BASE MOLECULAR DE LA HERENCIA

E. coli dividindose Fago T4 Virus de mosaico del tabaco

Propiedades que debe reunir una molcula para ser el material hereditario.

Caractersticas que debe reunir una especie para ser un buen material de investigacinen un laboratorio de gentica.

Principales caractersticas de las bacterias.

Experimentos que demuestran que el ADN es el material hereditario en bacterias:Transformacin bacteriana.

Principales caractersticas de los bacteriofagos de la serie T.

El Ciclo Ltico.

Experimentos que demuestran que el ADN es el material hereditario en bactetriofagos.

Caractersticas del virus del mosaico del tabaco: TMV.

Experimentos que demuestran que el ARN es el material hereditario en el virus delmosaico del tabaco.

PROPIEDADES QUE DEBE REUNIR UNA MOLCULA PARA SER ELMATERIAL HEREDITARIO

Las caractersticas o propiedades que debe reunir cualquier molcula para ser el materialhereditario se deducen de la observacin de las propiedades que tienen los organismos vivos.

ALMACENAR INFORMACIN BIOLGICA DE UNA FORMA ESTABLE.

REPLICARSE Y TRANSMITIRSE DE UNA CLULA A OTRA Y DE UNAGENERACIN A LA SIGUIENTE.

LLEVAR INFORMACIN PARA OTRO TIPO DE MOLCULAS Y ESTRUCTURAS.

MUTACIN Y RECOMBINACIN.

Fuente Primaria de variabilidad gentica: mutacin.

Las alteraciones o cambios en la molcula que contiene la informacin se denominanmutaciones. La mutacin es la fuente primaria de variabilidad gentica, si no existiera lamutacin, no habra sido posible observar la enorme variabilidad existente de especiesdiferentes, ni la variabilidad dentro de cada especie. Sin la mutacin no se podra haberproducido el proceso evolutivo.

Fuente secundaria de variabilidad gentica: recombinacin.

La produccin de nuevas combinaciones genticas a partir de las generadas inicialmente pormutacin se produce cuando dos molculas de material hereditario intercambian informacinmediante el proceso de la recombinacin. Dos mutaciones diferentes que se encontraban enmolculas de material hereditario distintas pueden reunirse en la misma molcula mediante larecombinacin. Por consiguiente, la recombinacin genera variabilidad produciendocombinaciones nuevas de mutaciones.

Esquema de mutacin y recombinacin

CARACTERSTICAS QUE DEBE REUNIR UNA ESPECIE PARA SER UN BUENMATERIAL DE INVESTIGACIN EN EL LABORATORIO

FCIL MANEJO Y MANTENIMIENTO EN EL LABORATORIO.

OCUPAR POCO ESPACIO.

REPRODUCIRSE EN POCO TIEMPO. GENERACIONES RPIDAS.

ELEVADO NMERO DE DESCENDIENTES.

VARIABILIDAD PARA CARACTERES FCILES DE ESTUDIAR.

Las bacterias y los virus renen todas las caractersticas anteriormente mencionadas.

La eleccin del material de estudio, o de la especie con la que se va a realizar un determinadoexperimento es muy importante, ya que de ello depende el que podamos encontrar con mayoro menor dificultad las respuestas a las preguntas planteadas en el experimento.

Para poder responder a la pregunta Qu molcula es la que contiene la informacin?, fuenecesario introducir en la investigacin organismos con una organizacin biolgica mas simple.Los organismos que se estaban manejando hasta el momento en la investigacin gentica,eran eucariticos, con una organizacin biolgica compleja, por tal motivo, se comenzaron aestudiar organismos procariticos (bacterias) y virus.

PRINCIPALES CARACTERSTICAS DE LAS BACTERIAS

La principal caracterstica que diferencia las clulas procariticas de las clulas eucariticas esla ausencia de membrana nuclear y por consiguiente la falta de ncleo. Las bacterias (clulasprocariticas) carecen de ncleo y su material hereditario no est separado del resto delcitoplasma mediante una membrana. De forma muy esquemtica, una bacteria consta de fuerahacia dentro de los siguientes componentes: una pared celular de lipopolisacridos, unamembrana plasmtica y el citoplasma clular. Dentro del citoplasma a su vez es posibledistinguir los ribosomas necesarios para llevar a cabo la sntesis de protenas durante latraduccin de los ARN-mensajeros y el nucleoide bacteriano. El nucleoide bacteriano contienede forma compactada la molcula portadora de la informacin (ADN) en asociacin con otrasmolculas (protenas) y est en contacto con la membrana plasmtica en un puntodenominado mesosoma.

Esquema de una bacteria Bacteria dividindose ADN de bacteria reventada

Cuando se somete una bacteria a un choque osmtico es posible hacerla reventar y que sucontenido salga al exterior, en particular, su ADN.

EXPERIMENTOS QUE DEMUESTRAN QUE EL ADN ES EL MATERIALHEREDITARIO EN BACTERIAS: TRANSFORMACIN BACTERIANA

Transformacin de neumococos no virulentos en virulentos: Principio Transformante(Griffith 1928).

Transformacin de neumococos no virulentos en virulentos: El Principio transformante esel ADN. Avery, McLeod y McCarthy (1944).

EXPERIMENTOS DE TRANSFORMACIN BACTERIANA DE GRIFFITH (1928).

EL PRINCIPIO TRANSFORMANTE.

El material empleado por Griffith (mdico ingls) fue la bacteria Diplococcus pneumoniae oneumococo y los ratones. Cuando se inyecta a un ratn con el esputo de una persona enferma(con neumona) dicho ratn muere de septicemia a las 24 horas. Esta capacidad virulenta delos neumococos se debe a la presencia de una cpsula de polisacridos (polmeros de glucosa+ cido glucurnico) que envuelve a la bacteria y la protege de la fagocitosis.

Para poder realizar cualquier estudio gentico es necesaria la existencia de variabilidad para elcarcter analizado. Griffith observ la existencia de diferentes tipos de neumococos:neumococos virulentos de tipo S que dan lugar a colonias con aspecto liso y brillante(producen la cpsula azucarada que los protege de la fagocitosis del husped) y neumococosno virulentos (avirulentos) de tipo R que dan lugar a colonias de tipo rugoso y mate (carecende la cpsula azucarada protectora).

Colonia de tipo S Colonia de tipo R Esquema colonias S y R

Experimento control: Griffith nuca haba observado que los neumococos RII (no virulentos)mutarn o cambiarn a SIII (virulentos).

Griffith observ que si inyectaba a los ratones con neumococos de tipo RII (avirulentos) a las24 horas seguan vivos (Figura A), mientras que si los inyectaba con neumococos SIII(virulentos) a las 24 horas los ratones moran (Figura B). Entonces decidi calentar losneumococos SIII (virulentos) para destruirlos y posteriormente inyectarlos a los ratones,encontrando que los ratones seguan vivos despus de 24 horas (Figura C). Por consiguienteel calor, destrua el poder infectivo de los neumococos SIII. Por ltimo, inyect a los ratonesuna mezcla de neumococos RII vivos (no virulentos) y de SIII (virulentos) previamente muertospor calor, encontrado que los ratones moran a las 24 horas y extrayendo de su sangreneumococos SIII vivos Figura D).

Figura A Figura B Figura C Figura D

Conclusiones de Griffith: puesto que los neumococos RII (avirulentos) nunca mutan a SIII(virulentos), en el ltimo experimento (Figura D) se demuestra la existencia de una sustanciapresente en los extractos de neumococos SIII muertos por calor que es capaz de transformar a

los neumocos RII vivos en SIII vivos, dicha sustancia fue denominada por Griffith el PrincipioTransformante.

Estudios posteriores pusieron de manifiesto que la transformacin de neumocos RII en SIII sepoda realizar en tubo de ensayo sin necesidad de utilizar ratones en el experimento. Es decir,se puede mezclar en el mismo medio de cultivo lquido neumocos RII vivos con neumococosSIII previamente muertos por calor y obtener neumococos SIII vivos y virulentos.

Transformacin de RII en SIII en tubo de ensayo

EXPERIMENTOS DE TRANSFORMACIN BACTERIANA DE AVERY, McLEOD YMcCARTHY (1944). EL PRINCIPIO TRANSFORMANTE ES EL ADN.

Avery, McLeod y McCarthy mediante analsis qumicos, enzimticos y serolgicos y utilizandotcnicas de electroforesis, ultracentrifugacin y espectroscopa aislaron a partir de los extractosde neumococos SIII (virulentos) muertos por calor cinco fracciones distintas con el mayorgrado de pureza posible en la poca. Estas cinco fracciones diferentes fueron unacorrespondiente a Polisacridos, otra de Lpidos, una de Protenas, otra de ARN y otra deADN.

Con cada una de estas fracciones procedentes de SIII muertos por calor intentaron transformarlas clulas RII vivas en SIII. Comprobaron que ninguna de las fracciones era capaz detransformar los neumococos RII en SIII excepto la fraccin qumicamente pura que contenaADN (cido desoxirribonucleico).

Para asegurarse de que solamente la fraccin de ADN era capaz de transformar losneumococos RII en SIII, emplearon enzimas de degradan o digieren especficamente el ADN.Cuando trataban la fraccin de ADN con estas enzimas y despus intentaban transformar lasclulas RII en SIII, no lo conseguan. Si trataban la fraccin de ADN con enzimas quedegradan especficamente el ARN y despus intentaban la transformacin, las clulas RII setransformaban en SIII. Si la fraccin de ADN se trataba previamente con proteasas (enzimasque degradan las protenas) tambin conseguan transformar los neumococos RII en SIII.

Conclusiones de Avery, McLeod y McCarthy: Teniendo en cuenta que la nica fraccin

qumicamente pura de los neumococos SIII muertos por calor que puede transformar losneumococos RII en SIII es el ADN, el Principio Transformante detectado por Griffith debe ser elADN. Por tanto, la molcula responsable de convertir los neumococos no virulentos envirulentos es el ADN y, por consiguiente, en l debe residir la informacin gentica.

Esquema de los resultados de Avery, McLeod yMcCarthy (1944)

Fotografa de Oswald Avery trbajando en sulaboratorio

La primera demostracin de que el ADN es el material hereditario se debe, por tanto, a Avery,McLeod y McCarthy en 1944, pero la comunidad cientfica, en ese momento, no estabapreparada para aceptar sus resultados, ya que pensaban que el ADN era una molculamontona que consista en la repeticin de un tetranucletido y que no poda ser la molculaque almacenaba la informacin gentica ya que no dispona de la variabilidad suficiente. Sinembargo, las protenas eran muy variables y si eran consideradas como candidatos a ser elmaterial hereditario.

La transformacin en bacterias: para conseguir que una bacteria se transforme es necesarioque el ADN exgeno o transformante penetre en su interior, posteriormente, el ADN exgeno otransformante debe integrarse en el ADN bacteriano, luego debe expresarse y, por ltimo,tiene que transmitirse de una bacteria a otra.

PRINCIPALES CARACTERSTICAS DE LOS BACTERIOFAGOS O FAGOS DELA SERIE T

Twort (1915) y D'Herelle (1917) descubrieron la existencia de virus que se alimentan debacterias o fagos. Posteriormente Delbrck y colaboradores (1938) sistematizaron los anlisisgenticos en fagos que infectaban a la bacteria E. coli. Max Delbrck y Salvador Luriarecibieron el Premio Nobel en 1969 por sus estudios con fagos.

Los virus que infecta a las bacterias (comedores de bacterias) se denominan bacteriofagos ofagos. Entre los virus que infectan a las bacterias, uno de los grupos ms estudiados engentica, es la familia de los fagos de la serie T que infectan a la bacteria del tracto intestinalEscherichia coli. La organizacin biolgica de estos virus es mucho ms sencilla que la de lasbacterias ya que solamente poseen dos tipos de compuestos que son el ADN y las protenas.

Los virus de la serie T, y en concreto el virus T4, posee una envoltura externa de naturalezaproteica denominada cpside o cabeza de forma icosadrica en cuyo interior se encuentraADN doble hlice lineal (el cromosoma del virus) altamente empaquetado. Adems tienen unacola compuesta por una mdula hueca envuelta por una vaina, una placa basal con fibras finasde la cola y fibras gruesas de anclaje.

Esquema del Fago T4 Fago T4 Esquema del Fago T4

La relacin que existe entre las bacterias y los fagos que las infectan puede ser de dos tipos:Relacin de tipo ltico y relacin de tipo lisognica.

Relacin Ltica: Tiene lugar cuando los fagos infectan a la bacteria, se multiplican en suinterior y la revientan o lisan liberndose nuevas partculas virales.

Relacin Lisgnica: Tiene lugar cuando los fagos infectan a la bacteria y en lugar de lisarlainmediatamente, integran su ADN en el ADN bacteriano.

La relacin que existe entre los virus de la serie T y la bacteria E. coli es de tipo ltico.

CICLO LTICO

Las diferentes fases del ciclo, respuesta o relacin de tipo Ltico son las siguientes: Adsorcin,Inyeccin, Multiplicacin Vegetativa, Maduracin y Lisis.

Adsorcin: los fagos se pegan a la pared celular bacteriana mediante una reaccin dereconocimiento tipo antgeno-anticuerpo, de manera que los fagos reconocen mediante lasfibras de la cola los lipopolisacaridos de la pared bacteriana.

Inyeccin: El fago introduce su ADN en el interior de la bacteria.

Multiplicacin Vegetativa: El ADN del fago se replica en el interior de la bacteria produciendomuchas copias.

Maduracin: La informacin contenida en el ADN del fago se expresa y se producen lasprotenas necesarias para formar la cpside, cola, fibras etc. Se ensamblam las distintas partesdel virus. Al final del proceso de maduracin, el ADN del virus se introduce en el interior de lascpsides apareciendo partculas virales completas en el interior de la bacteria.

Lisis: se produce una protena que revienta las bacterias matndolas y liberndose nuevaspartculas virales que pueden volver a infectar a otras bacterias.

Esquema ciclo ltico Adsorcin Inyeccin Fases del ciclo ltico Lisis bacteriana

EXPERIMENTOS CON FAGOS RADIACTIVOS HERSHEY Y CHASE (1952).

El material que utilizaron Alfred Hershey y Marta Chase (1952) en sus estudios fue el virus T4que infecta a la bacteria E. coli. Dicho virus mantiene una relacin de tipo ltico con estabacteria.

Los virus de la serie T, como el T4 cuando se aslan y se someten a un choque osmticopueden reventarse liberndose el ADN que estaba en el interior de su cpside.

Hershey y Chase pensaron en alguna forma para marcar los virus T4 solamente en su ADN ysolamente en sus protenas, se dieron cuenta de que el azufre (S) forma parte solamente delas protenas pero no del ADN, y que el Fsforo (P) forma parte solamente del ADN pero no delas protenas. Por tanto decidieron obtener dos colecciones de fagos diferentes, una coleccinde fagos T4 marcados solamente en su ADN con Fsforo radiactivo (P32) y otra coleccin defagos T4 marcados solamente en sus protenas con Azufre radiactivo (S35). Para conseguireste tipo de fagos T4 llevaron a cabo dos experimentos, en uno de ellos infectaron bacterias deE. coli que crecan en un medio que con tena P32, los virus descendientes de la infeccintenan marcado su ADN con P32; en el otro experimento infectaron bacterias de E. coli quecrecan en un medio con S35 , los virus descendientes de la infeccin tenan marcadas susprotenas con S35 .

Para comprobar que haban marcado correctamente los virus T4, unos solamente en el ADN yotra coleccin solamente en las protenas, aislaron parte de los virus descendientes de lasinfecciones los sometieron a choque osmtico y centrifugaron en condiciones tales que lascpsides de los virus eran ms pesadas y se iban al fondo del tubo despus de lacentrifugacin, mientras que el ADN que haba salido fuera de las cpsides, comoconsecuencia del choque osmtico, se quedaba en solucin al finalizar la centrifugacin.Cuando el experimento se hacia con virus marcados en su ADN con P32 el marcaje aparecaen solucin y no en el fondo del tubo, mientras que si el experimento se realizaba con fagosmarcados en sus protenas con S35 el marcaje apareca en el fondo del tubo donde estabanlas cpsides y no en solucin.

Fago reventado por choque osmtico Fago reventado por choque osmtico

Obtencin fagos T4 marcados en ADN

Obtencin fagos T4 marcados en protenas

Una vez conseguidos los virus que tenan marcado solamente su ADN con P32 y los fagos T4que tenan marcadas solamente sus protenas con S35, prepararon dos nuevos experimentos.

En primer lugar, infectaron bacterias de E. coli que crecan en un medio normal con los fagosT4 marcados en su ADN con P32 e inmediatamente despus de la infeccin agitaronviolentamente la mezcla en una batidora, de esta manera trataban de separar las bacterias delos fagos. Posteriormente centrifugaban de forma que las bacterias al ser mas grandes ypesadas se depositaban en el fondo del tubo, mientras que las cpsides de los virus mspequeas quedaban en solucin. Despus de centrifugar observaron que el marcajecorrespondiente al P32 apareca en el fondo del tubo donde estaban las bacterias, mientrasque en la solucin, donde estaban las cpsides de los fagos, no apareca marcaje debido alP32 (Figura A). Algunos de los virus descendientes de esta infeccin tenan marcado su ADNcon P32 .

El segundo experimento consisti en infectar bacterias que crecan en un medio normal con

fagos marcados en sus protena con S35, agitar inmediatamente despus de forma brusca enuna batidora la mezcla y centrifugar. En este caso, la mayor parte del marcaje (80%)correspondiente al S35 estaba en la solucin, donde se encontraban las cpsides; mientrasque en el fondo del tubo, lugar en el que estaban las bacterias, haba muy poco marcajedebido al S35 de las protenas (Figura B). Los virus descendientes de esta infeccin no tenanmarcadas sus cpsides con S35 .

Infeccin con fagos T4marcados en ADN

Infeccin con fagos T4marcados en protenas

De izquierda a derecha MartaChase y Alfred Hershey

Conclusiones de Hershey y Chase: Prcticamente lo nico que entra en las bacteriasdespus de la infeccin por el fago T4 es el ADN del fago, por dicho motivo, cuando se infectacon virus T4 marcados en su ADN el marcaje aparece en el fondo del tubo donde estn lasbacterias y no en la solucin. Adems en este caso, los virus descendientes estn marcadosen su ADN, lo que indica que el nico nexo de unin entre dos generaciones de fago T4 es elADN. Sin embargo, cuando se infecta con virus marcados en las protenas, se detecta muypoco marcaje en el fondo del tubo, donde estn las bacterias, estando la mayora del marcajeen la solucin, lugar en que se localizan las cpsides proteicas de los virus y no se observanvirus descendientes marcados en sus protenas. Por consiguiente, la molcula portadora de lainformacin en los virus T4 es el ADN y no las protenas.

A pesar de que el experimento de Hershey y Chase (1952) no fue tan limpio como el de Avery.McLeod y McCarthy (1944), ya que exista un 20% de marcaje de protenas que apareca en elfondo del tubo cuando se infecta con fagos T4 marcados con S35, la comunidad cientfica siadmiti en en este momento que el material hereditario era el ADN y no las protenas.

Este pequeo porcentaje de marcaje debido a protenas que aparece en el fondo del tubo, sedebe a que cuando los fagos de la serie T infectan a E. coli, como parte natural del proceso deinfeccin, adems de inyectar su ADN en el interior de la bacteria entran protenas virales.Para evitar este problema en los experimentos, se puede mediante tratamiento condetergentes destruir la pared bacteriana (conseguir un protoplasto) y seguidamente aadirsolamente ADN del virus T4 sin cpside al medio. En estas condiciones el ADN de T4 sincpside puede penetrar en el interior de la bacteria y realizar un ciclo ltico completo,apareciendo fagos descendientes completos con sus cisdes y su ADN empaquetado en elinterior, lo que significa que en el ADN reside la informacin para producir todas las protenasdel virus.

Conclusin: EL ADN es el material hereditario (la molcula portadora de la informacin) en elfago T4.

Alfred Hersey recibi el Premio Nobel por sus trabajos con fagos en 1969 junto con MaxDelbrck y Salvador Luria.

CARACTERSTICAS DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO (TMV)

El virus del mosaico del tabaco (TMV) infecta a las plantas del Tabaco produciendo manchasnecrticas en las hojas y prdidas muy importantes en las cosechas. El TMV tiene una cpsidecilndrica formada por 2.130 capsmeros, siendo todos los capsomros idnticos y estandoconstituidos por un polipptido de 158 aminocidos de longitud. Dichos capsmeros estndispuestos helicoidalmente dejando en el centro de la cpside un hueco donde se aloja el ARNde 6.400 ribonucletidos de longitud y de una sola hlice de este virus.

En este virus se han desarrollado tcnicas de reconstruccin de virus que permiten separar elARN de la cpside y posteriormente volver a reconstruir el virus uniendo las cpsides con elARN.

Esquema TMV Tres virus TMV Planta de tabacosana Planta infectada Hoja infectada

EXPERIMENTOS QUE DEMUESTRAN QUE EL ARN ES EL MATERIALHEREDITARIO EN EL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO (TMV)

Fraenkel-Conrat y Williams (1955) demostraron que despus de separar la cpside y el ARNdel virus TMV era posible volver a reconstruir el virus con capacidad infectiva.

Fraenkel-Conrat y Singer (1957) comprobaron que era posible separar el ARN y la cpside dedos tipos de virus TMV diferentes y reconstruir virus con la cpside de un tipo y el ARN de otrotipo. Cuando estos virus hbridos con cpside de un tipo (tipo 1) y ARN de otro tipo (tipo 2) seutilizaban para infectar hojas de tabaco, los virus descendientes de la infeccin mostrabansiempre un tipo de cpside (tipo 2) coincidente con el tipo de ARN (tipo 2) utilizado en lainfeccin.

Fraenkel-Conrat y colaboradores (1957) y Gierer y Schramn (1956) comprobaron que alinfectar plantas de tabaco solamente con el ARN aislado de partculas del virus TMV, seprovocaban los sntomas normales de la infeccin y adems era posible recuperar virus TMVcompletos a partir de las hojas de tabaco infectadas.

Conclusiones de los experimentos de Fraenkel-Conrat y colaboradores: Infectando

solamente con el ARN del virus TMV es posible obtener virus TMV completos con cpside yARN, y cuando se infecta con virus hbridos los virus descendientes poseen siempre unacpside coincidente con el tipo de ARN empleado para infectar; se deduce que la molculaportadora de la informacin, la que determina que aparezca la cpside del virus TMV es elARN.

Infeccin de hojas de tabacosolamente con ARN de TMV

Reconstruccin de virushbridos de TMV

Infeccin de hojas de tabacocon virus TMV hbridos

CONCLUSIONES GENERALES

La respuesta a la pregunta que nos habamos planteado al inicio de este captulo Qumolcula contiene la informacin gentica?, es que los cidos nucleicos, el ADN en lamayora de los organismos y el ARN en algunos virus, son el material hereditario y, porconsiguiente, las molculas que almacenan la informacin gentica.