Universidad Central de VenezuelaFacultad de MedicinaEscuela “Luis Razetti”Cátedra de Bioquímica

FOSFORILACIÓN OXIDATIVA Y CICLO DE KREBS

Prof. Carlos González

Prof. María del Rosario Sánchez

Febrero, 2006

Para el momento actual en el mundo científico se acepta que las leyes de la Física y la Química son aplicables al mundo biológico. Lo mismo sucede con las leyes de la Termodinámica, ciencia que estudia los intercambios de energía entre los sistemas, los cuales son constituidos por una cantidad de materia con límites definidos mientras que el entorno incluye a todo el resto del universo (no contenido en el sistema).

La aplicación de los principios termodinámicos a la materia viviente se denomina Bioenergética. Ella se ocupa del estudio de 1os intercambios de energía en la materia viviente.

Seres autótrofos y heterótrofos

Cuando se considera la fuente de la cual derivan los seres vivientes la energía necesaria, estos se pueden dividir en dos clases: autótrofos y heterótrofos (Fig. 1). Los primeros son capaces de utilizar sustancias simples come CO2 y H2O y por medio de la energía de la luz solar, sintetizar componentes celulares en un proceso denominado fotosíntesis. Los heterótrofos no pueden utilizar la energía solar y derivan la energía

que necesitan de la combustión de moléculas más o menos complejas sintetizadas por los autótrofos. Por lo tanto, a fin de cuentas, es el sol la fuente de energía utilizada por los seres vivos para sintetizar moléculas complejas a partir de otras muy sencillas. Estas moléculas complejas pueden, a su vez, ser utilizadas como fuente de energía y vuelven a dar moléculas pequeñas (Fig. 2). Este proceso degradativo se denomina catabolismo y de allí deriva el mundo biológico la energía necesaria para realizar trabajo químico, mecánico, etc.

Fig. 1: Fuentes de carbono y energía para el metabolismo.

Cuando un ser vivo muere otros seres vivos utilizan esa materia como fuente de energía, produciendo moléculas pequeñas. De tal manera, que la energía de la luz solar se utiliza para mantener el mundo viviente y al final, cuando los organismos vivos mueren, es disipada en el entorno.

La célula y los procesos metabólicos

La unidad por medio de la cual el mundo biológico realiza este intercambio de energía es la célula, la cual contiene moléculas de variados tamaños y funciones con un grado fabuloso de organización. Se puede por lo tanto afirmar que la célula es un estado muy especial de la materia: altamente organizado y sin embargo, sujeto a

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cambios incesantes. La célula esta continuamente intercambiando moléculas con su ambiente y a pesar de ello las moléculas en su interior se mantienen dentro de limites estrechos de concentración. Este hecho es el resultado de que para una determinada sustancia, la velocidad con la cual es modificada, degradada o excluida de la célula se balancea casi exactamente con la velocidad con la cual es introducida en la célula o

Fig. 2: Características del metabolismo.

sintetizada por ella. De allí que se diga que la célula se encuentra en un “estado fijo dinámico”. Es evidente, entonces, que en una célula están sucediendo muchas reacciones químicas simultáneamente. Estas reacciones químicas son catalizadas por enzimas que conforman generalmente vías metabólicas, en las cuales la molécula producto de una reacción enzimática es a su vez el sustrato de la próxima enzima de la vía y así sucesivamente. Las vías metabólicas se dividen para su estudio en:

a.- Catabólicas, que son aquellas en las cuales hay conversión de moléculas en otras más sencillas y

b.- Anabólicas, en las cuales moléculas sencillas terminan dando otras moléculas más complejas o macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos, etc.

Papel del ATP en el intercambio de energía

El continuo recambio de los componentes celulares implica una estrecha relación entre la liberación celular de la energía química necesaria y su utilización. En forma

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general se puede afirmar que los procesos catabólicos generan energía libre, la cual es utilizada para la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi, mientras que los procesos anabólicos utilizan la energía del ATP y producen ADP y Pi.

Se puede, por lo tanto, visualizar al ATP como el eslabón que encadena las reacciones catabólicas lieradoras de energía libre y las reacciones anabólicas consumidoras de esa energía libre.

Es importante destacar que la célula consume energía libre (trabajo) en otros procesos además de las reacciones anabólicas o de biosíntesis. Tal es el caso del transporte activo de iones o de la contracción muscular.

Fig. 3: Papel del ATP en el metabolismo

Para comprender las relaciones energéticas de la síntesis y utilización del ATP es necesario recordar algunas nociones de termodinámica.

ALGUNOS PRINCIPIOS DE TERMODINÁMICA

Calcular la cantidad de energía contenida en un sistema determinado es un problema muy difícil, si no imposible. Pero el cálculo de la diferencia de energía entre el estado inicial de un sistema y su estado final al alcanzar el equilibrio, es a menudo bastante sencillo. Es decir, es posible saber qué cantidad de energía es intercambiada entre un sistema y su entorno.

La primera ley de la termodinámica establece que la energía se conserva, es decir no puede ser creada ni destruida. De este postulado se desprende que una forma de energía puede ser transformada en otra. Por ejemplo la energía química de una batería puede convertirse en energía eléctrica y ésta a su vez, en la energía mecánica de un motor. Es importante señalar que, cuando hay transferencia de energía de un sistema a otro, una parte de la energía se disipa finalmente como calor. Por ejemplo, si se impulsa una rueda, esta no continua girando indefinidamente, sino que al cabo de cierto tiempo se detiene debido al roce.

La segunda ley de la termodinámica establece que no es posible transformar íntegramente el calor en trabajo. Esto puede ser ilustrado con un ejemplo: si un gas contenido en un recipiente a una determinada presión se pone en contacto, por medio de un agujero, con otro recipiente al vacío, el gas llena el recipiente vacío hasta que se igualen las presiones en ambos recipientes. Una vez que se ha llegado a este estado de equilibrio ya no hay más modificaciones en la presión, es decir, no es posible que,

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sin influencia externa, el gas vuelva a llenar un solo recipiente y deje el otro vacío.

Concepto de Entropía

Se preguntará ¿Y esto qué tiene que ver con el calor? Lo que sucede es que en este ejemplo esta interviniendo otra condición de la materia y la energía, que se conoce como entropía y se define en términos simples como el grado de desorden en un sistema. En este caso la entropía del sistema ha aumentado, puesto que al aumentar el volumen para el mismo número de moléculas el sistema esta más desordenado.

Por otra parte, la segunda ley establece que los procesos físicos o químicos suceden en el sentido en que la entropía aumenta hasta el punto en que se alcanza el equilibrio y que estos procesos son irreversibles, ya que la entropía del universo siempre aumenta. Si en el ejemplo, a temperatura constante, se quisiera volver a la situación inicial, con un recipiente con gas y otro vacío, habría que suministrar más energía que la absorbida originalmente porque la entropía estaría disminuyendo y esto contradice la segunda ley de la termodinámica. Si en un sistema la entropía disminuye, en el entorno del sistema la entropía tendría que aumentar algo más para que se cumpla el postulado de que la entropía del universo aumenta.

Concepto de energía libre

En los sistemas biológicos la presión y la temperatura se mantienen constantes. En estas condiciones, hay una estrecha correlación entre el cambio de entropía durante un proceso y el cambio en la energía total del sistema. Esta correlación puede ser expresada por medio de una función llamada energía libre, la cual puede ser medida y utilizada para predecir el sentido de una reacción química y su estado de equilibrio.

Cuando un sistema pasa de un estado A, a un estado de equilibrio B, hay una disminución de la energía del sistema y una fracción de ese cambio de energía puede ser utilizada para realizar trabajo en el entorno.

Esa fracción es lo que se denomina energía libre. La energía libre de un sistema siempre tiende a un mínimo, puesto que el sistema siempre tiende al equilibrio y en esta condición no puede realizar trabajo.

En el caso de las reacciones químicas es necesario que la energía libre disminuya para que la reacción se produzca, exactamente lo contrario de lo que sucede con la entropía que siempre aumenta, al tomar en cuenta el cambio en la entropía de la reacción junto con el cambio de la entropía del entorno.

Relación entre la energía libre y la constante de equilibrio de una reacción química.

Si en una reacción química los reaccionantes A + B dan como producto C + D, cuando se alcanza el punto de equilibrio la velocidad de conversión de A+ B en C + D

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es exactamente igual a la velocidad de la reacción inversa. Cuando se tiene esta situación se define como constante de equilibrio (Keq) la relación entre las concentraciones de los productos y las concentraciones de los reaccionantes

A + B → C + D

Keq = _[C] _[D] __

[A] [B]

Para condiciones determinadas de temperatura y presión el valor de Keq es inmutable, independiente de las concentraciones iniciales de reaccionantes y productos.

Es evidente que si por ejemplo, la reacción comienza con solamente A y B presentes, para cuando se alcanza el equilibrio la energía libre del sistema debe haber variado. La relación del cambio de energía libre con la constante de equilibrio es la siguiente:

ΔG = ΔG° + RT ln _[C] _[D] __

[A] [B]

pero como al alcanzarse el equilibrio ΔG = 0 se tiene que: ΔG = -RT ln Keq

ΔG° es el cambio standard de energía libre, el cual es una constante para cada reacción. Esta constante se obtiene por el cambio de energía libre en condiciones de reacción determinadas: transformación de 1 mol de reaccionante en 1 mol de producto a 25°C y pH 7.0, siempre que tanto los reaccionantes como los productos se mantengan a concentración 1 molar.

Es importante destacar que ΔG° es una constante mientras que el valor de ΔG en la ecuación

ΔG = ΔG° + RT ln __[productos]___

[reaccionantes]

varía con las concentraciones.

Puede darse el caso de que ΔG° sea negativo para una reacción y sin embargo, al poner en contacto los reaccionantes no se observe nada, debido a que la relación de concentraciones hace que ΔG sea positivo. Por ejemplo en la reacción A → B cuyo ΔG° sea -0.96 Cal.

Si B se encuentra a la concentración 0.005 M y A en la concentración 0.001 a 25°C se tendría

ΔG = -0.96 + 1.98 x 2.98 x 2,303 log __0,005__ ΔG = 0 0,001¡no sucede nada a pesar de que ΔG° es negativo!.

Se puede ahora definir reacciones endergónicas y exergónicas:

Endergónicas son aquellas en las cuales ΔG° es positivo y exergónicas aquellas en las cuales ΔG° es negativo. Es decir, cuando se lleva a cabo una reacción exergónica

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en condiciones standard la energía libre disminuye y se puede realizar trabajo, al menos teóricamente. Por el contrario, en las endergónicas la energía libre aumentaría, y por lo tanto estas reacciones no son termodinámicamente espontáneas.

En Bioquímica, generalmente se utilizan los ΔG° de las reacciones y no el ΔG ya que no es muy fácil medir las concentraciones intracelulares de muchas sustancias. Los ΔG° de reacciones con intermediarios comunes, tienen naturaleza aditiva y esto se puede utilizar en el cálculo de ΔG° de ciertas reacciones con intermediarios comunes.

El ΔG° de la reacción ATP + HOH → ADP + Pi es de -7,3 Kcal/mol

Este valor es muy difícil de determinar midiendo las concentraciones de equilibrio, porque este se desplaza mucho hacia la derecha y la concentración de ATP es demasiado pequeña para medirla con exactitud. Por lo tanto se utiliza para el cálculo de ΔG°, el hecho de que éste tiene naturaleza aditiva en reacciones con intermediarios comunes.

hexoquinasa

1.- ATP + Glucosa ADP + Glucosa 6P ΔGl°= -4.0 Kcal/mol fosfatasa2.- Glucosa 6P + H2O glucosa + Pi ΔG2°= -3,3 Kcal/mol

La suma de las dos reacciones es:

ATP + H2O → ADP + Pi

ΔG°ATP = ΔG1° + ΔG2°

ΔG°ATP = -4.0 + (-3,3) = -7,3 Kcal/mol

Bases estructurales de la “alta energía” del ATP

De comienzo es importante aclarar que la estructura del ATP no tiene nada especial en términos de los enlaces químicos que unen a los átomos (Fig. 4).

Se dice que los enlaces que unen el grupo fosfato terminal al intermedio y éste al proximal son de “alta energía” porque, cuando esos enlaces son hidrolizados hay un cambio importante en ΔG° (-7,3 Kcal). Pero la razón de ese cambio de energía libre no está en el enlace, sino en las diferencias que hay entre el ATP y sus productos de hidrólisis: ADP y Pi:

Fig. 4: Estructura del ATP.

a) En primer lugar los productos tienen mayores posibilidades de estabilización por resonancia y se sabe que los “híbridos de resonancia” son más estables, o sea, tienen menor energía libre. En consecuencia, mientras más posibilidades de

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formar híbridos de resonancia, menor energía libre.

b) El hecho de que al pH intracelular (cercano a 7,0) los grupos fosfato estén casi totalmente ionizados, hace que las cargas negativas resultantes estén sujetas a una marcada repulsión electrostática.

Esto hace que una vez separado un grupo fosfato tenga poca tendencia a unirse de nuevo al ADP, lo cual hace que la constante de equilibrio [ADP] [Pi] /[ATP]) sea muy alta, contribuyendo esto a que ΔG° sea más negativa.

Este valor ΔG° de hidrólisis del ATP lo coloca en un lugar intermedio entre los compuestos fosforilados que se encuentran en las células:

ΔG° hidrólisis Kcal/mol

Fosfoenolpiruvato -14.801,3-Difosfoglicerato -11.80Fosfocreatina -10.30ATP -7. 30Fructosa 6-P -3.80Glucosa 6-P -3.30

Es importante destacar que estos compuestos fosforados, se ordenan de acuerdo a su ΔG° de hidrólisis, pero que en realidad en las células ellos no son simplemente hidrolizados, sino que transfieren su grupo fosfato a otros compuestos, de tal manera que parte de la energía libre es conservada en el compuesto que adquiere el grupo fosfato.

Por ejemplo, en el catabolismo de la glucosa (glicólisis) se produce un intermediario llamado 1,3-difosfoglicerato. Este puede reaccionar con el ADP y se forma 3-fosfoglicerato y ATP. El ΔG° de esta reacción es -4,50 Kcal/mol. Se observará que si sumamos este valor al ΔG° de hidrólisis del ATP obtenemos -11,80 Kcal/mol que es el ΔG° de la hidrólisis del 1,3-difosfoglicerato.

De la misma manera el ATP puede transferir su fosfato terminal a otras sustancias y así las “eleva” de nivel energético para que se puedan hacer reacciones que de otra manera serían imposibles termodinámicamente a temperatura y presión constantes. El ADP producto de la pérdida del fosfato terminal del ATP es inmediatamente refosforilado y nuevamente se forma ATP. Por esta razón se dice que el ATP es la molécula que sirve de eslabón entre los procesos exergónicos del catabolismo y los procesos endergónicos del anabolismo, transporte, etc.

Fosforilación Oxidativa

Se ha descrito hasta ahora como puede ser sintetizado el ATP por fosforilación del ADP a partir del grupo fosfato de compuestos con ΔG° más negativo que el ATP. Este no es, sin embargo, el principal mecanismo de síntesis de ATP. La mayor parte (90%) del ATP es producida en la mitocondria por medio de la llamada fosforilaci6n oxidativa.

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Estructura Mitocondrial

La mitocondria es un organelo subcelular que mide 1,5 a 2 nm en cuya estructura se describen una membrana externa y una membrana interna, la cual contiene la llamada matriz mitocondrial. Además existe el espacio intermembranoso. (Fig. 5)

Fig. 5: Estructura de la mitocondria.

La membrana externa tiene aproximadamente 50% de lípidos y 50% de proteínas. Entre estas se encuentra la enzima monoamino-oxidasa, la cual se utiliza como “marcador” de la presencia de esta membrana en preparaciones subcelulares. En el espacio intermembranoso hay también varias enzimas, la más característica de las cuales es la adenilatoquinasa. La matriz es una solución gelatinosa en la cual están la mayor parte de las enzimas del ciclo de Krebs, las de β-oxidación de los ácidos grasos y otras.

La membrana interna contiene aproximadamente 20% de lípidos y 80% de proteínas. Entre estas se encuentran la succinato deshidrogenasa (una flavoproteína) y la carnitina aciltransferasa. Además, la membrana interna es el sitio donde se encuentra la cadena oxidativa, cuyos componentes se describen brevemente a continuación.

La mayoría de los componentes de la cadena respiratoria se encuentran asociados formando cuatro complejos. Todos ellos están formados por varia proteínas, pero sólo nos referiremos aquí a las moléculas que intervienen en las reacciones de oxidorreducción del transporte electrónico.

En el complejo I se encuentra la NAD deshidrogenasa o NADH-CoQ oxidorreductasa. Ésta contiene FMN como coenzima. En el complejo II se encuentra la succinato deshidrogenasa, que contiene FAD como coenzima. En el complejo II se encuentran los citocromos b y c1. Todos los citocromos son proteínas que contienen grupos hemo que son capaces de intervenir en reacciones de oxidorreducción porque poseen hierro, que puede interconvertirse en sus estados férrico (Fe+3) y ferroso (Fe+2).

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Al complejo IV, llamado citocromo oxidasa, pertenecen los citocromos a y a3, que son los que donan finalmente los electrones al oxígeno. Además de estos complejos, la cadena de transporte electrónico esta formada por el citocromo c y la coenzima Q o ubiquinona, que es una molécula pequeña y liposoluble, lo que le permite gran movilidad en la membrana interna mitocondrial. Los citocromos solo pueden aceptar o donar electrones, en cambio la coenzima Q puede aceptar electrones y protones. En la tabla 1 se encuentra un resumen de las características de los componentes de la cadena de transporte electrónico.

Los componentes de la cadena de transporte electrónico se encuentran orientados vectorialmente de manera que algunos de ellos quedan en contacto sólo con el espacio intermembranoso (proteína FeS, citocromos b, c y c l) mientras que otros se extienden a través de toda la membrana (NADH deshidrogenasa, citocromo oxidasa).

Se considera como un quinto complejo al denominado complejo F1FO. F1 es una proteína globular que se encuentra en una especie de protuberancias que se pueden observar en la membrana interna con el microscopio electrónico. Esta proteína ha sido aislada y purificada y se ha demostrado que está involucrada en la síntesis de ATP. FO

es una proteína hidrofóbica que une F1 a la membrana y que constituye un canal de protones.

Tabla 1: Resumen de la estructura y función de los complejos constituyentes de la cadena de transporte electrónico.

Componente Acepta e- de: Entrega e- a: Constituyentes

Complejo I NADH CoQ NADH deshidrogenasa:FMN como grupo prostético,Proteínas con Fe y S.

Complejo II succinato CoQ Succinato deshidrogenasaFAD como grupo prostético.Proteínas con Fe y S.

CoQ Complejos I y II Complejo III

Complejo III CoQH2 Citocromo c Citocromo bCitocromo c1

Proteínas con Fe y S.

Citocromo c Complejo III Complejo IV Citocromo c

Complejo IV Citocromo c O2 Citocromo c oxidasa:~10 proteínas diferentes, citocromos a y a3.

Oxígeno Complejo IV O2 es el aceptor final de los electrones

ATP Sintetasa

Componente Acepta H+ de Acción Constituyentes

"Complejo V" Espacio intermembrana.

convierte ADP + Pi a ATP + H2O

F1: a3b3g3de

F0: (SHP)n

Concepto de Oxidorreducción

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Equivalentes de oxidorreducción: En las reacciones de oxidorreducción de las células a veces se transfieren electrones y otras veces átomos de hidrógeno completos (recuerde que un átomo de hidrógeno tiene dos electrones y dos protones), por esta razón hablaremos de equivalentes de oxidorreducción al referirnos a la oxidación y reducción de moléculas.

Se recordará que en las reacciones de oxido-reducción una sustancia reductora le cede equivalentes reductores (electrones o átomos de hidrógeno) a una sustancia oxidante. Al ceder los electrones el reductor queda oxidado y el oxidante queda reducido al recibirlos. Por ello se dice que los agentes reductores funcionan como parejas redox acopladas. Por ejemplo, un ión Ferroso (Fe++) cede un electrón a un oxidante y es oxidado a ión férrico (Fe+++). En este caso la pareja redox acoplada es Fe+

++/Fe++.

Coenzimas de oxidorreducción

Frecuentemente en la célula las reacciones de oxidorreducción están catalizadas por enzimas que utilizan las coenzimas NAD+, NADP+ y FAD.

La coenzima NAD+ (nicotinamida-adenina dinucleótido) contienen nicotinamida, que es sintetizada en el organismo a partir de la vitamina niacina. El NAD+ se une muy laxamente a las enzimas que lo utilizan como coenzima, puede disociarse fácilmente de ellas tanto en estado oxidado como en estado reducido. Como puede observarse en la figura 6, el anillo de nicotinamida, el cual es la parte de la molécula que cede o acepta

equivalentes reductores, posee una carga positiva neta y por eso la forma oxidada se escribe NAD+. Cuando las enzimas que contienen NAD+ participan en reacciones de oxidorreducción, se transfieren dos átomos de hidrógeno, de los cuales solo pueden unirse al NAD+ los dos electrones y uno de los protones, como se observa en la fig. 6. Esta es la razón por la cual el NAD+ reducido se escribe frecuentemente NADH + H+.

FIg. 6: Estructura del NAD+

El FAD (flavin dinucleótido) y el FMN (flavin mononucleótido) se forman en el

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organismo a partir de la vitamina riboflavina. Se unen fuertemente a las enzimas que los utilizan como coenzimas, las cuales son enzimas que se encuentran como proteínas integrales de membranas. Por ejemplo, la NAD deshidrogenasa (deshidrogena al NAD reducido), que contiene FMN forma parte del complejo I de la cadena de transporte de electrones; la succinato deshidrogenasa, que contiene FAD, una enzima del ciclo de Krebs, también se encuentra unida a la membrana interna mitocondrial. La parte de estas coenzimas que acepta y cede equivalentes reductores es el anillo de isoaloxazina, que se encuentra remarcado en la fig. 7. Como se nota en la misma fig. los nucleótidos de flavina intercambian dos protones y dos electrones cuando intervienen en reacciones de oxidorreducción.

Fig. 7: Estructura del FAD

El potencial redox Standard

Se puede determinar por medio de la ecuación

E = E0’ + __2303 RT__ log __[oxidante]___

n F [reductor]

en la cual E es el potencial observado E0’ es el potencial redox Standard, “n” es el número de electrones transferidos y F es el faraday (23,062 Cal/V) Se vera que cuando las concentraciones de oxidantes y reductor son iguales la ecuación se transforma en

E = E0’

Esta es la manera de medir el potencial redox Standard. Una sustancia reduce a otra cuando su potencial redox es menor. Por ejemplo, el citocromo c reduce al oxigeno, ya que el potencial redox Standard de la pareja cit. c+++/cit. c++ es de +0,25 y el de la pareja H2O/O2 es de +0,816 V.

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Se ha encontrado que en la membrana interna mitocondrial las proteínas de la cadena oxidativa se disponen de tal manera que quedan ordenadas de acuerdo a su potencial redox (Fig. 8).

Fig. 8: Ordenamiento de los componentes de la cadena de transporte electrónico de acuerdo a su potencial redox.

Funcionamiento de la cadena oxidativa

Los procesos que se realizan en la matriz mitocondrial generan equivalentes reductores al oxidar diversas sustancias. En el ciclo de Krebs se oxida Acetil-CoA y se producen CO2 y equivalentes reductores (NADH y FADH2). La beta oxidación de los ácidos grasos también genera NADH y FADH2. Estas coenzimas reducidas son oxidadas paso a paso por la cadena respiratoria, de manera tal que en el primer paso

queda la coenzima oxidada y la deshidrogenasa reducida. En segundo paso la deshidrogenasa es a su vez oxidada al ceder electrones a una proteína férrica (sin grupo hemo). En este paso los iones Fe+++ de la proteína quedan reducidos a iones Fe+

+, pero por cada FMNH2 quedan 2H+ libres.Actualmente se acepta que la membrana interna funciona vectorialmente, de tal

manera que los protones generados salen hacia el espacio intermembranoso. También se postula que la membrana interna es impermeable a los H+ y, por lo tanto, al ser expulsados los protones se crea un gradiente de concentración (Fig. 9)

Se postula que la coenzima Q por ser bastante hidrofóbica tiene mucha movilidad dentro de la membrana. Además, se sabe que hay una proporción 6:1 entre la concentración molar de CoQ y la de cualquiera de los citocromos. Se dice que CoQ sirve de transportador de los electrones entre la proteína férrica y el citocromo b y toma 2H+ de la matriz mitocondrial. Cuando el citocromo b es oxidado por el c1, salen otros dos protones al medio intermembranoso.

El citocromo cl es oxidado por el cit c y este a su vez por la citocromo oxidasa (cit. a + a3) la cual finalmente cede los electrones al O2. Cada molécula de O2 capta 4e- y 4H+

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y se transforma en 2H2O.Se puede decir que los electrones fluyen por la cadena respiratoria como el agua

por el cauce de un río y cada vez que se acercan al espacio intermembrana salen H+

(Fig. 9). Va a encontrar diferentes versiones de lo que se acaba de describir, no tienen que aprenderse ninguna con detalle. Sólo es importante que comprenda que el paso de los electrones por los diferentes componentes, genera un gradiente de protones entre el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Mitchell propuso que la formación de este gradiente es la fuerza que impulsa la síntesis de ATP por el complejo FoF1 ATP sintetasa. Es imprescindible que la membrana interna mitocondrial sea impermeable a los protones para que pueda formarse el gradiente.

Fig. 9: Formación del gradiente de protones que permite la síntesis de ATP.

La fosforilación

El resultado final del transporte de un par de equivalentes reductores desde el NADH hasta el O2 es la salida de 3 pares de H+ (va a encontrar diferentes relaciones estequiométricas en diferentes libros) con lo cual se crea un gradiente de concentración de H+ entre el espacio intermembrana y la matriz, a través de la membrana interna mitocondrial. Pero además, se obtiene una diferencia de potencial entre el espacio intermembranoso (positivo) y la matriz (negativo), y una diferencia de pH. En este gradiente electroquímico se conserva una fracción de la energía liberada por la oxidación que es utilizable para que se realice la reacción

ADP+ Pi → ATP G° +7,3 Kcal.

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Esta reacción es catalizada por la proteína F1 de la membrana interna, componente del complejo FoF1 ATP sintetasa (fig. 10). Se postula que los protones entran de nuevo a la matriz mitocondrial a través de la proteína FO y esto determinaría un cambio conformacional de la proteína F1, que permite la fosforilación de F1 para formar F1P. Ésta cedería el fosfato al ADP para formar ATP y regresaría a la conformación original, para repetir el ciclo cuando pasa otro par de protones a través de FO. Por lo tanto, se considera que 3 pares de H+ aportan suficiente energía para la síntesis de 3 ATP, 2 pares de H+ para 2 ATP y un par de H+ para un ATP.

Es importante tener en mente que el proceso descrito sucede continuamente en las células: el transporte de electrones es muy rápido y los componentes de la cadena respiratoria son reducidos y reoxidados a gran velocidad. El gradiente de protones puede ser medido experimentalmente, pero "in vivo" probablemente sea casi imperceptible porque continuamente se utiliza para la síntesis de ATP.

Fig. 10: Estructura del Complejo FoF1 ATP sintetasa.

El transportador de ATP

El ATP formado por F1 debe salir de la mitocondria para ser utilizado en el citosol. Se ha demostrado que existe una proteína que realiza la traslocación de ATP y ADP a través de la membrana interna: por cada molécula de ATP que sale de la mitocondria entra una de ADP. Es interesante que esta molécula transportadora de ATP es la proteína más abundante de la membrana interna mitocondrial y representa aproximadamente el 12% de la proteína total de las mitocondrias. Esta constituida por dos subunidades y se ha encontrado que entre las dos conforman el sitio de unión de los sustratos. El ATP solamente se une por la cara interna de la membrana, mientras que el ATP sólo lo hace por la cara externa. Se postula que esto se debe a que la proteína tiene dos conformaciones diferentes: cuando se une al ATP hay un cambio conformacional que hace salir el ATP y permite la unión del ADP en la cara externa. Esto determina el cambio a la conformación original, el ADP es introducido a la mitocondria y nuevamente puede unirse un ATP para salir (Fig. 11).

Este sistema de traslocación puede ser inhibido por un producto vegetal diterpenoide llamado atractilósido.

Se ha demostrado que la proteína transportadora sólo tiene afinidad por el atractilósido cuando hay ADP en el lado externo de la membrana; este inhibidor no se

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une a la proteína por el lado interno, haya o no ADP en el medio.

Fig. 11: Transportador de ATP/ADP (translocasa)

Producción de equivalentes reductores para alimentar la cadena respiratoria

La cadena respiratoria oxida a las coenzimas reducidas que son el producto de la oxidación de moléculas pequeñas producidas por las diversas rutas metabólicas.

Ya se ha dicho que las macromoléculas de la célula pueden ser degradadas a aminoácidos, el glucógeno a glucosa 6-P, etc. Estas moléculas mas pequeñas todavía contienen mucha energía y para aprovecharla la célula las degrada por diferentes vías metabólicas a acetil-CoA (acetato “activado”). Este es el alimentador del denominado Ciclo de Krebs.

Ciclo de Krebs

Este ciclo consiste en una cadena de reacciones mediante las cuales el acetato de la acetil-CoA es oxidado a CO2, con la producción concomitante de equivalentes reductores, los cuales pasan a lo largo de la cadena respiratoria para finalmente reducir al O2 y formar H2O. A continuación se enumeran las reacciones del ciclo de Krebs:

1) Reacción de la Piruvato deshidrogenasa:

Aunque la reacción catalizada por la piruvato deshidrogenasa no es estrictamente una de las enzimas del ciclo de Krebs, en ciertos tejidos y en ciertas situaciones (que no mencionaremos aquí) es la reacción que aporta la mayor parte del acetil-CoA que se oxida en el ciclo. Por esta razón en la mayoría de los libros de texto, la descripción del ciclo de Krebs comienza con la de la reacción catalizada por la piruvato deshidrogenasa.

La piruvato deshidrogenasa es un complejo multienzimático, formada por un conjunto de varias proteínas que coordinadamente y por pasos catalizan la descarboxilación oxidativa del piruvato.

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Fig. 12: Reacción catalizada por la piruvato deshidrogenasa

En la fig. 12 está remarcado el grupo acetato, que es la unidad de dos carbonos que va a oxidarse en el ciclo de Krebs. Note que la mayor parte del acetil-CoA está formada por la coenzima A, la cual se deriva del ácido pantoténico, una vitamina.

2) Condensación de Acetil-CoA y Oxalacetato: El catalizador de la reacción es la citrato sintasa.

3) Conversión del citrato en isocitrato: Esta reacción es catalizada por la enzima aconitasa, la cual cataliza una deshidratación y rehidratación del citrato para formar isocitrato.

4) Conversión del isocitrato en -cetoglutarato reacción catalizada por la isocitrato deshidrogenasa.

Esta es una reacción interesante:

En primer lugar se desprende CO2 con lo cual se reduce de 6 a 5 el número de átomos de carbono en los intermediarios del ciclo. En segundo término se generan equivalentes reductores bajo la forma de

NADH. Y en tercer lugar as una reacción estimulada por el ADP. En ausencia de este procede muy lentamente.

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OxalacetatoCitrato

OxalacetatoCitrato

Citrato IsocitratoCitrato Isocitrato

Isocitrato ð-CetoglutaratoIsocitrato ð-Cetoglutarato

5) Descarboxilación del α-cetoglutarato a succinil-CoA

Esta reacción es catalizada por una enzima compleja llamada α-cetoglutarato deshidrogenasa. La reacción es semejante a la descarboxilación del piruvato para dar origen al acetil-CoA.

En este paso se libera CO2 con lo cual se llega a 4 átomos de carbono en el esqueleto de los intermediarios del ciclo. Además, se produce NADH. El producto de la reacción, succinil-CoA, es una molécula de "alta energía", debido a que como consecuencia de la oxidación se obtiene un tioéster del ácido succínico, cuya hidrólisis es una reacción fuertemente exergónica.

Este compuesto, succinil-CoA, no es hidrolizado directamente, sino que primero se forma un intermediario succinil-P, el cual transfiere el grupo fosfato primero a la enzima y luego al GDP y se forma GTP.

Pi + succinil-CoA → succinil-P + CoA

Succinil-P + -------- En-P + succinato E-P + GDP ---- GTP

Esta reacción es un ejemplo de lo que se denomina fosforilación a nivel de sustrato, la cual se define como la formación de compuestos fosfatados de "alta energía" sin intervención de la cadena respiratoria, ni del mecanismo ya descrito para la formación de ATP en la mitocondria.

Regeneración del oxaloacetato

El ciclo continúa con las siguientes reacciones:

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SuccinilCoAð-Cetoglutarato SuccinilCoAð-Cetoglutarato

SuccinilCoA

Succinato

SuccinilCoA

Succinato

6) Catalizada por la succinato

deshidrogenasa.

7) Catalizada por la fumarasa

8) Catalizada por la malato deshidrogenasa.

En la deshidrogenación del succinato hay un aspecto interesante; la coenzima es el FAD y está unida covalentemente a la enzima. La coenzima reducida FADH2 cede sus equivalentes reductores a la cadena respiratoria en un punto más próximo al oxígeno que el NADH, probablemente la CoQ. (Fig. 9). Esto significa que el paso de esos equivalentes por la cadena oxidativa sólo causa la expulsión de 2 pares de H+ y por lo tanto sólo provee energía para la síntesis de 2 ATP por la proteína F1.En la fig. 13 se presenta un esquema todas las reacciones del ciclo de Krebs.

Regulación del ciclo de Krebs

Como todas las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones del ciclo de Krebs, dependen, en parte, de las concentraciones relativas de reactantes y productos.Por ejemplo, si consideramos la siguiente reacción:

Isocitrato + NAD+ α-cetoglutarato + NADH + H+

Si aumenta la concentración de NAD+, aumentará la velocidad de conversión de isocitrato en α-cetoglutarato. Esto tendrá una repercusión sobre la velocidad del ciclo de Krebs, ya que el aumento de la formación de α-cetoglutarato aumenta la concentración de uno de los sustratos de la reacción:

α-cetoglutarato + CoA + NAD+ Succinil-CoA + CO2 + NADH + H+

lo cual aumentará la velocidad del ciclo.

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Succinato FumaratoSuccinato Fumarato

Fumarato MalatoFumarato Malato

Malato OxalacetatoMalato Oxalacetato

Acetyl-CoA

Oxalacetato Citrato

MalatoIsocitrato

Fumarato -cetoglutarato

SuccinatoSuccinil-CoA

Fig. 13: Reacciones del ciclo de Krebs.

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Todas las reacciones del CK donde intervienen coenzimas de óxido-reducción, dependen de la concentración relativa de sus formas reducidas y oxidadas. La concentración de NAD+, independientemente de su estado de óxido-reducción es fija en el interior mitocondrial (y también en el citosol, ya que ellas no atraviesan la membrana interna mitocondrial). Esto quiere decir que si aumenta la concentración de su forma reducida, es porque disminuyó la de su forma oxidada, y viceversa. Así, si decimos que hay una disminución de NAD+, decimos implícitamente que hay un aumento de NADH. Es por esta razón que al querer referirnos a la concentración de alguna de las formas de óxido-reducción del NAD, hablamos de una relación: NAD+/NADH

Hay que tener en cuenta, entonces, que si decimos que hay un aumento de la relación NAD+/NADH, quiere decir que aumentó la concentración de NAD+ (aumenta la relación si el numerador es mayor que el denominador); y si decimos que la relación disminuye, quiere decir que aumentó la concentración de NADH.

Algo parecido puede decirse de la concentración de nucleótidos de adenina. Su concentración dentro de la mitocondria es constante, pero varía su estado de fosforilación. En el caso de los nucleótidos de adenina no se debe a que no puedan atravesar la membrana interna mitocondrial, sino a que el transporte de ellos a nivel de esta membrana es un antiportador equimolecular: solo funciona si intercambia una molécula de ATP por una de ADP. Esto hace que se mantenga constante la concentración intramitocondrial de estos nucleótidos. Así, si aumenta la concentración de ATP es porque la de ADP disminuyó. Por esta razón frecuentemente también habamos de la relación ATP/ADP1 para referirnos a la concentración de alguno de ellos.A continuación detallaremos la regulación de cada una de las enzimas que limitan la velocidad del CK.

Regulación de la piruvato deshidrogenasa: El complejo de la piruvato deshidrogenasa está sujeto a formas múltiples de regulación. Depende, como todas las deshidrogenadas que utilizan NAD+ como coenzima, de la relación NAD+/NADH. Además, es regulada por modificación covalente reversible por fosforilación/desfosforilación. Cuando la enzima está fosforilada es inactiva y es activa cuando está desfosforilada. Como puede notarse en la fig. la quinasa que fosforila e inactiva a la piruvato deshidrogenasa, es un enzima que es regulada alostéricamente por varios metabolitos. Por ejemplo, el aumento del NADH y del ATP la activan, lo cual quiere decir que fosforila a la piruvato deshidrogenasa inactivándola; es decir que tanto un aumento del NADH como del ATP tienen el efecto neto de inhibir a la piruvato deshidrogenasa. La regulación de esta enzima es muy compleja y también depende del efecto de algunas hormonas, pero este punto se tratará más extensamente en el tema de Integración y Regulación del Metabolismo.

Regulación de la citrato sintasa: Es inhibida alostéricamente por el ATP y activada por el ADP. El NADH también inhibe alostéricamente a la enzima. Cuando aumenta la concentración de citrato, la se hace mas lenta la liberación del mismo del complejo EP, por lo que la reacción global se hace mas lenta, el efecto neto será que el aumento de

1 En realidad habría que incluir en la ecuación las concentraciones de AMP y Pi (fosfato inorgánico), pero para los fines de esta guía los omitiremos.

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la concentración de citrato, inhibe a la enzima porque permanece por mas tiempo unido al centro activo de ella, donde se ha formado.El succinil-CoA compite por al enzima y la inhibe, porque el succinil CoA se parece a uno de los sustratos de la enzima (acetil-CoA). Todos los factores que inhiben la actividad de la enzima, disminuirán la velocidad del ciclo de Krebs.

Fig. 15: Regulación de la piruvato deshidrogenasa.

Regulación de la isocitrato deshidrogenasa : Como todas las enzimas deshidrogenadas depende de la relación NAD+/NADH. El aumento de la concentración de NADH, desplaza el equilibrio de la reacción:

Isocitrato + NAD+ α-cetoglutarato + NADH + H+

hacia la formación de isocitrato, siendo el efecto neto una disminución de la velocidad de formación de -cetoglutarato y, por supuesto una reducción de la velocidad del CK.

Lo contrario ocurrirá si hay un aumento de la concentración de NAD. Recuerde que un aumento de la concentración de NAD+ implica una disminución de NADH, por lo cual podemos decir entonces que un aumento de la relación NAD+/NADH aumenta la actividad de la enzima isocitrato deshidrogenasa y viceversa.

La isocitrato deshidrogenasa también es inhibida alostéricamente por el ATP y activada por el ADP.

Regulación de la α-cetoglutarato deshidrogenasa : Está sujeta a la regulación de la relación NAD+/NADH al igual que otras deshidrogenadas dependientes del NAD+. Además, su regulación es muy parecida a la de la piruvato deshidrogenasa, aunque no es regulada por fosforilación desfosforilación.

Regulación de la malato deshidrogenasa: Como todas las enzimas deshidrogenadas depende de la relación NAD+/NADH. El aumento de la concentración de NAD+, desplaza el equilibrio de la reacción:

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Malato + NAD+ oxalacetato + NADH + H+

hacia la formación de oxalacetato, o sea que aumentará la velocidad del CK.

Regulación coordinada del ciclo de Krebs y de la fosforilación oxidativa:La regulación de las enzimas del CK por la concentración relativa de

reaccionantes y productos está interrelacionada con la regulación alostérica de las enzimas. Por ejemplo, un aumento de la concentración de citrato sólo aumenta la velocidad del ciclo de Krebs si concomitantemente las enzimas sujetas a regulación alostérica están también activas.

Los factores que tienden a aumentar la velocidad del ciclo de Krebs, aumentarán la formación de coenzimas reducidas que son el sustrato para la cadena de transporte electrónico, por lo que aumentará también la velocidad de dicho transporte y, por consecuencia, la síntesis de ATP. Podemos decir entonces que el aumento de la velocidad del ciclo de Krebs, aumenta la síntesis de ATP y el consumo de oxígeno (recuerde que al ser el oxígeno un gas, su concentración se expresa como presión parcial), ya que siendo éste el último aceptor de los electrones en la cadena respiratoria se consumirá más si aumenta la velocidad del transporte electrónico. El consumo de oxígeno, de hecho, se utiliza experimentalmente para medir la velocidad del transporte de electrones, así como para medir la tasa de síntesis de ATP, se mide la cantidad de fosfato consumido. Recuerde que el ATP se forma a partir de ADP y Pi (fosfato inorgánico).

Igualmente, la velocidad de la fosforilación oxidativa afectará la velocidad del ciclo de Krebs. Por ejemplo, una disminución de la síntesis de ATP, aumentará la concentración de ADP lo que traerá como consecuencia que se activen las enzimas alostéricas citrato sintasa e isocitrato deshidrogenasa, lo cual aumentará la velocidad del CK, es decir que aumentará la producción de coenzimas reducidas que aportan sustrato a la cadena de transporte electrónico, aumentando así la síntesis de ATP. Intuitivamente, podemos darnos cuenta que esta interdependencia entre ambos procesos tiende a conservar el estado homeostático de la célula.

Papel anfibólico del ciclo de Krebs

Hasta este punto se ha descrito el papel del ciclo de Krebs como vía degradativa, en la cual como balance neto se tiene que el acetato de la acetil-CoA es convertido en 2 CO2. Esa oxidación produce 3 NADH y 1 FADH2, alimentadores de la cadena respiratoria para la síntesis de 11 ATP. Además, se produce un GTP (equivalente a 1 ATP) por fosforilación a nivel del sustrato.

Pero el ciclo de Krebs también puede aportar precursores para la síntesis de metabolitos, es decir, puede jugar un papel como ruta anabólica. Por ejemplo, el citrato puede salir de la mitocondria y dar origen en el citosol a Acetil-CoA, precursora de los ácidos grasos. Asimismo, el oxaloacetato puede originar fosfoenolpiruvato y a partir de este puede ser sintetizada la glucosa en el hígado.

Por ello se dice que el ciclo de Krebs es una vía anfibólica: puede ser catabólica o anabólica según las condiciones imperantes en la célula.Concepto de reacciones anapleróticas: Las reacciones anapleróticas son aquellas que aportan intermediarios al ciclo de Krebs. Por ejemplo la reacción catalizada por la

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piruvato carboxilasa, una enzima mitocondrial que nos encontraremos nuevamente en el metabolismo de los carbohidratos, puede aportar oxalacetato al ciclo de Krebs:

Piruvato + ATP + CO2 Oxalacetato + ADP + PiIgualmente, la reacción catalizada por la glutamato deshidrogenasa, otra que también retomaremos mas tarde, puede aportar α-cetoglutarato al ciclo:

Glutamato + NAD(P)+ α-cetoglutarato + NADH(P) + H+

Hay muchas otras reacciones anapleróticas, pero por ahora solo nos interesa que se comprenda el concepto.

El papel del ATP en la regulación del metabolismo

La posición clave del ATP como eslabón entre los procesos catabólicos y anabólicos hace que la concentración de ATP sea determinante en la activación o inhibición de las vías metabólicas. En realidad, más que la concentración de ATP es la relación ATP/ADP el factor importante, ya que al ser utilizado el ATP aumenta la concentración de ADP, ya que se ha determinado que (ATP)(ADP) = K (constante)

Por ejemplo, al considerar la situación metabólica del músculo en reposo se encuentra lo siguiente:- la concentración de ATP es elevada, mientras que la de ADP es baja.- la reacción

Fosfocreatina + ADP → ATP + creatinaG°= -3,0 Kcal/mol.

se desplaza hacia la izquierda (en el sentido endergónico) debido al efecto de la concentración de ATP sobre Keq.

En las mitocondrias el consumo de O2 es bajo porque, entra otros factores:a.- La concentración de ADP en la matriz mitocondrial es baja y por lo tanto hay

poco sustrato para la reacción catalizada por F1:ADP + Pi → ATP.

b.- El flujo de electrones a través de la cadena respiratoria disminuye debido a que: i) El gradiente de H+ no es utilizado totalmente por la síntesis de ATP, lo cual hace que el bombeo de protones hacia el espacio intermembranoso disminuya. ii) La concentración de coenzimas reducidas (NADH y FADH2) aumenta y por tanto

la concentración de coenzimas oxidadas disminuye. La baja concentración de NAD+

disminuye la velocidad de las reacciones en que intervienen las deshidrogenasas que requieren esa coenzima.

c.- La isocitrato deshidrogenasa disminuye su actividad debido a que su activador (ADP) está en baja concentración.

d.- El transportador de ATP-ADP a través de la membrana mitocondrial disminuye su actividad, ya que hay baja concentración de ADP para ser intercambiado por el ATP intramitocondrial.

e.- La velocidad de conversión de la glucosa en piruvato y acetil-CoA disminuye

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porque la elevada concentración de ATP inhibe a la enzima fosfofructoquinasa, que es la determinante de la velocidad total de la glicólisis (transformación de glucosa en piruvato). Si el músculo pasa de la condición de reposo a la contracción, el consumo de O2 aumenta violentamente, debido a que los factores mencionados se encuentran ahora en la situación inversa. En condiciones fisiológicas la situación es más compleja todavía porque intervienen factores hormonales (adrenalina) y otros. Sin embargo, en forma muy sucinta se puede decir que al aumentar la demanda de O2 por las mitocondrias musculares se ponen en juego mecanismos fisiológicos para aumentar el aporte de O2 a los músculos: aumenta la velocidad y frecuencia de la respiración, aumenta la frecuencia cardiaca, etc.

Todo ello hace que más O2 sea tomado del aire y transportado por la hemoglobina desde los pulmones a los músculos, o más propiamente a las mitocondrias musculares.

Inhibidores y desacoplantes de la fosforilación oxidativa:

El estudio experimental de los mecanismos de síntesis de ATP se ha apoyado con el uso de sustancias que pueden inhibir el proceso. Igualmente, es importante conocer cómo actúan estas sustancias, ya que en la práctica clínica se encontraran pacientes afectados por algunas de ellas. Finalmente, algunas moléculas que normalmente están en el organismo, como la termogenina, ejercen su acción fisiológica porque afectan el proceso de fosforilación oxidativa.

Inhibidores de la cadena del transporte electrónico: el cianuro, el monóxido de carbono, el amital sódico, entre otros, son sustancias que se unen irreversiblemente a algunos de los componentes de los complejos que forman parte de la cadena de transporte electrónico, impidiendo su acción. Cuando esto ocurre, los electrones no pueden fluir libremente hasta el oxígeno y todos los componentes de la cadena que están antes del complejo bloqueado, permanecen reducidos (porque no pueden “soltar” sus electrones) y todos los que están después, permanecen oxidados. Al no haber transporte de electrones (no hay consumo de oxígeno), no se forma el gradiente electroquímico de protones, por lo cual no hay paso de ellos por el complejo FoF1 ATP sintetasa y no habrá síntesis de ATP. Entonces, los inhibidores de la cadena de transporte electrónico inhiben la síntesis de ATP y el consumo de oxígeno.

- Prediga cómo se encontrará la relación NAD+/NADH y la ATP/ADP.- Cuál será el efecto sobre la velocidad del ciclo de Krebs.

Desacoplantes: Éstas son sustancias que pueden transportar protones a través de la membrana interna mitocondrial a favor de su gradiente de concentración. El ejemplo clásico, el 2,4 dinitrofenol, es una molécula liposoluble que al instalarse en la membrana interna mitocondrial, puede unirse reversiblemente a protones, pasándolos desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial. El efecto neto de esto es parecido a que se abriera un hueco en la membrana que deja escapar a los protones. Como no está interrumpido el flujo de electrones, éste continua por lo que se sigue consumiendo oxígeno; pero como no puede formarse el gradiente de protones, porque los que son bombeados al espacio intermembrana son retornados a la matriz por el 2,4 dinitrofenol y no pasan por el complejo FoF1 ATP sintetasa, no habrá síntesis de ATP.

- Prediga cómo se encontrará la relación NAD+/NADH y la ATP/ADP.

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- Cuál será el efecto sobre la velocidad del ciclo de Krebs.- ¿Por qué uno de los efectos de los desacoplantes es el aumento de la liberación

de calor?

Inhibidores de la FoF1 ATP sintetasa: La oligomicina puede unirse al componente Fo (de hecho de aquí toma su nombre, ya que es “o” y no cero) inhibiendo su acción. Esto impide que los protones pasen a través de él y por lo tanto, no se puede sintetizar ATP. Los protones se acumulan en el espacio intermembrana, lo que hace que la energía de oxidación de los componentes de la cadena respiratoria, que es la utilizada para el bombeo de protones, llegue un momento en que será insuficiente debido a la magnitud del gradiente que se ha formado. Esto trae como consecuencia que también se inhiba el transporte electrónico y, en consecuencia, el consumo de oxígeno.

- Prediga cómo se encontrará la relación NAD+/NADH y la ATP/ADP.- Cuál será el efecto sobre la velocidad del ciclo de Krebs.

Muchos de los estudios experimentales que se hacen sobre el funcionamiento de la cadena de transporte de electrones, se realizan en lo que se llama preparaciones mitocondriales, que no son otra cosa, grosso modo, que el resultado de romper células en un buffer adecuado y someterlas a un proceso de centrifugación que permite obtener diferentes fracciones que contienen, también, diferentes organelos. En el pasillo de la Cátedra se puede ver un póster que ilustra este proceso.

Por ejemplo, se puede medir el consumo de oxígeno de una preparación mitocondrial, como resultado de varias manipulaciones experimentales. Recuerde que el consumo de oxígeno es una medida del funcionamiento de la cadena de transporte de electrones. La medición del consumo de O2 se puede realizar con un electrodo de hidrógeno, que detecta la diferencia de potencial que se genera en las reacciones de oxidorreducción. En la fig.16 se observa el gráfico que puede obtenerse si se mide el consumo de oxígeno de una preparación mitocondrial a la cual se añade ADP. El ADP, además de ser un activador alostérico de varias enzimas del ciclo de Krebs, es uno de los sustratos para la síntesis del ATP, por lo que aumentará el consumo de oxígeno. Se puede ver en el gráfico que desde una presión parcial de oxígeno mayor, se pasa a una menor a medida que transcurre el tiempo, ya que parte del oxígeno se consumió para

formar agua en la cadena del transporte electrónico.

Fig. 16: Aumento del consumo de oxígeno en presencia de ADP en una preparación mitocondrial.

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B I B L I OG R A F Í A

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