biofertilizantes_caraotas

8/3/2019 BIOFERTILIZANTES_CARAOTAS

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MEJORAMIENTO GENÉTICO DE LA CARAOTA MEJORAMIENTO GENÉTICO DE LA CARAOTA

SubproyectoEstudio y aplicación de microorganismos tipo biofertilizante:

Micorrizas Arbusculares y Rhizobium como una estrategia paraincrementar la productividad de Phaseolus vulgaris en suelos ácidos

Marcia Toro y Edith MoraFacultad de Ciencias

Universidad Central de Venezuela



La caraota (Phaseolus vulgaris ) es una legu-

minosa alto interés comestible en los paísestropicales. Las plantas de la familia Legumi-nosae poseen la particularidad de asociarsecon bacterias gram negativas de los génerosRhizobium y Bradyrhzobium en estructuras

denominadas nódulos ubicadas en la raíz.

Ello permite captar el N2 atmosférico y trans-

formarlo en formas asimilables para la planta,constituyendo un importante mecanismo parala nutrición del N



Cortesía Prof. José Miguel Barea Estación Experimental del Zaidín

TTambiambiéénn sese asocian con Micorrizasasocian con Micorrizas Arbusculares (MA), simbiosis con Arbusculares (MA), simbiosis con--

formada por hongosformada por hongos ZigomicetesZigomicetesque habitan en el suelo y queque habitan en el suelo y que sumisumi--nistrannistran a la planta P gracias a la exa la planta P gracias a la extensa red de micelio del hongo quetensa red de micelio del hongo que

se extiende fuera de la rase extiende fuera de la raíízz



LasLas leguminosasleguminosas conformanconforman unun interesanteinteresante grupogrupo dede plantasplantas con lacon la particularidadparticularidaddede poseerposeer unauna simbiosis simbiosis tripartita tripartita : la: la plantaplanta,, Rhizobium Rhizobium y MA, y MA, queque lele garantizagarantiza lalanutricinutricióónn de dosde dos macronutrientesmacronutrientes escencialesescenciales: N y P; de: N y P; de allallíí queque estosestos micoroorgamicoroorga--nismosnismos sese conozcanconozcan comocomo biofertilizantesbiofertilizantes..

ElEl interinterééss sobresobre ééstasta simbiosissimbiosis y y susu interacciinteraccióónn concon MicorrizasMicorrizas Arbusculares Arbusculares seseacentacentúúaa enen suelossuelos pocopoco f f éértilesrtiles comocomo loslos mencionadosmencionados,, puespues lala captacicaptacióónn del N adel N atrav trav ééss de la bacteriade la bacteria Rhizobium Rhizobium constituyeconstituye unun procesoproceso altamentealtamente costosocostoso parapara lala

plantaplanta desdedesde elel puntopunto de vistade vista metabmetabóólicolico ((unauna molmolééculacula de Nde N22 fijadafijada requiererequiere dedeunasunas 2020 molmolééculasculas de ATP).de ATP).

EsteEste costocosto sese ver verííaa compensadocompensado con lacon la asociaciasociacióónn con MA,con MA, especializadasespecializadas en capen cap--tar P entar P en suelossuelos pocopoco f f éértilesrtiles..



Rhizobium Rhizobium y MA para mejorar y MA para mejoraráánn el estado nutricional de la planta en suelosel estado nutricional de la planta en suelos áácidoscidosde baja fertilidad como los predominantes en Venezuela, dede baja fertilidad como los predominantes en Venezuela, de acuerdo a suacuerdo a su habilidadhabilidadcompetitiva para colonizar la racompetitiva para colonizar la raííz de la planta mz de la planta máás eficientemente que otross eficientemente que otros comcom--ponentes de la microbiota del suelo.ponentes de la microbiota del suelo.

PorPor lo tanto es importante la caracterizacilo tanto es importante la caracterizacióónn y la colonizaci y la colonizacióón rizosf n rizosf éérica por losrica por los

microorganismos seleccionados para determinar el destino demicroorganismos seleccionados para determinar el destino de ééstos cuando son instos cuando son in--troducidostroducidos en el suelo.en el suelo.



En los estudios conEn los estudios con Rhizobium Rhizobium ::

El uso de metodologEl uso de metodologíías alternativas como las basadas en la aplicacias alternativas como las basadas en la aplicacióón den de isoenziisoenzi--mmasas::

αβαβαβαβαβαβαβαβ--esterasaesterasamalatomalato deshidrogenasadeshidrogenasaSorbitolSorbitol deshidrogenasadeshidrogenasa

Arabinosa Arabinosa deshidrogenasadeshidrogenasaGlucosa 6Glucosa 6--PP deshidrogenasadeshidrogenasaFosfoglucomutasaFosfoglucomutasaSuperSuperóóxidoxido dismutasadismutasaLeucinaLeucina aminopeptidasaaminopeptidasaProlinaProlina aminopeptidasaminopeptidasaa

para la determinacipara la determinacióón den de relaciones genrelaciones genééticasticasentre los distintosentre los distintos Rhizobium Rhizobium , o, o enen el desarrolloel desarrollo

de metodologde metodologííaas bioqus bioquíímicas ymicas ymoleculares para detectar diferenciasmoleculares para detectar diferenciasgengenóómicas intrmicas intríínsecas entre las cepasnsecas entre las cepas

estudiadas.estudiadas.



EnEn micorrizasmicorrizas ha permitido:ha permitido:

** La separación deLa separación de proteinasproteinas fungicasfungicas de lade la EctomicorrizaEctomicorriza Pisolitus Pisolitus --EucaliptoEucalipto** Detección deDetección de isoenzimasisoenzimas específicas de plantas:específicas de plantas: fosfatasafosfatasa ácida y alcalina enácida y alcalina en

raícesraíces micorrizadasmicorrizadas** Estudios de genética de poblaciones enEstudios de genética de poblaciones en ectoecto y y endomicorrizasendomicorrizas** Identificación de diferentes simbiontes enIdentificación de diferentes simbiontes en endoendo y y ectomicorrizasectomicorrizas

Metodología con potencialidades para el estudio de la relación p Metodología con potencialidades para el estudio de la relación p lanta lanta - - hospedero hospedero

a niveles bioquímicos y ecológicos a niveles bioquímicos y ecológicos

El análisis de lasEl análisis de las isoenzimasisoenzimas a través de la electroforesisa través de la electroforesis herraherra--

mienta valiosa en estudios de genética de poblaciones demienta valiosa en estudios de genética de poblaciones de bactebacte--riasrias, plantas y hongos, plantas y hongos



Para la identificación de la colonización por micorrizas el análisis por

isoenzimas permite identificar la presencia de uno ó más hongos en con-junto. El análisis de las enzimas El análisis de las enzimas Peptidasa Peptidasa (PEP),(PEP), Glutamato Glutamato oxaloacetato oxaloacetato

transaminasa transaminasa (GOT) y (GOT) y Esterasa Esterasa (EST) en el hongo y la planta se (EST) en el hongo y la planta se identifi identifi - -

caron caron diferencialmente en raíces colonizadas ó no diferencialmente en raíces colonizadas ó no ((RosendahlRosendahl && HepperHepper,,1987).1987).

En estudios de microcosmos el análisis isoenzimático permitió verificar quehongos MA ya inoculados prevenían de forma efectiva la colonización deotro hongo introducido.

RosendahlRosendahl (1992) logró separar los componentes proteicos del hongo y de l(1992) logró separar los componentes proteicos del hongo y de laaplanta y estudiarlos por separado por la posterior aplicación deplanta y estudiarlos por separado por la posterior aplicación de lalaelectroforésiselectroforésis..



En este proyecto nuestro interEn este proyecto nuestro interéés se centra en los siguientes aspectos:s se centra en los siguientes aspectos:1)1) Aislar y caracterizar cepas de Aislar y caracterizar cepas de Rhizobium Rhizobium afines aafines a Phaseolus Phaseolus vulgaris vulgaris nativas denativas desuelossuelos áácidoscidos

2)2) Aislar y caracterizar especies de hongos de MA afines a Aislar y caracterizar especies de hongos de MA afines a Phaseolus Phaseolus vulgaris vulgaris y ynativos de suelosnativos de suelos áácidoscidos

3)3) Establecer combinaciones de ambos simbiontes:Establecer combinaciones de ambos simbiontes: Rhizobium Rhizobium y MA y evaluar la y MA y evaluar lamejor combinacimejor combinacióón en parn en paráámetros fisiolmetros fisiolóógicos como: altura, produccigicos como: altura, produccióón de materian de materiaseca, contenido de N y P y la producciseca, contenido de N y P y la produccióón den de ureureíídosdos y y alfamidasalfamidas..

4)4) Detectar isoenzimas especieDetectar isoenzimas especie--especespecííficas inducidas porficas inducidas por Rhizobium Rhizobium y/o MA y/o MA para utilizar como marcadores bioqupara utilizar como marcadores bioquíímicos.micos.5)5) Estudiar los patronesEstudiar los patrones isoenzimisoenzimááticosticos de las plantas dede las plantas de P.P. vulgaris vulgaris que puedanque puedan

ser utilizados para el seguimiento del estado y actividad de losser utilizados para el seguimiento del estado y actividad de los biofertilizantesbiofertilizantesseleccionados.seleccionados.



RESULTADOS



Cepa Cantidad

de goma

Textura Forma Apariencia

CENIAP 002 Intermedia Elástica Redondeada Brillante

CENIAP 005 Intermedia Cremosa Redondeada Brillante

CENIAP 008 Escasa Seca Plana Opaca

CENIAP 018 Abundante Cremosa Redondeada Brillante- Translucida

UCV 001 Abundante Cremosa Redondeada Brillante-

Translucida

UCV 002 Abundante Cremosa Redondeada Brillante-

Translucida

UCV 003 Abundante Cremosa Redondeada Brillante- Translucida

CIAT 899 Abundante Cremosa Redondeada Brillante-

Translucida

Resultados:Resultados:

Caracterización de las cepas deCaracterización de las cepas deRhizobium Rhizobium

Observación de las cepas en el medio de crecimiento ELMARC

Todas las cepas viraron el medio al color amarillo indicando capacidad deacidificar el medio. La prueba de la leche tornasolada confirmó su pureza.





Debido a que varias de las cepas de Rhizobium provienen de zonascon características edáficas similares y la caracterización morfológicano es suficiente para diferenciarlas a nivel de especie se procedió arealizar la determinación de la variabilidad genética de las cepas contécnicas moleculares. Se aplicó la metodología de Polimorfismos de

ADN amplificados aleatoriamente (RAPD’s), utilizando los siguientesprimers: OPA, PB, PC, OPE, OPF, OPJ, OPM, OPP y PJ

A = Amplificó el primer--- = No Amplificó el primer





Cep

/Prime

OPA PB P

C

OP

E

OPF OPJ OPM OPP PJ

2 4 9 17 06 07 13 02 12 1

4

01 02 4 05 06 20 0

1

07 03

CEN2

-

-

-

A ---

-

CEN5

-

-

-

--

-

---

-

CEN 8

A --

-

A ---

-

---

-

---

-

---

-

---- ---- -

-

-

---- ---- -

-

-

-

---

-

---

-

---

-

--

--

---

-

---

-

CEN18

-

-

-

--

-

---

-

UCV 001

A --

-

---

-

UCV 002

A A A ---

-

---

-

---

-

A ---- ---- -

-

-

-

---- ---- -

-

-

-

---

-

---

-

---

-

--

--

---

-

---

-

UCV 003

-

-

-

--

-

---

-

CIA

T899

A --

-

A



Resultados:Resultados:Selección de cepas deSelección de cepas de Rhizobium Rhizobium

Sòlo algunas de las cepas ò ecotipos amplificaron con algunosprimers: OPA, PB y PC

Los resultados no son concluyentes pues habría que probar con otrosprimers que permitan una mejor amplificación y así tener más herramientas

para la separación de los ecotipos. Se continuó el trabajo con las cepas deRhizobium ya señaladas




Selección de variedades deSelección de variedades dePhaseolus Phaseolus vulgaris vulgaris

Espectro de Luz Visible

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

Longi tud de Onda (nm)

Cep M2

Cep M5

Cep M8

Cep M18

Cep M45

Cep UCV 1

Cep UCV 2

Cep UCV 3

El promedio de longitud de onda en el que presentaronla mayor absorbancia la mayoría de las cepas es 420 nmen el barrido espectral





Para los organismosunicelulares esproporcional larelación entre elnúmero de colonias

y las unidadesfotométricas, por lo

cual la turbidezpuede utilizarsecomo un sustitutopara otros métodos

de contajes.

y = 36123x + 1016,6

R2 = 0,9927

y = 49186x + 7097,8

R2 = 0,9992

y = 225273x + 19228

R2 = 0,9997

y = 322532x + 22005

R2 = 0,9992

y = 2E+06x + 5349,7

R2 = 1

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

-0,1000 0,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000 0,5000 0,6000 0,7000 0,8000

Absorbancia

U F C

m l - 1

Cp 1 Cp 3

Cp 10 Cp 17

Cp 19 Cp 21

Curvas estándar de las cepas





Se seleccionaron las siguientes variedades de Phaseolus vulgaris:

Selec. 13 Línea 140 Salih MGM 01-98-016Selec. 07 Tacarigua DOR 500 Colombia

MGM 08-02-044

Siete variedades en total a las que se realizará inoculaciòn cruzada con

todas las cepas de Rhizobium señaladas



Resultados: Selección de cepas deResultados: Selección de cepas de Rhizobium Rhizobium

Sin Rh + N

Sin Rh SinN

CIAT 899

UCV 003

UCV 002

UCV 001

CENIAP 018

CENIAP 008

CENIAP 005

CENIAP 002

MGM

01-98-016

TenerifeLínea 140Salih

DOR 500Colombia

MGM 08-02-044

Sele.7

Sele. 13Cepa\

Variedad



Resultados: SelecciónResultados: Selección

de cepas dede cepas deRhizobium Rhizobium

Ensayo de variedadesde Caraota en la cámarade crecimiento



Una vez desarrolladas las plantas por un lapso de 6 semanas, se cortará el vástago y se determinará el contenido de Nitrógeno total, Nª y peso de

nódulos, y contenido de ureidos para cuantificar la eficiencia de lascepas en la fijación biológicas del N2

FASE EN EJECUCIÓN



Se seleccionaron las especies de hongo de micorriza arbuscular ainocular en la fase siguiente a la caracterización con Rhizobium

Acaulospora mellea

Scutellospora heterogama

Típicas de suelos ácidos de sabana

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