biofuel, enzimas. informe de lab oratorio

8/3/2019 Biofuel, Enzimas. Informe de Lab Oratorio.

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Prctica BiofuelEfectos en la velocidad de reaccinenzimtica

Esta prctica se realiz con la finalidad de determinarqu factores afectan a la actividad enzimtica.

Mesa 4: Alejandro Trillo Prez; AlejandroMartnez Carballo; Oscar Da Silva Gmez,Daniel Gil Artabe19/12/2011


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PRCTICA 1

DETERMINACIN CUALITATIVA DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO.

Tabla 1. Comparacin de las cubetas de reaccin a las cubetas estndar.

TIEMPO (min) CUBETA ESTNDAR QUE ESMS SIMILAR

CANTIDAD DE p-nitrofenol (nmol)

0 Inicio S1 0

8 Fin S1 0

1 E1 S2 0

2 E2 S3 12,5

4 E3 S4 25

6 E4 S4 50

8 E5 S5 100

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO.

1. Localizar las cinco cubetas de los estndar etiquetados S1-S5 en su mesa delaboratorio, sus concentraciones se observan en la Tabla 1. El blanco delespectrofotmetro a 410 nm se realiza con la cubeta S1. A continuacin, medir yregistrar la absorbancia a 410nm para el resto de estndar en el cuadro 3. Se usaresta informacin para generar una curva que relaciona la absorbancia a 410 nm con la

cantidad presente de p-nitrofenol.

Tabla 3. Valores de absorbancia de las normas.

ESTNDAR CANTIDAD DE p-nitrifenol ABSORBANCIA A 410 nmS1 0 0,063S2 12.5 0,247S3 25 0,448S4 50 0,853S5 100 1,666

2. Medir la absorbancia de la cubeta de reaccin catalizada pro la enzima (E1-E5) y sucubeta de control (Inicio-Fin) a 410 nm, y registrar sus resultados en la Tabla 4. Usted usaresta informacin para determinar la cantidad de producto, p-nitrofenol, formado en lascubetas de reaccin.


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Tabla 4. La determinacin de p-nitrofenol producidos utilizando una curva estndar.

TIEMPO (mn) CUBETA CANTIDAD DE p-nitrofenol (nmol)

Absorbacia a410nm

0 Inicio 4.9 0.083

8 Fin 4.9 0,0831 E1 44.1 0,742

2 E2 76.7 1,291

4 E3 129.7 2,183

6 E4 139.2 2,343

8 E5 169.0 2,844

3. Determinar (nmol) de producto formado a partir de los valores de absorbancia. Laabsorcin del producto, p-nitrofenol, est directamente relacionado con la cantidad actualde nitrofenol en la cubeta. En otras palabras, la solucin ms amarilla, la que ms p-nitrofenol tiene y mayor ser su valor de absorbacia a 410 nm. Trazando los valores de

absorbancia de los estndares con cantidades conocidas de p-nitrofenol (llamada curvaestndar), puede determinar la cantidad de p-nitrofenol que est presente en la enzimamuestras de ensayo.

Grfica 1.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Concentracindep-nitrofenol(nmol)

Absorbancia


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Grfica 2.

ANLISIS DE LOS RESULTADOS.

1. Tasa inicial de formacin de producto

Al comienzo de la reaccin, hay un montn de sustrato para la enzima. Sin embargo, como la

reaccin progresa, hay menos sustrato disponible, porque se est convirtiendo en producto. Si

el grfico da la cantidad de producto formado en cada momento, los datos pueden ser

utilizados para calcular el tipo inicial del producto que se forma en la presencia o ausencia de

la enzima.

En la grfica 3, la cantidad de producto, p-nitrofenol, se traza a travs del tiempo para

determinar la cantidad inicial de producto formado. La unidad de velocidad es nmol / min.

Grfica 3.

0

20

40

60

80

100

120

0 0.5 1 1.5 2

Absorbancia410nm

Concentracin S1-S5

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 2 4 6 8 10

Concentracinp-nitrofenol

(nmol)

Tiempo


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La grfica 3. Ejemplo de una curva para una reaccin enzimtica. La cantidad de producto

elaborado en funcin del tiempo para determinar la velocidad inicial de reaccin.

Hay una regin donde la cantidad de producto formado aumenta de forma lineal. Esto se llama

la velocidad inicial de reaccin. En el grfico anterior, esta regin es lineal entre 0 y 4 minutos.

Tambin observamos que entre el minuto 6 y 8 la concentracin no debera mantenerse paraposteriormente volver a subir, en teora debera mantenerse ya que ya no hay ms sustrato.

Tasa inicial de formacin de producto = pendiente de la recta y = cambio en y / cambio en x

Tasa inicial de formacin de producto= (169.0-0)/ (4-0)= 42.25 nmol/min

PRCTICA 2

ANLISIS CUANTITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES TEMPERATURAS.

1. Deberamos tener 5 cubetas del estndar S1-S5 (patrones colorimtricos realizados en la

actividad 1). Comparamos los ensayos anteriores con los patrones y relacionamos cuales son

semejantes.

2. Hacemos una tabla con las temperaturas, el estndar que ms se le parece, y la

concentracin del patrn.

Temperatura Patrn similar Concentracin del patrn

0 C S4 50

22 C S5* 100

37 C S5* 100

ANLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES TEMPERATURAS.

1. Hacemos un blanco en el espectrofotmetro con el estndar S1 a 410nm y medimos la

absorbancia de las 3 muestras.

2. Hacemos una tabla con los resultados.

Temperatura Absorbancia a 410 nm. Concentracin del producto

formado

0C 0.933 55.7

22C 2.503 149.4

37 C 2.636 157.3


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ANLISIS DEL RESULTADO.

1. Calculamos la velocidad de reaccin a cada una de las diferentes temperaturas. Como slo

se puede medir una cantidad de patrn a los dos minutos, asumimos que la cantidad de patrnes de 0 nM.

CLCULOS.

PRODUCCIN INICIAL A 0 C = (55.7 0 nmol) / (2 0 min) = 27.85 nmol/min



Representamos grficamente la velocidad de reaccin enzimtica.

ANLISIS DE LOS RESULTADOS

En la grfica se refleja como las temperaturas ms altas actan como catalizador para

que la velocidad de reaccin sea mayor.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Velocidaddereaccin

Temperatura


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Practica 3

Determinacin de p-nitrofenol producido en tres deferentes valoraciones de pH basado en las

normas de p-nitrofenol.

pH Patrn ms parecido Concentracin dep-notrofenol

5.0 S5 100

6.3 S5* 100

8.6 S5* 100

*Ms oscuro.

ANLISIS CUANTITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO EN DIFERENTES

NIVELES DE PH.

pH Absorbancia (410 nm) Concentracin dep-nitrofenol

5.0 1.515 90.4

6.3 1.734 103.5

8.6 1.373 81.9

Representacin grfica del efecto del pH a la concentracin.

pH Velocidad de reaccin5.0 45.2

6.3 51.75

8.6 40.95

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10

Concentraciondep

-nitrofenol

(nmol/min

)

pH


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PRCTICA 4:

ANLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ENZIMA.

1. Deberamos tener 5 cubetas del estndar S1-S5 (patrones colorimtricos realizados en laactividad 1). Comparamos los ensayos anteriores con los patrones y relacionamos cuales son

semejantes.

TABLA1. PATRONES DE P-NITROFENOL.

ESTNDAR CANTIDAD DE p-nitrifenol ABSORBANCIA A 410 nmS1 0 0,063S2 12.5 0,247S3 25 0,448

S4 50 0,853

S5 100 1,666

2. Hacer un blanco en el espectrofotmetro con el S1 a 410nm y mide la absorbancia de las

seis cubetas obtenidas, y anotar la absorbancia.

Cubeta Absorbancia concentracin p-nitrofenol

Tiempo (min)

H1 1.144 68.3 1

H2 1,147 68.4 2

H3 1,325 79.1 8

L1 0,765 45.7 1

L2 0,771 46.0 2

L3 0,967 57.7 8

3. Calcular la cantidad de p-nitrofenol.

Tasa inicial es 68.3 nmol/min para concentracin alta

Tasa inicial para concentracin baja 45.7 nmol/min


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Grfica.

PRCTICA 5

ANLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ENZIMA.

1. Deberamos tener 5 cubetas del estndar S1-S5 (patrones colorimtricos realizados en la

actividad 1). Comparamos los ensayos anteriores con los patrones y relacionamos cuales sonsemejantes.

2. Hacer un blanco en el espectrofotmetro con el S1 a 410nm y mide la absorbancia de las

seis cubetas obtenidas, y anotar la absorbancia

Cubeta Concentracin de p-nitrofenol Absorbancia Tiempo(min)

H1 60.9 1.021 1

H2 115.9 1.942 2

H3 169.4 2,839 8L1 21.0 0.352 1

L2 35.9 0.601 2

L3 67.9 1,138 8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10

Cantidadp-nitrofeno

l

Tiempo(min)


10/10

Grfica.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 2 4 6 8 10

Cantidadp-nitrofeno

l

Tiempo (min)

Alta

Baja

biofuel, enzimas. informe de lab oratorio

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