estudiadas en profundidad utilizando

métodos independientes del cultivo de microorganismos [22]. Este proyecto tiene

como objetivo conocer el efecto de la contaminación crónica de hidrocarburos sobre

las comunidades microbianas de ambientes costeros de distintas regiones frías del

mundo. Las otras regiones que están siendo analizadas con este proyecto,

financiado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos (Community

Sequencing Program, Joint Genome Institute), son la Península Antártica, el Mar

Báltico (Suecia) y el Archipiélago Svalbard (Noruega). Se intenta conocer, por

ejemplo, qué microorganismos estarían degradando los hidrocarburos, y qué vías

degradativas serían utilizadas en este proceso. Al estudiar en forma comparativa

sitios expuestos a un tipo similar de contaminación pero separados entre sí por

grandes distancias geográficas, se puede obtener información más general sobre

estos procesos que luego puede ser aplicada a otros sitios de las mismas

características. Los resultados obtenidos en este proyecto sugieren que la

biodegradación de hidrocarburos en sedimentos costeros infralitorales es llevada a

cabo por bacterias anaeróbicas sulfato reductoras pertenecientes a la clase

Deltaproteobacteria [22]. Estas bacterias alcanzaron las mayores concentraciones,

de entre todos los sitios analizados, en cercanías del muelle de la planta de

almacenamiento de combustibles Orión, en Bahía Ushuaia [22].

Capacidad biodegradativa de las comunidades microbianas

Una forma de estudiar la capacidad que presentan las comunidades

microbianas para degradar hidrocarburos es evaluar dicha capacidad en el

laboratorio. Esto se realiza midiendo la disminución de la concentración de los

hidrocarburos agregados artificialmente o evaluando la liberación de dióxido de

carbono. Olivera y colaboradores [73] estudiaron la biodegradación de alcanos por

parte de comunidades microbianas de un sitio prístino (Golfo Nuevo) y contaminado

39 39


con hidrocarburos (Golfo San Jorge). En este estudio, la comunidad microbiana de

los sedimentos expuestos a la contaminación con hidrocarburos presentó una mayor

capacidad degradativa que la comunidad de los sedimentos prístinos, sugiriendo que

los sedimentos del Golfo San Jorge se encontraban enriquecidos en

microorganismos degradadores de hidrocarburos. Estos resultados concuerdan con

los reportados por Pucci y colaboradores [86-88], en donde se muestra un alto

potencial de degradación de hidrocarburos de las comunidades microbianas de

sedimentos y agua de mar de Comodoro Rivadavia y Caleta Córdova, Golfo San

Jorge. Un aspecto interesante de estos estudios está relacionado con el efecto de la

época del año sobre la capacidad degradativa. Los autores reportan una mayor

capacidad degradativa de estas comunidades en las estaciones templadas, con

respecto al invierno en donde la capacidad degradativa fue menor [86-88]. En un

estudio similar, Pucci y colaboradores [86] estudiaron la mineralización de

hidrocarburos un año antes del derrame de diciembre de 2007, y en una serie

temporal hasta 164 días luego del derrame. Cuatro días luego de ocurrido el

derrame, las velocidades de mineralización encontradas para los distintos

hidrocarburos evaluados (gas oil, diesel y aceite lubricante) fueron aproximadamente

el doble de las observadas un año antes del derrame, y dichas velocidades se

redujeron a los valores previos 164 días luego de ocurrido el derrame [86].

Microorganismos degradadores de hidrocarburos - Métodos dependientes del cultivo

Si bien sólo una pequeña parte de la comunidad microbiana puede ser

cultivada en el laboratorio, los métodos dependientes del cultivo permiten examinar

en detalle las rutas degradativas utilizadas por estos microorganismos y evaluar sus

estrategias de subsistencia bajo las condiciones altamente desfavorables que

ocurren en un derrame. Por lo tanto, esta estrategia provee de información

fundamental que no sólo complementa aquella obtenida por métodos independientes

del cultivo, sino que constituye la base para su análisis. Por otra parte, las cepas

microbianas o consorcios obtenidos pueden presentar numerosas aplicaciones

biotecnológicas, tanto en el área ambiental como industrial. Algunas de las

aplicaciones más prometedoras de estos microorganismos incluyen el tratamiento de

sustancias contaminantes en bioreactores y las aplicaciones de sus enzimas en

procesos industriales. En consecuencia, la búsqueda de actividades de interés en

40 40


microorganismos de ambientes costeros de la Patagonia presenta un gran potencial,

el cual se encuentra mayormente inexplorado [24, 25].

Hasta el momento se han aislado varias cepas bacterianas capaces de

degradar hidrocarburos a partir de ambientes costeros de la Patagonia. La cepa

Bacillus subtilis O9, aislada a partir de sedimentos del puerto de San Antonio Oeste,

Provincia de Río Negro, Argentina, presenta la capacidad de producir un compuesto

biosurfactante denominado surfactina [68]. Este compuesto tensoactivo fue capaz de

incrementar la degradación de residuos de sentina de buques, en particular de

alcanos de cadena larga, en experimentos a escala de laboratorio [68]. De igual

manera, en estudios realizados en tanques de 20 L de volumen localizados al aire

libre, el agregado de este biosurfactante mostró una importante disminución en el

tiempo requerido para alcanzar altas velocidades de degradación [72]. Dado que

este biosurfactante puede ser producido de forma relativamente simple y económica,

representa una alternativa prometedora para el tratamiento de residuos conteniendo

altas concentraciones de hidrocarburos. En el año 2006 se inició un estudio

interdisciplinario que involucró a laboratorios localizados en tres instituciones,

CENPAT (Puerto Madryn), CRIDECIT (Comodoro Rivadavia) y PROIMI (San Miguel

de Tucumán), con el fin de estudiar los niveles de contaminación y caracterizar a las

poblaciones bacterianas degradadoras de hidrocarburos de la costa Patagónica.

Para este estudio se eligió como sitio de muestreo la Península Aristizábal, área de

alta diversidad biológica y productividad ubicada al norte del Golfo San Jorge. En un

muestreo realizado en el año 1995 se había observado una importante

contaminación con hidrocarburos en esta península. De hecho, en ese momento

esta zona presentaba las mayores concentraciones de hidrocarburos de la costa

Patagónica [14]. Esta zona constituye un área de acumulación de distintos residuos

(entre ellos hidrocarburos), probablemente debido al transporte de los mismos por

acción del viento y de las mareas (Figura 14). Los hidrocarburos que llegan a esta

zona posiblemente provengan de derrames ocasionados durante las actividades de

carga de petróleo crudo en Comodoro Rivadavia y Caleta Córdova, o durante el

transporte del petróleo [14, 29]. Las muestras obtenidas en esta zona fueron

analizadas en los distintos laboratorios involucrados en este proyecto, utilizando

diversas herramientas de estudio. El análisis químico de los sedimentos determinó

que, si bien existían hidrocarburos intemperizados en las playas de la península

41 41


Aristizábal (Figura 14), los niveles de contaminación por hidrocarburos en

sedimentos intermareales de esta zona habían disminuido considerablemente desde

el último estudio [29, 58]. A pesar de las bajas concentraciones de hidrocarburos, en

el marco de este proyecto se aislaron diversas cepas microbianas degradadoras de

hidrocarburos con interesantes propiedades.

Figura 14. Península Aristizábal, en el norte del Golfo San Jorge. Arriba, izquierda, acumulación de residuos en la costa; arriba, derecha, rocas con hidrocarburos intemperizados, abajo, detalle de rocas con hidrocarburos. A partir de esta región, se obtuvieron aislamientos microbianos degradadores de hidrocarburos y productores de biosurfactantes. Fotos: los autores.

En una de las líneas de trabajo de este proyecto interinstitucional, se

seleccionaron los aislamientos microbianos degradadores de hidrocarburos por su

habilidad para producir biosurfactantes [74]. De las 96 cepas aisladas en este

estudio, 5 fueron capaces de disminuir la tensión superficial debido a la producción

de biosurfactantes. Tres de ellas pertenecían al género Alcanivorax, y las otras dos a

los géneros Cobetia y Halomonas. En este trabajo se identificaron además los genes

que codifican para enzimas de las rutas degradativas de hidrocarburos. Cuando

estas cepas fueron analizadas con más detalle se evidenció que dos de los

aislamientos pertenecientes al género Alcanivorax se encontraban formando

consorcios con otro microorganismo [74]. En el consorcio formado por Pseudomonas

putida PA1 y Alcanivorax sp. PA2 (Figura 15), el modo de acceso al hidrocarburo fue

la adhesión de la cepa PA2 a las gotas del compuesto contaminante durante la fase

exponencial de crecimiento. A partir de la fase exponencial tardía el biosurfactante

42 42


es secretado al medio de cultivo, permitiendo la disociación de este microorganismo

de la gota de hidrocarburo. La cepa PA1 presentó la habilidad de degradar todos los

hidrocarburos evaluados, si bien no fue capaz de adherirse a los mismos, y no

produjo biosurfactantes [74]. Se evaluó además para este consorcio la capacidad de

formar biofilms sobre distintos soportes sólidos [93]. Debido a las capacidades

degradativas de estos consorcios, como así también la habilidad de formar

agregados celulares y de sintetizar biosurfactantes, los mismos podrían presentar

gran utilidad en diversas aplicaciones biotecnológicas.

Figura 15. Microscopía electrónica de barrido mostrando el consorcio conformado por Alcanivorax sp. PA2 y Pseudomonas putida PA1 [74]. Fuente de la foto: Nelda Olivera.

Una segunda línea de trabajo consistió en el aislamiento de bacterias marinas

degradadoras de hidrocarburos en base a su capacidad de producir y acumular

lípidos [96]. Generalmente, los microorganismos que presentan esta característica

tienen la ventaja de poder degradar las sustancias contaminantes bajo condiciones

nutricionales adversas, transformando a los productos de degradación en lípidos

intracelulares que se almacenan en forma de gránulos. Estos productos presentan

un gran valor biotecnológico, ya que pueden ser útiles para aplicaciones en la

industria química, de biocombustibles y cosmética, entre otras. Entre las cepas

aisladas en este estudio, la bacteria Cobetia sp. PC412 resultó la más promisoria.

Esta cepa degrada hidrocarburos alifáticos (hexadecano, escualeno), poliaromáticos

(naftaleno, fenantreno, antraceno y fluoreno) y mezclas como el gasoil. Además, es

capaz de acumular hasta un 23% de su peso seco en lípidos en condiciones

43 43


limitantes de nitrógeno [96]. Esta cepa posee interesantes características para su

aplicación en biotecnología ambiental debido a su capacidad de degradar

hidrocarburos, de transformar sustratos en lípidos celulares y de mantenerse activas

en un rango amplio de condiciones ambientales.

En otro estudio, se aislaron cepas bacterianas con capacidad para crecer en

presencia de los HAPs naftaleno, fenantreno o pireno como única fuente de carbono

y energía a partir de sedimentos costeros provenientes de distintos sitos a lo largo

de la costa Patagónica. Los sitios elegidos fueron el Puerto de Rawson, y muelles de

Puerto Madryn, Caleta Córdova y Bahía Ushuaia. Las cepas aisladas fueron

identificadas por medio de la

secuenciación del gen ARNr 16S. Se

encontraron cepas pertenecientes a

una variedad de géneros bacterianos,

por ejemplo Citreicella, Bacillus,

Lutibacterium, Oceanisphaera,

Pseudomonas, Halomonas, Cobetia,

Brachybacterium, Brevibacterium,

Marinobacter, Marinomonas,

Salinibacterium, Nocardioides y

Sporosarcina [44, 51, M. Ferrero,

comunicación personal]. En particular,

la cepa Pseudomonas plecoglossicida

J26 fue aislada a partir de sedimentos

costeros de la ciudad de Rawson,

provincia del Chubut, por medio de un

enriquecimiento selectivo con

naftaleno como sustrato de

crecimiento [66]. Esta cepa presentó

la capacidad de formar biofilms bajo condiciones de estrés [78]. Se utilizaron

sustancias extraídas a partir de la semilla de una planta para mimetizar este efecto.

Estas sustancias de origen vegetal no sólo promovieron la formación de biofilm, sino

además incrementaron la biodegradación de naftaleno. En consecuencia, el uso de

las mismas como promotoras de la formación de biofilm de la cepa en estudio

¿QUÉ ES UN BIOFILM?

Un biofilm es una forma de

crecimiento celular en el cual las

células crecen unidas a una

superficie y embebidas en una

matriz producida por ellas mismas.

En este estado, estas células se

encuentran protegidas de los

distintos factores de estrés. Por lo

tanto, este fenómeno resulta de gran

utilidad en bioreactores, como una

forma de inmovilizar los

microorganismos dentro del mismo,

y protegerlos durante el

tratamiento de los efluentes.

44 44


presenta un gran potencial para el desarrollo de procesos biotecnológicos que

involucren la degradación de hidrocarburos [77].

En otro estudio, se realizaron recuentos de microorganismos degradadores a

partir de agua de mar y sedimentos intermareales de las costas de Comodoro

Rivadavia y Caleta Córdova. Para ello, se utilizó un medio de cultivo preparado en

agua de mar y suplementado con una mezcla 1:1 de petróleo:gasoil [87, 88]. Las

cepas bacterianas aisladas a partir de estos recuentos fueron identificadas, en este

caso, analizando sus ácidos grasos metíl esteres. En estos estudios se recuperó una

gran diversidad de microorganismos degradadores de hidrocarburos en Caleta

Córdova. Los géneros bacterianos más frecuentemente aislados fueron

Pseudoalteromonas, Psychrobacter y Shenewanella, si bien también fueron

encontradas cepas pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Acinetobacter y

Rhodococcus [87]. Pucci y colaboradores [86] también realizaron aislamientos

utilizando este medio de cultivo con hidrocarburos en muestras de sedimentos de

Caleta Córdova obtenidas a distintos tiempos luego del derrame de petróleo de

diciembre de 2007. Entre otras, se aislaron a partir de este sitio cepas

pertenecientes a los géneros Rhodococcus, Pseudomonas, Micrococcus, y Kocuria

con conocida capacidad para degradar hidrocarburos. No se han reportado para

todas estas cepas, sin embargo, estudios que exploren las posibles aplicaciones

biotecnológicas de los microorganismos aislados.

Microorganismos degradadores de hidrocarburos - Métodos independientes del cultivo

Como se mencionó anteriormente, dado que la mayoría de los

microorganismos marinos actualmente no pueden cultivarse en el laboratorio

utilizando métodos tradicionales, desde hace unas décadas se han comenzado a

utilizar métodos independientes del cultivo basados en el estudio de sus

biomoléculas (Anexo 1). Si bien estas metodologías también presentan sus

limitaciones, permiten identificar a los microorganismos presentes en la muestra

ambiental a estudiar, independientemente de si pueden o no crecer en el laboratorio.

Una forma de estudiar a los microorganismos capaces de degradar

hidrocarburos es exponer a una comunidad microbiana a estos compuestos, y

estudiar los cambios producidos como respuesta a dicha exposición. Esta estrategia

45 45


permite prescindir de uno de los pasos limitantes en el aislamiento de los

microorganismos, que es su crecimiento en forma aislada en la superficie de un

medio de cultivo sólido. El aislamiento de los microorganismos en medio sólido

impide su interacción con otras poblaciones microbianas que resultan esenciales

para su crecimiento. Utilizando esta estrategia, se evaluaron sedimentos que se

hallan crónicamente contaminados por hidrocarburos en la costa Patagónica. Se

observó qué tipos de bacterias aumentaban su abundancia dentro de una

comunidad microbiana luego de ser expuestos los sedimentos a los HAPs naftaleno

o fenantreno [51, 91]. Para este estudio se utilizó un método independiente del

cultivo de microorganismos que detecta a todos los microorganismos presentes en el

enriquecimiento [49]. En estos estudios se observó la presencia de una gran

diversidad de bacterias marinas enriquecidas en presencia de estos HAPs a partir de

sedimentos de Puerto Madryn, Rawson, Península Aristizábal, Comodoro Rivadavia

y Ushuaia [51, 91]. Entre las poblaciones bacterianas enriquecidas, se destacó la

presencia de Cycloclasticus spp. en todos los sedimentos analizados, la cual es una

bacteria marina degradadora hidrocarburos aromáticos que utiliza casi

exclusivamente a estos compuestos como sustrato para su crecimiento. Estos

resultados sugieren que este microorganismo se encuentra ampliamente distribuido

en sedimentos contaminados con hidrocarburos de la costa Patagónica. Sin

embargo, esta bacteria no pudo ser detectada cuando los sedimentos se sembraron

sobre medio de cultivo sólido. De hecho, se encontró una marcada diferencia entre

las bacterias detectadas en medios de cultivos sólido y líquido de igual composición,

lo cual refuerza la importancia de tener en cuenta el alto grado de interacción que

tienen los microorganismos ambientales al intentar cultivarlos en el laboratorio.

Mientras que en los estudios mencionados en el párrafo anterior se detectan

todas las bacterias presentes en la muestra, otros estudios apuntan a detectar sólo

aquellas que están involucradas en el proceso degradativo. Para ello, se estudian

biomoléculas que están directamente relacionadas con este proceso, como por

ejemplo genes que codifican enzimas de las vías degradativas de hidrocarburos (ver

Anexo 1). Utilizando esta metodología, se demostró la presencia de una gran

diversidad de poblaciones bacterianas con potencial para degradar HAPs en

sedimentos intermareales contaminados con hidrocarburos de la costa Patagónica

[23, 58, 64]. Los sitios analizados en estos estudios incluyeron los muelles de la

46 46


ciudad de Puerto Madryn, las Penínsulas Aristizábal y Gravina, y tres sitos dentro de

la Bahía Ushuaia. De las 25 poblaciones de bacterias detectadas en estos estudios,

22 aún no habían sido estudiadas ([23, 64], Dionisi, resultados no publicados).

Todas estas poblaciones novedosas fueron detectadas en sedimentos

Subantárticos, lo cual muestra el gran potencial aún inexplorado que presentan

estos ambientes (Figura 16). Las otras 3 poblaciones identificadas se encuentran

cercanamente relacionadas a bacterias pertenecientes al género Pseudomonas [45],

a betaproteobacterias como Alcaligenes faecalis AFK2 y Delftia sp. Cs1-4 [43], y a

bacterias del género Cycloclasticus [99].

En un estudio posterior, Marcos y colaboradores [63] estimaron la abundancia

de siete de estas poblaciones bacterianas en sedimentos intermareales de la costa

Patagónica (Figura 17). Este estudio mostró que tres de las poblaciones novedosas

fueron abundantes en los sedimentos intermareales de Bahía Ushuaia, y además

estables dentro de la comunidad de este sitio durante seis años [63]. Estos

resultados sugieren que estas poblaciones bacterianas son miembros estables y

ecológicamente relevantes dentro de la comunidad degradativa de sedimentos

intermareales de Bahía Ushuaia. Todas las poblaciones novedosas analizadas

fueron, en cambio, poco abundantes en sedimentos prístinos de la Península Valdés

y en sedimentos contaminados de Caleta Córdova. Por lo tanto, estas poblaciones

bacterianas parecerían estar restringidas a los ambientes fríos [63]. Por otra parte,

Cycloclasticus fue detectada en la mayor parte de las muestras analizadas, tanto en

sedimentos de Caleta Córdova como de Bahía Ushuaia (Figura 17). Además, su

abundancia era mayor en muestras que presentaban altas concentraciones de HAPs

de bajo peso molecular [61, 63]. Estos resultados sugieren que bacterias del género

Cycloclasticus podrían presentar un rol importante en la biodegradación de HAPs de

bajo peso molecular en el ambiente costero de Patagonia, en concordancia con los

resultados encontrados al analizar cultivos de enriquecimiento con naftaleno y

fenantreno mencionados anteriormente [44].

47 47


48 48

Bahía Ushuaia

Figura 16. De arriba hacia abajo: Imagen satelital del Sur de Sudamérica; imagen satelital de la Bahía Ushuaia, Isla Grande de Tierra del Fuego; foto de Bahía Ushuaia (a la derecha de la imagen se observa la planta de almacenamiento de combustibles Orion); muelle de la planta Orión. Fuente de las imágenes satelitales: Google Earth; fuente de las fotos: los autores.


49 49

Las poblaciones bacterianas con capacidad para degradar hidrocarburos

alifáticos también han sido estudiadas utilizando métodos independientes del cultivo,

en este caso en sedimentos costeros de Bahía Ushuaia. Al contrario de los HAPs,

los hidrocarburos alifáticos se hallaron en relativamente baja concentración en estos

sedimentos (Figura 17). Asimismo, éstos se encontraban en estado avanzado de

biodegradación [38]. La baja concentración de estos compuestos contrastó con la

alta diversidad encontrada de bacterias capaces de degradar estos compuestos.

Algunas de ellas fueron detectadas en varios sitios de la Bahía y en muestras

obtenidas en varios años diferentes, lo cual sugiere que estos microorganismos son

ecológicamente relevantes en este sitio [38]. Los microorganismos detectados

estaban relacionados con otros encontrados en ambientes fríos de otras partes del

mundo. Esto los posiciona como posibles marcadores a ser monitoreados en el

proceso de biodegradación de hidrocarburos alifáticos en este tipo de ambientes. En

este estudio se detectó además una alta proporción bacterias pertenecientes al

género Oleispira, la cual utiliza hidrocarburos alifáticos en forma obligada (Figura

17). Todos estos resultados sugieren que los compuestos alifáticos derivados del

petróleo están siendo rápidamente degradados por la comunidad de

microorganismos degradadores que habita este ambiente crónicamente

contaminado. Ensayos de laboratorio realizados en el marco de este estudio

confirmaron esta hipótesis, ya que estas comunidades microbianas fueron capaces

de degradar componentes del petróleo crudo en menos de 20 días, inclusive sin el

agregado de nutrientes [38]. Por el contrario, en este sitio los HAPs (en particular

aquellos de alto peso molecular) parecerían ser degradados más lentamente, lo que

ocasiona su acumulación en los sedimentos (Figura 17). Esto es así a pesar de la

gran diversidad de bacterias degradadoras detectadas en este sitio [23, 58, 63, 64],

lo cual refleja la mayor dificultad que presentan estos compuestos para su

biodegradación.


50 50

Figura 17 (Página anterior). Gráfico integrador de los principales resultados encontrados en muestras de sedimentos intermareales de la Patagonia. Se indican los sitios de muestreo, las temperaturas promedio en el mes más cálido y más frío del año, los géneros relacionados con la biodegradación de hidrocarburos más abundantes (en color verde), las poblaciones bacterianas cuantificadas (en color rojo), la granulometría de los sedimentos (en color azul), las concentraciones de HAPs y de hidrocarburos alifáticos totales (AT). El tamaño de letra de los géneros degradadores y de las poblaciones cuantificadas, así como el tamaño de los gráficos de HAPs y AT son proporcionales a las abundancias o concentraciones de los mismos en las muestras de sedimentos. En los gráficos de concentración de HAPs, el color gris representa a los HAPs de bajo peso molecular y el negro a los HAPs de alto peso molecular. n.d., no detectado. Las flechas azules y rojas indican sedimentos expuestos a la contaminación con petróleo crudo o combustibles refinados, respectivamente [61].

Conclusiones

Los distintos estudios descriptos en esta sección permiten comenzar a

conocer aspectos ecológicos y moleculares importantes relacionados con la

biodegradación de hidrocarburos en la costa Patagónica. A pesar de la cantidad de

información recaudada en los últimos años, aún queda mucho por descubrir sobre

las comunidades microbianas de la costa Patagónica. Uno de los aspectos que se

desprenden a partir de estos estudios es que, si bien algunos microorganismos

como por ejemplo Cycloclasticus se encuentran ampliamente distribuidos en los

sedimentos costeros de Patagonia, otros microorganismos degradadores

previamente desconocidos presentan una distribución geográfica mucho más

acotada (Figura 17, [63]). El objetivo final es llegar a conocer a las poblaciones

microbianas claves para el proceso degradativo, y comprender los mecanismos que

regulan la degradación de hidrocarburos en estos ambientes.

Si bien los estudios mencionados en esta sección muestran evidencias de

una alta diversidad y abundancia de poblaciones bacterianas con capacidad para

degradar hidrocarburos en sitios impactados de la costa Patagónica, la

contaminación con estos compuestos en muchos casos sigue siendo prevalente en

áreas cercanas a puertos, o de carga y descarga de hidrocarburos del petróleo [13,

15]. Estos compuestos se acumulan en el ambiente como resultado de un ingreso a

velocidades superiores a la capacidad degradativa natural. Esta acumulación es más

evidente en los compuestos más difíciles de degradar, como por ejemplo los HAPs

51


de alto peso molecular, los cuales tienden a acumularse tanto en sedimentos (Figura

17) como en organismos vivos [2]. Cuando la exposición a estos compuestos genera

riesgos sobre la salud de la población o del ecosistema, se vuelve necesario

implementar protocolos de remediación ambiental con el fin de acelerar su

eliminación. En el caso de la contaminación crónica, resulta además esencial

controlar el ingreso de los compuestos al ambiente, de forma de minimizar el

impacto que éstos tienen sobre el ambiente y la población.

10- ¿CUÁLES SON LAS PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE UN AMBIENTE PRÍSTINO, UNO CRÓNICAMENTE CONTAMINADO Y UNO IMPACTADO POR UN DERRAME DE PETRÓLEO?

En la Figura 18 se esquematizan las principales diferencias que existen entre

los ambientes prístinos, los crónicamente contaminados, y los impactados en forma

aguda por un derrame de petróleo. La contaminación por hidrocarburos sólo puede

verse a simple vista cuando ocurren derrames importantes. Sedimentos con

apariencia normal pueden contener concentraciones importantes de compuestos

tóxicos, mutagénicos y carcinogénicos, como por ejemplo HAPs. Por lo tanto, la

única manera de conocer si un sedimento se encuentra contaminado es determinar

la concentración y el tipo de contaminantes por medio de análisis químicos

complejos. Debido a la distribución en parches de los hidrocarburos, estos análisis

deberán abarcar una amplia distribución espacial y temporal. Por ejemplo, debido a

los grandes movimientos que ocurren en los sedimentos costeros, es común que los

sedimentos contaminados sean enterrados o desplazados desde el ambiente

intermareal al infralitoral, y por lo tanto los cambios observados en la concentración

de hidrocarburos no necesariamente se deban a la desaparición de los mismos por

procesos físicos o biológicos. Cuando los sedimentos son enterrados, generalmente

se encuentran limitados en su disponibilidad de oxígeno, los procesos de

biodegradación resultan más lentos y por lo tanto serán más persistentes en el

ambiente. Otro aspecto de la dinámica temporal a tener en cuenta al evaluar el

riesgo que representa un sitio contaminado son los procesos de toxicidad crónica,

que puede persistir durante décadas luego de evento de contaminación puntual.

52


Figura 18. Principales diferencias entre sedimentos prístinos, crónicamente contaminados e impactados por un derrame de petróleo en lo que respecta a sus características químicas, toxicidad y potencial degradativo. PV, Península Valdés. Origen de las fotos: los autores.

53


Con respecto a la capacidad degradativa de la comunidad microbiana, en

ambientes prístinos ésta es generalmente muy baja. Si bien las poblaciones

microbianas capaces de degradar los componentes del petróleo se encuentran

habitualmente presentes en estos ambientes, las mismas son muy poco abundantes.

Dependiendo de la metodología utilizada, estas poblaciones pueden resultar

inclusive muy difíciles de detectar. Debido a sus bajas abundancias, la capacidad de

respuesta ante un derrame será lenta. Estos microorganismos deben aumentar el

tamaño de sus poblaciones varios órdenes de magnitud para alcanzar una velocidad

de degradación aceptable, que ayude a disminuir los efectos negativos de los

mismos tanto a mediano como a largo plazo. Para que un microorganismo

incremente exponencialmente su abundancia, deben encontrar todas las

condiciones adecuadas que permitan su multiplicación. Los microorganismos no sólo

requieren de una fuente de carbono y energía (en este caso los hidrocarburos), sino

además concentraciones adecuadas otros nutrientes (macro y micronutrientes),

aceptores de electrones, condiciones ambientales adecuadas, etc.

En ambientes crónicamente contaminados, en cambio, las poblaciones

microbianas que degradan los hidrocarburos se encuentran presentes en mayores

abundancias con respecto a los ambientes no expuestos. En estos casos, a medida

que ingresan al ambiente, los hidrocarburos son utilizados por los microorganismos,

y la concentración detectada depende de un balance entre los hidrocarburos que

ingresan y los que son degradados. En estos casos, generalmente las

concentraciones de hidrocarburos son mantenidas a niveles intermedios. A estas

concentraciones, la comunidad microbiana no se ve afectada radicalmente y aún

presenta una alta riqueza de especies. En consecuencia, esta comunidad, aunque

impactada, es aún capaz de cumplir con la mayoría de los procesos metabólicos que

ocurren en el sedimento. Además, una alta riqueza de especies es importante

porque estas comunidades microbianas tendrán la capacidad para adaptarse a

diferentes perturbaciones. Una comunidad microbiana diversa es más estable, ya

que cuenta con distintos microorganismos capaces de cumplir una misma función.

Esta propiedad de la comunidad se denomina redundancia funcional. Ante un nuevo

derrame, esta comunidad responderá con un rápido crecimiento de las poblaciones

microbianas degradadoras, y en consecuencia mayores velocidades de

54


biodegradación. Para que el crecimiento microbiano ocurra, sin embargo, deben

cumplirse las mismas condiciones que se mencionaron en el párrafo anterior

(nutrientes, aceptores de electrones, etc.). Sin embargo, estas poblaciones ya se

encuentran adaptadas a las condiciones ambientales y nutricionales del sitio en

donde habitan, como así también a las interacciones con los otros miembros de la

comunidad. Es por ello que es preferible aprovechar las capacidades intrínsecas de

la comunidad microbiana autóctona, en vez de intentar “sembrar” microorganismos

exógenos para biodegradar los contaminantes. Las poblaciones microbianas

cultivadas en el laboratorio competirán pobremente con los microorganismos nativos

del sitio, aunque provengan del mismo sitio.

Durante de un derrame de petróleo crudo ingresa al ambiente una gran

cantidad de hidrocarburos en un tiempo muy corto. Como consecuencia, las

comunidades microbianas de los sitios impactados se ven seriamente afectadas, y

sufren una pérdida drástica de especies, asociada a una proliferación de unos pocos

tipos de microorganismos adaptados a sobrevivir en condiciones muy adversas. El

ambiente afectado perderá su capacidad para recuperarse a condiciones previas al

derrame y de responder a otros factores de estrés. Eventualmente, cuando los

hidrocarburos más degradables disminuyen su concentración, disminuirá

naturalmente la abundancia de las poblaciones microbianas que los degradan. Sin

embargo, es probable que nunca se recupere la estructura de la comunidad “sana”,

mayormente debido a la lenta velocidad de biodegradación de muchos de estos

compuestos, los cuales persistirán en el ambiente.

11- ¿QUÉ SON LAS TECNOLOGÍAS DE BIORREMEDIACIÓN?

Dado que la mayoría de los hidrocarburos que componen el petróleo crudo y

los productos refinados son biodegradables, estos compuestos deberían

desaparecer del medio ambiente marino. Sin embargo, los microorganismos

requieren de condiciones ambientales y nutricionales adecuadas para poder

degradar a los hidrocarburos [16]. Si estas condiciones no son las adecuadas, la

eliminación de estos contaminantes se vuelve lenta y a menudo incompleta. Por

ejemplo, la mayoría de los hidrocarburos presentan una muy baja solubilidad en

55


agua, lo cual los convierten en poco disponibles para los microorganismos [97].

Además, si bien estas moléculas presentan un alto contenido de carbono y energía,

carecen de otros nutrientes esenciales para el crecimiento de los microorganismos

[41]. Cuando las sustancias tóxicas no son degradadas con la velocidad suficiente,

generan consecuencias ecológicas adversas y daños a la salud de la población [85].

En estos casos, es posible acelerar la velocidad de biodegradación natural de estos

compuestos por medio de la utilización de la tecnología de recuperación ambiental

llamada biorremediación.

La biorremediación se define como la explotación de actividades biológicas

para detoxificar o remover contaminantes [4]. Esta tecnología emerge como una de

las tecnologías más prometedoras para la eliminación del petróleo del ambiente. La

principal ventaja de la biorremediación es su bajo costo y su menor impacto

ambiental, comparada con métodos físicos o químicos de descontaminación [82].

Por ejemplo, durante la limpieza del derrame del Exxon Valdez en Alaska, el costo

de biorremediar 120 km de costa fue menor que el de un día de limpieza física

(lavado) [3]. Además, los métodos convencionales, tales como la remoción física de

los contaminantes los cuales constituyen la primera opción de tratamiento,

raramente llevan a la limpieza completa de un derrame. La biorremediación puede

ser llevada a cabo en el mismo sitio contaminado, sobre todo cuando los

contaminantes están presentes en forma difusa y en bajas concentraciones

(biorremediación in situ) o, por el contrario, el material contaminado puede ser

relocalizado para su tratamiento (biorremediación ex situ) [21].

En el mundo, la remediación de sitios contaminados tiene un mercado que

alcanza los 25 mil millones de dólares anuales [4]. A pesar de sus claras ventajas, la

biorremediación tiene una muy baja participación en este mercado, por debajo del

10%. La lenta adopción de esta metodología es debida a los riesgos que han sido

asociados con la utilización de protocolos de biorremediación. Éstos incluyen la falla

de la tecnología empleada, la remoción incompleta del contaminante sin alcanzar los

estándares regulatorios requeridos, la estimulación de procesos microbianos no

deseados, como por ejemplo la metanogénesis, el excesivo crecimiento microbiano

y/o la generación de cambios permanentes en la comunidad microbiana del sitio

remediado con posibles impactos en la función del ecosistema y los servicios que

este provee [57]. Si bien estos riesgos son reales, los mismos pueden ser evitados

56


por medio de una correcta evaluación del sitio contaminado que posibilite la

selección del método más apropiado de biorremediación en cada caso en particular,

y a través de un manejo efectivo del proceso. Estos puntos se tratarán con mayor

detalle en las secciones siguientes.

Existen tres estrategias que pueden ser utilizadas para la biorremediación in situ

de los sitios contaminados. Cuando los procesos bióticos y abióticos resultan lo

suficientemente eficientes para la remoción de los compuestos contaminantes, y los

mismos no representan un riesgo para la salud de la población o del ambiente, a

menudo se utiliza la estrategia denominada atenuación natural monitoreada o

recuperación natural monitoreada. En este caso, el proceso natural es extensamente

monitoreado, pero el mismo no es intervenido. En cambio, cuando los procesos

naturales son muy lentos debido principalmente a la ausencia o baja velocidad del

proceso degradativo, se vuelve necesario intervenir sobre el proceso natural. Si las

poblaciones microbianas que degradan a los compuestos contaminantes se

encuentran presentes en el ambiente, pero en bajas abundancias o con un bajo nivel

de actividad, las mismas pueden ser estimuladas por medio de la tecnología

denominada bioestimulación. Cuando las poblaciones microbianas requeridas no se

encuentran presentes, es necesario agregar en el sitio a remediar microorganismos

exógenos que presenten la capacidad de degradar los compuestos contaminantes

(bioaumentación) [96]. Todas estas estrategias serán tratadas con mayor detalle en

los puntos siguientes de este Informe Técnico.

12- ¿QUÉ TIPO DE ANÁLISIS DEBEN REALIZARSE EN EL SITIO CONTAMINADO?

La biorremediación es un campo interdisciplinario, ya que combina

conocimientos y herramientas de química, microbiología ambiental, biología

molecular, biotecnología, ingeniería ambiental y geología. Como se mencionó en el

punto anterior, para lograr la efectiva implementación de esta tecnología es

necesario contar con un conocimiento exhaustivo no sólo de los procesos abióticos

que están ocurriendo en el sitio contaminado, sino además de los procesos

degradativos llevados a cabo por la comunidad microbiana. Dentro de las variables

que deben ser monitoreadas en el sitio contaminado se incluyen: la concentración y

57


tipo de compuestos contaminantes, su toxicidad, las condiciones ambientales (como

temperatura y pH), las concentraciones de los principales nutrientes esenciales para

el crecimiento microbiano (como nitrógeno y fósforo), el oxígeno disuelto, y la

abundancia y actividad microbiana. Estas variables, así como las herramientas que

se utilizan para su medición, se presentan en la Tabla 2.

Medición de variables físicas, químicas y ambientales

La técnica más utilizada para medir la concentración de los hidrocarburos en

las distintas matrices ambientales o en los organismos es la cromatografía gaseosa

(GC). En esta metodología, las distintas moléculas se separan al moverse dentro de

una columna a distintas velocidades, impulsadas por un gas inerte. Al salir de la

columna, pasan por un detector que genera un cromatograma en donde las señales

son proporcionales a la concentración de cada compuesto. Esta técnica es muy

precisa, sobre todo al utilizar detectores de masa acoplados al GC (GC-MS). Sin

embargo, requiere de equipamiento sofisticado y es costosa y laboriosa. Por lo tanto,

se han desarrollado otras técnicas para su aplicación en el monitoreo, por ejemplo la

cromatografía de capa delgada y detección por ionización en llama o TLC-FID [105].

Este método constituye una forma rápida de cuantificar las fracciones mayores del

petróleo. Sin embargo, tiene la desventaja de no poder discriminar los compuestos

individuales. Para disminuir la variabilidad en las mediciones de las concentraciones

de hidrocarburos, típicas de las condiciones ambientales heterogéneas, se utilizan

hidrocarburos de baja biodegradabilidad como marcadores, como por ejemplo

pristano y fitano u hopano. Estos marcadores son utilizados para relativizar las

mediciones durante los análisis cromatográficos como el GC-MS. El pristano y el

fitano son adecuados para su utilización sólo en los primeros estadíos del proceso,

ya que se observó que estos compuestos son biodegradables a más largo plazo

[109]. Por otro lado, el hopano, si bien es muy resistente a la biodegradación, es

también afectado por procesos abióticos, por lo cual otros compuestos serían más

útiles para distinguir la biodegradación de procesos de degradación abiótica [30].

58


Tabla 2. Plan de monitoreo para la biorremediación. Modificado de [109]

Análisis Matriz Método recomendado

Nitrógeno disuelto Sedimento (agua

intersticial)

Extracción con KCl

/oxidación

persulfato/reducción

cadmio [26]

Fósforo disuelto Sedimento (agua

intersticial)

Extracción con KCl./

oxidación

persulfato/método del

ácido ascórbico[26]

Petróleo residual Sedimento Extracción en cloruro de

metileno - GC-MS-SIM

Oxígeno disuelto Acuosa Ensayo Hach® de alto

rango

PH en agua intersticial Acuosa electrodo de combinación

Poblaciones microbianas Sedimento NMP para degradadoras

de alcanos y HAPs

Actividad metabólica Sedimento Producción de CO2 en

ensayos de laboratorio

Toxicidad del petróleo

residual

Sedimento Microtox® Solid-Phase

Test

(ensayo de supervivencia

de anfípodos de 10 días)

Potencial de

bioacumulación

Membranas

semipermeables

sintéticas

Adsorción a membranas

(test de 2 semanas)

Perfil de costa Evaluación visual Utilización de

marcadores fijos

59


La determinación de los niveles de nutrientes es un punto fundamental por su

gran influencia sobre el éxito del proceso biodegradativo. Si los mismos son

limitantes de la velocidad de biodegradación, se recurre a su agregado durante el

proceso de bioestimulación. En este caso, la frecuencia de la toma de muestras para

la determinación de la concentración de nutrientes debe estar coordinada con la

aplicación de los mismos, con el fin de asegurar que el tratamiento está llegando a

penetrar la zona a remediar. De esta forma, se puede asegurar la obtención de la

concentración de nutrientes necesaria en el medio ambiente a remediar, y evitar el

agregado de un exceso de nutrientes que puede alcanzar niveles tóxicos para los

organismos bentónicos. Otra variable crucial a determinar es la disponibilidad de

oxígeno, ya que la biodegradación es mayormente un proceso aeróbico en los

sedimentos [19]. Sin embargo, en algunos casos se han reportado procesos

dependientes de nitrato y sulfato [67, 76, 92]. La medición del oxígeno disuelto se

coordina con la aplicación de los nutrientes, en especial cuando éstos son orgánicos,

para asegurar una concentración adecuada y evitar la anoxia.

Determinación de variables microbiológicas

Cuando se considera a la biorremediación como alternativa, además de la

evaluación de las condiciones físicas, químicas, geológicas y ambientales de los

sitios contaminados se debe incluir la determinación de la capacidad degradativa de

la comunidad microbiana [20]. El objetivo de esta evaluación es determinar si existen

microorganismos con la capacidad para degradar los contaminantes en el sitio a

remediar, e idealmente estimar tanto su abundancia como su actividad (Tabla 2,

Figura 19). La estimación de su abundancia es importante porque en general cuanto

mayor es el número de bacterias degradadoras, más rápidamente se degradarán los

contaminantes. Este monitoreo también es realizado durante la fase de

implementación del protocolo de biorremediación, en donde se intenta conocer si se

han producido los cambios esperados en la comunidad microbiana como

consecuencia de la estrategia de biorremediación elegida. El aumento de la

abundancia de los microorganismos degradadores puede ser visualizado incluso

antes de que ocurran cambios en la concentración de los contaminantes [101]. En

particular, se evalúa si la abundancia de los microorganismos degradadores se

incrementó por encima de las condiciones normales observadas a campo, y esto se

toma como un indicio de que la estrategia elegida está teniendo el efecto esperado

60


[59]. Los análisis microbiológicos permiten además evaluar el momento adecuado

para discontinuar el tratamiento elegido, y continuar con un proceso de atenuación

natural monitoreada. Por lo tanto, el disponer de información microbiológica precisa

y de forma rápida resulta esencial para incrementar la eficacia de los protocolos de

biorremediación y para disminuir los costos asociados con las tecnologías utilizadas

[53]. En este sentido, la microbiología ambiental resulta fundamental para proveer

los conocimientos necesarios para poder manejar efectivamente a las comunidades

microbianas de los sitios contaminados.

Debido a las dificultades metodológicas que presentan los estudios de

comunidades microbianas complejas, el monitoreo de las poblaciones degradadoras

de los ambientes contaminados representa aún un desafío. Actualmente se dispone

de pocas herramientas diagnósticas que permitan evaluar de forma rápida y

confiable la capacidad degradativa de la comunidad microbiana. Esta falta de

herramientas se debe a la escasa información que aún existe sobre los

microorganismos presentes en los sitios contaminados, y en particular, sobre las

poblaciones microbianas que se encuentran directamente involucradas en la

biodegradación de los compuestos contaminantes. A continuación se describirán

brevemente los dos tipos de estrategias disponibles para el estudio de la abundancia

de los microorganismos degradadores: métodos de microbiología clásica como por

ejemplo el recuento de organismos degradadores en placa o en medio líquido, y

herramientas emergentes independientes del cultivo de microorganismos, basadas

en el análisis de biomoléculas específicas de dichos organismos.

a- Herramientas de microbiología clásica:

Los conteos microbianos son habitualmente utilizados para monitorear el

proceso de biodegradación. Las herramientas clásicas incluyen los recuentos en

placa (determinación de unidades formadoras de colonias o UFC) y la técnica del

número más probable (NMP). El recuento en placa es una técnica tradicional que

cuantifica el número de bacterias capaces de crecer en un medio de cultivo sólido

predeterminado. En la técnica de UFC, se utilizan para enumerar a los

microorganismos degradadores distintos hidrocarburos como sustrato de

crecimiento. Sin embargo, muchas bacterias son capaces de crecer utilizando muy

pequeñas concentraciones de sustrato que se encuentran presentes en el medio

debido a impurezas en sus componentes o provenientes de la muestra ambiental.

61


Además, los microorganismos incapaces de crecer en forma aislada en medios

artificiales sólidos no serán detectados. La técnica de NMP es considerada más

confiable que la anterior para enumerar los microorganismos degradadores [107].

Esta técnica elimina la necesidad de un agente sólido, ya que utiliza medio líquido

con nutrientes en tubos o microplacas, e hidrocarburos como sustrato de

crecimiento. La enumeración se lleva a cabo a partir de un análisis estadístico

basado en diluciones seriadas, que muestran evidencias de crecimiento bacteriano.

La medición del crecimiento puede basarse en turbidez, liberación de 14CO2 a partir

de hidrocarburos marcados u otros procedimientos como reducción de colorantes

[89]. Estos dos métodos son laboriosos y lentos, y además presentan grandes

desvíos debido a que la gran mayoría de las bacterias (inclusive las poblaciones

microbianas degradadoras de compuestos contaminantes) resultan incultivables en

medios artificiales [59].

b - Herramientas de biología molecular:

Debido a las limitaciones de los métodos de microbiología tradicional, en los

últimos años ha crecido el interés en utilizar herramientas de diagnóstico de la

capacidad degradativa basadas en técnicas de biología molecular [90]. La biología

molecular es el estudio de la estructura, función y actividad de las macromoléculas

esenciales para la vida, por ejemplo los ácidos nucleicos, las proteínas y los lípidos

[100]. En estas técnicas emergentes, se seleccionan biomoléculas para ser

utilizadas como blanco de los ensayos, de forma de obtener información sobre la

identidad, la abundancia o la actividad de las poblaciones relevantes para la

biorremediación del sitio contaminado [53]. Dado que no se requiere del cultivo de

los microorganismos, no sufren de los desvíos de las técnicas de microbiología

tradicional, y los resultados pueden ser obtenidos de forma muy rápida. Presentan,

sin embargo, otras limitaciones, como por ejemplo requieren de un profundo

conocimiento sobre diversidad de las biomoléculas blanco en el sitio contaminado, y

resultan más costosas que las técnicas de microbiología tradicional. Sin embargo, se

considera que el costo derivado de su uso es justificado debido a que la información

obtenida reduciría los costos de la biorremediación [53, 90, 100, 101].

62


Figura 19: Herramientas de estudio de las variables bióticas y abióticas de

los sitios contaminados.

Las metodologías basadas en el análisis de moléculas biológicas han sido

desarrolladas y evaluadas a campo para el estudio de la biodegradación anaeróbica

de solventes clorados en aguas subterráneas [53]. En el caso de la biodegradación

de hidrocarburos, aún se encuentran en una etapa muy temprana de desarrollo y

han sido utilizadas mayormente para la investigación de los procesos degradativos.

Dado que existen numerosos compuestos en el petróleo crudo y los combustibles

refinados, y numerosas poblaciones bacterianas adaptadas para crecer a expensas

de dichos compuestos en presencia de oxígeno, el desarrollo de ensayos

específicos para dicha actividad metabólica resulta actualmente un desafío. El

conocimiento disponible sobre los procesos anaeróbicos de biodegradación de

hidrocarburos es aún más limitado, por lo que el diseño de ensayos específicos para

evaluar la capacidad de biodegradación anaeróbica de estos compuestos se

encuentra aún más lejano.

63


El desarrollo de herramientas moleculares aplicables a tecnologías de

biorremediación requiere de una serie de pasos que resultan esenciales para

garantizar que las mismas sean capaces de proveer información correcta, precisa, y

reproducible. Todas estas características son necesarias para que estos ensayos

sean de utilidad al momento de ser aplicados a campo [100]. En primer lugar, es

necesario tener conocimientos previos sobre la microbiología del sitio. En particular,

es necesario identificar cuáles son las poblaciones microbianas que son de mayor

importancia para el proceso degradativo, ya que son estas poblaciones las que son

utilizadas como blanco de las herramientas moleculares. Dado que las poblaciones

claves para el proceso pueden diferir en distintas regiones geográficas, no siempre

es posible utilizar la información obtenida en otros ambientes o regiones geográficas.

El segundo paso es el diseño de los ensayos moleculares basados en los

conocimientos de los biomarcadores a utilizar (Anexo 1). Posteriormente, estas

herramientas deben ser optimizadas y evaluadas tanto en el laboratorio como en

estudios a campo, de forma de determinar su precisión y reproducibilidad. Las

distintas etapas del análisis, desde el muestreo hasta el análisis de los resultados,

deben ser estandarizadas. El desarrollo de estas herramientas presenta un gran

potencial para catalizar una transición desde las tecnologías de remediación

basadas en prueba y error actuales hacia enfoques basados en principios científicos,

con resultados más predecibles [100]. Sin embargo, resulta importante difundir la

potencialidad de estas herramientas emergentes y el estado de desarrollo actual de

las mismas a los actores que participan de la respuesta ante un derrame de

hidrocarburos.

Importancia del diseño de muestreo y el análisis estadísticos

Para poder afirmar que la biorremediación está siendo efectiva, se debe

demostrar estadísticamente una desaparición del petróleo más rápida en las áreas

tratadas que en las no tratadas. Además, debe demostrarse que la biodegradación

es la razón mayoritaria para el incremento en la velocidad de desaparición de estos

compuestos. Para el primer punto, la normalización de los datos cromatográficos con

respecto a un marcador conservado (ej. hopano) ha demostrado ser de utilidad, ya

que contribuye a disminuir gran parte de la variabilidad observada entre muestras

[30]. Para poder afirmar que los contaminantes son degradados significativamente

64


en mayor medida en los sitios tratados que en los controles, se requiere del uso de

análisis estadísticos que lo soporten. En este sentido, para asegurarse de que los

resultados del monitoreo reflejan la realidad de un ambiente extremadamente

heterogéneo, es importante que el plan de muestreo esté diseñado de acuerdo a

principios estadísticos válidos (randomización, replicación, controles). Para muestras

con un alto grado de heterogeneidad espacial, como es el caso de los derrames en

el medio ambiente costero, deberían utilizarse estrategias estratificadas de

muestreo. Para ello, el sitio de muestreo en una costa marina puede ser dividido en

un número de sectores o cuadrantes basados en la homogeneidad de la

geomorfología dentro de cada sector (por ejemplo zona intermareal alta y baja) para

luego obtener múltiples muestras dentro de cada sector [109].

Con respecto al segundo punto, una forma de inferir la ocurrencia de

procesos de biodegradación es mediante el cálculo de índices basados en la

biodegradabilidad relativa de los distintos componentes del petróleo [15]. Estos

análisis deben complementarse con estudios microbiológicos, los cuales son

capaces de brindar evidencias más directas de los procesos de biodegradación en el

sitio a evaluar. Existen varios componentes que contribuyen a la variabilidad

observada, y afectan la capacidad para obtener resultados estadísticamente válidos

a partir de estos análisis. Estos son la variabilidad natural de las poblaciones en el

sedimento, como así también las variabilidades relacionadas con las distintas etapas

involucradas en los ensayos de laboratorio. Si bien la replicación de los análisis de

laboratorio es necesaria, el mayor esfuerzo debe realizarse en la toma de un alto

número de muestras en el sitio impactado, debido a que esta última presenta los

mayores niveles de variabilidad. Además, es importante tener en cuenta las

condiciones de la toma de las muestras, transporte y almacenamiento, dependiendo

del tipo de análisis que se realizará posteriormente. Condiciones incorrectas en

estas etapas pueden afectar los resultados de dichos análisis.

13- ¿CÓMO SE DECIDE QUÉ TECNOLOGÍA UTILIZAR?

Uno de los primeros puntos a considerar son los objetivos de remediación para

el sitio afectado, los cuales deben ser definidos explícitamente. Por ejemplo, los

65


objetivos pueden incluir reducir a niveles aceptables: (i) los riesgos para niños y

adultos, asociados a la ingestión incidental o exposición dérmica de los sedimentos

durante actividades tales como jugar, caminar, o nadar en el sitio; (ii) los riesgos

asociados a la ingestión de peces o mariscos extraídos del sitio; (iii) la toxicidad para

los organismos acuáticos bentónicos del sitio, (iv) los riesgos para las aves y

mamíferos que se alimentan de organismos expuestos a la contaminación [103].

Para poder conocer si estos objetivos de remediación pueden ser alcanzados en un

tiempo razonable (considerando las características del sitio en cuestión), y en última

instancia elegir entre las diferentes alternativas de remediación, se necesita recabar

la siguiente información a partir del sitio:

• Identificar y cuantificar los contaminantes presentes en el sedimento y en

la biota, su distribución horizontal y vertical

• Identificar las fuentes de contaminación histórica y cuantificar el impacto de

cualquier fuente que aún continúe activa

• Comprender qué procesos geomorfológicos afectan la estabilidad del

sedimento en el sitio (resuspensión, transporte, deposición)

• Comprender los procesos químicos y biológicos claves que afectan el

destino, transporte y biodisponibilidad de los contaminantes

(intemperización)

• Identificar las principales vías de exposición humana y ecológica para los

contaminantes

• Proveer una línea de base de datos que puedan ser usada para luego

monitorear la efectividad de la remediación en todos los medios

(generalmente sedimentos, agua y biota)

Es importante tener en cuenta los cambios que pueden haber ocurrido en el

sitio desde el evento de contaminación, por ejemplo en la distribución de los

contaminantes en los sedimentos superficiales y subsuperficiales, en el agua y en la

biota. También el efecto de la época del año en estas distribuciones. La importancia

relativa de estas fuentes de variabilidad dependerá fuertemente del sitio. También es

importante comprender las propiedades que afectan la zona de mezcla, que es la

66


capa biológicamente activa del sedimento superficial. Los contaminantes presentes

en esta zona son más proclives a quedar expuestos. En particular, el rol potencial de

los organismos bioturbadores (mezcladores del sedimento, tales como moluscos y

otros invertebrados) deberá ser evaluado en el sitio en cuestión.

Por otra parte, los estudios microbiológicos que se realizan en el sitio

contaminado permiten evaluar el potencial que presentan los microorganismos

presentes en el mismo para la biodegradación de las sustancias contaminantes, y de

esta manera identificar la mejor alternativa de remediación. Cuando la capacidad

natural de remediación del sitio es elevada, la alternativa elegida es habitualmente la

atenuación natural monitoreada. Dicha estrategia depende de los procesos naturales

de degradación o aislamiento de los contaminantes. Si bien en este caso no se

interviene sobre estos procesos naturales, en esta estrategia se realiza un

exhaustivo monitoreo de distintas variables del sitio a lo largo del tiempo, con el fin

de confirmar que los procesos de eliminación de los contaminantes efectivamente

están ocurriendo. La atenuación natural monitoreada se caracteriza por ser no

invasiva y relativamente económica. Su principal limitación es que puede llegar a ser

un proceso muy lento, principalmente cuando las condiciones ambientales son

adversas. Según la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos [103],

para poder seleccionar la alternativa de recuperación natural monitoreada, el

responsable de la remediación del sitio debe contar con:

• una comprensión exhaustiva de los procesos naturales que están

afectando los sedimentos y los contaminantes en el sitio

• una herramienta predictiva, generalmente basada en modelos de

computación o extrapolación de datos empíricos, para predecir posibles

futuros efectos de estos procesos

• una evaluación de los riesgos durante el período de recuperación, cuando

sea posible

• la habilidad de monitorear los procesos naturales y/o la concentración de

contaminantes en sedimentos o biota para corroborar que la recuperación

está ocurriendo a la tasa esperada

La recuperación natural monitoreada es una alternativa válida si el sitio contiene

microorganismos capaces de degradar las sustancias contaminantes en alta

67


abundancia y en forma activa, y si los nutrientes y los aceptores de electrones están

presentes en una concentración que permita que la biodegradación ocurra a

velocidades cercanas a la máxima estimada (Figura 20). Otras condiciones del sitio

especialmente conductivas hacia esta estrategia de biorremediación, incluyen:

• los usos del sitio o nuevas estructuras son compatibles con la recuperación

natural

• la exposición esperada de los seres humanos es baja y/o puede ser

razonablemente controlada a nivel institucional

• la capa de sedimento es razonablemente estable

• los contaminantes se biodegradan fácilmente o se transforman en formas

menos tóxicas

• la concentración de los contaminantes es baja y cubre áreas difusas

• los contaminantes muestran poca bioacumulación

En algunos casos resulta imprescindible utilizar estrategias que permitan

acelerar el proceso natural, de manera de alcanzar la remediación del sitio en un

tiempo aceptable y disminuir el riesgo sobre la población y el ecosistema. Las

distintas situaciones en las que se recurre a estrategias de biorremediación

acelerada incluyen: (i) cuando la capacidad degradativa natural es insuficiente para

alcanzar los objetivos de remediación en un tiempo razonable, (ii) en sitios donde

existe la necesidad de proteger un hábitat o recurso en particular, y (iii) en sitios en

donde las poblaciones humanas presentan una alta exposición a la contaminación,

tal como zonas de pesca o recreativas.

En el caso de que existan microorganismos degradadores en el sitio a remediar,

pero que éstos se encuentren en bajas abundancias o con un bajo nivel de actividad,

se recurre a la bioestimulación (Figura 20). Para esta estrategia, es necesario

conocer cuál o cuáles de las condiciones ambientales o nutricionales son las que se

encuentran limitando la velocidad de biodegradación del contaminante, y

modificarlas. Un ejemplo es el agregado de nutrientes, tecnología que ha sido muy

eficiente para remediar ambientes costeros contaminados con hidrocarburos [3, 7].

Los tipos de preparaciones de nutrientes más comúnmente utilizados son los

nutrientes solubles en agua, nutrientes sólidos de liberación lenta, y fertilizantes

68


oleofílicos. Cada tipo de nutriente tiene sus ventajas y limitaciones. Los nutrientes

solubles en agua son usualmente aplicados en el campo en forma de spray o

desparramando gránulos sólidos. Este tipo de nutrientes ha sido efectivo en el

incremento de la biodegradación del petróleo en varios ensayos a campo. Son

altamente disponibles para los microorganismos y fácilmente manipulables para

mantener las concentraciones necesarias en el agua intersticial. Sin embargo tienen

la desventaja de que al ser solubles en agua pueden ser lavados fácilmente por la

acción del agua (marea y olas). Además, los nutrientes inorgánicos, en especial el

amonio, deben ser usados con cuidado para no alcanzar niveles tóxicos para los

organismos bentónicos [109].

El uso de fertilizantes de liberación lenta es uno de los enfoques utilizados para

proveer una fuente continua de nutrientes. Estos fertilizantes se encuentran

normalmente en formas sólidas que consisten en nutrientes inorgánicos recubiertos

con material hidrofóbico como parafina o aceite vegetal. Esta forma de agregar

nutrientes puede ser más económica que la anterior debido a que precisa una

aplicación menos frecuente. Sin embargo, un problema de esta tecnología es lograr

el control de las tasas de liberación para que se mantengan las concentraciones

óptimas de nutrientes en el agua intersticial. Si los nutrientes son liberados muy

lentamente, la concentración efectiva nunca llegará a ser suficiente para soportar

altas tasas de biodegradación y la estimulación no será suficiente. Por el contrario, si

son liberados muy rápidamente, sufrirían el lavado al igual que los nutrientes

solubles. Los nutrientes orgánicos oleofílicos son fertilizantes que se adhieren al

petróleo y proveen nutrientes en la interfase agua-petróleo. De esta manera, se

estimula la biodegradación sin necesidad de incrementar la concentración de

nutrientes en el agua intersticial. Este tipo de preparaciones son costosas, y su

efectividad ha demostrado ser variable [109]. Además, contienen carbono orgánico

que puede competir con la degradación del petróleo y resultar en condiciones

anóxicas no deseadas y/o eutroficación.

La efectividad de todos estos tipos de nutrientes dependerá también de las

características del ambiente contaminado. Por ejemplo, los fertilizantes solubles en

agua pueden tener una buena relación costo-beneficio en ambientes de baja energía

y/o de grano fino, donde el lavado por el agua de mar es limitado. En cambio, los

69


fertilizantes oleofílicos pueden ser más apropiados para utilizar en costas de alta

energía y grano grueso, con buena oxigenación. Por lo tanto, estos métodos poseen

una alta complejidad, ya que su efectividad depende de múltiples condiciones

ambientales. La aplicación exitosa de estos productos siempre requiere una

evaluación experimental previa en cada sitio a remediar.

El oxígeno también puede limitar la velocidad de biodegradación, dado que los

procesos de degradación de hidrocarburos son más eficientes en presencia de este

aceptor de electrones. En general, el oxígeno no limita la capacidad degradativa en

el medio ambiente marino, en particular en sedimentos con granulometría gruesa o

en costas con una alta energía. Sin embargo, cuando se trata de ambientes

saturados de agua o con sedimentos finos, el consumo de materia orgánica lleva

rápidamente a la anoxia, limitando el proceso biodegradativo [42]. Para asegurar una

disponibilidad adecuada de oxígeno se pueden adicionar compuestos químicos

como el peróxido de hidrógeno, o llevar a cabo el mezclado (tilling) de la matriz. Sin

embargo, estos métodos no suelen ser utilizados en el ambiente marino por su alto

costo y su naturaleza invasiva [109].

Cuando los microorganismos capaces de degradar los contaminantes no se

encuentran naturalmente en el ambiente se recurre a la bioaumentación, es decir, el

agregado de los mismos para acelerar los procesos naturales de remediación del

ambiente (Figura 20). En el medio ambiente marino, la presencia de

microorganismos capaces de degradar hidrocarburos es ubicua, y la implementación

de protocolos de bioaumentación resulta normalmente innecesaria. Los

microorganismos marinos han estado expuestos a los hidrocarburos a lo largo de su

evolución, y en consecuencia se han adaptado para utilizar hidrocarburos como

fuentes de carbono y energía. Existen preparaciones comerciales de

microorganismos que se ofrecen para acelerar el proceso de biodegradación. Sin

embargo numerosos estudios han demostrado que la bioaumentación no logra

incrementar a largo plazo la velocidad de biodegradación de estos compuestos [16].

Los microorganismos exógenos compiten pobremente con la comunidad microbiana

autóctona, por lo que su efecto suele ser muy breve [104, 109]. Además, la

percepción del público con respecto a la incorporación de microorganismos a un

ambiente natural es en general negativa. Sin embargo, la bioaumentación sí resulta

de utilidad en sistemas modificados por ingeniería, como por ejemplo en

70


bioreactores. Además, puede ser necesaria durante la biorremediación de

compuestos xenobióticos, los cuales no son compuestos naturales sino que han sido

sintetizados por el hombre. En este último caso, los microorganismos capaces de

degradar estos compuestos no se encuentran tan ampliamente distribuidos, ya que

no han tenido el tiempo necesario para adaptarse a degradar estos compuestos.

En resumen, la decisión de aplicar la biorremediación en un sitio depende de las

condiciones ambientales, microbiológicas y nutricionales presentes en el sitio a

remediar así como de los objetivos de protección del hábitat. Se debe tener en

cuenta la presencia de aceptores de electrones (como el oxígeno) y de nutrientes, la

presencia y actividad de los microorganismos degradadores, las características del

sito y las circunstancias del derrame.

71


Figura 20. Estrategias de biorremediación ambiental ante un derrame de petróleo en un ambiente costero.

72


14- CONCLUSIONES

En varios países, como por ejemplo Estados Unidos, Canadá o Gran Bretaña, la

biorremediación ha sido utilizada para la recuperación de sitios contaminados con

hidrocarburos. En nuestro país, en cambio, esta estrategia aún no ha sido

incorporada entre las herramientas de respuesta ante un derrame de hidrocarburos

en ambientes costeros [84]. En este libro intentamos resumir los aspectos más

relevantes relacionados con la remediación de ambientes costeros contaminados

con hidrocarburos, con énfasis en las tecnologías de biorremediación. El mismo está

destinado a las autoridades de aplicación de los planes de contingencia ante

derrames, a las autoridades nacionales y provinciales, y al público en general

interesado en estas temáticas.

A partir de los estudios microbiológicos que se han llevado a cabo en la región y

en el mundo, se desprenden cuáles serían algunas de las investigaciones y los

desarrollos tecnológicos que resultan necesarios para la aplicación de dichas

tecnologías en las costas Patagónicas:

• incrementar los conocimientos sobre las poblaciones microbianas claves

para la biodegradación de hidrocarburos de las costas Patagónicas, con

énfasis en las variaciones espaciales y temporales

• realizar estudios a escala de laboratorio para conocer la respuesta de

estas poblaciones microbianas ante un derrame

• identificar los factores limitantes de la capacidad degradativa del ambiente

en los distintos tipos de costas

• desarrollar herramientas de estudio de la capacidad degradativa del

ambiente y protocolos estandarizados de análisis

A pesar de los avances logrados en los últimos años, los conocimientos sobre

la capacidad degradativa de los ambientes costeros de la Patagonia son aún

fragmentados, y las líneas de investigación se encuentran en una etapa básica del

conocimiento científico. Sería necesario por lo tanto avanzar en la generación de

proyectos más aplicados e interdisciplinarios, y para ello sería de gran utilidad el

73


coordinar los esfuerzos individuales observados en la actualidad. Por ejemplo, se

podrían generar oportunidades de discusión sobre este tema, en el marco de

reuniones con formato de taller o mesa redonda, que incluyan expertos en las

distintas disciplinas involucradas en la biorremediación y distintos actores públicos y

privados. A partir de estas reuniones de trabajo, se podrían priorizar ciertas líneas de

desarrollo tecnológico, tendientes a generar protocolos de biorremediación

específicos para la región. El disponer de estos conocimientos, herramientas y

protocolos ya desarrollados y específicos para las costas Patagónicas será de gran

utilidad en caso de ocurrir un derrame de magnitud. Además, se podrían utilizar para

la remediación de los ambientes crónicamente contaminados presentes en nuestras

costas.

15- REFERENCIAS

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82


ANEXO

METODOLOGÍAS UTILIZADAS PARA EL ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS AMBIENTALES

La principal dificultad que existe para

estudiar a una comunidad microbiana es su

extrema complejidad, dado que está compuesta

por cientos o miles de microorganismos diferentes.

Por lo tanto, las metodologías utilizadas para su

estudio intentan simplificar el sistema en estudio

para permitir su análisis. Por ejemplo, el sistema

puede simplificarse estudiando un microorganismo a la vez, por medio de su

aislamiento en el laboratorio y su posterior caracterización [17]. Alternativamente,

puede simplificarse estudiando solamente un gen presente en todos o parte de los

microorganismos de la comunidad [46]. Sin embargo, los grandes avances

tecnológicos ocurridos en la última década, permiten el estudio de sistemas cada

vez más complejos, lográndose un conocimiento cada vez más profundo de las

comunidades microbianas [21, 35, 52, 102]. En las próximas secciones

describiremos las dos principales estrategias utilizadas para estudiar a los

microorganismos ambientales: métodos dependientes e independientes del cultivo

de microorganismos.

Métodos dependientes del cultivo de microorganismos

La obtención de microorganismos en cultivo representa el enfoque tradicional

de la microbiología ambiental. A pesar de la imposibilidad de cultivar la mayor parte

de los microorganismos ambientales, esta estrategia continúa siendo altamente

relevante, dado que sólo es posible conocer en detalle la fisiología y el metabolismo

de determinados grupos microbianos a partir del análisis de los microorganismos

aislados. El cultivo de un microorganismo también permite estudiar en detalle a sus

83


genes, por ejemplo por medio de la determinación de sus secuencias de nucleótidos.

Gracias al avance de las tecnologías de secuenciación, ahora es frecuente

determinar la secuencia completa del genoma de un microorganismo, el cual es el

conjunto de genes presentes en el mismo. Además, muchos de los microorganismos

que son cultivados en el laboratorio presentan características que los hacen útiles

para el ser humano, por medio de su aprovechamiento biotecnológico [24].

1- Enriquecimientos y aislamientos:

Cuando exponemos a una comunidad microbiana en el laboratorio a

condiciones particulares (por ejemplo por medio del agregado de hidrocarburos)

estamos favoreciendo el crecimiento de ciertos grupos microbianos que son

beneficiados por estas nuevas condiciones. A este tipo de incubación se la

denomina enriquecimiento, y es comúnmente el

primer paso realizado para el aislamiento de los

microorganismos ambientales. La comunidad

microbiana resultante, ya simplificada, puede ser

sometida a nuevos cultivos de enriquecimiento, o

sembradas en medios selectivos con el fin de

obtener cultivos puros. Estos microorganismos son

sembrados en al menos tres oportunidades para

asegurar su pureza, e inmediatamente preservados.

El medio de cultivo a utilizar dependerá del

tipo de microorganismo que deseamos aislar, y el

mismo será adicionado con un agente solidificante

para su cultivo en placas de Petri. Habitualmente,

se utiliza agar como agente solidificante, el cual es

un polisacárido obtenido a partir de algas marinas,

similar a la gelatina. Además de la siembra en

superficie en placas de Petri, se pueden realizar diluciones sucesivas en medio

líquido hasta aislar microorganismos individuales. También pueden separarse

células individuales en forma manual, e incorporarlas al medio de cultivo para su

crecimiento.

84


2- Nuevos métodos para el cultivo de los microorganismos:

Existen varias razones por las cuales la mayor parte de los microorganismos

ambientales no pueden ser cultivados en el laboratorio. Por ejemplo, se conoce muy

poco sobre los requerimientos nutricionales y ambientales de los microorganismos,

que suelen ser complejos. Los medios artificiales utilizados en el laboratorio

generalmente contienen concentraciones muy elevadas de nutrientes, alejadas de

las condiciones naturales presentes en el medio ambiente. Bajo estas condiciones,

los microorganismos de rápido crecimiento impiden el aislamiento de aquellos de

lento crecimiento, que son ecológicamente más relevantes. Además, al ser

separados en medios sólidos, los microorganismos pierden las interacciones

existentes entre los distintos miembros de la comunidad, a menudo esenciales para

su crecimiento. Debido a ello, muchos de los microorganismos capaces de crecer en

cultivos de enriquecimiento en medio líquido no son recuperados en los

aislamientos.

En los últimos años se han desarrollado varias metodologías de cultivo

novedosas, con el fin de aumentar el porcentaje de microorganismos que pueden

ser cultivados en el laboratorio. Estas estrategias incluyen el tratar de simular los

ambientes naturales, por ejemplo utilizando medios de cultivo con bajas

concentraciones de nutrientes, o realizando los cultivos de enriquecimiento en los

mismos ambientes, separados por sistemas de membranas [79]. Otra estrategia

consiste en utilizar largos tiempos de incubación luego de realizar diluciones de la

comunidad microbiana, o cultivar dos tipos celulares juntos para imitar las

interacciones naturales que ocurren en la comunidad. Gracias a estas estrategias,

se ha logrado incrementar de forma importante la recuperación de microorganismos

en cultivo a partir de las comunidades microbianas naturales.

Métodos independientes del cultivo de microorganismos

Dado que la mayoría de los microorganismos marinos (más del 99,9%)

actualmente no pueden cultivarse en el laboratorio utilizando métodos tradicionales,

desde hace ya varias décadas se han comenzado a desarrollar métodos que

permiten estudiarlos sin recurrir a su cultivo [24, 35, 46, 52, 102]. Si bien estas

metodologías tampoco se encuentran libres de desvíos, presentan la ventaja de

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permitir estudiar a las poblaciones microbianas, independientemente de si pueden

cultivarse o no en el laboratorio. Este tipo de estrategias aprovecha las diferencias

que existen en sus moléculas biológicas (por ejemplo ADN, ARN o proteínas) entre

los distintos microorganismos. Esto se debe a que las características morfológicas

varían muy poco entre los microorganismos, en particular en las bacterias y las

arqueas, por lo que estas características son de poca utilidad para la identificación

de los microorganismos ambientales.

El primer paso en las estrategias

independientes del cultivo suele ser la

ruptura de las células microbianas

presentes en la muestra ambiental, la cual

puede realizarse por ejemplo por acción

mecánica o de forma enzimática.

La ruptura celular es llevada a cabo

directamente a partir de la muestra

ambiental, sin un paso previo de extracción de los microorganismos de la muestra,

dado que muchos microorganismos están fuertemente unidos a la matriz ambiental

(por ejemplo los sedimentos) y por lo tanto resultan muy difíciles de separar. La

ruptura celular es seguida por la purificación de la o las biomoléculas elegidas. La

biomolécula más comúnmente utilizada es el ADN, debido a que es fácil de purificar,

es muy estable y existen numerosas metodologías

para su estudio.

MUESTRA AMBIENTAL

RUPTURA CELULAR

PURIFICACIÓN DE

BIOMOLÉCULAS

(ADN, ARN, PROTEÍNAS)

ANÁLISIS

Las distintas biomoléculas aportan diferente

tipo de información, de acuerdo a su función dentro

de la célula. Por ejemplo, el ADN almacena la

información genética del microorganismo, por lo que

su estudio informará sobre quienes son los

microorganismos presentes en la comunidad

microbiana, y qué es lo que podrían potencialmente

hacer, es decir, su potencial genético. En cambio,

cuando estudiamos el ARN mensajero (ARNm),

producto de la transcripción de estos genes y que

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resultarán en la biosíntesis de proteínas, estamos obteniendo información cada vez

más cercana sobre a la función que estarían cumpliendo los microorganismos dentro

de esta comunidad. Las proteínas forman parte de la estructura de las células, y

participan en los procesos metabólicos de las mismas, por lo que cumplen funciones

esenciales en las células microbianas. Debido a su función esencial para el

metabolismo de los microorganismos, el estudio de las proteínas aportará

información sobre los procesos realmente llevados a cabo en la comunidad.

Entonces, dependiendo de qué tipo de pregunta se desea responder, se

seleccionará una determinada biomolécula para su estudio.

¿Qué microorganismos integran la comunidad? ADN, ARNr

¿Qué es lo que pueden potencialmente hacer? ADN, ARNm

¿Qué es lo que están haciendo? PROTEÍNAS

PREGUNTA BIOMOLÉCULA

1- ¿Qué métodos se utilizan para identificar a los microorganismos que

integran una comunidad?

Para conocer quiénes son los microorganismos que integran una comunidad

microbiana, generalmente se utiliza como blanco de estudio al gen que codifica para

la subunidad pequeña del ARN ribosomal (gen ARNr 16S en procariotas y 18S en

eucariotas) [102]. El ARNr y las proteínas ribosomales conforman los ribosomas, los

cuales son responsables de la síntesis de las proteínas de la célula. Debido a la

función esencial de los ARNr, todas las células vivas contienen genes que codifican

para los ARNr 16S o 18S, a menudo en múltiples copias. Además, estos genes

contienen zonas que evolucionan muy lentamente (llamadas regiones conservadas)

y otras zonas que evolucionan rápidamente (llamadas regiones hipervariables), lo

que los hace ideales para estudiar las relaciones evolutivas que existen entre los

seres vivos, y también para identificar a los microorganismos.

La molécula de ARNr toma una estructura secundaria compleja dentro de los

ribosomas, al tomar contacto con las otras moléculas que integran esta estructura.

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Debido a ello,

algunas partes del

gen (las regiones

hipervariables)

pueden evolucionar

más rápidamente sin

afectar la función del

ribosoma, mientras

que otras regiones

del gen resultan más

conservadas

evolutivamente. Una

de las formas más

sencillas de estudiar

quiénes son los

microorganismos

que integran una

comunidad es

aprovechar estas

regiones altamente conservadas del gen para diseñar ensayos de reacción en

cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction). Esta reacción

consiste en la amplificación (multiplicación del número de copias) de un fragmento

del gen en cuestión, a partir del ADN purificado de la comunidad. Una vez

amplificados, estos fragmentos pueden ser separados o analizados utilizando

múltiples técnicas, aunque el objetivo final es determinar su secuencia. Estas

secuencias son luego comparadas con las existentes en bases de datos, obtenidas

a partir de microorganismos cultivados, para lograr así identificar el microorganismo

del cual proviene dicho gen, en este caso el del ARNr. Una de las metodologías más

modernas y poderosas desarrolladas para estudiar estos fragmentos amplificados

por PCR consiste en determinar su secuencia utilizando tecnologías de

secuenciación de segunda generación, de reciente desarrollo [38, 102]. Esta

estrategia presenta dos ventajas. En primer lugar permite analizar decenas de miles

de genes ARNr simultáneamente a partir de la comunidad, logrando así identificar

los microorganismos presentes con una profundidad de análisis adecuada para el

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estudio de comunidades microbianas complejas. En segundo lugar, permite estimar

qué tan abundantes son cada uno de los integrantes de la comunidad, basándose en

qué tan frecuentemente son detectados cada uno de los tipos de genes dentro de la

comunidad. Estos dos tipos de información (quiénes integran la comunidad y qué tan

abundantes son) es lo que se conoce como estructura de una comunidad

microbiana. Sin embargo, debido a las limitaciones de la técnica de PCR en este

sentido, este último punto puede presentar importantes desvíos con respecto a las

abundancias de las poblaciones naturales.

2- ¿Qué métodos se utilizan para evaluar el potencial metabólico de los

microorganismos que integran una comunidad?

Cuando el objetivo es estudiar la capacidad que presenta una comunidad

microbiana para llevar a cabo algún proceso en particular, como por ejemplo la

biodegradación de una sustancia contaminante, se utiliza como blanco de análisis un

gen que esté directamente relacionado con este proceso. La degradación de las

sustancias contaminantes es llevada a cabo a través de una serie de reacciones

enzimáticas que van transformando a los compuestos biodegradados en estructuras

cada vez más sencillas. En el caso de las bacterias que utilizan hidrocarburos como

sustrato para su crecimiento, habitualmente se estudian los genes que codifican a

alguna de las enzimas que forman parte de de las vías degradativas de estos

compuestos [46]. A estos genes se los llama biomarcadores.

¿QUÉ ES UN GEN BIOMARCADOR?

Un gen biomarcador es un gen que se encuentra asociado a una actividad

de interés, y por lo tanto es elegido como blanco de estudios

moleculares. El biomarcador proveerá información sobre la capacidad

para ejercer la actividad de interés en la comunidad en estudio. En el

caso de la biodegradación de hidrocarburos, se utilizan genes que

codifican para enzimas oxigenasas, las cuales catalizan el primer paso de

la ruta degradativa de estos compuestos en condiciones aeróbicas [46].

89


90

Una forma de estudiar estos genes es amplificarlos por PCR, como se explicó

anteriormente, y analizar los fragmentos amplificados utilizando diversas

metodologías moleculares. Por ejemplo, es posible saber si el gen biomarcador está

presente en la comunidad (en concentraciones superiores al límite de detección de

la técnica), y es posible conocer la secuencia de los fragmentos amplificados. Para

ello, generalmente los fragmentos son clonados y multiplicados en una célula

hospedadora, habitualmente Escherichia coli, lo cual permite su posterior análisis.

Una mejora de esta técnica básica ha permitido utilizar la técnica de PCR para

estimar la abundancia del gen biomarcador dentro de la comunidad de forma rápida

y precisa. Esta técnica es llamada PCR cuantitativa, o qPCR (del inglés quantitative

PCR). Es importante volver a resaltar que la presencia de dichos genes sólo es

indicativa del potencial metabólico de la comunidad en estudio, y no garantiza la

actividad metabólica de interés en el ambiente contaminado, la cual depende de que

se den las condiciones favorables [100]. Sin embargo, un aumento en la abundancia

de determinados genes es indicativa de una selección de poblaciones que puede

relacionarse con un proceso biodegradativo (por ejemplo mediante la disminución de

los niveles del contaminante). La qPCR es considerada la opción más adecuada

para ser utilizada a campo durante la biorremediación ambiental [53, 100]. Esto es

debido a que permite obtener información sobre la abundancia de los

microorganismos directamente involucrados con la biodegradación, y pueden

analizarse un gran número de muestras de forma rápida. El principal problema para

su implementación radica en la falta de información sobre los biomarcadores del

proceso, por lo que más estudios resultan necesarios para poder implementar este

tipo de análisis microbiológicos.

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Toma de muestras

Extracción de ADN

Amplificación del gen

biomarcador

Clonado de los fragmentos

amplificados

Secuenciación de los

fragmentos amplificados

Análisis filogenético de las secuencias

Análisis fisico-

químicos y ambientales

Métodos dependientes del

cultivo de microorganismos

Análisis de las poblaciones microbianas degradadoras de hidrocarburos utilizando una estrategia independiente del cultivo de microorganismos (flechas amarillas), complementado con el análisis de las características del sitio muestreado (flecha celeste), y el aislamiento de microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos como sustratos para su crecimiento (flecha anaranjada).


Las técnicas de secuenciación de segunda generación también pueden ser

utilizadas para obtener las secuencias de fragmentos al azar del ADN purificado a

partir de la comunidad [35]. Esta estrategia, denominada metagenómica, permite

caracterizar en gran profundidad a la comunidad microbiana, y muchas veces

reconstruir genomas completos de los organismos más abundantes, permitiendo así

comenzar a comprender principios básicos de su funcionamiento que pueden

favorecer el desarrollo de tecnologías de biorremediación. Otra estrategia que ha

sido posible sólo a partir del desarrollo de las tecnologías de secuenciación de

segunda generación ha sido la secuenciación de gran parte de los genes de una

única célula, elegida y separada a partir de una comunidad microbiana [52]. Esta

estrategia, llamada genómica de células individuales (del inglés single-cell

genomics), es a menudo utilizada de forma complementaria con la estrategia

metagenómica.

METAGENÓMICA Y GENÓMICA DE CÉLULAS

INDIVIDUALES

Comunidadmicrobiana

ADN

SecuenciaciónADN

Secuenciación

METAGENÓMICAGENÓMICA DE CÉLULAS INDIVIDUALES

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Otras biomoléculas que pueden utilizarse como blanco de los análisis

moleculares son los transcriptos de los genes biomarcadores (ARN mensajero) o las

proteínas sintetizadas a partir de los mismos, es decir las mismas enzimas que

participan de la vía degradativa del hidrocarburo. Si bien estas biomoléculas aportan

una información más cercana a la actividad de interés, su estudio resulta mucho más

complejo y hasta el momento han sido poco utilizadas en el contexto de la

remediación de sitios contaminados.

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biorremediacion de ambientes costeros

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