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Alteraciones Histopatológicas y de los niveles de Inmunoglobulina G Página 91

Alteraciones Histopatológicas y de los niveles de Inmunoglobulina G en laCriptococosis inducida en mus musculus balb/c a diferentes tiempos de

infección.

Lujan Velásquez Manuela, Luyo Padilla Abraham, Chávez Castillo Milciades, Benites CastilloSantiago.Docentes UCV y UNT

R E s u M E N

El presente estudio tuvo por finalidad evaluar las alteraciones histopatológicas y los niveles deIgGen la criptococosisinducidaen Mus musculus BALB/c "ratón" a diferentes tiempos deinfección. Se trabajó con Cryptococcusneoformansy 45 ejemplaresde MusmusculusBALB/cde ambos sexos, de 45 días de edad y de aproximadamente 25g, en 5 de los cuales elegidos alazar se descartó infección natural porG.neoformansmediante la prueba de tinción negativa connigrosina al1 O% en muestras de cerebro y pulmones, con los 40 restantes se distribuyeron alazar en grupo control y grupo experimental de 20 ejemplares cada uno y subdividiéndose en4 subgrupos de 5 ejemplares cada uno. Los ratones del grupo experimental fueron inoculadosintraperitonealmente con 0,5 mL de una suspensión del hongo a una concentración similar altubo No 3 del Nefelómetro de Mac Farland, y para el grupo control se utilizó 0,5 mL soluciónsalina fisiológica (SSF) estéril. A los 10, 15, 20 Y 25 días de la inoculación, se tomaronmuestras de sangre para evaluar los niveles de IgG en suero, y luego del sacrificio se extrajeronel encéfalo, los pulmones, el bazo, el hígado y los riñones para su evaluación macroscópica ehistológica luego de su conservación en formol al 10% Y su posterior coloración conHematoxilina eosina. Se observó cambios macroscópicos como: Aumento de tamaño enlongitud presentándose marcada hepatomegalia y esplenomegalia, cambio de color, aspectohemorrágico y presencia de abscesos que iban aumentando en número a mayor tiempo deinfección y alteraciones histopatológicas que variaron de acuerdo al tiempo de infección, asítenemos que: a los 10 Y 15 días se observó hiperemia en meninges, infiltración inflamatoriacrónica en meninges , alvéolos e intersticio en pulmón, hígado y riñón; edema en cortezacerebral; necrosis en corteza cerebral, bazo, hígado y riñón; zonas de hemorragias en cerebro,pulmón, y tejido adiposo perirrenal; tendencia a formar granuloma en pulmón, e hígado;hiperplasia de nódulos linfáticos y de megacarioblastos en bazo; proliferación de linfocitos enbazo, dilatación de sinusoides en hígado; Cryptococcus en meninges, cerebro en formabilateral, pulmón, higado y riñón. A los 20 y 25 días de infección además de las alteracioneshistopatológicas observadas a los 10 Y 15 días, se encontró: Infiltración inflamatoria crónicagranulomatosa en meninges y pulmón; hiperemia en corteza cerebral; infiltración inflamatoriacrónica en bazo; múltiples focos de necrosis en hígado y riñón; abundantes Cryptococcus enmeninges, cerebro, bazo, pulmón, hígado y riñón. La evaluación de los niveles de IgGanticriptococósico del grupo experimental y control se realizó mediante la prueba de ELlSA,siendo el grupo control negativo para IgG anticripto~ocósico, y el .grupo experimental positivocon títulos de 1/80, 1/320,1/160,1/160 correspondientes a los días 10, 15,20, Y 25 días deinfección. Se concluyó que a mayores tiempos de infección se presentaron mayoresalteraciones histopatológicasen los órganos evaluados y los niveles de IgG aumentan hasta los15 días de infeccióny luego disminuyen a partir de los 20 días de infección. Se utilizó la pruebade correlación de Pearson, para determinar si hay relación entre el tamaño de los órganosevaluados y el tiempo de infección con C. neoformans, y la prueba de Chi cuadrado paradeterminar la relación de dependencia entre los niveles de alteración histopatológica y losnivelesde IgGencontrandose que existe relación de dependencia entre estos.

REVISTA MÉDICA VALLEJIANA

ABSTRACT

The present study had the purpose of evaluate histopatological alterations and IgG levelsin induced criptococosis in Mus musculus BALB/c "mouse" at different times of infection.For that it was worked with a culture of Cryptococcus neoformans and 45 specimens of Musmusculus BALB/c of both sexes, of 45 days of age and approximately 25g weigh, in 5 ofthose randomly chosen natural infection by C.neoformanswas discarded by means ofthetest of negative tint with 10% nigrosine in brain samples and lungs, the 40 remaining weredistributed at random in control group and experimental group of 20 especimens each oneand were subdivided in 4 subgroups of 5 specimens each one. The mice ofthe experimentalgroup were inoculated intraperitoneally with 0,5 mL of a suspension from the fungus in asimilar concentration to the tube N° 3 of of Mac Farland's Nefelometer, and for the controlgroup it was used 0,5 mL of sterile physiologic saline solution (SSF). At the 10, 15,20 and 25days of the inoculation, there were taken samples of blood to evaluate the levels of IgG inserum, and after the sacrifice there were extracted the encephal, lungs, spleen, liver andkidneys for their macroscopic and histological evaluation after their conservation in 10%formol and were later colorated with Hematoxylin. eosin. In relation to the control group inthe organs of the experimental group were observed macroscopic changes as: sizeIncrease in longitude presenting marked hepatomegalia and esplenomegalia, change ofcolor, hemorrhagic aspect and presence of abscesses that went increasing in number atmore time of infection and histopatological alterations were also observed at the days 10and 15 as hiperemia in meninxes, chronicle inflammatory infiltration in meninxes, alveolusand interstice in lung, liver and kidney; edema in cerebral cortex; necrosis in cerebralcortex, spleen, liver and kidney; areas of hemorrhages in brain, lung, and perirrenal adiposetissue; tendency to form granuloma in lung, and liver; hiperplasia of Iymphatic nodules andmegacarioblastos in spleen; proliferation of Iymphocytes in spleen, sinusoids dilation inliver; Cryptococcus in meninxes, brain in bilateral form, lung, liver and kidney. At the 20 and25 days of infection besides the histopatological alterations observed at the days 10 and 15,it was observed granulomatose chronic inflammatory Infiltration in meninxes and lung;hiperemy in cerebral cortex; chronicle inflammatory infiltration in spleen; multiple necrosisfocuses in liver and kidney; abundant Cryptococcus in meninxes, brain, spleen, lung, liverand kidney. The evaluation of the levels of anticriptococosic IgG of experimental group andcontrol was carried out by means of ELlSA'S test, being the control group negative foranticriptococosic IgG, and the experimental group positive with titles of 1/80, 1/320, 1/160,1/160 corresponding to the 10, 15, 20, and 25 days of infection. It was concluded that atmore times of infection bigger histopatological alterations were presented in the evaluatedorgans and the levels of IgG increases until the 15 days of infection and then they diminishstarting from the 20 days of infection. The test of correlation of Pearson was used, todetermine if there is relationship between the size of the evaluated organs and the time ofinfection with C. neoformans, and it was found that it is highly significant, and the test of Chisquared to determine the dependence relationship between the histopalogical alterationsand the levels of Ig G and it was found that dependence relationship exists.

Alteraciones Histopatológicas y de los niveles de Inmunoglobulina G

INTRODUCCIONPágina 93

La criptococosis (Blastomicosis europea óenfermedad de Busse Buschke), es unainfección sistémica subaguda o crónica,causada por Cryptococcus neoformansque afecta a nivel de la piel, huesos,pulmóny otras vísceras, pero con marcadotropismo por el sistema nervioso central(1,2,3). C. neoformans es una levadura de5 - 20 um que se multiplica por gemación yposee una cápsula polisacárida que leconfiere patogenicidad, por proteger alhongo de la fagocitosis (4,5). El estadoperfecto o telemorfo de C. neoformans es elbasidiomicete Filobasidiellaneoformans, ypresenta dos variedades, C.neoformansvariedad neoformans (serotiposA y D) YC.neoformansvariedadgattii(serotipos ByC), que se diferencian tanto desde el puntode vista patogénico, de distribucióngeográfica y bioquímica que hacen posiblesu identificación (6,7).Los factores que hacen a C. neoformanspatógeno puede ser dividido en dosgrandes grupos. El primero comprende lascaracterísticas básicas que necesita paraestablecer una infección y sobrevivir en elhuésped humano como son la presencia deuna cápsula polisacárida, habilidad paraproducir melanina (acción de lafeniloxidasa) y crecimiento a 37 ac. Elsegundo incluye características quepueden contribuir a su virulencia como lasecreción de proteinasas, fosfolipasaextracelular, ureasa y producción demanitol (3,8,9).La cápsula tiene característicasantifagocíticas por bloquear los efectosopsónicos del complemento y la acción delos anticuerpo s anticriptocócicos,igualmente la cápsula interfiere con elprpceso de la presentación de losantígenos que inducen la proliferación de lacélulas T y la producción de interleucinas 2y del interferon gama ( 4,10).La criptococosis se adquiere por inhalaciónde las levaduras dispersas en el medioambiente, lo que hace que el aparatorespiratorio sea el órgano de choque, enindividuos inmunocompetentes la infecciónpulmonar primaria suele ser asintomática óproducir una infección respiratoria similar ala influenza, producir a vecesexpectoración. con estrías sanguinolentas

siendo el cuadro más frecuente el nódulopulmonar solitario, que simula uncarcinoma, también produce unaneumonía sintomática que se caracterizapor infiltrados pulmonares difusos (11). Enlos pacientes inmunocomprometidos laslevaduras pueden multiplicarse ydiseminarse desde los pulmones a otraspartes del cuerpo, pero con preferencia alSNC para producir meningoencefalitiscriptococócica, cuyos síntomas suelenconsistir en cefaleas, fiebre que seprolonga varias semanas, rigidez o no de lanuca, deficiencias neurológicas yalteraciones a nivel de la conciencia(11,12).Actualmente se piensa que lamorfopatología de la lesión se relacionacon el estado de los mecanismos dedefensa tanto celulares como humorales (7,8). En individuos normales los linfocitosCD4+ inducen la formación de células

gigantes multinucleadas alrededor de loscriptococos, confinándolos en el sitio deinfección; en el individuo

~nmunocomprometido, estas células CD4+disminuyen y el hongo vence las defensasdel huésped, se disemina por vía

¡<11ematógena y va al sistema nerviosocentral, una vez que ha penetrado la

¡¡barrera hematoencefálica y contaminado ellíquido cefalorraquídeo se disemina por

dodo el cerebro (6,8).En el encéfalo, la criptococosis que

¡produce meningitis, meningoencefalitis,granulomas (criptococoma), que adoptan aveces la forma de una masa cerebralexpansiva y abscesos que provocandeficiencias neurológicas foca les (1,13). Anivel pulmonar puede haber infiltración enla parte inferior del pulmón, siendo lasmanifestaciones radiológicas múltiples, enalgunos casos infiltración en parches osignos de neumonitis intersticial y en otros,lesiones focales únicas (1,13). En algunosestudios el C. neoformans ha sidoencontrado en el 90% de autopsias decerebro, médula espinal o meninges, yaproximadamente en el 10% en otrasvísceras como riñón, adrenales, próstata,ojo, tracto urinario, hueso, y piel con o sinmeningitis (8).


Cuando el Cryptococcus llega a losalvéolos pulmonares se desencadena unarespuesta de la inmunidad celular yhumoral del huésped (4). La defensa delhuésped contra este patógeno es reguladapor la inmunidad mediada por células y lascélulas T CD4+juegan un rol central en lalimitación de la infección, y el balance entrelas citocinas Th1 y Th2 influencianmarcadamente el resultado de la infección.La predominancia de la síntesis de Th1sobre Th2 protege contra la infección,mientras que la infección es exacerbadabajo ladominancia de Th2 (14,15).La respuesta humoral está dada por laproducción de anticuerpos dirigidoscontra el glucoronoxilomanano (GMX) de lacápsula los cuales pueden opsonizar a losCryptococcus convirtiéndose en los gatillosde los mecanismos de citotoxicidadanticuerpodependiente (8). Estosanticuerpos se detectan al inicio de lainfección, pero con el progreso de laenfermedad hay una rápida multiplicaciónde células de levaduras con la producciónde grandes cantidades de antígenocapsular que neutraliza al anticuerpo(15).EI diagnóstico clínico de lacriptococosis es difícil, ya que las formas depresentación son inespecíficas, por lo queel diagnóstico definitivo es elmicrobiológico, para lo cual debeseleccionarse la muestra adecuada,según el foco de infección. Realizándosetinción negativa con tinta china o nigrosina,con mucicarmin de Mayer, 9ultivo eidentificación por pruebas bioquímicas,pruebas inmunológicas para detección delantígeno capsular o de anticuerpos,diagnóstico molecular e histopatología(1,11).Entre las pruebas inmunológicas para ladetección de antígeno capsular de C.neoformans se encuentran la prueba deaglutinación en lámina (LA test), y pruebade ELlSA con anticuerpos monoclonales.Dentro de las pruebas inmunológicas paradetectar anticuerpos anti C. neoformanstenemos inmunofluorescencia indirecta yaglutinación en tubo (8,16). Lacriptococosis tiene una distribuciónmundial, pero su prevalencia real se

desconoce debido a la ausencia depruebas serológicas fiables. Anteriormenteera una enfermedad rara que afectaba apacientes con alguna enfermedad queproducía alteración de la inmunidad celulary en la actualidad es la micosis sistémicamás frecuente en los pacientesinmunosuprimidos como en el SIDA (4). Sinembargo, un gran número de meningitiscriptococósica se producen en pacientessin anomalías inmunológicas nimetabólicas de base (4).En el Perú y en nuestro medio todos loscasos reportados y estudiados decriptococosis están relacionados conpacientes que presentan SIDA (17,18,19).En el estudio realizado por Rodriguez yTrigoso (1992) encontraron que el 28,5%de muertes de pacientes con SIDA en elHospital Daniel Alcides Carrión se debió ala criptococosis; sin embargo, dado a quese ha encontrado la existencia saprofítica yla alta patogenicidad de este hongo,constituye una amenaza tanto para niños yadultos inmunocompetentes. Siendo pocoslos trabajos de investigación realizados conC. neoformans a nivel de laboratorio,dentro de estos tenemos el estudiorealizado por Canelo y cols (1999), sobre ladeterminación de la variedad de C.neoformans aislado de un paciente conSIDA y el estudio realizado por Rea (1995)sobre el efecto antimicótico del aceite deAlliun sativum en la criptococosis inducidaen Mus musculus var albinus, sin embargono existen investigaciones para evaluar lasalteraciones histopatológicas y los nivelesde anticuerpos en la criptococosis inducidaen Mus musculus BALB/c (18,20,21).El presente estudio tuvo los siguientesobjetivos: Evaluar las alteracioneshistopatológicas, evaluar los niveles de IgG mediante la prueba de ELlSA ydeterminar la relación que existe entreestos, en la Criptococosis inducida en Musmusculus BALB/c a diferentes tiempos deinfección.


MATERIAL Y METODOS

Material Biológico:?45 especímenes de Mus musculus(BALB/c) de ambos sexos, 45 días denacidos y 25 9 de peso, obtenidos delbioterio de la Univ.P..Cayetano Heredia.Cultivo de Cryptococcus neoformans,obtenido del Laboratorio del HospitalRegional Docente de Trujillo.

Métodos:Determinación de la especie de C.neoformans:C. neoformans fueconfirmada mediante las siguientespruebas:Crecimiento en Agar Sabouraud atemperatura ambiente.Crecimiento en medio selectivo para C.neoformans propuesto por Shields Ajello yStaib Seeling modificado por Arellano,presencia de cápsula; de ureasa;asimilación de KN03; desarrollo en agarsabouraud a 37 o C; patogenicidad:Inoculación intracraneal en ratones (AnexoFig. 2) (1,22,21 ,23).Distribución del material biológicoSe verificó que los ratones se encuentranlibres de infección por C. neoformans,mediante la prueba de tinción negativa connigrosina en muestras de cerebro ypulmones de 5 ratones seleccionados alazar. Luego a los 40 ratones restantes seles distribuyó en dos grupos: Un grupoexperimental y un grupo controlseleccionados al azar, manteniéndose enlas mismas condiciones de alimentación.Grupo experimental: Conformado por 20ratones distribuidos en cuatro subgrupos de5 ratones cada uno, seleccionados al azar.Para evaluar el daño hiostopatológico y lapresencia de IgG específico a los 10, 15,20,Y25 días de infección.Grupo control: Conformado por 20ratones distribuidos en cuatro subgrupos de5 ratones cada uno, correspondiente a losdías 10, 15, 20 Y 25 tal como fueronevaluados los ratones del grupoexperimental.Preparación del inóculo : Se preparó apartir de un cultivo de C. neoformans en

Agar Sabouraud incubado a 37 °C durante72 horas, al cabo de los cuales fueroncosechados con SSF estéril, hasta obteneruna turbidez semejante al tubo 3 delNefelómetro de Mac Farland (21).Inoculación: A cada uno de los ratones del

grupo experimental se les inoculó 0.5 mLde la suspensión de Cryptococcusneoformans por vía intraperitoneal (Anexo,Fig. 3); Y a los ratones del grupo control seles inoculó 0.5 mL de SSF por víaintraperitoneal.Evaluación: A cada uno de los grupos quecorrespondieron a los días 10, 15, 20 Y 25después de inoculados se los evaluó enbase a:1. Determinación de niveles deinmunoglobulinas G (Ig G)2.0btención de Suero: Se extrajo sangrepor punción cardiaca de los ratonespreviamente anestesiados con cloroformo(Anexo, Fig. 4). El suero fue obtenido porcentrifugación a 3000 rpm por 20 minutos.3.Detección y determinación de 105

títulos de IgG anticriptococósico: Ladetección y determinación de los títulos deIgG anticriptococósico tanto del grupoexperimental como del grupo control serealizó mediante la prueba de ELlSA.

Grupo Experimental:Para la detección y determinación de lostítulos de IgG se siguió el siguienteprotocolo.Obtención del antígenoSe realizó una suspensión densa deCryptococcus neoformans en formol al 5 %,Y luego se le aplicó tratamiento térmico a 56°c durante 30 minutos. Luego se centrifugóa 2 500 rpm durante 10 minutos, se eliminóel sobrenadante y se obtuvo el sedimento(Kaufman y cols, 1994).Sensibilización de la placaPreparación del antígenoA partir del sedimento obtenido en el pasoanterior, se realizó una suspensión enbuffer carbonato-bicarbonato O,2M pH 9,8a una concentración semejante al tubo N° 1del Nefelómetro de Mac Farland.


Sensibilización de la placaSe distribuyó 100 L de la suspensión de Agen cada pocillo de la placa de ELlSA. Serecubrió la placa con una hoja autoadheribley se incubó a 37°C durante 2 horas. Se dejóen incubación a 4°C para facilitar laadherencia de los antígenos al poliestireno.Lavado de los poeíllosLuego se eliminó la solución sensibilizante yse lavó 1vez con PBS.

Bloqueo de las zonas reactivas de la placaa) Cada uno de los pocillos de la placafue saturado con 100 L de una solución degelatina al 0,5 % y se incubó a 37°Cdurante 30 minutos.Lavado de los pocíllosSe descartó la solución bloqueadora y seenjuagó 3 veces con PBS-tween_20 al0,1%, cada lavado con un tiempo de cincominutos y en agitación constante.

Preparación de los suerosA partir de los sueros correspondientes a los10, 15, 20 Y 25 días de infección se preparódiluciones (1, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80/1/160,1/320,1/640,1/1280) en PBS-tween-gelatinaSe distribuyó 100 L de cada dilución en lospocillosLos dos últimos pocillos de cada hileracorresponden a control positivo (suero deratón a los 20 días de infección) y controlnegativo (suero de ratón no infectado)Se cubrió la placa con una hojaautoadherible y se incubó a 37°C durante 1-2 horas.Se lavó las placas 5 veces con PBS-tween_20 al 0,1 %

Detección del complejoAntígeno-AnticuerpoSe distribuyó 100 L de la solución al 1/100del conjugado anti Ig G de ratón-enzima(fosfatasa alcalina) en PBS-tween-gelatinaSe cubrió la placa e incubó a 37°C durante1-2 horasSe lavó la placa 5 veces con PBS-tween_20Se distribuyó 100 L del sustrato(paranitrofenilfosfato PNP disuelto en bufferglicina 9,8)Se incubó durante 10 a 30 minutos

Se detuvo la reacción con 50 DIde NaOH 3NSe realizó la lectura.

Grupo ControlPara la detección y determinación de lostítulos de IgG anticriptococósico del grupocontrol se siguió el mismo procedimientoque para el grupo experimental, siendo lospasos A, B, C, Y E similares, variando elpaso D.

D. Preparación de los suerosa) A partir de los sueros correspondientes alos ratones no infectados en los días 10, 15,20, Y 25, se preparó diluciones (1,1/5,1/10,1/20, 1/40, 1/80/ 1/160, 1/320, 1/640,1/1280) en PBS-tween-gelatina. Sedistribuyó 100 L de cada dilución en lospocillos. Los dos últimos pocillos de cadahilera corresponden a control positivo(suero de ratón a los 20 días de infección) ycontrol negativo (suero de ratón sininfección). Se cubrió la placa con una hojaautoadherible y se incubó a 37°C durante 1-2 horas. Se lavó las placas 5 veces conPBS-tween_20 al 0,1 %.Estudio histopatológicoLuego de extraer la sangre por puncióncardiaca, se sacrificaron y disectaron losratones y se extrajeron los siguientesórganos: Pulmón, hígado, bazo, riñón yencéfalo. Se realizó una evaluación

macroscópica y luego se tomó una muestrapara sembrar en agar Sabouraud y agar BHIy para observación microscópica connigrosina a110% (Anexo, Fig. 2 Y5), el restofue fijado con formal al 10% para realizarcortes histológicos y coloraciónHematoxilina eosina (HE), la evaluación delas alteraciones histopatológicas fuerealizada por un médico patólogo. Toda laexperiencia fue realizada bajo estrictasmedidas de bioseguridad (Anexo, Fig. 6).Tratamiento estadisticoSe realizó el análisis estadístico mediante

las pruebas de correlación de Pearson y laprueba Chi cuadrado. Se usó el paqueteestadístico SPSS versión 10.1.

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RESULTADOS

C. neoformans se confirmó por sumorfologia y crecimiento enAgar sabourauda P ambiental y a 37°C; producir ureasa, noasimilar el nitrato de potasio y matar al ratónluego de la inoculación intracraneal ypresentar cápsula (Anexo, Fig. 1).

En la evaluación macroscópica deencéfalo, pulmón, bazo, hígado y riñón(Tabla 1, 2, 3, Y 4) se encontró que enrelación a los órganos del grupo control, losórganos de los ratones del grupoexperimental presentaron cambios talescomo: Aumento de tamaño de encéfalo,pulmón, bazo, hígado y riñón, se observóhepatomegalia y esplenomegalia (Fig. 1),cambios de color, hemorragia y abscesos enriñón e hígado (Fig. 2).

Las alteraciones en encéfalotenemos: Infiltrado inflamatorio crónico (Fig.4), hiperemia (Fig. 5), colonias deCryptococcus (Fig. 6); en pulmón: Zonashemorrágicas (Fig. 8), granuloma (Fig. 9),tejido con abundantes Cryptococcus congran cápsula (Fig. 10); en bazo tenemos:Hiperplasia de megacarioblastos (Fig. 12),cápsula engrosada con Cryptococcus (Fig.13) Y células reticulares con materialfagocitado (Fig. 14); en hígado tenemosgranuloma y necrosis (Fig. 16) Y en riñón

Cryptococcus en zona perirrenal (Fig. 17),estas alteraciones se compararon concortes histológicos de los órganos de losratones del grupo control (Fig. 3, 7, 11, Y 15).

La tabla 9 muestra el grado deinfección de los diferentes órganos enrelación al tiempo de infección conCryptococcus neoformans. No sedetectaron IgG anticriptococósico en losratones del grupo control (Tabla 10 Y Fig. 23Y24) Yen los ratones del grupo experimentalfueron detectados a los 10, 15,20 Y 25 díasde infección, encontrándose títulos de 80,320, 160 Y 160 respectivamente (Tabla 10 YFig. 23 Y 25), demostrando un máximo a los15 días de infección con C. neoformans yluego disminuye a partirde los 20 días.

Se realizó la prueba de correlaciónde Pearson y se encontró que es altamentesignificativo, con un nivel de significancia del0,01, es decir, que el tamaño está enrelación con el tiempo de infección (Anexo,Tabla 2). Y se empleó la prueba de Chicuadrado para determinar la relación dedependencia entre los niveles de alteraciónhistopatológica y los niveles de Ig G, seencontró que existe dependencia entreestos (Anexo Tabla 3).

TABLA 1. Parámetros evaluados en el estudio macroscópico de encéfalo, pulmones, bazo, hígado y riñónde Mus musculus BALB/c a los 10 días de infección con Cryptococcus neoformans.

Hemorragias -Abscesos

C = Grupo controlE = Grupo experimental

/

ÓrganosParárretros Encéfalo

C ETarrañoen 1 1longitud(cm)Color Crerra Crerra

brillante brillante

Pulrrón Bazo Hígado RiñónC E C E C E C E

1,5 1,7 1,7 2,0 2,5 2,5 0,9 1,0

Blanco Blanco Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojorojizo vinoso vinoso vinoso vinoso vinoso vinos

oSi -

Si


TABLA 2. Parámetros evaluados en el estudio macroscópico de encéfalo, pulmones, bazo, hígado yriñón de Mus musculus BALB/c a los 15 días de infección con Cryptococcus neoformans.

C = Grupo controlE = Grupo experimental

TABLA 3. Parámetros evaluados en el estudio macroscópico de encéfalo, pulmones, bazo, hígado, yriñón de Musmusculus BALB/c a los20 días de infección con Cryptococcusneoformans.

TABLA 4. Parámetros evaluados en el estudio macroscópico de encéfalo, pulmones, bazo, hígado, yriñón de Mus musculus BALB/c a los 25 días de infección con Cryptococcus neoformans.

Hemorragias

Abscesos

C = Grupo controlE = Grupo experimental*= Numerosos abscesos.

QganosParárretros Encéfalo Pulrrón Bazo Hígado Riñón

C E C E C E C E C Etarraño en 1 1 1,5 1,9 1,7 2,2 2,5 3,0 0,9 1,2(cm)Color Crerra Crerra Blanoo Blanoo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo

brillante rojizo rojizo vinoso vinoso vinoso vinoso vinoso vinosoHermrragias - Si - Si - Si - Si - SiAbscesos - - - - - - - Si

ÓrganosParárretros Encéfalo Pulrrón Bazo Hígado Riñón

C E C E C E C E C ETarraño en 1 1,2 1,5 2,0 1,7 2,2 2,5 3,0 0,9 1,2longitud(cm)Color Crerra Crerra Blanoo Crerra Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo

briIIante rojizo rOJIzo vinoso oscuro vinoso oscuro vinoso oscuro

Hermrragias - Si - Si - Si - Si - SiAbsoesos - - - - - - - Si - Si

C = Grupo controlE= Grupo experimental

ÓrganosParámetros Encéfalo Pulmón Bazo Hígado Riñón

C E C E C E C E C E---

Tamaño en 1 1,5 1,5 2,5 1,7 2,5 2,5 3,5 0,9 1,2longitud(cm)

Color Crema Crema Blanco Crema Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo ROJobrillante rOjizo rOJIzo vinoso oscuro vinoso oscuro vinoso oscuro

Si Si Si Si Si

Si*Si

'_'____n__


FIG. 1. Aumento de tamaño del bazo (esplenogegalia) deMus musculus BALB/c a los 10 (b), 15 (c), 20 (d), Y25(e) díasde infección con C. neoformans comparado con uno noinfectado (a)

~ ,~~» fI ti

TABLA 5. Alteraciones histopatológicas de encéfalo, pulmón,bazo, hígado y riñón de Mus musculus BALB/c a los 10 díasde infección con Cryptococcus neoformans.

~ENCÉFALO

ALTERACIONES

MENINGES Infiltración inflamatoria crónica

CEREBRO Edema de parénquima de corteza cerebral

PULMÓN- Zonasdehemorragias,acúmulode Cryptococcusenel vértice de los lóbulos

Inf,ltración inflamatoria crón,ca

Tendencia a formar granulomas

BAZO Hiperplasia de nódulos linláticos y de megacarioblastos

HIGADO Algunos focos de necrasis

RIÑÓN Tejido adiposo con hemorragia, necrosis

TABLA 7. Alteraciones histopatológicas de encéfalo, pulmón,bazo, hígado y riñón de Mus musculus BALB/c a los 20 días de

QBSiA!:LQ.§..

ENC'FACO

ALTERAC'ONES

MEN'NGESH'p.,.m', "1111,,,16, ,,11'10",°'" "óo'CO, 10"",,,160 ,,60'co9"",,,m"mEd.m" h'p".m', eo '""m ""h,,'h,m''''9'', ,bp,'",,, C'"'oc,,,,,

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R'NON eo9""d, ,"o '0111",,160 'oflóm",,,,, "ó"'co,'o p"eoqOlm' ""'P'P'" ,bPOd"lo,

FIG. 5. Corte histológico de encéfalo de Musmusculus BALB/c infectado con C. Neoformansmostrando H: hiperemia. Coloración H.E. 40 X.

FIG 2. Hígado de Mus musculus BALB/c mostrando losabscesos (flechas) a los 25 días de infección con C.Neoformans.

t5

TABLA 6. Alteraciones histopatológicas de encéfalo, pulmón,bazo, hígado y riñón de Mus musculus BALB/c a los 15 días deinfección con Cryptococcus neoformans.

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ENCEFALO

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CEREBRO ",'e" ""b,,' hemo"agia,"'onia de

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BAZO

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TABLA 8. Alteraciones histopatológicas de encéfalo,pulmón, bazo, hígado y riñón de Mus musculus BALB/c a los

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ENCEFALO

LESIONES .~ ,-

MENINGES mlll'"eióo inflamato,ia "Oniea, ,"meoto d. fiboobla,"o, y

CEREBRO Intilt"eión ioflamoto,;a

C'yptoeoeeu,"OolCa ,eoioa",I", ,bondoo'"

PULMON

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HIGADO e ',"'t"e;On inflamato,ia "Oniea,g""" labiq''', abondaot"

RIÑÓN Tejido ,dipow y e'pcula con i""toa"óo ioflam,to,i, "On;ea, noooo,i,en p,,'oqoima necooSl' en mOd,la ,bondantes C>votoeoeeus.

FIG. 6. Corte histológico de encéfalo de Mus musculusBALB/c infectado con C. neoformans mostrando: C =colonias de Cryptococcus. Coloración H.E. 40 x.

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FIG. 7. Corte histológico de pulmón de Mus musculusBALB/c no infectado con C. neoformans. ColoraciónH.E.40X

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FIG. 9. Corte histológico de pulmón de Mus musculus BALB/cinfectado con C. neoformans, mostrando: Granuloma.Coloración H.E. 40 X

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FIG. 11. Corte histológico de bazo de Mus musculusBALB/c no infectado con C. neoformans. ColoraciónH.E.40 X

FIG. 13. Corte histológico de bazo de Mus musculusBALB/c infectado con C. neoformans, mostrando

cápsula engrosada con Cryptococcus. ColoraciónH.E. 40 X

FIG. 8. Corte histológico de pulmón de Mus musculusBALB/c infectado con C. neoformans; mostrando ZH: zonahemorrágica. Coloración H.E. 40 X.

FIG. 12. Corte histológico de bazo de Mus musculusBALB/c infectado con C. neoformans, mostrandoHiperplasia de megacarioblastos. Coloración H.E.40 X

Fig. 14. Corte histológico de bazo de Mus musculusBALB/c con C. neoformans, células reticulares conmaterial fagocitado en su citoplasma. ColoraciónH.E. 100 X

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Alteraciones Histopatológicas y de los niveles de Inmunoglobulina G

FIG. 15. Corte histológicode hígado de Mus musculusBALB/cno infectado con C. neoformans. ColoraciónH.E.40X.

FIG. 17. Corte histológico de riñón de Mus musculusBALB/c infectado con C. neoformans, mostrando alhongo encapsulado a nivel de tejido adiposoperirrenal. Coloración HE 40X.r W'"J'

FIG: 18. Corte histológico de encéfalo de Musmusculus BALB/c no infectado con C. neoformans.Coloración H.E. 40 X.

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FIG. 20. Corte histológico de encéfalo de Musmusculus BALB/cinfectado con C. neoformans,mostrando el grado de infección (++) a los 15 díasde infección. Coloración H.E. 100X.

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Página 101

FIG. 16. Corte histológicode hígado de Musmusculus BALB/cinfectando con C. neoformans,mostrando: N: necrosis; G: granuloma. ColoraciónH.E. 40 X.

TABLA9. Grado de infección de los diferentes órganosen relación al tiempo de infección en la criptococosisinducida en Mus musculus BALB/c.

ORGANOS

DíAS ENCÉFALO PULMÓN BAZO HIGAOO RIÑÓN

10

15

20 +++ ++

25 +++

1 10 levaduras por campo: +10 20 levaduras por campo: ++Más de 20 levaduras por campo: +++

FIG. 19. Corte histológico de encéfalo de Musmusculus BALB/c infectado con C. Neoformans,mostrando el grado de infección (+) a los 10 días deinfección. Coloración H.E. 100 X

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TABLA 10. Título de Ig G anti Cryptococcusneoformans en el grupo control y grupoexperimental de Mus musculus BALB/c en

FIG. 24. Determinación del título de Ig Ganticriptococósico a diferentes diluciones, a partir desueros obtenidos de Mus musculus BALB/c del grupocontrol, mediante la prueba de ELlSA.

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DISCUSION

C. neoformans en humanos puede causarlesiones variadas desde micosissuperficiales hasta micosis profundas degran variedad. Se presentan lesiones enpiel, pulmones, mucosas, riñones, hígado,cerebro y meninges (4,11).Macroscópicamente, se distinguen dosclases de lesiones principalmente: Focosde tamaño variable que presentan aspectogelatinoso, se observan masas mucoidessobre todo en las leptomeninges, perotambién pueden encontrarse en el encéfaloy en otros órganos. En esta clase delesiones se presentan numerosas célulasfúngicas; Granulomas y focos nodularesque alcanzan varios centímetros dediámetro y que son de aspecto tumora!. En

FIG. 23. Título de Ig G anti C. neoformans en losratones del grupo control (A) y del grupo experimental(B) de Mus musculus BALB/c en relación al tiempo deinfección, mediante la prueba de ELlSA.

350

300

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50

oo 10 15 20 25

Tiempo (minutos)

I . Titulode IgG IFIG: 25. Determinación del título de Ig Ganticriptococósico a diferentes diluciones, a partir desueros obtenidos de Mus musculus BALB/c del grupoexperimental a diferentes tiempos de infección conCryptococcus neoformans. Mediante la prueba deELlSA.

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focos grandes se llaman criptococomas . Enestos nódulos, de color grisáceo-blanquecino, las células fúngicas son másbien escasas (4). Microscópicamente seobservan: Una proliferación histiocitaria ouna reacción celular más bien escasa opoco característica a nivel de las lesionesmacróscopicamente gelatinosas y deaspecto mucoide que tienen numerosascélulas capsuladas. Una reaccióngranulomatosa en los focos sólidos onodulares con pocos hongos. En estosfocos pueden formarse tubérculos que nose distinguen de los granulomas que se venen la tuberculosis (26,27). C. neoformanses patógeno para el ratón (Mus musculusBALB/c).

TITULO

ffiLP(} 10 20 40 80 180 320 640

CXNTRO...

E*'ERIIvENTI'L10 DíAS +

15 DíAS +

20 DíAS +


Si se inyecta por vía intraperitoneal producemasas gelatinosas en el mesenterio y en elcerebro y ocasiona la muerte de los animalesen 3 o 4 semanas (1,27).

Esto concuerda conlo observado en la presente investigación, enlaque se observó cambios macroscópicos enencéfalo, pulmones, bazo, y riñones, talcomo se describe en las Tablas 1, 2, 3, Y 4.Estos cambios como aumento de tamaño,pueden deberse a la producción de masasgelatinosas en los órganos, sin embargo, elcambio de tamaño en encéfalo y pulmoneses mínimo (Tablas 1,2, Y3) Ysegún Gutiérrez(2000), se debe a que hay ocupación de losespacios por parte de los Cryptococcus,observándose en estos órganos solo cambiode consistencia y cambio de color. El cambiode color a un tono rojizo hemorrágicopresentado en el encéfalo puede deberse aque se presentan hemorragias debido alaumento de la presión intracraneana. Enrelación a la presencia de abscesos estos sedeben a la acumulación y/o establecimientodel hongo (27).

El cambio de color a

un tono más oscuro observado en hígado ybazo, no concuerda con lo reportado por Rea(1995) quien describe que en lacryptococosis experimental en ratones, estosórganos se vuelven hipocrómicos. Lasalteraciones histopatológicas que semuestran en las Tablas 5, 6, 7, Y 8observadas en los ratones del grupoexperimental son semejantes a lasreportadas para cryptococosis humana. Asítenemos que en casos humanos se presentaun proceso infecciosos granulomatoso conescasas células gigantes multifocal enpulmón, bazo, meninges y tejido nerviosocon abundantes levaduras rodeadas de unhalo mucoide (3).Gutiérrez (2000), y Pérez y Carrasco (2000)afirman que la reacción inflamatoria en estainfección es variable de unos pacientes aotros. Y si se presenta respuesta inflamatoriapueden participar células multinucleadasgigantes (con decenas de Cryptococcusfagocitados), macrófagos (con o sinfagocitosis de elementos micóticos),linfocitos, células plasmáticas y leucocitosneutrófilos que típicamente son poco

numerosos ya que salvo en los abscesos, laslesiones no suelen ser supurativas, lo queconcuerda con los resultados obtenidos enlos que se observa reacción inflamatoria detipo crónica y tipo crónica granulomatosa(28).La tabla 9 muestra el grado de infección deacuerdo al número de levaduras por campo,presentes en los diferentes órganos; En elcual se observa que al inicio de la infecciónhay pocas levaduras en cada órgano, peroestas van aumentado a medida quetranscurre el tiempo de infección, a los 25días está completamente invadido por lalevadura, esto a pesar que no se utilizóningún inmunosupresor.Esto podría ocurrirporque la cantidad de levaduras vence laresistencia natural del huésped y la invadecompletamente, resultando en micosissistémica, o porque los productos queconstituyen la cápsula(glucuronoxilomanano y galactoxilomanano)previenen la migración de los leucocitos a lossitios de inflamación aguda, inducensupresión de los linfocitos T y supresión de larespuesta de los anticuerpos anticriptococos(8), y según Kawahami, C. neoformansinfecta los pulmones a través de la vía aéreay causa lesiones granulomatosas, queprevienen la diseminación delmicroorganismo fuera de los sitios deinfección primaria. Sin embargo, la infecciónpuede diseminarse vía hematógena alsistema nervioso central y que la defensa delhuésped contra este patógeno fúngico esregulado por inmunidad mediada por célulasy las células CD4 y T juegan un rol central enla limitación de la infección. El balance entre

citocinas Th 1 YTh2 influye marcadamente enel resultado de la infección, la síntesispredominante de citosina Th1 sobre Th2protege a los ratones contra esta infección,mientras que la infección es exacerbada bajola dominancia de Th2 y además propone elrol de las NKT (Células T Natural Killer) en larespuesta contra la infección criptocócica.Lavirulencia de C. neoformans depende enparte de la cápsula polisacárida. Lasinterrelaciones que puedan existir entre lavirulencia del hongo y las características dela cápsula con la respuesta inflamatoriatisular que provoca, deben encontrarse


modificados por el estado deinmunodeficiencia del huésped y además elsuero humano normal inhibe el crecimientode C. neoformans y la encapsulación vienea representar la expresión de una forma deresistencia (12,28).Esto concuerda con loobservado en nuestra experiencia ya que alos ratones no se les administró ningúninmunosupresor, y se observó unaconsiderable cápsula en los diferentesórganos infectados.Se observa un mayor daño al encéfalo, loque coincide con la literatura, lo cual seexplica por la ausencia de factoresanticriptococósicos solubles y de activacióndel complemento en el LCR, la escasarespuesta inflamatoria en el encéfalo y losaltos niveles de dopamina dentro del SNCque favoreceD la infección en este nivel (3).

En relación a laproducción de anticuerpos Mendoza y Arias(1999); Rose y cols (1993) sostienen quedurante la infección criptococócica losanticuerpos no son formados, pero si seproducen lo hacen en bajos títulos y puedenopsonizar los criptococos, convirtiéndose enlos gatillos de mecanismos de citotoxicidaddependiente de anticuerpos. El nivel de IgGen ratones del grupo experimental fuemayor a los 15 días (título 320) y luegodisminuyó a 160 a los 20 y 25 días (Figuras22 y 24).

7Esto concuerda con Rose y cols (1983),quienes afirman que al principio del curso de

gla criptococosis, las pruebas serológicasdemostraron anticuerpos pero no antígenos.Con el progreso de la enfermedad, hay una

9rápida multiplicación de las células delevaduras, con gran producción de antígenocapsular que neutraliza al anticuerpo.Además concuerda con Parra y cols (2001)quienes trabajando con modelos murinos,encontraron en cepas de ratones BALB/c y

CONCLUSIONES

El C. Neoformans en Mus musculus BALB/Cproduce criptococosis sistémica concompromiso de encéfalo, pulmones, bazo,hígado, riñones, páncreas y ganglioslinfáticos, cuyos cambios macroscópicos yalteraciones histopatológicas varían enrelación al tiempo de infección.

ratones C57BL/6 similar respuesta. Estoshallazgos difieren con Chinchilla (2002) queencontró una mayor producción de Ig G a los8 días de infección y disminuye en el día 13.

En la presenteinvestigación se encontró que la relaciónentre las alteraciones histopatológicas y losniveles de Ig G es inversa, mientras mayores el daño histológico (Tabla 5, 6, 7, Y 8) Ymayor la cantidad de levaduras (Tabla 9) sonmenores los niveles de Ig G. Por lo tantomientras mayor es el tiempo de infeccióntranscurrida, los niveles de Ig G vandisminuyendo. Este conocimiento adquiereimportancia en el diagnóstico de lacriptococosis. La prueba de ELlSA es unapropuesta para la detección temprana deanticuerpos de tipo Ig G contra la cápsula(glucoronoxilomanano o GXM), tal como loreportan Parra y cols (2001) en suinvestigación con modelos murinos. Esto encomparación con el estudio realizado porLópez y Castañon-Olivares (1996) quereportan la detección y cuantificación delantígeno criptococócico como pruebasensible (83,3 %) pero que no se puedecorrelacionar clínica mente (29).

Además, por laimportancia de esta enfermedad esnecesario aumentar las oportunidadesdiagnósticas, razón por la cual se propuso

21mplementar el presente estudio con elobjeto de relacionar el daño histopatológicoy los niveles de IgG en Mus musculus

2BALB/c empleándose la prueba de ELlSApara la detección y determinación de los

2títulos de IgG, en la cual se fijó a la placacomo antígeno al hongo capsulado denaturaleza polisacárida a diferencia de otrosprocedimientos de la prueba de ELlSA quefija antígeno soluble y de naturalezaproteica.

C. neoformans induce la producción deanticuerpos Ig G en Mus musculus BALB/C,obteniéndose un máximo a los 15 días ydisminuyendo el a los 20 días de infección.A mayor tiempo de infección las alteracioneshistopatológicos son mayores y los nivelesde Ig G disminuyen.


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FIG. 1. Pruebas para la determinación de Cryptococcus ne%rmans a)Cultivo enAgar sabouraud a temperatura ambiente: Positivo; b) a 37 'C: Positivo c) Cultivoen Agar Úrea: produce ureasa; d) Cultivo en Caldo Nitrato de Potasio: Negativo; e)Cultivo en Agar Shields Ajello y Staibseeling modificado por Arellano: Formacolonias pardas f) Cultivo en placa deAgar Sabouraud: Forma colonias mucosas ycremas.

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ESTUDIO Correlación Pearson

S ig (2 colas)

N

PULMON Correlación Pearson

Sigo (2 colas)

N

ENCEFALO Correlación Pearson

S ig (2 colas)

N

B A Z O Correlación Pearson

Sigo (2 colas)

N

H IG A D O Correlación Pearson

Sigo (2 colas)

N

R I Ñ O N Correlación Pearson

S ig (2 colas)

N

FIG. 2. Cryptococcus ne%rmans, mostrando gran cápsula en muestras deencéfalo de Mus musculus BALB/c infectados (prueba de patogenicidad).

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-ESTUDIO PULMON ENCEFALO B A Z O H IG A DO R IÑ O N---- ,,------

1 , O O O O ,9 9 1 0,795 O , o 7 8 O ,9 O 1 ,9 1 9

O , O O 1 O ,1 O 8 O , O O 4 O , O 3 7 O , O 2 7

5 5 5 5 5

0,991" 1 , O O O O ,8 3 6 O ,9 8 5 O ,9 5 1 O ,9 1 6

O , O O 1 O , O 7 8 O , O O 2 O , O 1 3 O , O 2 9

5 5 5 5 5 ,5

O ,7 9 5 O ,8 3 6 1 , O O O 0,797 O ,8 7 3 O ,5 6 5

O ,1 O 8 O , O 7 8 O ,1 06 O , O 5 3 O ,3 2 1

5 5 5 5 5 5

0,978" O ,9 8 5 0,797 1 , O O O O ,9 3 2 O ,8 9 9

O , O O 4 O , O O 2 O ,1 O 6 O , O 2 1 O , O 3 8

5 5 5 5 5 5

O ,9 O 1 . O ,9 5 1 O ,8 7 3 O ,9 3 2 1 , O O O O ,8 4 5

O , O 3 7 O , O 1 3 O , O 5 3 O , O 2 1 O , O 7 1

5 5 5 5 5 5

O ,9 1 9 . O ,9 1 6 O ,5 6 5 O ,8 9 9 O ,8 4 5 1 , O O O

O , O 2 7 O , O 2 9 O ,3 2 1 O , O 3 8 O , O 7 1

5 5 5 5 5

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