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Bilirrubina Para la determinacin de bilirrubina directa y total

SIGNIFICACION CLINICALa bilirrubina, compuesto de degradacin de la hemoglobina, es captada por el hgado para su conjugacin y excrecin en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias.La eritroblastosis fetal o anemia hemoltica del recin nacido es una patologa provocada por incompatibilidad materno-fetal en la que se produce una destruccin excesiva de glbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina srica con el consecuente riesgo de difusin del pigmento al sistema nervioso central, por lo que la determi-nacin de la bilirrubina en estos nios recin nacidos resulta sumamente importante.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfa-nlico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violceo (azobilirrubina) que se mide fotocolo rimtricamente a 530 nm.Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona direc-tamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso (Reactivo A) que posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafena al medio de reaccin.

REACTIVOS PROVISTOSA. Reactivo A: solucin acuosa de benzoato de cafena 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada.B. Reactivo B: solucin de cido sulfanlico 29 mmol/l y cido clorhdrico 0,17 mol/l.C. Reactivo C: solucin de nitrito de sodio 0,07 mol/l.

REACTIVOS NO PROVISTOS- Agua destilada.- Bilirrubina Standard de Wiener lab. para efectuar la

calibracin peridica del equipo.

INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivo A: listo para usar.Reactivo B: listo para usar.Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar 1 parte de Reactivo C con 21 partes de Reactivo B. Rotular y fechar.

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnstico "in vitro".Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales

de trabajo en el laboratorio de anlisis clnicos.Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.Reactivo B: R36/38: irrita los ojos y la piel. S26: en caso de contacto con la piel, lvense inmediatamente y abun-dantemente con agua y acdase a un mdico. S37/39: usar guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Diazorreactivo: en refrigerador (2-10oC) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3 meses a partir de la fecha de su preparacin.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSLa presencia de sedimento y/o cambio de coloracin de los reactivos, pueden ser indicio de deterioro de los mismos.

MUESTRASuero, plasma o lquido amniticoa) Recoleccin: obtener suero o plasma de la manera usual. Proteger de la luz natural o artificial, envolviendo el tubo con papel negro.Tambin es posible realizar la determinacin en lquido amnitico.b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plas-ma, debe usarse heparina para su obtencin.c) Sustancias interferentes conocidas: hemlisis modera-da o intensa inhibe la reaccin directa, obtenindose valores de bilirrubina total falsamente aumentados.Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento, el suero debe conservarse hasta 48 horas en el refrigerador (2-10oC) y la sangre entera no ms de 24 horas en refrigerador o 12 horas a temperatura ambiente. El lquido amnitico es conveniente mantenerlo congelado hasta el momento de efectuar el ensayo.La accin de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. Es por tal motivo que debe protegerse cuida dosamente.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Espectrofotmetro o fotocolormetro.- Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados.

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- Frasco de vidrio color caramelo.- Tubos.- Reloj o timer.

CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda: 530 nm en espectrofotmetro o 520-

550 nm en fotocolormetro con filtro verde.- Temperatura de reaccin: temperatura ambiente- Tiempo de reaccin: 5 minutos- Volumen de muestra: 200 ul- Volumen final de reaccin: 2,9 ml

PROCEDIMIENTO

I- TECNICA PARA SUEROEn tres tubos marcados B (Blanco), D (Directa) y T (Total) colocar:

B D T

Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ulAgua destilada 2,5 ml 2,5 ml -Reactivo A - - 2,5 mlReactivo B 200 ul - -Diazorreactivo - 200 ul 200 ul

Mezclar de inmediato cada tubo por inversin. Luego de 5 minutos, leer en espectrofotmetro a 530 nm o en fotocolormetro con filtro verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirru-bina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si se lee antes, habr subvaloracin de los resultados por reaccin incompleta. Si se lee despus, habr sobreva-loracin porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre.Sueros ictricos: debe emplearse la tcnica descripta pero con menores cantidades de muestra, de acuerdo a la severidad de la ictericia. De tal forma, en caso de ictericia moderada se usarn 50 ul de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren slo 20 ul. Multiplicar los resultados obtenidos por 3,79 y 9,38 respectivamente.

II- TECNICA PARA LIQUIDO AMNIOTICOSe determina bilirrubina total. En dos tubos marcados B (Blanco) y T (Total) colocar:

B T

Muestra (lquido amnitico) 1 ml 1 ml

Agua destilada 1,5 ml -

Reactivo A - 1,5 ml

Reactivo B 0,2 ml -

Diazorreactivo - 0,2 mlProceder de la misma manera que en la tcnica I. Dividir el resultado final por 5,37.

CALCULO DE LOS RESULTADOSBilirrubina total (mg/l) = (T - B) x fBilirrubina directa (mg/l) = (D - B) x fBilirrubina libre (indirecta) = BRB total - BRB directaEl factor colorimtrico (f) debe calcularse con Bilirrubina Standard de Wiener lab.

METODO DE CONTROL DE CALIDADSi la muestra a ensayar es suero o plasma, procesar 2 nive-les de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de bilirrubina, con cada determinacin.

VALORES DE REFERENCIABilirrubina en suero o plasma- Adultos:

Directa: hasta 2 mg/lTotal: hasta 10 mg/l

- Recin nacidos: Nacidos a trmino Prematuros

Sangre de cordn 25 mg/lhasta las 24 hs 60 mg/l 80 mg/lhasta las 48 hs 75 mg/l 120 mg/ldel 3 al 5 da 120 mg/l 240 mg/l

Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. En los pre-maturos, los niveles de bilirrubina tardan ms en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez heptica.

Bilirrubina en lquido amniticoValores menores de 1 mg/l son considerados normales, mientras que entre 1 y 2,7 mg/l sugieren la posibilidad de un feto afectado.Los niveles por encima de 2,7 mg/l slo se encuentran en presencia de eritroblastosis fetal. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4,7 mg/l el feto ya se encuentra afectado y tiene probablemente algn tipo de falla circulatoria.Si la cantidad de bilirrubina sobrepasa los 9,5 mg/l la muerte fetal es inminente.Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CONVERSION DE UNIDADESBilirrubina (mg/l) = Bilirrubina (mg/dl) x 10Birrubina (umol/l) = Bilirrubina (mg/dl) x 17,1

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.La accin de la luz, tanto sobre los sueros como sobre las soluciones standard, es capaz de destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.

PERFORMANCEa) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se obtuvo lo siguiente:

Bilirrubina directa Nivel D.S. C.V. 2,1 mg/l 0,18 mg/l 8,5 % 26,0 mg/l 0,62 mg/l 2,4 %

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Bilirrubina total Nivel D.S. C.V. 9,8 mg/l 0,47 mg/l 4,7 % 127,7 mg/l 1,45 mg/l 1,1 %

b) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 150 mg/l.c) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de bilirrubina a distintos sueros, se obtuvo una recuperacin entre 100 y 106%.d) Lmite de deteccin: depende del espectrofotmetro empleado y de la longitud de onda. De acuerdo con la sen-sibilidad requerida para un A mnimo de 0,001, el menor cambio de concentracin detectable ser de 0,17 mg/l.

PRESENTACIONEquipo para 200 determinaciones (Cd. 1120001).

BIBLIOGRAFIA- Botwell, J. H. - Clin. Chem. 10/3:197 (1964).- Watson, D. - Clin. Chem. 7/6:603 (1961).- Ichida, T.; Nobuoka, M. - Clin. Chim. Acta 19/2:249 (1968).- Zaroda, R. - Am. J. Clin. Path. 45/1:70 (1966).- OBrien, D. et al - Laboratory manual of pediatric micro-

biochemical techniques, Harper & Row Pub - 4a Ed. (1968).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",

AACC Press, 4th ed., 2001.

2000 Rosario - Argentina

M Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Tc.: Viviana E. CtolaBioqumicaProducto Autorizado A.N.M.A.T. Disp. N: 252/75-5347/98

UR120327

Wiener lab.

SIMBOLOSLos siguientes smbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnstico de Wiener lab.

CEste producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnstico "in vitro"

P Representante autorizado en la Comunidad EuropeaV Uso diagnstico "in vitro"

X Contenido suficiente para ensayos

H Fecha de caducidad

l Lmite de temperatura (conservar a)

No congelar

F Riesgo biolgico

Volumen despus de la reconstitucin

Contenido Cont.g Nmero de lote

M Elaborado por:

NocivoXn

Corrosivo / Castico

IrritanteXi

i Consultar instrucciones de uso

CalibradorCalibr.

Controlb

b Control Positivo

c Control Negativo

h Nmero de catlogo