“efecto de la deficiencia nutricional proteica frecuente sobre experimental a ratones hembra...
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
“Efecto de la deficiencia nutricional proteica frecuente sobre
los contenidos de proteínas hepáticas en ratón. Indicadores
precancerosos y su control por metionina”
Lic. Verónica J. Caballero
Director (UNMDP-CONICET): Dr. Rubén D. Conde
Co-Directora (UNMDP-CONICET): Dra. Andrea N. Chisari
Instituto de Investigaciones Biológicas
Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Biológicas
A… Papá, Dami,
Mauro y Vaughan…
Vive de manera que puedas mirar
fijamente a los ojos de cualquiera
Henry-Louis Mencken (1880-1956)
AGRADECIMIENTOS
- A mi director, el Dr. Rubén Conde por su ayuda y dedicación permitiéndome llevar a cabo esta Tesis Doctoral. Gracias por demostrarme ante todo buenos valores humanos.
- A la Dra. Marcela Giudici por toda su dedicación y correcciones a pesar de la distancia. Gracias por enseñarme.
- A la Dra. Julieta Mendieta por el aguante y las correcciones a pesar de las panzas.
- Al Dr. Daniel Lombardo por haberme hecho sentir una más de su grupo, ayudarme en el desarrollo de la Tesis doctoral y apadrinarme como su “tesista” de corazón.
- A todos los integrantes del Lab. 3-4 del IIB, Yami, Debo, Carmen, Ramiro y Leo por las tardes, mates, días y charlas compartidas.
- A todos los integrantes del Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal, (INITRA), FVet-UBA, especialmente a Juan, Marcelo y Clara por haberme hecho sentir una más del grupo.
- Al IIB, por el lugar de trabajo.
- Al CONICET por el financiamiento.
- A mis amigas marplatenses que siempre están Carla, Pochi, Noe, Silvi, Pame.
- A Mer y Seba gracias por todo, gracias por ser mis amigos que van a estar siempre a pesar de las distancias…..Gracias por los mates, charlas, viajes, asados y por llevarme a los lugares más inesperados.
- A Alan, mi amigazo que quiero como un hermano, Gracias por el aguante, las charlas y por estar SIEMPRE!.
- A mi amiga del alma Zita que con su Skype me aguantó días enteros, gracias por darme todo lo mejor de su amistad y su vida.
- A mi loca amiga Nathi por alojarme este último tiempo en su depto y aguantarme tantas tardes de locura con toda su paciencia, por prestarme el oído SIEMPRE a pesar de sus guardias y días tan cansadores de trabajo. Gracias por el optimismo Na!
- A mis ahijados Tincho e Ivannita por llenarme el corazón. Los Amo.
- A los amores de mi vida mi papá y mi hermano Dami por su aguante durante toda la carrera, por estar, por entenderme, por apoyarme y siempre ponerme ante todas sus cosas. Gracias por hacerme sentir lo más importante de sus vidas.
- A mi nueva familia Tresarroyense: Mary, Diego, Cata, Lore, Ramy, Briza, Mateo, Lili, Bicho, Moni, Orne, Emma, Cuca… Gracias por recibirme!
- Quiero Agradecer especialmente a la persona que me llena el Alma, que me completa, y que me hace muy feliz… Mauro, Gracias, Gracias por llevarme adelante, por ser mi sostén, por apoyarme para terminar esta difícil etapa de mi vida, Gracias por la paciencia y por entenderme siempre, por hacerme sentir tan importante!. Gracias por ser parte de mis días y hacerme tan feliz.
-Por último, como dijo Antonio Machado “Caminante no hay camino, se hace camino al andar. Al andar se hace el camino, y al volver la vista atrás se ve la senda que nunca se ha de volver a pisar” quiero agradecer a TODAS aquellas personas que estuvieron en mi camino, las que ayudaron y las que pusieron piedras, gracias por enseñarme que a veces no existen las cosas desinteresadas, gracias por enseñarme la diferencia entre el trabajo, los amigos y la familia. Gracias, porque al tropezarme con situaciones no tan buenas aprendí a ubicarme, a valorar más las pequeñas cosas y conocí y reconocí muchas personas, algunas que quedarán en el camino y otras que deseo me acompañen siempre. Gracias a toda esta gente en el doctorado de mi vida me llevo el mejor de los conocimientos el cual me enseñó a tener el valor para enfrentar los arduos caminos siempre junto a las personas que amo.
INDICE
RESUMEN ................................................................................................. 1 INTRODUCCION GENERAL...................................................................... 3
- Malnutrición proteica, influencia de los aminoácidos ................................. 3 - Modelo nutricional de ciclos de privación proteica realimentación .............. 4 - Cáncer de Hígado .................................................................................... 5 - Relación entre la malnutrición proteica y las proteínas involucradas en procesos preneoplásicos y de hepatocarcinogénesis ............................. 9 - Estrés oxidativo ........................................................................................ 12 - Componentes del suero sanguíneo .......................................................... 13 - Apoptosis ................................................................................................. 15 - Descripción histológica del hígado ............................................................ 17 OBJETIVO GENERAL ............................................................................... 18 HIPÓTESIS ................................................................................................ 18 CAPITULO I
“EFECTO DE LA MALNUTRICIÓN PROTEICA CRÓNICA SOBRE EL HÍGADO DE RATÓN. ANÁLISIS DEL SUPLEMENTO CON METIONINA”
INTRODUCCION ....................................................................................... 20 RESULTADOS .......................................................................................... 24
1- Efecto de la malnutrición proteica crónica sobre el peso corporal, peso del hígado, y contenidos de proteínas citosólicas y ácidos nucleicos. Influencia del suplemento con metionina. .................................................... 25 1.1- Peso corporal y hepático ..................................................................... 25 1.2- Contenidos de proteínas citosólicas y ácidos nucleicos ........................ 27 2- Efecto de la malnutrición proteica crónica y el suplemento de metionina sobre los contenidos de ARNm y proteico de las enzimas citosólicas FAS, ACIII, GSTs y GAPDH ....................................................................... 29 2.1- Contenido de ARNm ............................................................................ 29 2.2- Contenido de enzimas citosólicas ........................................................ 30 3- Estudio de la malnutrición proteica crónica y el suplemento de metionina sobre el balance redox del hígado .............................................................. 33 4- Análisis del suero sanguíneo e histología del hígado de ratones Sometidos a malnutrición proteica crónica, con o sin el suplemento de metionina .............................................................................................. 34 4.1- Análisis bioquímico del suero ............................................................... 34 4.2- Análisis histológico del hígado ............................................................. 35 DISCUSION ............................................................................................... 48
Efecto de la malnutrición proteica crónica sobre el hígado de ratón. Análisis del suplemento con metionina........................................................ 49 - La malnutrición proteica crónica altera el peso corporal del ratón hembra, y los contenidos de proteínas y ácidos nucleicos del hígado.
Estas modificaciones ocurren en menor grado si se conserva el aporte dietario de metionina ..................................................... 49 - La malnutrición proteica crónica afecta los contenidos de ARNm y proteico de las enzimas FAS, ACIII, GSTs y GAPDH. Metionina evita parcialmente el daño ocasionado........................................ 52 - La malnutrición proteica crónica altera el estado redox del hígado. Metionina atenúa este efecto ...................................................................... 55 - La malnutrición proteica crónica modifica niveles de indicadores séricos de daño hepático y la histología del hígado. Efecto hepatoprotector de metionina.. ................................................................... 56 CAPITULO II
“EFECTO DE LA MALNUTRICIÓN PROTEICA CRÓNICA EN AUSENCIA Y PRESENCIA DE METIONINA SOBRE EL DESARROLLO DE
CARCINOGÉNESIS QUÍMICA EN HÍGADO DE RATÓN” INTRODUCCION ....................................................................................... 60 RESULTADOS .......................................................................................... 66
1- Estimación del peso corporal y hepático ................................................. 67 2- Estimación del contenido de las enzimas hepáticas ACIII, FAS, GSTP1 y GAPDH. ...................................................................................... 69 3- Evaluación del estado redox del hígado.. ................................................ 71 4- Estimación de marcadores de daño hepático en el suero sanguíneo.. ..... 72 5- Evaluación de la apoptosis en el hígado. ................................................ 72 6- Evaluación histológica general y búsqueda de focos preneoplásicos en el hígado ............................................................................................... 77 6.1- Contenido de GSTP1........................................................................... 78 6.2- Análisis histohepático de ratones iniciados con DEN y sometidos a malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de metionina. ............................................................................................. 79 DISCUSION ............................................................................................... 92
Efecto de la malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de metionina sobre el desarrollo de carcinogénesis química en hígado de ratón. ......................................................................................................... 93 - La inyección con DEN no modifica el efecto de la malnutrición proteica crónica y el suplemento con metionina, sobre el peso hepático y corporal en ratones hembra BALB/c. .......................................................... 93 - La malnutrición proteica crónica y la inyección de DEN alteran los niveles de ciertas enzimas hepáticas en ratones BALB/c.
El suplemento con metionina atenúa estos efectos. .................................... 94 - La iniciación con DEN altera las enzimas relacionadas con el mantenimiento redox celular. El estrés oxidativo está directamente relacionado con el daño hepático. Metionina ejerce un efecto hepatoprotector. ......................................................................................... 96 - La malnutrición proteica crónica produce apoptosis celular hepática. DEN la modifica. Metionina detiene esos cambios. ..................................... 98 - La malnutrición proteica crónica en ratones iniciados con DEN produce daño hepático y la formación de focos preneoplásicos. Metionina ejerce un efecto hepatoprotector. ................................................ 101 CONCLUSIONES ...................................................................................... 105 MATERIALES Y METODOS ...................................................................... 107
1- Animales de laboratorio .......................................................................... 108 2- Dietas .................................................................................................... 108 3- Químicos................................................................................................ 108 4- Diseño experimental ............................................................................... 109 4.1- Modelo de malnutrición crónica............................................................ 109 4.2- Modelo de iniciación y progresión de hepatocarcinogénesis ................. 110 5- Eutanasia y necropsia ............................................................................ 111 6- Extracción de ARN ................................................................................. 112 7- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .......................................... 112 7.1- Síntesis de ADN copia ......................................................................... 112 7.2- RT-PCR semicuantitativa..................................................................... 113 8- Densitometría de bandas ........................................................................ 114 9- Northern Blot .......................................................................................... 114 9.1- Obtención de la membrana de hibridación ........................................... 114 9.2- Obtención de las sondas ..................................................................... 115 9.3- Marcado radiactivo de las sondas e hibridación.................................... 115 10- Análisis de proteínas ............................................................................ 116 10.1- Obtención del citosol ......................................................................... 116 10.2- Obtención secuencial de las fracciones mitocondrial y citosólica ........ 116 11- Cuantificación de proteínas .................................................................. 117 12- Cuantificación de ácidos nucleicos........................................................ 118 13- Electroforesis en gel de poliacrilamida .................................................. 118 14- Inmunodetección .................................................................................. 119 15- Determinación de actividad de caspasa-3 ............................................. 120 16- Determinación de actividad CAT ........................................................... 120 17- Determinación de actividad SOD .......................................................... 120 18- Determinación de actividad GSTs, GR y CAT ....................................... 121 19- Determinación de grupos carbonilos ..................................................... 121 20- Determinación de peroxidación de lípidos ............................................. 121 21- Análisis del suero sanguíneo ............................................................... 122 22- Análisis histológico ............................................................................... 123 22.1- Toma y procesamiento de la muestra................................................. 123 22.2- Tinciones Histológicas ....................................................................... 123 22.3- Inmunohistoquímica........................................................................... 124 23- Análisis estadístico ............................................................................... 124 ANEXO ...................................................................................................... 125
ABREVIATURAS ....................................................................................... 127 BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................... 129 ARTÍCULOS PUBLICADOS ...................................................................... 145
1
RESUMEN
La malnutrición es un desequilibrio entre la ingesta de nutrientes y las
necesidades energéticas básicas, origina alteraciones del balance energético, estrés
oxidativo y recambio de proteínas. Los aminoácidos no son sólo importantes
precursores de la síntesis de proteínas y otros compuestos nitrogenados, sino que
también participan en la regulación de la mayoría de los procesos metabólicos. En
este trabajo se propuso examinar si la malnutrición proteica crónica altera los
niveles de algunas enzimas hepáticas, generando un ambiente favorable para el
desarrollo de hepatocarcinogénesis y, además, si la ingesta permanente de
metionina ejerce un efecto hepatoprotector. Para ello, se diseñó y aplicó un modelo
experimental a ratones hembra BALB/c. El mismo consiste en la aplicación de 3 ciclos
de alimentación, constituido cada uno por 5 días de dieta carente de proteínas y
aminoácidos seguidos de 5 días de realimentación con dieta completa. Un protocolo
parecido se utilizó para examinar la acción del aminoácido metionina, que fue
agregado a la dieta aproteica en la proporción que posee la dieta completa. Además,
dado que las alteraciones metabólicas causadas por la malnutrición proteica crónica
pueden acrecentar la susceptibilidad al desarrollo de hepatocarcinogénesis (HCC), se
analizaron los efectos de los tratamientos nutricionales en animales inyectados con
dietilnitrosamina (DEN). Los resultados obtenidos mediante una amplia gama de
técnicas bioquímicas e histológicas sugieren que la malnutrición proteica crónica
modifica ciertas enzimas hepáticas en el mismo sentido al descripto para el desarrollo
de HCC, aumentando el estrés oxidativo, y alterando parámetros físicos, bioquímico –
moleculares, e histológicos que configuran un marcado daño hepático. En su mayoría,
estas alteraciones también se presentan en los ratones inyectados con DEN, con la
añadidura del desarrollo de focos preneoplásicos. Estos, junto con la disminución en la
actividad apoptótica, promoverían el desarrollo de tumores malignos a largo plazo.
2
Por otro lado, este estudio también demuestra que la ingesta permanente de
metionina ejerce una acción hepatoprotectora previniendo, en algunos casos en forma
total y otros en forma parcial, las alteraciones generadas por la malnutrición proteica
crónica en presencia o ausencia de DEN.
Introducción general
3
Malnutrición proteica, influencia de los aminoácidos.
Muchos factores pueden causar malnutrición, la mayoría de los cuales se
relacionan con una dieta pobre en alguno de sus componentes principales, ya sean
hidratos de carbono, lípidos ó proteínas.
En animales, la desnutrición proteica produce pérdida de peso, retardo en el
crecimiento, incremento en la susceptibilidad a enfermedades infecciosas y en caso
extremo la muerte (Young 1994; Fafournoux y col., 2000). Estudios realizados en
ratones muestran que la privación dietaria de proteínas afecta de manera diferente a
distintos órganos. Bajo estas condiciones el contenido total de proteínas disminuye en
mayor proporción en hígado (40%) (Conde y Scornik 1976) y riñón (20%) (Addis y col.,
1936), y en menor proporción en los demás órganos y tejidos. Además, se producen
modificaciones en el contenido de ribosomas tisulares y disminución del crecimiento
corporal (Pain y col., 1974; Conde y Franze-Fernandez 1980).
Durante la década del 50, se analizó el rol de los aminoácidos en los
requerimientos nutricionales a partir de estudios del balance de nitrógeno. Estos
estudios definieron un grupo de 8 aminoácidos cuya omisión en la dieta genera un
balance de nitrógeno negativo. Estos aminoácidos se denominaron esenciales y son
requeridos para mantener la salud en el adulto. Ellos son: isoleucina, leucina, lisina,
metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina (Rose 1957; Rose 1968). Más
adelante, algunos investigadores demostraron que la suplementación con aminoácidos
esenciales a una dieta sin proteínas no disminuye la pérdida de nitrógeno, pero sí
mejora el balance del mismo (Yokogoshi y Yoshida 1976), previniendo las
consecuencias fisiológicas ocasionadas por su déficit. Esto se fundamentó en el hecho
de que los aminoácidos esenciales son importantes reguladores del crecimiento,
influyendo directamente sobre la síntesis y degradación de las proteínas (Conde y
4
Scornik 1976). La tasa de síntesis proteica de los diferentes tejidos animales es
controlada por el suministro de aminoácidos. Cuando éste es inadecuado, los
diferentes tejidos responden con una respuesta adaptativa importante (Mortimore y
Poso 1984; Meijer y col., 1993). Los aminoácidos pueden actuar como sustratos
glucogénicos, transportadores de nitrógeno, neurotransmisores y reguladores del
recambio proteico, la actividad enzimática y el flujo de iones. Además, pueden ser
precursores de transductores de señales, nucleótidos y neurotransmisores
(Fafournoux y col., 2000), y participar en la regulación de la expresión de diversos
genes (Bruhat y col., 2000; Averous y col., 2003).
Además de ser esencial, el aminoácido metionina, es necesario para la síntesis
de coenzima A, taurina y glutatión. Actúa, también, como donor de grupos metilo para
la metilación del ADN durante la expresión de proteínas, la síntesis de epinefrina,
fosfatidilcolina, creatinina y melatonina (Miller 2003). También es el primer aminoácido
en la biosíntesis de las proteínas eucariotas. Por lo tanto, su déficit dietario podría
afectar a este mecanismo y provocar, consecuentemente, un mal funcionamiento de
los órganos (Bonatto y col., 2006).
Modelo nutricional de ciclos de privación proteica-realimentación
Nuestro grupo de investigación ha realizado diversos estudios sobre el efecto
de la administración de una dieta sin proteínas y aminoácidos durante 5 días sobre el
metabolismo hepático del ratón (Conde y Scornik 1976; Amils y col., 1977; Conde y
Scornik 1977; Conde y Franze-Fernandez 1980; Cassia y col., 1991; Sanllorenti y col.,
1992; Cassia y Conde 1994; Garcia-Mata y col., 1997; Sanllorenti y col., 2001; Ronchi
y col., 2004; Ronchi y col., 2010). Por el tiempo de tratamiento, este modelo
experimental representa una malnutrición proteica “aguda” (Addis y col., 1936).
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Con el objetivo de analizar los efectos de la dieta sin proteínas ni aminoácidos
en mayores períodos de tiempo, se ideó aplicar a ratones hembra BALB/c ciclos de 5
días de dieta sin proteínas ni aminoácidos (privación proteica) seguidos de 5 días de
dieta completa (realimentación) repetidos tres veces. Este modelo experimental
compuesto por 3 ciclos de privación proteica-realimentación, procura representar una
malnutrición proteica “crónica”.
Existen numerosos estudios sobre el efecto de la malnutrición calórica crónica
sobre procesos de envejecimiento celular (Estep y col., 2009), carcinogénesis
(Kirkland 2010; Froy y col., 2011), y otros mecanismos fisiológicos (McKee Alderman y
col., 2010). También existen estudios acerca de los efectos de una malnutrición
proteica parcial –dieta hipoproteica- crónica (Ayala y col., 2007; Caro y col., 2009). Sin
embargo, son escasas o incompletas las investigaciones sobre los efectos causados
por períodos reiterados bajo dieta totalmente carente de proteínas y aminoácidos. Esta
falta de conocimiento ha motivado la realización del presente estudio.
Cáncer de Hígado
Cáncer o neoplasia es el proceso de proliferación anormal de células de un
órgano o tejido que desemboca en la formación de tumor. Las neoplasias son el
resultado de un proceso generado por una enfermedad crónica que se puede
desarrollar durante la vida de cualquier especie. Durante este proceso, se producen
una serie de cambios secuenciales que afectarán a un tejido particular. Una de las
vías más comunes para el desarrollo del cáncer implica la aparición de lesiones
focales (nódulos, papilomas, pólipos) también denominadas focos preneoplásicos. Su
denominación como focos preneoplásicos se fundamenta en que estas lesiones no
son más que precursores neoplásicos de la enfermedad, ya que la continuidad de la
lesión en el desarrollo del cáncer está ampliamente demostrada tanto en animales de
experimentación como en la clínica aplicada (Laconi y col., 2008). Por lo tanto estas
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lesiones presentan uno de los posibles sitios en donde el cáncer puede desarrollarse.
La población celular que da lugar a los nódulos, papilomas o pólipos son generalmente
homogéneas en tamaño, forma y en la expresión de determinados marcadores
bioquímicos. Sin embargo, estas últimas propiedades se pierden durante el desarrollo
tumoral, que se caracteriza típicamente por aumento de los niveles de heterogeneidad
de las células tumorales (Foulds 1965).
El cáncer de hígado o hepatocarcinogénesis (HCC) es una enfermedad
compleja que resulta de un proceso con múltiples etapas que implica la desregulación
de una serie de diferentes cascadas de señales. En 2010, a un total de 24.120 adultos
(17.430 hombres y 6.690 mujeres) se les diagnosticó cáncer primario de hígado en
USA; American Cancer Society (2010). Se calculó que durante ese año esta
enfermedad causó unas 18.910 muertes (12.720 hombres y 6.190 mujeres). El cáncer
de hígado también es la quinta causa más frecuente de muerte por cáncer en los
hombres y la novena en las mujeres con una tasa de supervivencia del 13%, American
Cancer Society (2010). En comparación con USA, el cáncer de hígado es mucho más
común en los países en desarrollo como México, Argentina, África y Asia oriental.
El cáncer de hígado comienza con el desarrollo de lesiones focales o focos
preneoplásicos en el parénquima. Para que un tumor se desarrolle deben ocurrir 3
procesos (Fig.1):
i) Iniciación de las células: la célula se inicia en un grado de crecimiento de
autonomía inerte. Durante este proceso se generan alteraciones genéticas
irreversibles, inducidas por iniciadores (Lee 2000). Los iniciadores carcinogénicos son
compuestos genotóxicos que causan mutaciones alterando la expresión de varios
genes, la mayoría de ellos involucrados en la regulación del ciclo celular. La
dietilnitrosamina (DEN) es el agente iniciador más utilizado para generar HCC química
(Vesselinovitch y Mihailovich 1983). El análisis de varias etapas de desarrollo del
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cáncer ha llevado a la conclusión de que la iniciación por sí sola no da lugar a un
crecimiento significativo de las lesiones preneoplásicas y/o neoplásicas y que su
desarrollo depende de un ambiente promotor (Farber 1981) ya sea por agentes
externos o endógenos (Lee 1998).
ii) Promoción: la promoción tumoral está definida como un proceso de selección
celular, a partir de la proliferación de células (iniciadas por químicos o por mutaciones
endógenas) que adquieren una ventaja proliferativa frente a un medioambiente celular
particular (Solt y Farber 1976). El crecimiento de estas células que dan origen a las
lesiones focales puede ser inducido por estímulos fisiológicos endógenos o generados
por químicos. Por lo tanto, las primeras fases del desarrollo del cáncer son muy
dependientes de las influencias ambientales, de hecho se puede interpretar como
reacciones de adaptación a nuevas condiciones del tejido circundante (Laconi y col.,
2008). Concretamente, si el crecimiento potencial de las células normales en un tejido
determinado fue afectado, podría traducirse como la fuerza impulsora en cualquier
célula iniciada para expandirse y compensar el deterioro de sus células vecinas.
Consecuentemente se produce el desarrollo del cáncer. En el estado de promoción
también se involucran anormalidades como en el estado de iniciación pero con una
mayor amplificación de respuesta. Entre ellas encontramos amplificación de genes,
traslocación y deleción con anormalidades asociadas a cromosomas (Hikita y col.,
1999). Los factores que positivamente modulan el estado de promoción son llamados
promotores y son generalmente no genotóxicos, ejerciendo su efecto a través de
mecanismos epigenéticos (Lee 2000).
iii) Progresión: este proceso está determinado por las transformaciones que
convierten la proliferación celular original en un tumor maligno e invasivo (Farber
1981).
8
(Laconi y col., 2008)
Figura 1. Representación esquemática de estadios en el desarrollo de carcinogénesis.
Estudios realizados sobre animales sometidos a períodos de ayuno seguidos
de realimentación determinaron que cortos períodos de realimentación fueron capaces
de iniciar células y de potenciar los efectos de promoción tanto como los efectos de
proliferación celular en estadios tempranos de HCC (Hikita y col., 1998).
Los modelos animales, proveen un método adecuado para el estudio de los
eventos moleculares que pueden estar ocurriendo durante la tumorigénesis,
permitiendo la identificación de uno o más de los múltiples pasos en el desarrollo de
las neoplasias. De esta manera los sistemas in vivo, permiten avanzar en el
conocimiento de las etapas iniciales de la carcinogénesis, ya que los modelos de
tumores trasplantables, aquellos que se implantan en el organismo en una etapa
avanzada de desarrollo, solamente permiten evaluar la progresión y metástasis.
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Relación entre la malnutrición proteica y las proteínas involucradas en
procesos preneoplásicos y de hepatocarcinogénesis.
La regulación de la expresión de genes en respuesta a cambios en el
medioambiente nutricional es uno de los eventos mejores documentados (Fafournoux
y col., 2000). Particularmente, los mamíferos ajustan su metabolismo según la ingesta
de alimentos (Averous y col., 2003), siendo la expresión de genes una compleja
interacción de hormonas, neuronas y factores nutricionales (Fafournoux y col., 2000;
Chaveroux y col., 2010). En ratones alimentados durante 5 días con dietas carentes de
proteínas y aminoácidos cambian los niveles de proteínas relacionadas con el
metabolismo de lípidos, como la ácido graso sintasa (FAS), la eliminación de
sustancias tóxicas y en el mantenimiento del estado redox celular como las anhidrasas
carbónicas (AC) y las glutatión S-transferasas (GSTs) (Garcia-Mata y col., 1997;
Garcia-Mata y col., 1998; Ronchi y col., 2004) o el metabolismo de hidratos de
carbono, como la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Sanllorenti y col.,
1992). Los niveles proteicos de algunas de ellas son capaces de normalizarse con el
agregado de metionina como suplemento dietario (Ronchi y col., 2004). En este caso
la metionina actuaría como regulador en el balance proteico.
La proteína ácido graso sintasa (FAS) es una enzima multifuncional que
sintetiza el ácido palmítico desde acetil-CoA, malonil-CoA y NADPH. Por lo tanto juega
un rol principal en la síntesis de novo de lípidos en roedores y humanos. La regulación
hormonal de la expresión de FAS ha sido el foco de muchos estudios, y la insulina es
conocida por regular su expresión a nivel transcripcional (Wolf y col., 1994; Sul y Wang
1998; Wang y Sul 1998). Los componentes de la dieta pueden también afectarla,
donde los aminoácidos esenciales regulan su expresión (Dudek y Semenkovich 1995;
Fafournoux y col., 2000). Usualmente FAS se expresa en bajos niveles en la mayoría
de los tejidos de adultos, encontrándose regulada negativamente su síntesis de novo.
Los lípidos son necesarios no sólo para el metabolismo energético, sino que también
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proporcionan el conjunto de sustratos disponibles para la biogénesis de las
membranas celulares, lo cual es particularmente importante para las células tumorales
(Evert y col., 2005). Por este motivo esta enzima se encuentra sobreexpresada en
muchos neoplasmas. Varias evidencias demuestran su sobreexpresión en lesiones
preneoplásicas hepáticas siendo una de las principales alteraciones registradas (Evert
y col., 2005).
Las Anhidrasas Carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que
catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono, produciendo bicarbonato e
hidruro. Esta función enzimática regula el pH celular y el transporte de dióxido de
carbono (Tripp y col., 2001). Al menos 15 proteínas diferentes con estructura de
anhidrasa carbónica son conocidas en mamíferos, de las cuales 11 tienen actividad
catalítica activa (Lehtonen y col., 2004). La existencia de múltiples isoenzimas radica
en una importante variedad de funciones fisiológicas incluyendo el balance ácido base,
la respiración, la acidificación urinaria y la reabsorción ósea (Kim y col., 2004). Las
isoenzimas varían en su expresión durante el desarrollo, dependiendo del tejido y
localización subcelular. La ACIII se diferencia de otras isoenzimas del grupo por su
abundancia en músculo esquelético, tejido adiposo, hígado, y por presentar una baja
actividad hidratasa de CO2 (Kim y col., 2000). Posee dos residuos de Cys que se
enlazan con GSH (mecanismo llamado glutatiolación) en respuesta a estrés oxidativo
(Chai y col., 1994). En conjunto, estas evidencias permiten suponer que la ACIII posee
un rol fisiológico adicional en la célula, además de su actividad hidratasa. De este
modo, se determinó que el incremento en la expresión y actividad de ACIII, reduce el
nivel de especies reactivas de oxígeno y protege a la célula contra apoptosis inducida
por H2O2 (Raisanen y col., 1999). Además se une a glutatión in vivo cuando las células
son expuestas a estrés oxidativo, y es una de las proteínas más carboniladas en el
hígado de roedores. Esta observación sugiere que esta enzima tendría un rol
fundamental en la respuesta celular al estrés oxidativo (Thomas y col., 1995).
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Las glutatión S-transferasas (GSTs) son una familia de enzimas involucradas
en la detoxificación celular. Se encargan de catalizar la conjugación de glutatión (GSH)
con diversos compuestos electrofílicos exógenos y endógenos, incrementando su
solubilidad y acelerando su eliminación de la célula (Hayes y Pulford 1995). La
transferencia de GSH, junto con el metabolismo de drogas, secuestro de toxinas,
reparación del ADN, forman parte de un amplio mecanismo celular de protección
(Chanas y col., 2002). En ratón están descriptas 3 clases de GSTs: alpha (A3), mu
(M1), y pi (P1) (Ahmad y col., 1997). La expresión de las GSTs es dependiente de
tejido-edad-sexo. Además, su expresión puede ser inducida por estrés oxidativo dentro
de la célula (Hayes y Pulford 1995). Por otra parte, miembros de la familia de las GSTs
aumentan en hepatitis crónica, así como también en distintos tipos de cáncer
(Tsuchida y Sato 1992; Hayes y Pulford 1995; Morand Chirstine 1997; Strange y col.,
2001; Chanas y col., 2002; Nebert y Vasiliou 2004) y ciertas condiciones nutricionales
(Garcia-Mata y col., 1997; Garcia-Mata y col., 1998). Debido a esto, las GSTs son
consideradas marcadores cancerígenos y de lesiones preneoplásicas (Tsuchida y
Sato 1992). Entre ellas, la subunidad GSTP1 es un potente marcador de focos
preneoplásicos hepáticos (Marche-Cova y col., 1995; Ookawa y col., 1998; Satoh y
col., 2002).
La enzima Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es conocida por
su rol en la glicólisis, catalizando la conversión de gliceraldehido 3-fosfato en 1,3-
difosfoglicerato. Sin embargo, también está implicada en una gran diversidad de
funciones: transporte vesicular desde el retículo endoplásmico al complejo de Golgi
(Tisdale 2001), ensamblaje de microtúbulos, exportación de ARNt celular y ARN viral
desde el núcleo al citosol, regulación de la expresión génica mediante control
traduccional, reparación (actividad uracil-glicosilasa) y replicación de ADN (Sirover
1999). Su expresión génica puede estar regulada por insulina (Alexander-Bridges y
col., 1992) y aminoácidos (Claeyssens y col., 2003). En condiciones de estrés
12
oxidativo, al igual que ACIII (Chai y col., 1994), la GAPDH es glutatiolada en residuos
de cisteína, lo cual la protege de oxidación irreversible (Grant y col., 1999). Por otro
lado, se ha descripto un aumento en el contenido de GAPDH asociado a HCC debido
al incremento en la cantidad de depósitos de glucógeno en los focos preneoplásicos
(Bannasch y col., 1997).
Estrés oxidativo
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son constantemente generadas
dentro de las células por procesos metabólicos. Los radicales más comunes en los
sistemas biológicos son el radical superóxido (O2˙-) y el radical hidroxilo (OH˙), los
cuales son predominantemente generados por escapes de la mitocondria durante el
metabolismo (England y Cotter 2005). La mayor reducción de superóxido, está dada a
través de la enzima superóxido dismutasa (SOD), originando peróxido de hidrogeno
(Dalle-Donne y col., 2003). El radical superóxido es relativamente no reactivo pero en
los sistemas biológicos puede ser convertido en peroxilo, alcoxilo y radicales hidroxilos
más reactivos (England y Cotter 2005). El nivel celular de estas especies reactivas de
oxígeno está controlado por la actividad de SOD, así como también por otras enzimas
antioxidantes como la catalasa (CAT) y la glutatión reductasa (GR) (Averous y col.,
2003; Dasgupta y col., 2006; Ronchi y col., 2010).
La carbonilación de proteínas es utilizada como un marcador de estrés
oxidativo (Chevion y col., 2000) ya que ocurre en un alto nivel in vivo relativo a otras
modificaciones oxidativas, y además es fácilmente detectable (England y Cotter 2005).
La carbonilación puede ocurrir a través de oxidación directa de las cadenas de
aminoácidos con ROS incluyendo H2O2 y HOCl¯ (Berlett y Stadtman 1997). Otra
característica que permite determinar un ambiente prooxidante es el incremento en la
peroxidación de lípidos, los cuales pueden ser analizados mediante técnicas
particulares como la medición de los niveles de sustancias reactivas del ácido 2-
13
tiobarbitúrico (TBARS) (Berlett y Stadtman 1997; Dean y col., 1997; Francini y col.,
2010).
Las especies reactivas de oxígeno, pueden actuar dentro de la célula como
segundos mensajeros y estimular la muerte celular (Carmody y Cotter 2001), ya sea a
través de la activación indirecta de la célula y las vías de señalización de muerte o a
través de interacciones directas con las proteínas. Además, las especies reactivas de
oxigeno están involucradas en una gran variedad de patologías incluyendo el cáncer,
enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y autoinmunes (Benhar y col.,
2002; Barnham y col., 2004; Griffiths 2005; Cave y col., 2006; Lee y Griendling 2008).
Componentes del suero sanguíneo.
Analizar el estado de los componentes del suero o plasma sanguíneo resulta
de gran utilidad a la hora del diagnóstico de diferentes patologías, incluyendo diversos
tipos de cáncer. La síntesis de la mayor parte de las proteínas plasmáticas tiene lugar
en el hígado. Este órgano contiene también enzimas que puede liberar al plasma,
siendo de alto interés clínico las transaminasas y la fosfatasa alcalina (FA). Así, los
niveles séricos de transaminasas se utilizan como indicadores de patologías
hepáticas. Tanto la glutámico-pirúvico transaminasa (SGOT) como la glutámico-
oxalacético transaminasa (SGPT) están presentes en el suero en baja concentración.
No obstante, si el hígado está dañado, la permeabilidad de la membrana celular
aumenta y estas enzimas son liberadas a la sangre en grandes cantidades. Las
enfermedades hepáticas, hepatitis viral, cirrosis, hígado graso, consumo excesivo de
alcohol, quistes o tumores en el hígado u obstrucciones graves de la vía biliar pueden
provocar un aumento notable de la SGPT en sangre. Por otro lado, las fosfatasas
alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del
organismo, siendo particularmente alta en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón.
Tanto el aumento, así como su disminución en plasma tienen significado clínico. Un
14
aumento de la misma puede estar vinculado con una falla hepática entre otras causas
(Giannini y col., 2005).
La albúmina es la principal proteína de la sangre. El resto de las proteínas
presentes en el plasma son mayormente globulinas. La albúmina es fundamental para
el mantenimiento de la presión oncótica, necesaria para la distribución correcta de los
líquidos corporales entre el compartimento intravascular y el extravascular, localizado
entre los tejidos. En deficiencia nutricional proteica, los niveles de albúmina sérica
disminuyen antes de que aparezcan otros síntomas, incluida la reducción del
crecimiento (Whitehead y Alleyne 1972). Por lo tanto, los niveles séricos de albúmina
son indicadores del estado de nutrición proteica (Whitehead y Alleyne 1972; Bovio y
col., 2008).
Otro componente del plasma es el colesterol. Su nivel elevado no es un
problema a corto plazo, pero si se mantiene durante mucho tiempo, acelera el
desarrollo de arteriosclerosis, proceso arterial degenerativo, que consiste en un
endurecimiento y estrechamiento de las arterias. Diferentes estudios epidemiológicos
han indicado que la alimentación se relaciona con la concentración de colesterol en la
sangre (Giannini y col., 2005). Además, algunas enfermedades como la diabetes, el
funcionamiento deficiente de la tiroides o del riñón y enfermedades obstructivas del
hígado son padecimientos que elevan las tasas de colesterol en sangre. Si bien se ha
propuesto una relación entre los niveles de colesterol en sangre y el cáncer, aún no
existen evidencias que confirmen esta hipótesis.
Dentro de un análisis nutricional integral, es importante conocer el nivel de
glucosa en sangre. El mismo puede indicar la energía que proveen las dietas.
Además, los niveles altos de azúcar en la sangre a largo plazo pueden producir daños
en diversos órganos.
15
Apoptosis
Dos formas diferentes de muerte celular, apoptosis y necrosis, han sido
definidas en términos de morfología, bioquímica e incidencia en los últimos 40 años.
La apoptosis es un proceso activo con significado biológico y genéticamente definido,
que juega un rol central en la regulación de la homeostasis y desarrollo. Le da forma a
los órganos durante la morfogénesis y remueve células inmunológicamente reactivas.
Estos procesos se caracterizan por cambios morfológicos como son la condensación
de la cromatina y la fragmentación internucleosomal del ADN, involucrando gasto de
energía (ATP) (Garcia-Ruiz y Fernandez-Checa 2007). La necrosis, en contraste, es
un proceso pasivo y accidental, que provoca una ruptura progresiva del orden
estructural y funcional de la célula luego de un daño irreversible causado por cambios
en el ambiente como isquemia severa, temperaturas extremas o trauma mecánico
(Cummings y col., 1997). La necrosis puede afectar a grandes áreas celulares,
mientras que la apoptosis puede afectar sólo a un grupo de células. Otro punto que
permite su diferenciación es que la necrosis produce eventual acumulación de células
inflamatorias, debido a la liberación de los componentes celulares al tejido circundante
intersticial. En tanto, la apoptosis fragmenta ordenadamente los componente celulares,
dando origen a cuerpos apoptóticos que son rápidamente fagocitados por macrófagos
y, esencialmente, sin reacción inflamatoria (Savill y Fadok 2000; Kurosaka y col.,
2003).
La apoptosis se observa durante el desarrollo del conducto biliar intrahepático y
los hepatocitos (Terada y Nakanuma 1995), y también en el hígado adulto mostrando
cuerpos apoptóticos alrededor del área perivenular (Benedetti y col., 1988; Benedetti y
col., 1988). Asimismo, la muerte celular por apoptosis está relacionada con muchas
enfermedades hepáticas como colestasis, daño por alcohol, hepatitis, daño por
agentes tóxicos, entre otros (Benedetti y Marucci 1999).
16
La apoptosis se desencadena principalmente por dos caminos moleculares: (i)
mediante receptores de muerte celular (camino extrínseco) y (ii) mediante el camino
mitocondrial (camino intrínseco) (Fabregat y col., 2007). Ambos caminos activan una
variedad de proteasas denominadas caspasas (Cisteín aspartato proteasa específica)
y endonucleasas que degradan los componentes celulares. Las caspasas se expresan
constitutivamente como proenzimas inactivas, atravesando un proceso proteolítico
durante su activación. Los caminos intrínsecos y extrínsecos no son mutuamente
excluyentes y algunas células, incluyendo los hepatocitos, activan el camino
mitocondrial para amplificar la respuesta desencadenada por el camino de receptores
de muerte, siendo caspasa 3 la efectora en hepatocitos (Fabregat y col., 2007).
La inhibición de caspasas no previene la apoptosis, indicando que existe un
mecanismo de apoptosis independiente de ellas. Este tipo de apoptosis puede implicar
factores específicos mitocondriales, entre los cuales encontramos al factor inductor de
la apoptosis (AIF) (Ravagnan y col., 2002). AIF tiene un doble rol en la célula, en
primer lugar bajo condiciones normales fisiológicas permanece en la membrana
mitocondrial eliminando H2O2, mientras que bajo condiciones anormales que activan la
apoptosis, transloca desde la mitocondria al núcleo dando origen a fragmentos del
ADN mayores a 50 Kpb (Klein y col., 2002).
Por otro lado existen las XIAP, proteínas inhibidoras de apoptosis (IAPs), que
inhiben la actividad de caspasa-3, -7 y -9 (Liston y col., 2003), y protegen las células
contra varios estímulos apoptóticos (Suzuki y col., 2001; Bratton y col., 2002). Además
XIAP está críticamente involucrada en la detoxificación de ROS (Resch y col., 2008).
Cabe mencionar que hay datos opuestos sobre la regulación de XIAP. Por un lado, se
afirma que es una proteína regulada a nivel postranscripcional que puede estar
elevada bajo estrés oxidativo (Lewis y Holcik 2005). Por otro lado, se arguye que en la
apoptosis derivada de hiperglucemia se produce una regulación negativa de XIAP
debida a un incremento del estrés oxidativo (Verzola y col., 2004).
17
Descripción histológica del hígado
Un estudio completo de una afección hepática demanda un análisis histológico
profundo. Rappaport (1973) describió la mínima unidad funcional del acino hepático.
Esta unidad proporciona la mejor correlación entre la irrigación sanguínea, actividad
metabólica y patología hepática. Morfológicamente el acino hepático está delimitado
por el eje menor compuesto por el límite entre dos lobulillos clásicos y dos tríadas
portales formadas cada una por un ductulo biliar junto con las ramas terminales de la
vena porta y la arteria hepática, y el eje mayor determinado por una línea imaginaria
que une dos venas centrales. Esta unidad morfológica puede dividirse en tres zonas
según la disposición de los hepatocitos rodeando al eje menor (Fig. 2). La zona 1 está
representada por el área de tejido que rodea en forma inmediata a la triada portal. La
zona 3 comprende el parénquima más alejado de estas estructuras, rodeando a la
vena central y a la zona 2 que está formada por el tejido ubicado entre las zonas 1 y 3.
Además en un extremo del acino hepático puede observarse un área portal (espacio
portal) que contiene las pequeñas ramas de la arteria hepática y de la vena porta, un
pequeño dúctulo biliar interlobular y vasos delgados linfáticos. El parénquima que
rodea al espacio portal es llamado área periportal.
(Robbins y Cotran 2009)
Figura 2. Lobulillo hepático clásico En la porción derecha del lobulillo se puede observar la mitad del acino hepático con las zonas descriptas por Rappaport. CV: vena central, PV: rama de vena porta, HA: rama de arteria hepática, BD: rama dúctulo biliar.
18
Una vez determinada el área a analizar es necesario realizar cortes y tinciones
estándares. Entre estas tinciones se destaca la hematoxilina y eosina (H&E), que
permite describir la histoarquitectura del hígado, la tinción con reactivo de Schiff y
ácido periódico (PAS) que permite reportar la distribución de glucógeno y la tinción con
tricrómico de Masson que permite evaluar la morfología de los vasos sanguíneos,
distribución del tejido conectivo, hiperemia y hemorragia. La hiperemia es el aumento
del contenido sanguíneo intravascular, mientras que la hemorragia es el derrame
sanguíneo fuera del sistema vascular. Por otro lado, mediante técnicas de
inmunohistoquímica se pueden realizar estudios histopatológicos basados en la
utilización de un anticuerpo específico unido químicamente a una enzima que puede
convertir un sustrato en un producto visible sin afectar el reconocimiento del antígeno.
El complejo antígeno - anticuerpo así formado permite la identificación y localización
de marcadores antigénicos característicos de tipos de célula y estados metabólicos
(Suzuki y col., 2006).
Todos estos antecedentes permiten formular la siguiente hipótesis: la
malnutrición proteica crónica modifica la expresión y el contenido de algunas
enzimas hepáticas, generando condiciones propicias para el desarrollo de
hepatocarcinogénesis. Además, nuestros resultados previos sobre la malnutrición
proteica aguda permiten conjeturar que el aminoácido metionina ejerce un efecto
hepatoprotector durante la malnutrición proteica crónica.
En base a lo mencionado, se planteó estudiar el efecto de la malnutrición
proteica crónica sobre el hígado de ratón. Y además, analizar su vinculación con
el suplemento dietario de metionina y formación de procesos preneoplásicos.
Capítulo I
“Efecto de la malnutrición proteica crónica sobre el hígado de ratón. Análisis del suplemento
con metionina”
Introducción
20
Efecto de la malnutrición proteica crónica sobre el hígado de ratón.
Análisis del suplemento con metionina.
La malnutrición, desequilibrio entre la ingesta de nutrientes y las necesidades
energéticas básicas, produce alteraciones metabólicas y estructurales como
desbalances energéticos, estrés oxidativo y degradación de proteínas (Young 1994;
Fafournoux y col., 2000; Vabulas y Hartl 2005).
Los efectos de la malnutrición proteica se han estudiado en roedores
alimentados con dietas restringidas en proteínas. Estos modelos experimentales han
aportado importantes conocimientos sobre las modificaciones metabólicas producidas.
Nuestro grupo de investigación ha utilizado un modelo basado en la administración de
una dieta carente de proteínas y aminoácidos (SP) durante 5 días para examinar el
metabolismo proteico del hígado de ratón (Conde y Scornik 1976). Con este mismo fin,
se han examinado los efectos causados por la dieta SP suplementada con metionina
(SP+Met) administrada durante 5 días (Conde y Scornik 1976; Ronchi y col., 2004).
Respecto de una dieta completa (CD), la dieta SP reduce a la mitad la masa
proteica del hígado en 5 días. Está pérdida se recupera rápidamente con la dieta CD
debido a una disminución drástica de la tasa de degradación (Conde y Scornik 1976;
Ronchi y col., 2004). Estas modificaciones afectan a las proteínas de las distintas
fracciones subcelulares (Conde y Franze-Fernandez 1980; Pucciarelli y Conde 1984).
También la actividad de los sistemas proteolíticos hepáticos aumenta por efecto de la
dieta SP (Cassia y col., 1989; Goicoechea y col., 1994).
Mediante la separación de proteínas por punto isoeléctrico y tamaño en geles
bidimensionales (2D), es posible observar que 192 de un total de 305 polipéptidos son
afectados por la dieta SP. Estos resultados, incorporados a bases de datos 2D
(Garcia-Mata y col., 1997; Garcia-Mata y col., 1998; Tomasi y col., 1999; Sanllorenti y
21
col., 2001; Ronchi y col., 2004), muestran que las proteínas cuyos niveles modifica la
dieta SP se vinculan con: ● metabolismo de hidratos de carbono, como gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH); ● estrés oxidativo y eliminación de sustancias
tóxicas, como glutatión S-transferasa (GSTs), peroxirredoxina-1 (Prx-1), catalasa,
glutatión peroxidasa (GSH-Prx), Cu-Zn superóxido dismutasa, citocromo P450,
anhidrasa carbónica III (ACIII); ● síntesis de proteínas (factor de elongación 1A); ●
metabolismo y transporte de lípidos, como ácido graso sintasa (FAS), proteína de
unión a ácido graso (L-FABP; Liver Fatty Acid Binding Protein) y alcohol
deshidrogenasa (ADH) (Sanllorenti y col., 1992; Garcia-Mata y col., 1997; Sanllorenti y
col., 2001; Ronchi y col., 2004). Además, algunos de los polipéptidos mencionados se
relacionan con los procesos de apoptosis y transformación celular. Por ejemplo, los
niveles bajos de GSTs se relacionan con la susceptibilidad a la carcinogénesis y
enfermedades hepáticas (Cabiscol y Levine 1996; Bounous y Molson 2003). La
expresión y actividad de FAS es regulada por condiciones nutricionales y, además,
aumenta en procesos cancerígenos y enfermedades hepáticas (Brusselmans y col.,
2005; Evert y col., 2005). Además, la enzima glicolítica GAPDH estaría implicada en
procesos apoptóticos y de estrés oxidativo (Sirover 1999; Berry y Boulton 2000;
Dastoor y Dreyer 2001; Mazzola y Sirover 2001). Los niveles de ACIII disminuyen en
hepatocarcinoma (Kuo y col., 2003), mientras que los de PrxI aumentan en cáncer de
pulmón y mama (Butterfield y col., 1999). Además, una dieta carente de proteínas y
aminoácidos genera estrés oxidativo al alterar la expresión de SOD, CAT y GPx
(Ronchi y col., 2004; Ronchi y col., 2010).
Diversas evidencias indican que la dieta juega un rol primordial en el desarrollo
de neoplasias (Hinrichsen y col., 1993; Rogers y col., 1993; Tarsetti y col., 1993;
Tomasi y col., 1999). Si bien, la calidad de la dieta es un factor importante, es difícil
reconocer cual de sus componentes interviene en mayor medida en el desarrollo del
cáncer (Leveille y Cloutier 1987; Hennekens y col., 1994). Las teorías sobre los
22
mecanismos concernientes a la restricción de alimento son diversas (Grasl-Kraupp y
col., 1994; James y Muskhelishvili 1994; Hikita y col., 1998). Una de ellas es que la
privación de alimento (fasting) estaría ligada a un efecto supresor sobre el crecimiento
y división celular, o a un efecto inductor de la pérdida celular de los órganos,
incluyendo el hígado (Grube y col., 1985; Grasl-Kraupp y col., 1994; James y
Muskhelishvili 1994; Hikita y col., 1998). Por otro lado, estos cambios serían
contrarrestados por la realimentación (refeeding), la cual causa un incremento de la
proliferación celular y decrece el índice de muerte celular (Grube y col., 1985; Grasl-
Kraupp y col., 1994; James y Muskhelishvili 1994; Hikita y col., 1998).
Es necesario remarcar que los aminoácidos no son sólo precursores de la
síntesis de proteínas y de otros compuestos nitrogenados, sino que también participan
en la regulación de la mayoría de los procesos metabólicos (Mortimore y Poso 1984;
Meijer 2003). Pueden controlar la carga del ARNt (Dudek y Semenkovich 1995), el
nivel de expresión de proteínas y las actividades enzimáticas (Jousse y col., 2000).
Los mecanismos utilizados por las células hepáticas para controlar los niveles y
actividad de las proteínas son diversos. Por ejemplo, una dieta aproteica modifica las
velocidades de síntesis y degradación de las GSTs (Garcia-Mata y col., 1998). Otras
proteínas pueden ser controladas a nivel de la transcripción o luego de la traducción
en respuesta a señales intra y extracelulares. Por lo tanto, una restricción dietaria de
aminoácidos puede tener consecuencias patofisiológicas en varios niveles (Vabulas y
Hartl 2005). Por otro lado, se conoce que la presencia de metionina en dietas
hipoproteicas reduce el estrés oxidativo mitocondrial y, consecuentemente, el
envejecimiento celular (Caro y col., 2009). Por lo tanto, la patología, terapia, y
recuperación de varias enfermedades depende de la disponibilidad de aminoácidos
que tengan los tejidos.
Por lo antes mencionado, en esta primer parte del trabajo se examinaron los
cambios causados por la malnutrición proteica crónica en parámetros bioquímicos e
23
histológicos del hígado de ratón. Asimismo, se examinó la capacidad individual del
aminoácido metionina para prevenir esos cambios.
Para ello, se fijaron los siguientes objetivos particulares:
Evaluar el peso del hígado, y los contenidos de proteínas citosólicas,
totales y ácidos nucleicos.
Analizar los contenidos de ARNm y proteico de las enzimas hepáticas
FAS, ACIII, GSTs, y GAPDH.
Examinar el estado redox del hígado.
Analizar propiedades bioquímicas del suero sanguíneo e histológicas del
hígado.
Resultados
25
1- Efecto de la malnutrición proteica crónica sobre el peso corporal, peso
del hígado, y contenidos de proteínas citosólicas y ácidos nucleicos. Influencia
del suplemento con metionina.
1.1- Peso corporal y hepático.
Existen controversias acerca de la cantidad mínima de proteína que debe
ingerirse para satisfacer las necesidades energéticas básicas. Varias evidencias
provenientes de estudios clínicos y experimentales sugieren que la dieta tiene un rol
importante en el desarrollo normal del organismo como en la formación de neoplasias,
siendo la calidad el aspecto más importante (Hinrichsen y col., 1993; Rogers y col.,
1993; Tarsetti y col., 1993; Ames y Gold 1998; Tomasi y col., 1999). Por otro lado, los
ciclos de privación-realimentación (fasting-refeeding) producen alteraciones típicas de
la restricción. Con la etapa de realimentación se revierten algunas y se fijan otras
asociadas a un incremento de la proliferación celular típica de ciertos órganos como el
hígado (Laconi y col., 1995).
Se evaluó el efecto de 3 ciclos de privación proteica-realimentación (SP-CD) o
privación proteica suplementada con metionina-realimentación (SP+Met-CD) en
ratones hembra BALB/c (Fig. 1).
26
El peso corporal disminuyó en los ratones SP-CD. Este descenso se inició
luego del día 5 y alcanzó el 20% al finalizar el tratamiento. El peso final del hígado no
mostró diferencias significativas respecto al control (CD) (Tabla 1). Los ratones
tratados con SP+Met-CD, mostraron un comportamiento similar a SP-CD con respecto
al peso corporal y del hígado. Ambos sufrieron una pérdida de peso importante
durante cada periodo de privación el cual se recuperó parcialmente durante cada
periodo de realimentación. La amplitud de esta respuesta fue menor luego de los 2
primeros ciclos del tratamiento donde se registró sólo disminución del peso corporal
(Fig. 2).
Los ratones CD no registraron variaciones significativas de peso corporal ni del
hígado.
Figura 1. Diseño experimental. Hembras BALB/c de 2 meses de edad fueron sometidas a
períodos de 5 días de dieta carente de proteínas y aminoácidos o suplementada con metionina (SP ó SP+Met: □) seguidos por 5 días de alimentación completa (CD: ■) y repetidos tres veces. Los animales fueron adaptados a la dieta control durante 10 días previos a los tratamientos. Finalizados los 3 ciclos, fueron sacrificados por dislocación cervical o decapitación (↓). Los animales control fueron alimentados con dieta completa (CD: ■) durante todo el tratamiento.
27
Tabla 1. Peso corporal y hepático de ratones bajo dieta control CD y tratados con ciclos SP-CD o
SP+Met-CD.
CD SP-CD SP+Met-CD
Días Peso
corporal (g)
Peso
hepático (g)
Peso
corporal (g)
Peso
hepático (g)
Peso
corporal (g)
Peso
hepático (g)
-10 22.4 ± 0.9
1.03 ± 0.03
23.9 ± 0.5
0.94 ± 0.04
22.7 ± 0.9
0.89 ± 0.03
0 23.3 ± 0.9 24.7 ± 1.0 24.0 ± 0.5
5 23.3 ± 0.8 21.5 ± 0.8 20.5 ± 0.6
10 23.5 ± 0.8 22.3 ± 0.8 22.4 ± 0.7
15 24.0 ± 0.9 19.8 ± 0.7* 17.8 ± 0.7*
20 23.1 ± 0.9 19.1 ± 0.6* 20.5 ± 0.7
25 23.4 ± 1.3 16.4 ± 0.5* 18.1 ± 0.6*
30 22.8 ± 1.7 19.2 ± 0.7* 17.5 ± 0.7*
Valores representando la media ± SEM de tres experimentos independientes, con n = 6 en cada uno. Diferencias
significativas con respecto a CD: * P<0.05.
1.2- Contenidos de proteínas citosólicas y ácidos nucleicos.
Un aumento o disminución en la tasa de degradación pueden ser causa de
cambios en el contenido proteico de las células y tejidos. Por ejemplo, el rápido
crecimiento hepático producido por la realimentación con dieta completa luego de una
privación proteica de 5 días se debe, en mayor medida, a un freno de la degradación
(Conde y Scornik 1976). Ante estos antecedentes interesa conocer el recambio de
proteínas, como así también los niveles de los ácidos nucleicos en el hígado de
Figura 2. Peso corporal. Registro del peso corporal cada 5 días en ratones hembra BALB/c sometidos a malnutrición proteica crónica con o sin el suplemento de metionina.
28
ratones sometidos a malnutrición proteica crónica. Como se mencionó anteriormente,
metionina es un aminoácido esencial y su déficit podría generar un mal funcionamiento
de diversos órganos. Por otra parte, el suplemento de metionina en la dieta se
encontraría relacionado con la disminución del envejecimiento celular entre otros
procesos (Caro y col., 2009). En este es trabajo se estudió el suplemento de metionina
durante el período bajo dieta aproteica. Los contenidos de proteína total y de ARN
mostraron un aumento significativo del 23% y 20% respectivamente en SP-CD,
mientras que las proteínas citosólicas y el ADN total no presentaron ningún cambio
significativo (Tabla 2). En los animales suplementados con metionina (SP+Met-CD), el
contenido de proteínas citosólicas mostró un aumento del 75% con respecto a CD
(Tabla 2).
Tabla 2. Efectos de los diferentes tratamientos sobre el contenido de proteínas y ácidos
nucleicos en hígado de ratón.
Condición
nutricional
Proteína total
(mg/hígado)
Proteína
citosólica
(mg/hígado)
ADN
(mg/hígado)
ARN
(mg/hígado)
CD 144 ± 9a 70 ± 16a 1.9 ± 0.2 4.5 ± 0.4a
SP-CD 177 ± 49b 90 ± 19a 2.1 ± 0.1 5.3 ± 0.3b
SP+Met-CD 142 ± 21a 123 ± 41b 2.0 ± 0.1 4.8 ± 0.2a
Valores representando la media ± SEM de tres experimentos independientes, con n = 6 en cada uno.
Diferencias significativas analizadas por el test de ANOVA y tuckey. Letras diferentes: P<0.05.
29
2- Efecto de la malnutrición proteica crónica y el suplemento de metionina
sobre los contenidos de ARNm y proteico de las enzimas citosólicas FAS, ACIII,
GSTs y GAPDH.
2.1- Contenidos de ARNm.
Con el fin de analizar el comportamiento de las proteínas hepáticas FAS, ACIII,
GSTs y GAPDH, se evaluaron los niveles de sus ARNm en los ratones sometidos a
malnutrición proteica crónica (SP-CD), a la dieta con metionina SP+Met-CD, y a la
dieta control (CD). El estudio se realizó por RT-PCR y aquellos parámetros que
variaron significativamente fueron corroborados por Northern blot (datos no
mostrados). Los resultados se muestran en la figura 3. La cuantificación
densitométrica de las bandas pertenecientes a los diferentes ARNm se transcribe en la
Tabla 3 y figura 4. Los cambios respecto de la dieta control fueron los siguientes: 1) el
tratamiento SP-CD aumentó FAS ARNm (+55%) y GSTP1 ARNm (+36%), y disminuyó
ACIII ARNm (-46%); 2) el tratamiento SP+Met-CD mantuvo FAS ARNm próximo a su
valor normal, GSTP1 ARNm disminuyó (-30%), y previno parcialmente la pérdida de
ACIII ARNm; 3) ninguna de las dietas administradas modificó los niveles de GAPDH,
GSTM1 y GSTA3 mRNAs.
Figura 3. RT-PCR
El ARN total fue aislado y analizado por RT-PCR para las enzimas FAS, ACIII, GSTs y GAPDH en cada tratamiento (SP-CD, SP+Met-CD y CD). Se utilizó actina como control de carga. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% teñido con BrEt.
30
Tabla 3. Cuantificación densitométrica de transcriptos obtenidos por RT-PCR semicuantitativa
Enzima CD SP-CD SP+Met-CD
FAS 100 ± 9a 156 ± 14b 124 ± 8
ACIII 100 ± 8a 54 ± 3b 72 ± 13b
GAPDH 100 ± 3 95 ± 8 108 ± 5
GSTP1 100 ± 5a 136 ± 6b 70 ± 7c
GSTM1 100 ± 9 107 ± 15 96 ± 9
GSTA3 100 ± 4 106 ± 9 109 ± 8
El análisis fue realizado por el test estadístico ANOVA utilizando tuckey para discriminar las diferencias
entre tratamientos. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
2.2- Contenidos de enzimas citosólicas.
Estudios previos realizados mediante SDS-PAGE mostraron que el patrón
proteico hepático de ratones sometidos durante 5 días a dieta carente de proteínas
Figura 4. Representación gráfica de la densitometría obtenida a partir de las bandas de RT-PCR
Representación de: A) FAS, B) ACIII, C) GAPDH, D) GST. Las diferencias significativas en la intensidad de las bandas analizadas por densitometría, se expresan en la longitud de las barras con letras diferentes (P<0.05). Los valores representan las medias ± SEM de 3 experimentos independientes con n=6.
31
suplementada con aminoácidos esenciales es parecido al observado con la dieta
completa. Estos aminoácidos controlarían, principalmente, el contenido de ACIII y de
las subunidades GSTs. También previenen el aumento de GAPDH y, en parte, el de
FAS causados por la privación dietaria total de aminoácidos (Ronchi y col., 2004).
En base a estos resultados se procedió a analizar el efecto de ciclos de
privación proteica realimentación o malnutrición crónica sobre aquellas proteínas
alteradas durante 5 días de malnutrición proteica aguda (Conde y Scornik 1976;
Sanllorenti y col., 1992; Garcia-Mata y col., 1997; Garcia-Mata y col., 1998; Ronchi y
col., 2004; Ronchi y col., 2010).
Para ello, se analizaron citosoles del hígado de ratones sometidos a
malnutrición proteica crónica en SDS-PAGE 12%. La tinción con Coomassie blue
permitió la identificaron de las bandas pertenecientes a las enzimas FAS, ACIII, las 3
subunidades de GSTs (GSTM1, GSTA3 y GSTP1), y GAPDH (Fig. 5). Sus cantidades
relativas, ponderadas por densitometría con el programa imageQuant vL2005, están
agrupadas en la Tabla 4. Los cambios respecto de la dieta control fueron los
siguientes: 1) el tratamiento SP-CD aumentó FAS (+111%), redujo ACIII (-48%) y
GSTM1 (-25%). También mostró una baja de GSTA3 (-15%) que resultó no
significativa; 2) el tratamiento SP+Met-CD evitó el aumento de FAS, previno
parcialmente la baja de ACIII, y no impidió la reducción de GSTM1; 3) ninguna de las
dietas administradas modificó significativamente los niveles de las proteínas GSTP1,
GSTA3, y GAPDH. Cabe agregar que los análisis de FAS y GSTP1 se confirmaron por
Western blot (datos no mostrados).
32
Tabla 4. Densitometría relativa de los niveles proteicos citosólicos.
Enzima CD SP-CD SP+Met-CD
FAS 100 ± 16a 211 ± 31b 133 ± 16a
ACIII 100 ± 8a 52 ± 5b 61 ± 13b
GSTP1 100 ± 2 102 ± 1 88 ± 8
GSTM1 100 ± 4a 75 ± 8b 79 ± 4b
GSTA3 100 ± 4 85 ± 8 104 ± 10
GAPDH 100 ± 3 104 ± 4 102 ± 3
Los datos se obtuvieron por análisis densitométrico a partir de bandas de SDS-PAGE 12%. FAS y GSTP1 fueron corroborados por Western blot. Todos los valores se expresan respecto al 100% del grupo control. Análisis estadístico ANOVA utilizando tuckey. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). .
Figura 5. Análisis de proteínas citosólicas
A) SDS-PAGE 12% representativo (25 µg de proteínas). A la izquierda se representa el marcador de peso molecular (kDa), las proteínas analizadas son señaladas a la derecha. B y C) Representación grafica de la densitometría relativa de las bandas, letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). Los valores representan las medias ± SEM de 3 experimentos independientes con n=6. ■ CD, □ SP-CD, ≡ SP+Met-CD.
33
3- Estudio de la malnutrición proteica crónica y el suplemento de
metionina sobre el balance redox del hígado.
Observaciones previas de nuestro grupo sugieren que una dieta carente de
aminoácidos administrada durante 5 días causa estrés oxidativo, y este puede ser en
parte contrarrestado por el suplemento de metionina (Ronchi y col., 2010).
Con el objetivo de analizar el efecto de la malnutrición proteica crónica y el
suplemento de metionina sobre el estado oxidativo del hígado de ratón, se analizó la
actividad de las enzimas citosólicas SOD, CAT, y GR. También se analizaron los
niveles de proteínas carboniladas y la peroxidación de lípidos. En la Tabla 5, se
muestra que los animales sometidos a los ciclos SP-CD presentaron una disminución
en las actividades de SOD y CAT de un 30%, mientras que la actividad de GR se
incrementó un 28%. Los grupos carbonilos aumentaron un 70% respecto a CD. El
grado de peroxidación de lípidos se evaluó por medio de los niveles de TBARS, los
cuales mostraron un aumento del 95% respecto a CD. Cuando se administró la dieta
SP+Met-CD, los niveles de las enzimas y proteínas carboniladas resultaron similares a
los exhibidos por el grupo control. En este último tratamiento no se realizaron los
análisis de la enzima GR y peroxidación de lípidos.
Tabla 5. Efectos de la malnutrición proteica crónica y el suplemento con metionina sobre la
actividad de las enzimas relacionadas con el estrés oxidativo.
Condición nutricional
SOD
(U/ml citosol/mg
proteína)
CAT
(U/ml citosol/mg
proteína)
GR
(nKat/mg
proteína)
nmol
carbonilo/mg
proteína
nmol
TBARS/mg
hígado
CD 1.24 ± 0.07a 8.07 ± 0.38a 71 ± 16a 6.11 ± 0.75a 0.012 ± 0.01a
SP-CD 0.84 ± 0.01b 4.53 ± 1.13b 91 ± 19b 10.76 ± 0.74b 0.232 ± 0.02b
SP+Met-CD 1.25 ± 0.14a 8.69 ± 8.07a SD 5.53 ± 0.13a SD
Valores representando la media ± SEM de dos experimentos independientes (n = 4). Diferencias
significativas analizadas por el test de ANOVA y tuckey. Letras diferentes: P<0.05.
34
4- Análisis del suero sanguíneo e histología del hígado de ratones
sometidos a malnutrición proteica crónica, con o sin el suplemento de
metionina.
Los resultados descriptos hasta el momento permitieron mostrar algunos
efectos generados por la malnutrición proteica crónica y la capacidad protectora de
metionina en el hígado. Para profundizar el estudio se decidió examinar los cambios
causados por la malnutrición en la composición del suero sanguíneo y la histología
hepática.
4.1- Análisis bioquímico del suero.
En primer lugar, se consideró apropiado evaluar el efecto del modelo SP-CD
sobre la funcionalidad hepática. Se determinaron los niveles séricos de marcadores de
daño hepático como glutámico oxalacético transaminasa (SGOT), glutámico pirúvico
transaminasa (SGPT), fosfatasa alcalina (FA), glucosa, proteínas totales, colesterol y
albúmina (ALB). Los datos obtenidos se resumen en la Tabla 6. Como se puede
observar, los niveles de SGOT y SGPT mostraron un incremento significativo en los
ratones SP-CD respecto a CD. Además, se observaron alteraciones en los niveles de
FA, glucosa, colesterol, proteínas totales y albúmina.
La dieta suplementada con metionina SP+Met-CD mantuvo los valores séricos
comparables a CD, excepto el de FA.
35
Valores representando la media ± SEM de dos experimentos independientes (n = 4). Diferencias significativas analizadas
por el test de ANOVA y tuckey. Letras diferentes: P<0.05.
4.2- Análisis histológico del hígado.
Junto a los resultados obtenidos, se evaluó el daño ocasionado por la
malnutrición proteica crónica y el suplemento de metionina mediante histología
hepática. Por medio de tinciones estándares como H&E se describió la
histoarquitectura hepática. La tinción con reactivo de Schiff y ácido periódico (PAS)
permitió reportar la distribución de glucógeno; con tricrómico de Masson se evaluó la
morfología de los vasos sanguíneos, distribución del tejido conectivo, hiperemia y
hemorragia.
El hígado es un órgano con mucha actividad celular, en el cual las células se
mueren y duplican constantemente. Por esto, se investigó la muerte celular
dependiente de caspasa por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-
caspasa-3. Como medida de proliferación celular se realizó un análisis cualitativo de
células binucleadas, que son aquellas que poseen dos núcleos por una citocinesis
interrumpida. En este caso se cuantificaron utilizando signos “+” con fin de asignar un
valor que permita determinar si las diferencias obtenidas fueron significativas.
Por otro lado se realizó una evaluación inmunohistoquímica de GSTP1, debido
a que esta enzima se encuentra sobreexpresada en focos preneoplásicos hepáticos
de ratón (Satoh y col., 2002).
Tabla 6. Análisis del suero sanguíneo de ratones tratados con ciclos SP-CD y SP+Met-CD.
Condición
nutricional
SGOT
(U/l)
SGPT
(U/l)
FA
(U/l)
Glucosa
(mg/dl)
Proteínas
(g/dl)
Colesterol
(mg/dl)
Albúmina
(g/dl)
CD 397 ± 30a 88 ± 10a 79 ± 20a 141 ± 7a 6 ± 0.1a 113 ± 3a 3.4 ± 0.1a
SP-CD 611 ± 11b 163 ± 11b 291 ± 28b 150 ± 3b 5 ± 0.1b 139 ± 2b 2.6 ± 0.2b
SP+Met-CD 481 ± 25a 136 ± 12a 150 ± 31c 145 ± 18a 6 ± 0.1a 131 ± 14ab 3 ± 0.1a
36
En el hígado control (CD) teñido con H&E se observó una arquitectura
trabecular conservada en la cual los hepatocitos se encuentran en cordones tomando
una disposición radial desde la vena central (Fig. 6A). Los hepatocitos mostraron la
estructura poliédrica característica, con bordes citoplasmáticos y nucleares
homogéneos, conservando la relación núcleo citoplasma normal (1:1). En las células
hepáticas se observó una vacuolización microvesicular distintiva en este órgano.
Cuando se tiñeron cortes con PAS se determinó una distribución periportal normal del
glucógeno, observándose la mayor acumulación del mismo en la zona 1 del acino (Fig.
6B). Dentro de las células se observó un contenido homogéneo del mismo,
delimitando las micro vesículas lipídicas (Fig. 6C). En cortes teñidos con tricrómico de
Masson, se visualizó un aspecto normal de los vasos sanguíneos, sin hemorragia ni
hiperemia dentro del órgano (Fig. 6D,E).
37
38
El análisis inmunohistoquímico utilizando un anticuerpo anti-caspasa-3 en los
hígados CD mostró la presencia de células aisladas caspasa-3-positivas en la zona 2
del acino –flecha- (Fig. 7A,B). La inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo contra
la proteína GSTP1, no reveló células ni acúmulos GSTP1-positivos (Fig. 7E,F). El
análisis inmunohistoquímico se detalla en la Tabla 7. En cuanto al análisis de
proliferación celular, se encontraron células binucleadas distribuidas homogéneamente
a lo largo de todo el acino (Tabla 7).
39
40
En los cortes histológicos de los ratones tratados con SP-CD teñidos con H&E
se observó una desestructuración de la histoarquitectura normal hepática, en la cual
no se mostró una organización cordonal radial de los hepatocitos. Este desarreglo se
observó desde la zona 1 hacia la zona 3. También se detectó la presencia de células
gigantes “células bizarras” con núcleos pleomorficos de gran tamaño y un gran número
de células binucleadas, dispuestas por todo el parénquima, pero en mayor frecuencia
cercanas a la vena central, zona 3. Junto con esto se encontraron núcleos pignóticos y
cuerpos apoptóticos. También se distinguieron aéreas eosinófilas desestructuradas o
de necrosis temprana (Fig. 8A-C). Las características particulares mencionadas son
indicadas con flechas blancas en las diferentes fotografías.
En los animales SP-CD se observó una característica muy significativa
diferente a los demás tratamientos que es la lipoidosis. Esta consiste en depósitos de
grasa neutra de tipo microvesicular presente, principalmente, en la zona 1. Esta gran
vacuola lipídica desplaza al núcleo del hepatocito produciendo principalmente la
desorganización cordonal observada (Fig. 8C). Estas células se tiñeron negativamente
con PAS, permitiendo también observar un desarreglo en la organización periportal del
glucógeno, mostrándose una distribución heterogénea del mismo (Fig. 8D-F). A su
vez, por medio de la tinción de Masson se observó un aumento en la pared vascular
en donde la fibrosis (azul) infiltra los sinusoides que rodean la vena central englobando
los hepatocitos. También se observó la presencia de células hemorrágicas, en las
cuales los glóbulos rojos ocuparon el citoplasma celular. Por otra parte se detectó un
aumento de la hiperemia por congestión vascular. Además, se determinó un aumento
del torrente sanguíneo dentro de los vasos y de los sinusoides (Fig. 9A-C).
41
42
43
En la condición en SP-CD, la inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-
caspasa 3 reveló una gran cantidad de células positivas, principalmente en la zona 3
cercanas a la vena central, aunque también se encontraron algunas en la zona 1 (Fig.
9D-E). Por otra parte, utilizando un anticuerpo anti-GSTP1, se revelaron células
GSTP1-positivas en gran cantidad en la zona 2, encontrando algunos focos cercanos
a la zona 1 y 3 (Fig. 10). También se detectó un alto contenido de células binucleadas
(Tabla 7).
En la condición SP+Met-CD, los cortes teñidos con H&E mostraron una
arquitectura trabecular conservada de los hepatocitos dispuestos en cordones
radiales. Estos últimos presentaron un aspecto morfológico normal poliédrico, con
escasa o nula vacuolización. Se distinguieron algunas zonas necróticas entre la zona 2
y 3 (Fig. 11A-B)
En los cortes teñidos con PAS, el glucógeno mostró un gradiente periportal con
células conteniéndolo en distintas cantidades. En la figura 11 D se muestra la
presencia de un cordón de hepatocitos con mayor contenido de glucógeno que el
contiguo (Fig. 11C-D).
La tinción con tricrómico de Masson reveló un aspecto normal del lobulillo,
destacándose un leve engrosamiento de las paredes vasculares y un aumento de la
cantidad de tejido conectivo rodeando al hepatocito cercano a la vena central.
Además, se visualizó una hiperemia leve, debido al aumento de tejido sanguíneo
dentro de los vasos y sinusoides, sin embargo no se observó hemorragia (Fig. 11E-F).
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En la inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-caspasa 3, en los cortes
SP+Met-CD, se observaron células aisladas caspasa-3-positivas similares al grupo CD
(Fig. 12A-B) En la inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-GSTP1, se
determinaron células aisladas GSTP1-positivas, sin embargo no se observaron grupos
ni acúmulos de células positivas (Fig. 12 E-F). En cuanto a la cantidad de células
binucleadas, la cantidad observada se encontró en un nivel intermedio entre SP-CD y
CD (Tabla 7).
Tabla 7: Análisis cualitativo de células binucleadas y positivas para caspasa-3 y GSTP1
Condición nutricional
Células binucleadas Células caspasa-3-
positivas Células GSTP1-
positivas
CD + + -
SP-CD +++ +++ ++
SP+Met-CD ++ + +
Valores cualitativos expresados en cantidad de signos (+), obtenido a partir de la cuantificación relativa de
un número representativo de fotos analizadas.
47
Discusión
49
Efecto de la malnutrición proteica crónica sobre el hígado de ratón.
Análisis del suplemento con metionina.
Previamente, se determinó que el hígado de ratones hembras BALB/c
sometidos a 5 días de privación de proteínas y aminoácidos (SP) pierde proteínas,
exhibe cambios en los contenidos de ciertas enzimas, y padece estrés oxidativo
(Conde y Scornik 1976; Conde 1979; Sanllorenti y col., 1992; Garcia-Mata y col., 1997;
Ronchi y col., 2004; Ronchi y col., 2010). Estos cambios pueden ser prevenidos
parcialmente por la presencia de metionina (Ronchi y col., 2004; Ronchi y col., 2010),
y revertidos luego de 2 días de realimentación con una dieta normal (Conde y Scornik
1976; Sanllorenti y col., 1992). Estos tratamientos no permiten conocer con precisión
los cambios que pueden causar en el hígado los episodios repetidos de malnutrición
proteica. Por esta razón, esta investigación comenzó examinando los cambios
causados por la malnutrición proteica crónica en parámetros bioquímicos e
histológicos del hígado de ratón. También, se dedicó a examinar la capacidad
individual del aminoácido metionina para prevenir esos cambios.
- La malnutrición proteica crónica altera el peso corporal del ratón
hembra, y los contenidos de proteínas y ácidos nucleicos del hígado. Estas
modificaciones ocurren en menor grado si se conserva el aporte dietario de
metionina
Bajo el modelo de malnutrición proteica crónica aplicado, se preservó el peso
del hígado a pesar de una disminución significativa del peso corporal (Tabla 1). Este
resultado está de acuerdo con la recuperación del peso hepático en ratas expuestas a
ciclos de ayuno-realimentación (Laconi y col. 1995; Hikita y col. 1997), y en ratones
realimentados con dieta normal después de 6 días bajo dieta aproteica (Conde y
Scornik 1976). Cabe mencionar que los ratones ingieren mayor cantidad de dieta SP
que CD durante los dos primeros ciclos (Materiales y Métodos). Dado que ambas
50
dietas son isocalóricas, esa mayor ingesta inicial provocaría el mantenimiento del peso
hepático en los ratones SP-CD (Leduc 1949). Ciertos antecedentes aseveran que
después de una dieta pobre en aminoácidos los animales reconocen la deficiencia
nutricional, tratan de resolverla aumentando su ingesta y, luego, responden
reduciéndola (Chaveroux y col., 2010). Con el tiempo aparece una respuesta
anoréxica que se relaciona con la concentración del aminoácido limitante en el plasma,
detectándose en la corteza piriforme del cerebro, lo que desencadena un rechazo al
sabor, con el fin de reducir cualquier efecto nocivo de una alimentación a largo plazo
con una dieta desequilibrada (Gietzen y Magrum 2001). Durante los primeros dos
ciclos de nuestro tratamiento se destacó la primera respuesta en la cual los ratones
trataron de solventar el déficit nutricional, mientras que en el último ciclo comenzó a
observarse una disminución en la ingesta, manifestando una respuesta anoréxica.
En los animales tratados con la dieta suplementada con metionina, se registró
una leve disminución no significativa en el peso del hígado. Esto podría deberse a que
los animales ingirieron la misma cantidad de dieta SP+Met que CD, por lo tanto no
tuvieron un periodo de mayor ingesta calórica que ayude como en SP-CD a mantener
el peso del hígado. Por otra parte, la masa hepática disminuye luego de 5-6 días de
malnutrición proteica y se revierte por realimentación completa (Conde y Scornik,
1976). Esto sugiere que los 5 días bajo dieta control al finalizar cada ciclo ayudarían a
preservar la masa del hígado en el presente modelo experimental.
El peso corporal en los ratones SP+Met-CD disminuyó significativamente del
mismo modo a lo observado en SP-CD. Varios tipos de estrés, junto con la
malnutrición proteica, pueden generar un balance negativo del nitrógeno
desencadenando pérdida de la masa corporal (Chaveroux y col., 2010). En SP+Met-
CD, aunque se suplementó con el aminoácido metionina, la carencia del resto de los
aminoácidos esenciales generaría el balance negativo de nitrógeno de la misma
manera que la privación de proteínas y aminoácidos produciendo una degradación de
51
proteínas corporales, principalmente musculares generando la disminución del peso
corporal (Tabla 1).
Por otro lado, la dieta SP-CD no modificó el contenido de ADN hepático, pero
generó un incremento en los niveles de ARN. Estos resultados también concuerdan
con los reportados en ratones alimentados durante 5-6 días con dieta SP y
realimentados con CD (Conde y Scornik 1976; Conde y Franze-Fernandez 1980). En
este caso, la deficiencia de proteínas y aminoácidos ocasiona una respuesta en el
hígado alterando la tasa de síntesis y degradación de ARN (Conde y Scornik 1976;
Conde y Franze-Fernandez 1980). El incremento en el contenido de ARN se debe
posiblemente a un aumento de la síntesis y freno de la degradación provocado por los
5 días finales de realimentación con dieta control (Conde y Franze-Fernandez 1980).
Este incremento provee a las células del ARN ribosómico necesario para sintetizar
proteínas a una tasa normal. Este fenómeno también ocurre en el músculo de ratas
ayunadas (Munro 1968). En los animales tratados con SP+Met-CD no se registraron
cambios significativos en los niveles de ácidos nucleicos, indicando que el suplemento
con metionina sería suficiente para mantener estables sus niveles (Tabla 2).
Los ratones tratados con una dieta SP-CD registraron un leve incremento en
las proteínas citosólicas, mientras que las proteínas totales aumentaron 23%. Cuando
se suplementó con metionina (SP+Met-CD), las proteínas citosólicas aumentaron
significativamente, mientras que las totales mantuvieron sus valores normales. Dentro
de las proteínas citosólicas, se encuentran, principalmente, aquellas relacionadas con
procesos metabólicos, mientras que en las totales también están las estructurales. Un
desbalance entre la síntesis y degradación de proteínas siempre es la principal causa
de su aumento o disminución. El aumento de las proteínas en la condición SP-CD
puede ser consecuencia de una mayor disponibilidad de ribosomas (Conde y Scornik
1976). Por otra parte, el aumento de las proteínas citosólicas en SP-Met-CD puede
deberse a un freno en la degradación acompañado por una tasa normal de síntesis
52
(Conde y Scornik 1976). Dado que altera los contenidos de las proteínas citosólicas y
totales, se podría especular que el tratamiento SP-CD genera daños metabólicos y
estructurales. En cambio, el tratamiento SP+Met-CD sólo causaría cambios a nivel
metabólico y no estructural (Tabla 2).
- La malnutrición proteica crónica afecta los contenidos de ARNm y
proteico de las enzimas FAS, ACIII, GSTs y GAPDH. Metionina evita parcialmente
el daño ocasionado.
La administración de una dieta SP durante 5-6 días disminuye el contenido
proteico del hígado a la mitad (Conde y Scornik 1976). Sin embargo, este tratamiento
dietario agudo no afecta de igual manera a todas las proteínas. De este modo, se
determinó que existen proteínas reguladas positivamente y otras negativamente
(Conde y Scornik 1976; Conde 1979; Sanllorenti y col., 1992; Garcia-Mata y col., 1997;
Ronchi y col., 2004).
A partir de estos antecedentes, el objetivo en este estudio fue analizar los
efectos de la malnutrición proteica crónica sobre los niveles de las proteínas afectadas
por la dieta aguda como: FAS, ACIII, glutatión S-transferasas (GSTs) y GAPDH.
Además estudiar si el agregado de metionina a SP evita alguno de sus efectos.
En ratones sometidos a malnutrición proteica crónica se observó un incremento
en los niveles de FAS, tanto en el contenido de ARNm como proteico. Esto estaría
indicando una regulación a nivel transcripcional, generada por la carencia de proteínas
y aminoácidos. Este aumento de FAS concuerda con el presentado por células de
mamíferos cuando son incubadas en medios carentes de aminoácidos (Fafournoux y
col., 2000). A su vez, los niveles de FAS no fueron diferentes respecto a los valores
normales en los animales suplementados con metionina. Por lo tanto, metionina es
53
capaz de regular los niveles hepáticos de ARNm y proteico de FAS mediante los
mecanismos postulados por Hwahng y col. (2009) (Tabla 3,4).
Cuando se analizó la proteína ACIII, en ratones alimentados con dieta SP-CD
se observó una disminución del 50% aproximadamente tanto en el ARNm como en el
contenido proteico, similar a lo reportado con 5 días de dieta SP por Sanllorenti y col.
(2001). Cuando metionina estuvo presente en el período aproteico (SP+Met-CD), los
contenidos de ARNm y proteico de ACIII resultaron intermedios entre los exhibidos
luego de los tratamientos SP-CD y CD. Además de cumplir un rol en la homeostasis
celular manteniendo el balance ácido base, ACIII actúa eliminando los radicales de
oxígeno resguardando a la célula del estrés oxidativo (Raisanen y col., 1999). Por lo
tanto, su disminución con el tratamiento SP-CD daría lugar a un estrés oxidativo
(Laconi y col., 1995). Se ha demostrado que pueden existir varias alternativas a través
de las cuales los aminoácidos podrían regular los niveles de las ACs. Una de ellas es
a nivel transcripcional, partiendo de una modificación en la expresión del gen. Un
ejemplo de este mecanismo de regulación es el reportado para la proteína CHOP, que
presenta un elemento de respuesta sensible a la privación de aminoácidos (AARE) en
el promotor de su gen. A partir de resultados de análisis de homología de secuencia
en los promotores de las enzimas CHOP y ACIII (Bruhat y col., 2000; Kim y col., 2001),
pudimos descubrir que ACIII contiene el sitio AARE (Ronchi 2003). En base a esto, la
acción de metionina sobre AARE podría ser responsable de la recuperación parcial de
ACIII en los animales SP+Met-CD. No obstante, este suplemento no resultó suficiente
para evitar totalmente los cambios ocasionados por el tratamiento SP-CD (Tabla 3,4).
Las glutatión S-transferasas (GSTs) tienen un rol fundamental en la protección
de las células contra el estrés oxidativo. Además actúan en la detoxificación de
compuestos medioambientales, mutagénicos y cancerígenos (Tsuchida y Sato 1992;
Hayes y Pulford 1995). El tratamiento SP-CD causó un incremento significativo del
ARNm de la isoforma GSTP1, sin modificar los niveles de los ARNm de GSTM1 y
54
GSTA3. Además, SP-CD causó una leve disminución en el nivel proteico de GSTM1, y
no alteró los correspondientes a GSTA3 y GSTP1. Estos resultados indican que
GSTP1 es la isoforma más afectada por SP-CD y que su síntesis aumenta en paralelo
con su degradación (Garcia-Mata y col., 1997). Por otro lado, SP+Met-CD causó una
disminución significativa en el ARNm de GSTP1 y en el nivel proteico de GSTM1. Por
lo tanto, la presencia de metionina restauraría las tasas normales de síntesis y
degradación de GSTP1. La disminución en los niveles proteicos de GSTM1 se puede
atribuir a un aumento en su tasa de degradación y no en la de síntesis (Garcia-Mata y
col., 1997). Al menguar con SP-CD y SP+Met-CD, GSTM1 no sería regulada por
metionina. Este comportamiento concuerda con el exhibido por ratas sometidas a
malnutrición proteica con 5% de caseína en ausencia y presencia de metionina (Cho y
col., 2000), (Tabla 3,4).
Cabe destacar que las enzimas analizadas se modificaron en el mismo sentido
al descripto en procesos tumorales (Bannasch y col., 1980; Bannasch y col., 1984;
Tsuchida y Sato 1992; Marche-Cova y col., 1995; Evert y col., 2005). Asimismo,
teniendo en cuenta que durante el desarrollo de HCC se alteran genes relacionados
con el metabolismo de hidratos de carbono (Bannasch y col., 1984), se planteó el
estudio de GAPDH. Estudios previos muestran que los niveles de GAPDH aumentan
en animales sometidos a malnutrición proteica aguda (Ronchi y col., 2004). Sin
embargo, la malnutrición proteica crónica no generó diferencias en el nivel de ARNm o
proteico de GAPDH, sugiriendo que los 5 días de dieta completa subsiguientes a cada
período de privación proteica son suficientes para normalizar sus niveles. Esto es
coherente con la restauración del contenido de GAPDH observada al realimentar con
dieta completa durante 2 días a ratones que estuvieron 5 días bajo dieta SP
(Sanllorenti y col., 1992), (Tabla 3,4).
55
- La malnutrición proteica crónica altera el estado redox del hígado.
Metionina atenúa este efecto.
Se ha reportado que la restricción dietaria del 40% con el suplemento de
metionina incrementa la longevidad en ratas, ratones y monos, debido a generar una
producción de ROS mitocondrial inferior a la necesaria para dañar el DNA (Caro y col.,
2008; Caro y col., 2009 a; Caro y col., 2009 b).
En este estudio se determinó que la restricción total de proteínas y
aminoácidos aplicada en forma crónica genera un incremento en el estrés oxidativo
disminuyendo las actividades de las enzimas SOD, CAT y GR relacionadas con la
remoción de ROS. Además, indicando daño oxidativo, se observó un incremento en la
carbonilación de proteínas y peroxidación de lípidos. Por otro lado, cuando se
suplementó con metionina, se observó una protección del daño debido a que, tanto las
actividades de SOD y CAT, como el análisis de las proteínas carboniladas presentaron
valores similares al control (Tabla 5).
Los resultados obtenidos coinciden con los de Caro y col. (2009 b),
demostrando que la presencia de 0.86 g metionina cada 100g de dieta carente de
proteínas, o con una restricción del 40%, es suficiente para disminuir los niveles de
estrés oxidativo. Cabe mencionar que proporciones mayores a 0.86 g de metionina por
100g dieta podrían causar un efecto contrario (Sanz y col., 2006; Caro y col., 2008;
Caro y col., 2009 a; Caro y col., 2009 b). En conjunto, estas investigaciones revelan el
rol fundamental que desempeña la metionina dietaria en la regulación del estado redox
celular. Debido a la diferencia entre el presente modelo experimental y el planteado
por Caro, este trabajo suma antecedentes acerca de que el aporte sostenido de
metionina es necesario para mantener el estado redox celular.
56
- La malnutrición proteica crónica modifica niveles de indicadores séricos
de daño hepático y la histología del hígado. Efecto hepatoprotector de
metionina.
Se investigó si la malnutrición proteica crónica altera los niveles séricos de
SGOT, SGPT, FA, glucosa, proteínas colesterol y ALB (Dasgupta y col., 2006), (Tabla
6).
El tratamiento SP-CD incrementó los niveles de SGOT, SGPT y FA. La
hipertransaminasemia acompañada de un incremento en FA indica daño hepático, y
posible neoplasia (Theal y Scott 1996; Giannini y col., 2005). Las transaminasas son
indispensables para el metabolismo de los aminoácidos y la síntesis de proteínas. Sus
niveles séricos altos, debidos a un aumento en la permeabilidad de la membrana del
hepatocito, se correlacionan con un deterioro de la síntesis de proteínas plasmáticas
(Giannini y col., 2005). En consistencia con esto, el tratamiento SP-CD disminuyó los
contenidos de ALB y proteínas totales plasmáticas. Cabe mencionar que, por su vida
media larga, la ALB es útil para determinar la falla hepática ocasionada por una
alteración crónica. De esta manera, las enfermedades crónicas con compromiso
nutricional pueden asociarse a hipoalbuminemia, por ejemplo neoplasias.
El nivel de glucosa en el suero de los ratones sometidos a malnutrición proteica
crónica fue superior al del control. En el hígado normal se mantienen estables los
niveles de glucemia mediante la captación y almacenamiento de glucosa como
glucógeno (glucogénesis), por su degradación a glucosa cuando es necesario
(glucogenólisis) y a través de la formación de glucosa a partir de otras fuentes, tales
como aminoácidos (gluconeogénesis). En base a estos antecedentes, podemos decir
que la falla hepática causada por el tratamiento SP-CD alcanza también al
metabolismo de la glucosa.
57
Diariamente, aproximadamente el 10% de la biosíntesis del colesterol se hace
en el hígado. El colesterol de la dieta se transporta desde el intestino delgado al
hígado dentro de los quilomicrones. El colesterol sintetizado por el hígado y el
incorporado por la dieta se transportan en el suero. Una vez utilizado, vuelve al hígado
para ser excretado en la bilis como colesterol libre o como sales de biliares. En base a
lo que sugieren los niveles de transaminasas altas, la dieta SP-CD aumentaría el
colesterol sérico debido a una probable falla en su excreción. Esto sucedería a pesar
de un déficit en las funciones de síntesis de la célula hepática.
Todos los parámetros medidos en suero de los ratones SP-CD fueron
analizados también en el tratamiento SP+Met-CD. En todos los casos, se observó una
recuperación de los parámetros cercano al valor normal. El único valor que
permaneció más alto que en el control fue el de la enzima FA, sugiriendo que aún
existe daño hepático. Por lo tanto, la presencia de metionina normalizaría en parte el
metabolismo hepático.
Para complementar este análisis, como se realiza cuando los valores séricos
están alterados, se analizó la histoarquitectura hepática. En primer lugar la
histoarquitectura de los ratones control fue clara y sin anormalidades (Fig. 6). En los
hígados de los ratones sometidos a SP-CD, se observó claramente la desorganización
de la histoarquitectura normal con presencia de células gigantes, una gran hiperemia y
hemorragia (Fig. 8,9).
Como se observó en la figura 8D y E, la malnutrición proteica crónica altera el
contenido de glucógeno hepático. Estos resultados acompañan a lo observado por
Sidransky y col (Sidransky y Baba 1960; Sidransky y Verney 1964; Sidransky y col.,
1969) quienes demostraron que una dieta carente de aminoácidos provoca un
aumento en el glucógeno hepático. También se detectaron gran cantidad de células
apoptóticas y zonas de necrosis hepática con infiltración linfocitaria. Estos datos
58
demuestran que la apoptosis surge en etapas tempranas de la falla o daño hepático en
ratón (Zang y col., 2000). Estos resultados se confirman con el aumento en los
marcadores clínicos de daño hepático (Dasgupta y col., 2006).
Cambios asociados con una alteración en la restricción de nutrientes incluyen
un incremento en los depósitos de grasa en el hígado (Blaas y col., 2010). Esto se
correlaciona con el aumento de las vesículas lipídicas observadas en los hígados de
los ratones SP-CD (Fig. 8C, E, F). Lo cual es esperado luego de una dieta carente de
proteínas y aminoácidos (Sidransky y Baba 1960; Sidransky y Verney 1964), dando el
efecto de lo que se denomina hígado graso.
Muchos factores nocivos pueden desencadenar el fenotipo alterado del hígado,
entre ellos podemos mencionar, desbalance en la homeostasis celular, incremento en
la apoptosis hepática y regulación negativa de genes que mantienen el funcionamiento
celular normal (Blaas y col., 2010). En este caso, la dieta SP-CD produce estos
cambios, permitiéndonos afirmar el efecto nocivo de la misma.
Teniendo en cuenta el daño demostrado hasta el momento por la malnutrición
proteica crónica, y que todos los cambios son reportados en el mismo sentido al
desarrollo de tumor, es que se decidió evaluar histoquímicamente la presencia de
focos preneoplásicos debido a que ellos permiten un diagnóstico temprano de
desarrollo tumoral. GSTP1 es sobreexpresada en etapas tempranas de transformación
celular maligna (Satoh y Hatayama 2002; Gaitanarou y col., 2008), generando un foco
positivo que, si no es eliminado por apoptosis puede desarrollar carcinoma celular. En
este estudio se pudo determinar que la malnutrición proteica crónica genera focos
GSTP1-positivos (Fig. 10). Estos resultados, también demuestran que en focos
preneoplásicos hepáticos, existe un incremento del almacenamiento del glucógeno,
gran actividad proliferativa y acumulación de lípidos (Evert y col., 2005).
59
La apoptosis es una vía fundamental que permite, de forma selectiva, a células
con el ADN dañado entrar en proceso de muerte. La inducción de la apoptosis de
células tumorales es un objetivo en la terapia del cáncer, y la detección de la misma en
el tejido tumoral se ha convertido en un parámetro de diagnostico importante. Una
anomalía en esta vía de muerte puede conducir a una proliferación celular
incontrolada, y desencadenar el desarrollo de la carcinogénesis (Khan y col., 2011).
Una manera de reconocer la apoptosis en cortes histológicos es mediante la detección
de cuerpos apoptóticos o mediante inmunohistoquímica contra alguna proteína
involucrada en la vía de transducción de señales.
Los resultados mostraron que en los animales tratados con SP-CD el número
de células caspasa-3-positivas incrementó significativamente (Fig. 9D, E),
demostrando de esta manera que las células dañadas están siendo eliminadas por
apoptosis impidiendo su curso y desarrollo en células tumorales.
Por otro lado, en los animales suplementados con metionina la
histoarquitectura fue normal en los cortes teñidos con H&E, no se detectó
desorganización en el glucógeno hepático y la morfología de los vasos sanguíneos fue
normal sin hiperemia o hemorragia (Fig. 11). Además no se observaron células GSTP1
ni caspasa-3-positivas (Fig.12). De esta manera se confirmó a nivel fenotípico
histológico el efecto protector del suplemento con metionina durante el período
aproteico en la malnutrición proteica crónica.
Capítulo II
“Efecto de la malnutrición proteica crónica en ausencia y
presencia de metionina sobre el desarrollo de carcinogénesis química en hígado de ratón.”
Introducción
61
Efecto de la malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de
metionina sobre el desarrollo de carcinogénesis química en hígado de ratón.
Varios autores demuestran que la malnutrición crónica acompañada de un
ayuno genera inhibición en el proceso de envejecimiento celular (Weindruch 1992;
Hikita y col., 1997), decrecimiento en la incidencia de neoplasmas espontáneos
(Weindruch 1992; Keenan y col., 1995), y un retraso y/o decrecimiento en la incidencia
de lesiones degenerativas. Cuando este tipo de malnutrición es acompañada por
periodos de realimentación con una dieta completa, se producen cambios en la
lipogénesis y gluconeogénesis (Saudek y Felig 1976) y, también, en el contenido de
glutatión (Godin y Wohaieb 1988). Además, se potencian algunas alteraciones
particulares de la restricción alimenticia asociadas con el crecimiento y división celular
del hígado (Laconi y col., 1995). Por otro lado, las dietas carentes en aminoácidos
esenciales causan alteraciones metabólicas que favorecerían la inducción de la HCC
química (Grasl-Kraupp y col., 1994; Kuo y col., 2003). Asimismo, durante el desarrollo
de HCC ocurren alteraciones en algunas proteínas a las que se consideró marcadores
de tumor como FAS, ACIII, GSTP1 y GAPDH entre otras (Tsuchida y Sato 1992; Kuo y
col., 2003; Evert y col., 2005).
La ingesta proteica es la fuente más importante de aminoácidos esenciales.
Entre ellos se encuentra metionina que, junto con cisteína, actúa como antioxidante
intracelular. Las especies reactivas del oxígeno (ROS) son generadas por diferentes
procesos metabólicos y su excesiva producción dentro de las células puede ser letal
(England y Cotter 2005) o desencadenar el desarrollo de enfermedades como el
cáncer (Mourao y col., 2009). Varios investigadores han demostrado que las ROS
pueden modificar directamente la vía de señalización de diversas proteínas en
respuesta a diferentes estímulos. Así, las modificaciones redox de las proteínas
pueden regular su función en respuesta al ambiente celular (England y Cotter 2005).
La vinculación entre la privación de fuentes de alimentos, como son las proteínas y la
62
mayor vulnerabilidad a padecer HCC, podría deberse a las alteraciones de los
contenidos y actividades de las enzimas que participan en el mantenimiento del estado
redox, afectando el proceso de desintoxicación y el balance energético del hígado.
Por otro lado, tal como se mencionó previamente, la apoptosis es un
mecanismo de muerte celular requerido para el normal desarrollo y mantenimiento de
la homeostasis hepática (Alvarez y col., 2006). Además, está involucrada en
condiciones patológicas hepáticas, incluyendo la regresión, injuria física y química,
hepatitis viral, y HCC (Fabregat y col., 2007). Algunas moléculas fisiológicas
proapoptóticas son reguladas negativamente o inactivadas en HCC, pero el balance
entre muerte y supervivencia es interrumpido debido a la activación de señales
antiapoptóticas (Fabregat y col., 2007). La apoptosis puede iniciarse por diferentes
señales provenientes del exterior o del interior de la célula, o por señales más
inespecíficas como daño en el ADN (Kanzler y Galle 2000). Existen dos vías a través
de la cual puede activarse: la vía tradicional, o dependiente de caspasa, donde la
caspasa 3 actúa como efectora en el hepatocito (Fabregat y col., 2007); y la vía
independiente de caspasa que involucra factores específicos mitocondriales tales
como el factor inductor de la apoptosis AIF (Ravagnan y col., 2002). Por otro lado,
contrarrestando este efecto, se encuentra la proteína inhibidora de apoptosis XIAP
(Fabregat y col., 2007). Varios investigadores han demostrado que cerca del 90% de
los tumores hepáticos sobreexpresan XIAP, junto con algunos factores de crecimiento
que median la supervivencia celular. En este contexto se encuentra activada la
proteína AKT, un factor involucrado en mediar las señales de supervivencia celular
(Fabregat 2009). El rol principal de esta proteína es resguardar la integridad celular.
Su activación se produce por fosforilación (pAKT), respondiendo como un estímulo
antiapoptótico a través del cual envía señales de supervivencia celular suprimiendo los
estímulos de muerte (Martindale y Holbrook 2002). Un aumento en la relación
pAKT/AKT indica su activación, ya que en ella se encuentran involucrados diversos
63
genes que le confieren la resistencia frente a los estímulos apoptóticos (Fabregat
2009). Su activación también se ha detectado frente a condiciones de estrés oxidativo,
aunque esta respuesta siempre es generada con el objetivo de mantener la
supervivencia celular frente a la injuria (Martindale y Holbrook 2002).
Se considera que cada uno de los sucesos en la secuencia de la
transformación celular no puede ser interpretado de manera aislada, ni en el tiempo ni
en el espacio. Todos ellos interactúan de manera compleja y con una cinética propia
para cada sistema, generando las condiciones de estimulación para el crecimiento
celular maligno. Por esto, es necesario interpretar el desarrollo desde el estadio
preneoplásico hasta la formación de tumor. Como se mencionó previamente, para el
desarrollo de tumores deben ocurrir tres sucesos bien marcados: iniciación, promoción
y progresión. Los efectos de iniciación y promoción pueden ser cuantificados (Moore y
Kitagawa 1986) por medio del análisis de las lesiones hepatocelulares. Estas lesiones
pueden ser divididas en tres categorías histopatológicas: focos preneoplásicos,
adenomas, y carcinomas hepatocelulares. Por definición sólo los adenomas y
carcinomas son denominados tumor. Cada foco preneoplásico es una lesión focal
proliferativa usualmente mucho menor que un lóbulo hepático. Esta fue originada por
un crecimiento clonal de un simple hepatocito inicializado. Los focos preneoplásicos
son potencialmente promovibles hacia adenomas hepatocelulares, siendo cada uno
más grandes que un lóbulo (Lee 2000). La detección inmunohistoquímica de GSTP1
es una herramienta particularmente útil para detectar el estadio de iniciación de las
lesiones (Moore y col., 1987).
La etapa de iniciación en el desarrollo del cáncer puede ser inducida en el
hígado de ratones por la administración de dietilnitrosamina (DEN) (Klaunig y col.,
1988; Lee 2000) un carcinógeno que produce etiolación y mutación en el ADN (Becker
y Shank 1985). Dosis necrogénicas de DEN originan necrosis hepática masiva seguida
de regeneración (Pitot y col., 1989) y causan no solamente el incremento en la
64
expresión de genes relacionados con la regeneración sino también el incremento en la
expresión de oncogenes relacionados con la mutación (Alvarez y col., 2002). Los
agentes promotores son aquellos que promueven la proliferación de las células
inicializadas sobre las no inicializadas en un tejido diana (Dragan y col., 1994), dando
lugar a un crecimiento significativo (Farber 1981). Estos agentes promotores pueden
ser agregados de manera complementaria al iniciador como es el caso del fenobarbital
(PB) (Solt y Farber 1976), o bien pueden ser agentes endógenos (Lee 1998), que
activados por diferentes tipos de estrés son capaces de generar un ambiente
promotor.
Basado en estudios previos sobre los efectos del carcinógeno DEN en modelos
de inducción in vivo en ratones (Klaunig y col., 1988; Bursch y col., 2005), junto con los
antecedentes de malnutrición proteica aguda obtenidos en nuestro laboratorio (Conde
y Scornik 1976; Conde 1979; Sanllorenti y col., 1992; Garcia-Mata y col., 1997; Ronchi
y col., 2004; Ronchi y col., 2010), se propuso en este trabajo avanzar en el
conocimiento de los factores que intervienen en la instauración de cambios
bioquímicos y estructurales relacionados con la iniciación de HCC en el hígado
de ratones sometidos a malnutrición proteica crónica. Para cumplir este objetivo
se diseñó un modelo en el cual se combinan los efectos de la malnutrición proteica
crónica y dos dosis de DEN en ratones hembras BALB/c. En este modelo in vivo de
inducción de HCC se analizaron propiedades biológicas, bioquímicas y morfológicas
del hígado de ratón.
Ciertos estudios han demostrado el efecto protector del aminoácido metionina
frente a la HCC en roedores (Rogers y col., 1974; Fullerton y col., 1990), indicando
que su adición a dietas deficientes en grupos dadores de metilos, protege la formación
de tumor en ratas iniciadas con DEN (Fullerton y col., 1990). En base a estos
antecedentes nos propusimos analizar el efecto del suplemento con metionina
en ratones bajo malnutrición proteica crónica e iniciados con DEN.
65
En base a lo antedicho, se dispusieron los siguientes objetivos en ratones
sometidos a malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de metionina e
iniciados con DEN:
Estimar el peso corporal y hepático.
Estimar el contenido de las enzimas hepáticas ACIII, FAS, GSTP1 y
GAPDH.
Evaluar el estado redox del hígado.
Estimar marcadores de daño hepático en el suero sanguíneo.
Evaluar la apoptosis en el hígado.
Evaluar la histología general y analizar la presencia de focos
preneoplásicos en el hígado.
Resultados
67
1- Estimación del peso corporal y hepático
La malnutrición calórica crónica experimental basada en períodos de privación -
realimentación provoca el desarrollo de neoplasias (Laconi y col., 1995; Hikita y col.,
1997; Tagliaferro y col., 1997; Hikita y col., 1999). En base a estos antecedentes y a
resultados obtenidos en el primer capítulo de esta tesis, se planeó analizar los efectos
de la malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de metionina sobre el
hígado de ratones iniciados con DEN.
Hembras BALB/c fueron sometidas a dos dosis intraperitoneales (IP) con DEN
(100 mg/Kg de peso corporal). La primera inyección se aplicó a los 35 días de edad
(aproximadamente 5 semanas), 1º IP. A los 60 días, cuando los ratones tuvieron 2
meses de edad se inició el tratamiento de malnutrición crónica. Junto con los
tratamientos, a los 80 días con el comienzo del último ciclo se aplicó una segunda
dosis IP de DEN (Fig. 1). Para poder analizar de forma adecuada el efecto de la
inyección y los tratamientos, se realizaron los correspondientes controles de inyección
con solución fisiológica.
Figura 1. Modelo experimental de ratones iniciados con DEN. Hembras BALB/c iniciadas con doble inyección de DEN (IP: 100 mg/Kg) a los 35 y 80 días de edad respectivamente.
Ciclos de privación proteica en ausencia y presencia de metionina - realimentación. □: dieta
SPi o SP+Meti; ■: dieta CDi.
68
En primer lugar se analizó el peso corporal y del hígado. El peso corporal se
determinó desde el comienzo del tratamiento de malnutrición hasta su culminación,
este disminuyó significativamente un 30% y 25% para SP-CDi y SP+Met-CDi
respectivamente (Fig. 2), mientras que el peso del hígado disminuyó un 10% para
SP+Met-CDi (Tabla 1).
Tabla 1. Peso corporal y del hígado de ratones inyectados con DEN y sometidos a malnutrición
proteica crónica en ausencia y presencia de metionina.
CDi SP-CDi SP+Met-CDi
Días Peso
corporal (g)
Peso
hepático (g)
Peso
corporal (g)
Peso
hepático (g)
Peso
corporal (g)
Peso
hepático (g)
1.03 ± 0.03
0.95 ± 0.05
0.88 ± 0.02
0 22.3 ± 1.2 21.8 ± 0.9 22.1 ± 1.1
5 22.4 ± 1.3 19.9 ± 1.1 19.1 ± 0.7
10 22.4 ± 1.1 20.0 ± 1.0 20.4 ± 1.0
15 23.2 ± 1.3 17.7 ± 0.8** 16.9 ± 0.7**
20 22.7 ± 1.3 18.6 ± 0.9* 16.7 ± 0.7**
25 23.2 ± 1.4 13.6 ± 0.7** 15.6 ± 0.7**
30 23.3 ± 1.6 16.7 ± 0.8** 16.5 ± 0.8**
Valores representando la media ± SEM de tres experimentos independientes, con n = 5 en cada uno.
Diferencias significativas con respecto a CD o CDi: * P<0.05, **P<0.01. (CD y CDi no presentaron
diferencias en ningún caso analizado)
Figura 2. Peso corporal.
Registro del peso corporal cada 5 días en hembras BALB/c inyectadas con DEN y sometidas a malnutrición proteica crónica con o sin el suplemento de metionina.
69
2- Estimación del contenido de las enzimas hepáticas ACIII, FAS, GSTP1 y
GAPDH.
Con el fin de analizar el efecto de la malnutrición proteica crónica y la iniciación
con DEN sobre las enzimas citosólicas hepáticas, se evalúo el contenido de ACIII y
GAPDH mediante la densitometría de bandas en geles SDS-PAGE 12% (Fig. 3) y de
FAS y GSTP1 mediante Western blot (Fig. 4). ACIII reveló una leve disminución de un
8%, en los animales SP-CDi respecto a CD, mientras FAS aumentó significativamente
un 60% respecto a CD y un 30% respecto a CDi. GSTP1 y GAPDH no revelaron
diferencias significativas en ningún tratamiento respecto a CD o CDi. El suplemento
del aminoácido metionina en los tratamientos nutricionales de los ratones iniciados con
DEN, evitó las modificaciones producidas por SP-CDi (Tabla 2, Fig. 3 y 4).
Figura 3. Análisis de proteínas citosólicas A) SDS-PAGE 12% representativo (25 µg de proteínas). A la izquierda se representa el marcador de peso molecular (kDa), las proteínas analizadas son señaladas a la derecha. B y C) Representación grafica de la densitometría relativa de las bandas respecto al control. Los valores representan las medias ± SEM de 3 experimentos independientes con n=6.
70
Tabla 2. Estimación de los contenidos relativos de las enzimas citosólicas separadas por SDS-
PAGE (Figs. 3 y 4).
Enzima CD CDi SP-CDi SP+Met-CDi
FAS 100 ± 6a 120 ± 15ab 157 ± 10b 111 ± 12ab
ACIII 100 ± 1 104 ± 3 93 ± 3 98 ± 5
GSTP1 100 ± 4 87 ± 2 93 ± 12 94 ± 6
GAPDH 100 ± 3 112 ± 2 111 ± 3 113 ± 5
Los datos se obtuvieron por análisis densitométrico a partir de bandas de SDS-PAGE 12%, para ACIII y
GAPDH. FAS y GSTP1 fueron estimados por Western blot. Todos los valores se expresan respecto al
100% del grupo control CD. Diferencias significativas analizadas por el test de ANOVA y tuckey. Letras
diferentes: P<0.05.
Figura 4. Western blot Western blot representativo del análisis de proteínas citosólicas de ratones inyectados con DEN (50 µg de proteínas). A) Figura y gráfica representativa de GSTP1; B) Figura y gráfica representativa de FAS. Los valores representan las medias ± SEM de 3 experimentos independientes con n=6. Diferencias significativas analizadas por el test de ANOVA y tuckey. Letras diferentes: P<0.05.
71
3- Evaluación del estado redox del hígado.
Teniendo en cuenta que ciertos aminoácidos junto a enzimas como SOD y CAT
actúan participando en las defensas antioxidantes (Bonatto y col., 2006), y en base a
los resultados presentados en el capítulo anterior, se evaluó el efecto de las dietas y la
inducción con DEN sobre el estado redox celular. De esta manera, se determinaron las
actividades de las enzimas SOD y CAT, y los niveles de carbonilación de las proteínas
como índices del estado redox.
En los animales CDi se observó que la actividad de SOD aumentó un 30%.
Por otro lado, la actividad CAT no se modificó y los niveles de carbonilación de las
proteínas aumentaron un 90% respecto al control CD (Tabla 3). Los animales
sometidos a los ciclos SP-CDi mostraron una disminución en la actividad de SOD de
un 80%, similar a lo reportado para SP-CD. La actividad de CAT y los niveles de
proteínas carboniladas de SP-CDi no mostraron diferencias significativas respecto a
CD (Tabla 3).
Los animales sometidos a los ciclos SP+Met-CDi no mostraron alteraciones en
ninguna de las propiedades analizadas.
Tabla 3. Actividades de SOD y CAT, y contenido de grupo carbonilo en
proteínas.
Condición
experimental
SOD
(U/ml citosol/mg
proteína)
CAT
(U/ml citosol/mg
proteína)
Carbonilo
(nmol /mg
proteína)
CD 1.3 ± 0.1a 8.1 ± 0.4 6.1 ± 0.7a
CDi 1.6 ± 0.2a 8.4 ± 0.9 11.8 ± 0.9b
SP-CDi 0.3 ± 0.2b 9.0 ± 1.2 5.9 ± 0.6a
SP+Met-CDi 1.4 ± 0.1a 9.9 ± 1.3 6.1 ± 0.9a
Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos independientes,
con n = 6 en cada uno. Diferencias significativas con respecto a CD: P<0.05.
72
4- Estimación de marcadores de daño hepático en el suero sanguíneo.
La funcionalidad hepática luego de la aplicación de las dietas en ratones
iniciados fue estudiada analizando diferentes enzimas del suero: glutámico oxalacético
transaminasa (SGOT), glutámico pirúvico transaminasa (SGPT), fosfatasa alcalina
(FA), proteínas totales, colesterol y albúmina (ALB). La Tabla 4 muestra que los
ratones sometidos a SP-CDi, alteraron significativamente todos los parámetros
medidos excepto SGPT, glucosa y ALB. Por otra parte, excepto para FA, los valores
exhibidos por los ratones sometidos a la condición SP+Met-CDi resultaron similares a
CD y CDi.
5- Evaluación de la apoptosis en el hígado.
En situaciones patológicas el balance entre la proliferación celular y la muerte
se encuentran alterados. Una apoptosis insuficiente se ha relacionado con la
progresión de tumor hepático mientras que una apoptosis excesiva desarrolla injurias
agudas pudiendo desencadenar hepatitis fulminante (Guicciardi y Gores 2005;
Fabregat y col., 2007). Con el objetivo de estudiar la apoptosis celular en el modelo
experimental planteado se analizó por Western blot caspasa 3 en la fracción citosólica,
Tabla 4. Análisis del suero sanguíneo de ratones iniciados con DEN y sometidos a malnutrición proteica crónica en
ausencia y presencia de metionina.
Condición
experimental
SGOT
(U/l)
SGPT
(U/l)
FA
(U/l)
Glucosa
(mg/dl)
Proteínas
(g/dl)
Colesterol
(mg/dl)
ALB
(g/dl)
CD 397 ± 30a 88 ± 10 79 ± 20a 141 ± 7 6.3 ± 0.1a 113 ± 3a 3.4 ± 0.1 CDi 447 ± 21a 111 ± 18 169 ± 6b 131 ± 6 6.3 ± 0.2a 112 ± 4a 3.5 ± 0.1 SP-CDi 561 ± 33b 87 ± 19 161 ± 4b 136 ± 5 7.5 ± 0.5b 141 ± 6b 3.3 ± 0.1 SP+Met-CDi 447 ± 36a 119 ± 15 185 ± 7c 131 ± 7 6.3 ± 0.2a 134 ± 9ab 3.4 ± 0.1
Los valores representan la media ± SEM de dos experimentos independientes (n = 4). Diferencias significativas con respecto a
CD y CDi. Diferencias significativas analizadas por el test de ANOVA y tuckey. Letras diferentes: P<0.05.
73
así como también AIF (como parámetro de apoptosis independiente de caspasa) y
XIAP (proteína inhibidora de apoptosis) en la fracción mitocondrial. En el desarrollo
tumoral se encuentra la apoptosis inhibida y la supervivencia celular activada
(Martindale y Holbrook 2002). Para este caso y con el objetivo de complementar este
estudio se analizó la relación pAKT/AKT como parámetro indicador de supervivencia.
El análisis de caspasa 3 reveló un incremento significativo del 40% en los
animales SP-CD, tanto en contenido como en actividad. Los animales sometidos a
SP+Met-CD mostraron una leve disminución del 10% en la relación caspasa
3/procaspasa y del 40% en la actividad del fragmento activo. En los animales
inyectados no se pudo determinar el análisis por Western blot del fragmento activo de
caspasa 3, por lo que se analizó la disminución de la procaspasa. A partir de este
resultado se determinó que los animales inyectados no mostraron diferencias en el
fragmento activo de la enzima en ningún tratamiento, mientras que en el análisis de
actividad se reportó una disminución del 10%, 35% y 50% en CDi, SP-CDi y SP+Met-
CDi respectivamente (Fig. 5).
74
Figura 5. Análisis de caspasa 3
Western blot representativo del análisis de proteínas citosólicas de ratones inyectados con DEN (50 µg de proteínas). A) caspasa 3 / procaspasa 3. B) procaspasa 3 / actina. C) Actividad de caspasa 3 estimada por la ruptura del sustrato fluorogénico Ac-DEVD-AFC medida en Fluoroskan Ascent FL 100-240 V (Thermo electron, Finland), excitación 405 - emisión 525 nm. Los valores representan las medias ± SEM de 3 experimentos independientes con n=6. Diferencias significativas analizadas por el test de ANOVA y tuckey. Letras diferentes: P<0.05.
75
Por otro lado, XIAP, mostró una disminución del 20% y 10% para SP-CD y
SP+Met-CD respectivamente con respecto a CD. En los animales iniciados con DEN,
los niveles de XIAP mostraron una disminución del 28% para SP-CDi y un aumento del
20% y 30% aproximadamente para CDi y SP+Met-CDi , respectivamente (Fig. 6, Tabla
5).
Figura 6. Análisis por Western blot de los niveles de XIAP. 50 µg de proteínas citosólicas
fueron separadas mediante SDS-PAGE 12% y transferidas a membranas de nitrocelulosa para
luego ser analizadas por Western blot utilizando un anticuerpo anti-XIAP. Actina fue utilizada
como control de carga. Figura representativa de n=5.
Tabla 5. Cuantificación relativa de las bandas de XIAP reveladas por Western blot..
CD SP-CD SP+Met-CD CDi SP-CDi SP+Met-CDi
XIAP 100 ± 1a 80 ± 5b 89 ± 3a 120 ± 10b 72 ± 3b 130 ± 10b
Valores representando la media ± SEM de cinco experimentos independientes (n = 5). Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos, P<0.05.
Las densitometrías relativas de las bandas de AIF demostraron que en SP-CD
el valor disminuyó significativamente un 35%, mientras que en SP+Met-CD se
mantuvo semejante al control. Por otro lado, en CDi también se registró una
76
disminución significativa del 30%, mientras que en SP-CDi y SP+Met-CDi los valores
se mantuvieron semejantes respecto a CD (Fig. 7. Tabla 6).
Figura 7. Análisis por Western blot de los niveles AIF. 50 µg de proteínas provenientes de
fracciones mitocondriales fueron separadas en SDS-PAGE 12% y transferidas a membranas de
nitrocelulosa para luego ser analizadas por Western blot utilizando como anticuerpo anti-AIF.
Figura representativa n=5.
Tabla 6. Cuantificación densitométrica a de las bandas de AIF reveladas por Western blot.
CD SP-CD SP+Met-CD CDi SP-CDi SP+Met-CDi
AIF 100 ± 3a 65 ± 16b 89 ± 15a 70 ± 7b 88 ± 9a 85 ± 12a
Valores representando la media ± SEM de cinco experimentos independientes (n = 5). Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos, P<0.05.
Con el objetivo de determinar un parámetro de supervivencia celular, se
realizaron ensayos de Western blot de las proteínas pAKT/AKT, donde un aumento de
la relación implica una posible activación de la vía de supervivencia celular. En los
animales sometidos a los ciclos SP-CD se determinó un incremento del 50% en la
relación pAKT/AKT respecto a CD, mientras que el suplemento con metionina evitó
este efecto con valores semejante a CD. En todos los animales iniciados con DEN, la
77
relación pAKT/AKT se encontró incrementada aproximadamente un 60% más que en
CD. No se observaron diferencias entre CDi, SP-CDi y SP+Met-CDi (Fig. 8, Tabla 7).
Figura 8. Western blot pAKT, AKT. 50 µg de proteínas citosólicas fueron separados mediante
SDS-PAGE 12% y transferidas a membranas de nitrocelulosa para luego ser analizadas por Western blot utilizando anticuerpos específicos anti-AKT y anti-pAKT. Figura representativa de n=5.
Tabla 7. Relación pAKT/AKT a partir de la cuantificación densitométrica de las bandas obtenidas por Western
blot.
CD SP-CD SP+Met-CD CDi SP-CDi SP+Met-CDi
pAKT/AKT 100 ± 1a 155 ± 6b 98 ± 9a 175 ± 32b 167 ± 34b 168 ± 45b
Valores representando la media ± SEM de cinco experimentos independientes (n = 5). Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos, P<0.05.
6- Evaluación histológica general y búsqueda de focos preneoplásicos en el
hígado
Varios investigadores analizaron el efecto de fasting/refeeding sobre la
incidencia de HCC inducida químicamente en ratas (Laconi y col., 1995; Tomasi y col.,
1999) y en diferentes cepas de ratones (Klaunig y col., 1988; Lee y col., 1989; Lee
2000). También, el fasting/refeeding afecta la histoarquitectura hepática y favorece la
78
formación de focos preneoplásicos. En este estudio se planteó evaluar el efecto sobre
la histología hepática y la formación de focos preneoplásicos en animales inducidos
químicamente con DEN tratados con una dieta crónica sin proteínas ni aminoácidos en
ausencia y presencia de el suplemento de metionina.
6.1- Contenido de GSTP1.
Durante el desarrollo de nódulos precancerosos inducidos químicamente, se
encuentra sobre-expresada la enzima glutatión-S-transferasa P1. La función de
GSTP1 en estos nódulos es aún desconocida, aunque se sabe que esta enzima se
encarga de la detoxificación celular de compuestos electrofílicos y carcinógenos lo
cual podría indicar un rol crucial en el mecanismo de resistencia a
hepatocarcinogénesis (Hikita y col., 1997). Junto con esto y sabiendo que GSTP1 es
utilizado como marcador tumoral (Moore y col., 1987 a; Moore y col., 1987 b; Ookawa
y col., 1998) se realizó el análisis por Northern blot para evaluar el efecto de los
tratamientos sobre los niveles de GSTP1. Este análisis reveló un incremento
significativo del 40% en CDi y del 70% en SP-CDi respecto a CD (Fig. 9.).
Figura 9. Northern blot GSTP1.
Al finalizar cada tratamiento el ARN del hígado se aisló y se analizó por Northern blot. A) Figura representativa de Northern blot. B) Análisis densitométrico de las bandas por el software ImageQuant. Letras distintas indican diferencias significativas entre los
tratamientos, P<0.01
A B
CD
SP-C
D
SP+M
et-C
DCDi
SP-C
Di
50
100
150
a
Den
sid
ad
rela
tiva (
%)
b
c
bd
d
A B
79
Conocidos los niveles de transcriptos de GSTP1, se realizaron ensayos de
Western blot en citosoles hepáticos. Los datos obtenidos no mostraron diferencias
significativas en ningún tratamiento (Fig. 10). Debido a que se detectaron variaciones
en los niveles de expresión de GSTP1 en los tratamientos SP-CD con o sin DEN, se
decidió la búsqueda de focos preneoplásicos en el tejido.
6.2- Análisis histohepático de ratones iniciados con DEN y sometidos a
malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de metionina.
Con el objetivo de describir la histología hepática en los animales iniciados con
DEN, se comenzó por la descripción del control iniciado (CDi). Además en este texto
se hará referencia al corte histológico de los animales control (CD) cuya descripción se
realizó en el capítulo anterior.
En los cortes teñidos con H&E de CDi, se observó una histoarquitectura
hepática normal. Los hepatocitos presentaron una morfología poliédrica con la
presencia de pequeñas vacuolas microvesiculares características al igual que en CD
Figura 10. Western blot GSTP1.
50 µg de proteínas citosólicas fueron separadas en SDS-PAGE 12% y transferidas a membranas de nitrocelulosa para luego ser analizadas por Western blot utilizando un anticuerpo contra GSTP1. Figura representativa de n=6.
80
(Fig. 11A-B). La tinción de PAS reveló un gradiente periportal de glucógeno normal
(Fig. 11C-D). Los cortes teñidos con tricrómico de Masson evidenciaron un lobulillo
hepático característico con paredes vasculares normales sin hiperemia ni hemorragia
(Fig. 11E).
En al análisis de células apoptóticas se pudieron evidenciar escasas células
caspasa-3-positivas en la zona 2 del acino, resultado no significativo con respecto a
CD (Fig. 12A-B). De la misma manera, en la inmunohistoquímica utilizando el
anticuerpo anti-GSTP1, se encontraron algunas células aisladas GSTP1-positivas. No
se evidenciaron focos ni acúmulos celulares positivos para este marcador (Fig. 12E-F).
No se observaron diferencias con respecto a la cantidad de células binucleadas (Tabla
5).
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82
83
Los cortes histológicos de los ratones tratados con SP-CDi teñidos con H&E
presentaron un desarreglo importante de la histoarquitectura normal, en la cual no se
detectó una organización cordonal radial de los hepatocitos (Fig. 13A-C). Este
desarreglo se mostró desde la zona 3 hacia la zona 1 del acino, de la misma manera a
lo reportado para SP-CD. También se detectaron células gigantes (células bizarras)
con núcleos pleomórficos de gran tamaño, junto con esto se observaron sincitios
(células polinucleadas) y un gran número de células binucleadas dispuestas por todo
el parénquima, pero en mayor frecuencia en la zona 3, cercanas a la vena central (Fig.
13). Además, se distinguieron áreas eosinófilas desestructuradas o de necrosis
temprana, detectándose focos de infiltración linfocitaria en la zona 2 del acino (Fig.
13D). Se detectó una lipoidosis escasa o nula.
En los cortes SP-CDi teñidos con PAS se observó un desarreglo de la
organización periportal del glucógeno, determinándose una distribución heterogénea
del mismo (Fig. 14A-B).
La tinción con tricrómico de Masson permitió observar, al igual que en SP-CD
un aumento en la pared vascular donde la fibrosis (tinción azul) infiltró los sinusoides
rodeando la vena central. Se observó la presencia de células hemorrágicas, en la cual
los glóbulos rojos ocuparon el citoplasma celular. Además, se destacó un aumento de
la hiperemia por congestión vascular. Se observó un aumento del torrente sanguíneo
dentro de los vasos y de los sinusoides (Fig. 14C-F).
84
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86
La inmunohistoquímica anti-caspasa 3 reveló una disminución significativa en
la cantidad de células caspasa-3-positivas, aunque se encontraron algunas pocas
distribuidas en la zona 2 del parénquima (Fig. 15). Sin embargo cuando se tiñeron los
cortes con anticuerpo anti-GSTP1 se revelaron células GSTP1-positivas
intralobulillares en gran cantidad, encontrando algunas formando focos cercanas a la
zona 1 del acino. Se observó una mayor coloración del parénquima hepático respecto
al tratamiento SP-CD, lo cual permitió visualizar áreas mayores con diferentes
intensidades (Fig. 16).
87
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89
El suplemento con metionina en animales malnutridos iniciados con DEN,
permitió observar en los cortes de hígados teñidos con H&E una arquitectura
trabecular conservada (Fig. 17A-C). A pesar de que los hepatocitos presentaron una
morfología poliédrica normal, no se distinguió la presencia de microvesículas lipídicas
intracelulares. Se detectaron zonas eosinófilas, indicando posibles centros de
necrosis, principalmente distribuidas en la zona 2 del acino (Fig. 17C). Se observó una
distribución heterogénea del glucógeno en los cortes teñidos con PAS detectándose
células heterogéneas en la intensidad PAS-positiva (Fig. 17D-E).
Con respecto a la tinción con tricrómico de Masson se reveló un aspecto
vascular normal, con hiperemia moderada y sin hemorragia (Fig. 17F).
El análisis inmunohistoquímico, tanto para caspasa-3 como para GSTP1, no
reveló diferencias respecto al grupo CD, mostrando en ambos casos células positivas
aisladas en el parénquima hepático (Fig. 18). También, se determinó un alto
porcentaje de células binucleadas indicando una posible recuperación metabólica.
Tabla 8: Estimación semicuantitativa de células positivas para caspasa-3 y GSTP1, y binucleadas.
Condición experimental
Células caspasa-3-
positivas Células GSTP1-positivas Células binucleadas
CDi + + +
SP-CDi + +++ ++++
SP+Met-CDi + + +++++
Valores cualitativos expresados en cantidad de (+), obtenido a partir de la cuantificación relativa de un
número representativo de fotos analizadas.
90
91
Discusión
93
Efecto de la malnutrición proteica crónica en ausencia y presencia de
metionina sobre el desarrollo de carcinogénesis química en hígado de ratón.
En el capítulo anterior quedó demostrado que la malnutrición proteica crónica
produce alteraciones fisiológicas, bioquímicas, y estructurales componiendo un daño
hepático. Varias de estas alteraciones son originadas en el mismo sentido a aquellas
descriptas en procesos pre o neoplásicos. Para que una neoplasia se desarrolle deben
producirse tres pasos bien definidos: (1) iniciación, (2) promoción y (3) progresión
(Hikita y col., 1999). En animales iniciados únicamente, el desarrollo tumoral sólo se
puede observar a largo plazo (Lee 2000). En periodos relativamente cortos, se
necesita la presencia de un promotor tumoral para que las células iniciadas sean
capaces de proliferar evadiendo la capacidad auto correctiva endógena del animal
(Pitot 2001).
Por otra parte, en nuestro modelo de ciclos de privación proteica
realimentación, sugerimos que los daños irreversibles originados durante el periodo de
privación proteica permanecen y proliferan durante el periodo de realimentación,
simulando un efecto promotor. Considerando los resultados logrados, se propuso
evaluar la acción de la malnutrición proteica crónica sobre el hígado de ratones
iniciados con el agente químico DEN. Además, teniendo en cuenta el efecto
hepatoprotector comprobado de metionina, se planteó evaluar su eficacia en ratones
inyectados con DEN.
- La inyección con DEN no modifica el efecto de la malnutrición proteica
crónica y el suplemento con metionina, sobre el peso hepático y corporal en
ratones hembra BALB/c.
El estudio se realizó en ratones BALB/c debido a que esta cepa no desarrolla
tumor hepático espontáneo en contraste con otras cepas susceptibles como las C3H
94
(Lee y col., 1989). Además es resistente al desarrollo de tumor inducido por DEN en
cortos períodos de tiempo, sin el efecto de un agente promotor (Klaunig y col., 1988).
Esto antecedentes nos permiten observar los pequeños cambios preneoplásicos
producidos por la dieta SP.
En lo concerniente al peso corporal y del hígado, la respuesta a SP-CDi y
SP+Met-CDi fue equivalente a la mostrada frente a los tratamientos SP-CD y SP+Met-
CD. Específicamente, consistió en una disminución significativa en el peso corporal,
sin variación en el peso del hígado. La disminución del peso corporal causada por
todos los tratamientos de malnutrición se puede explicar, una vez más, por la
adaptación a la baja ingesta proteica. La capacidad de mantener el balance de
nitrógeno es, probablemente, el ejemplo más claro de la adaptación nutricional. El
organismo tiene que mantener constante la masa proteica total, economizando
nitrógeno y reduciendo la masa corporal (Waterlow 1986). Por lo tanto, si la ingesta de
proteínas es inadecuada, es indefectible que exista una disminución en el peso
corporal. Sumado a esto, el comportamiento en el peso corporal similar al grupo sin
iniciar indica que la inducción con DEN no afecta a los ratones tratados, al menos en
el periodo estudiado. Por lo tanto, este modelo, nos permite observar los efectos
ejercidos por la dieta sobre las células iniciadas. Respecto al peso hepático, podemos
deducir que los últimos 5 días de dieta completa son suficientes para mantenerlo
estable.
- La malnutrición proteica crónica y la inyección de DEN alteran los
niveles de ciertas enzimas hepáticas en ratones BALB/c. El suplemento con
metionina atenúa estos efectos.
Durante el desarrollo de HCC, ciertas enzimas se modifican siendo
consideradas marcadoras de tumor. Entre estas proteínas podemos mencionar a FAS,
ACIII, GAPDH y GSTP1 (Tsuchida y Sato 1992; Kuo y col., 2003; Evert y col., 2005).
95
Apoyándonos en estos antecedentes, se decidió evaluar el nivel proteico de las
mismas en los ratones iniciados con DEN sometidos a malnutrición proteica crónica
con y sin el suplemento de metionina.
El análisis de ACIII, GAPDH y GSTP1 no reveló diferencias significativas en los
niveles proteicos en ningún tratamiento sujeto a la iniciación con DEN. Sin embargo, el
nivel de FAS, aumentó 60% en SP-CDi respecto a CD y 30% respecto a CDi, pero no
presentó diferencias en los animales SP+Met-CDi.
FAS es una proteína que se encuentra sobreexpresada debido a la presencia
de focos preneoplásicos en HCC inducido químicamente (Evert y col., 2005). Por lo
tanto, es de esperar que la expresión de esta enzima aumente en ratones inyectados
con DEN. El suplemento con metionina también pudo evitar la sobreexpresión de FAS
generada por la malnutrición proteica crónica en ratones iniciados, manteniendo los
niveles similares al control.
Se ha comprobado que el pH extracelular es más ácido en tumores sólidos que
en tejidos normales. Sin embargo, el pH intracelular se mantiene neutro (7.1 - 7.2) en
células tumorales de humanos y animales. Esto indica que las células de los tumores
sólidos mantienen su pH intracelular en un nivel fisiológico reduciendo el pH
extracelular (Webb y col., 1999). Para establecer el gradiente de pH entre el espacio
extracelular y el intracelular, las células tumorales expresan proteínas de transportes
de iones, incluyendo ATPasas, intercambiadores Cl¯/HCO3¯, intercambiadores
Na+/H+, y en muchos casos expresan las anhidrasas carbónicas (AC) que catalizan la
reacción reversible H2O + CO2 ↔ H+ + HCO3¯ (Tashian 1989). Aunque se ha
propuesto que las AC disminuyen durante el desarrollo de HCC (Kuo y col., 2003), no
es claro su comportamiento en preneoplasias. Por esta razón podríamos suponer que
la preservación del contenido de ACIII luego del tratamiento SP-CDi se debe a que
aún participa en la acidificación del medio extracelular generando un ambiente óptimo
96
para que las células inicializadas prosperen. Para afirmar o refutar esta hipótesis
deberíamos completar el estudio determinando la actividad de esta enzima. Por otro
lado, tampoco se observó una variación en el contenido de ACIII en SP+Met-CDi. La
misma puede atribuirse a un comportamiento similar al control.
GAPDH y GSTP1 no revelaron diferencias en SP-CDi respecto a CDi,
comportándose similarmente a lo observado en los tratamientos de los animales sin
iniciar. Teniendo en cuenta que bajo 5 días de restricción proteica los niveles de estas
enzimas se modifican (Sanllorenti y col., 1992; Garcia-Mata y col., 1997; Garcia-Mata y
col., 1998; Ronchi y col., 2004), una vez más, podríamos suponer que los 5 días de
dieta completa al finalizar cada ciclo de nuestro modelo de malnutrición crónica son
suficientes para restablecer sus niveles normales tanto en los animales con o sin DEN.
- La iniciación con DEN altera las enzimas relacionadas con el
mantenimiento redox celular. El estrés oxidativo está directamente relacionado
con el daño hepático. Metionina ejerce un efecto hepatoprotector.
Existen varias evidencias que apoyan que la mayoría de los daños
ocasionados por químicos/carcinógenos/mutágenos, incluyendo la generación del
daño al ADN, se producen mediante la generación de radicales libres derivados del
oxígeno, los cuales son mediadores en la producción del estrés oxidativo (Dasgupta y
col., 2006). También se ha reportado que dentro del cuerpo se encuentra un sistema
antioxidante de defensa involucrando enzimas como SOD, CAT y peroxidasas.
En el hígado de ratones alimentados con SP-CDi se detectó una disminución
significativa en la actividad de la proteína SOD, involucrada en la remoción de ROS.
Pero no se detectaron alteraciones en los niveles de actividad de CAT, o en las
proteínas carboniladas. Existen diversos compuestos cancerígenos, como la arecolina,
que inducen estrés oxidativo en el hígado decreciendo los niveles de proteínas
97
oxidadas e incrementando los niveles de malondialdehído o de las sustancias
reactivas con el ácido tiobarbitúrico (Dasgupta y col., 2006). En nuestro caso también
podemos sugerir que la disminución de SOD podría aumentar la peroxidación de
lípidos al permitir un mayor nivel de radicales ˙OH.
Teniendo en cuenta que la producción de estrés oxidativo está directamente
vinculada con el desarrollo de daño hepático, se analizaron indicadores del suero
sanguíneo.
En los ratones SP-CDi se observó un incremento significativo de SGOT y FA,
enzimas que aumentan en hepatotoxicidad (Dasgupta y col., 2006). Este resultado,
junto con el incremento en las proteínas totales de suero y de colesterol, nos permite
asociar el tratamiento nutricional a una falla en la excreción biliar (Giannini y col.,
2005). Los niveles de SGPT, glucosa y ALB no resultaron diferentes de los hallados en
CD o CDi. Esto no descarta un daño hepático. Por ejemplo, SGOT es una enzima que
no se encuentra vinculada estrictamente al hígado, ya que también actúa en músculo y
corazón (Giannini y col., 2005).
Los ratones controles iniciados (CDi) no mostraron alterados los contenidos de
las enzimas SOD y CAT. A pesar de esto, exhibieron niveles elevados de proteínas
carboniladas, indicando un estrés oxidativo ocasionado por la inyección de DEN. El
mismo se debería a un desbalance entre la producción de ROS y el sistema de
protección ROS. Por lo tanto, en SP-CDi se generaría un estrés oxidativo potenciado
afectando a la peroxidación de lípidos y carbonilación de las proteínas. En presencia
de metionina, la malnutrición crónica en animales iniciados no alteró los niveles de
SOD y CAT ni los de SGOT y FA. Por lo tanto, este aminoácido participa en un
sistema antioxidante.
98
- La malnutrición proteica crónica produce apoptosis celular hepática.
DEN la modifica. Metionina detiene esos cambios.
Al incrementarse los niveles de ROS, produciendo un estrés oxidativo celular,
pueden desencadenarse respuestas como necrosis o inducirse la muerte celular
programada, también denominada apoptosis (Ueda y col., 2002). Apoyándonos en
estos antecedentes y en todos los resultados presentados hasta el momento, el
objetivo fue estudiar en primera aproximación cómo se ve afectado el mecanismo de
apoptosis en los animales iniciados con DEN y sometidos a la malnutrición proteica
crónica absoluta o con el agregado de metionina.
Según se describió en la introducción, los principales mediadores de la
apoptosis son las caspasas (Cryns y Yuan 1998) siendo en el hígado la caspasa 3, la
efectora (Benedetti y Marucci 1999). Además existen moléculas que controlan la
actividad de caspasas como son las proteínas de la familia de inhibidoras de apoptosis
IAP (Holcik y col., 2001; Holcik y Korneluk 2001), entre las cuales se encuentra XIAP
como supresor principal. Por otro lado, AIF (factor inductor de la apoptosis) es una
proteína localizada en el espacio intermembrana de la mitocondria que transloca al
núcleo induciendo la fragmentación de grandes fragmentos de ADN ocasionando una
apoptosis independiente de caspasa (Daugas y col., 2000).
En este estudio se demostró que SP-CD incrementa caspasa 3, tanto en
contenido como en actividad (Fig. 5). Complementando este resultado, se reportó una
disminución en los niveles de XIAP (Fig. 6). Este comportamiento de XIAP junto al de
caspasa 3 sugiere la activación de una apoptosis dependiente de caspasa ocasionada
por la malnutrición proteica crónica (Resch y col., 2008). Además, en SP-CD, AIF
presentó una disminución del 35% sugiriendo una posible translocación al núcleo la
cual podría desencadenar una apoptosis independiente de caspasa (Fig. 6). Por otro
lado, la proteína AIF también es indicadora de integridad mitocondrial, y su
99
disminución está relacionada con un aumento en el estrés oxidativo (Klein y col., 2002;
Lipton y Bossy-Wetzel 2002).
Al no exhibir un aumento de caspasa 3 (Fig. 5), los animales sometidos a
malnutrición proteica crónica iniciados con DEN no experimentan apoptosis
dependiente de caspasa. Esto sucede a pesar de que los niveles de XIAP
disminuyeron con respecto a CD y a CDi (Fig. 6). Por otro lado, los valores de AIF
disminuyeron, sugiriendo la activación de una apoptosis independiente de caspasa
(Fig. 7). Para confirmar este resultado, se deberían analizar los niveles de AIF en
núcleo. Como se mencionó anteriormente, una disminución mitocondrial de AIF indica
un daño en la membrana mitocondrial con un subsecuente aumento en los niveles de
ROS y apoptosis independiente de caspasa (Klein y col., 2002). Por otro lado, también
ha sido reportado que una regulación negativa de XIAP incrementa los niveles de ROS
(Resch y col., 2008). Ambos resultados apoyarían la hipótesis que la malnutrición
proteica crónica en los ratones iniciados con DEN produciría daño oxidativo. A pesar
de no observarse un aumento en los niveles de proteínas carboniladas, deberíamos
analizar otros parámetros tales como los niveles de TBARS.
Cuando los ratones sometidos a malnutrición proteica crónica fueron
suplementados con metionina, SP+Met-CD, los niveles y actividad de caspasa 3
disminuyeron respecto al control (Fig. 5), mientras que los niveles de XIAP no
resultaron alterados (Fig. 6). Por otro lado los niveles de AIF fueron similares al control
(Fig. 7), indicando que tampoco se encontraría activa una apoptosis independiente de
caspasa.
En los ratones iniciados con DEN y sometidos a malnutrición proteica crónica
en presencia de metionina (SP+Met-CDi), la apoptosis vía caspasa dependiente no se
encontraría activada correlacionándose con el aumento de los niveles de XIAP (Fig. 5
100
y 6). Además tampoco se encontraría activa la apoptosis independiente de caspasa ya
que los valores de AIF no cambian significativamente respecto al control (Fig. 7).
Con el objetivo de analizar la vía de supervivencia celular se decidió evaluar en
todos los tratamientos la relación entre las proteína citosólica pAKT/AKT (Fig. 8).
La expresión y/o activación de pAKT/AKT se encuentra incrementada en
muchos hepatocarcinomas celulares, confiriendo resistencia al estímulo apoptótico
(Fabregat 2009). En los animales SP-CD, la relación pAKT/AKT se encontró
aumentada respecto a CD, la cual se restablece con el suplemento de metionina. En
todos los animales iniciados con DEN, pAKT/AKT se encuentra un 60% mayor que en
CD, sin establecer diferencias entre sí. Esto indicaría que la iniciación con DEN ejerce
un efecto potenciador sobre la proliferación celular y, junto con una disminución de la
apoptosis, puede desencadenar un aumento en la proliferación celular llevando a un
posible desarrollo tumoral.
A partir de estos resultados se concluyó que en los animales sometidos a los
ciclos SP-CD, la apoptosis dependiente e independiente de caspasa se encuentra
activa, pero que a su vez también estaría activa la vía de supervivencia celular. Los
animales sometidos a SP+Met-CD no tendrían activa la apoptosis dependiente e
independiente de caspasa ni la vía de supervivencia relacionada con las proteínas
AKT. En SP-CDi y SP+Met-CDi no se encuentra activa la vía de apoptosis
dependiente ni independiente de caspasa. En general podríamos inferir que el hígado
de los ratones SP-CD trata de balancear la homeostasis celular entre la muerte y la
supervivencia. En SP-CDi, la apoptosis dependiente e independiente de caspasa no
está activa, mientras que la supervivencia celular si lo está. Estas condiciones
favorecerían el desarrollo tumoral.
101
- La malnutrición proteica crónica en ratones iniciados con DEN produce
daño hepático y la formación de focos preneoplásicos. Metionina ejerce un
efecto hepatoprotector.
La restricción alimentaria elimina las lesiones preneoplasicas (Grasl-Kraupp y
col., 1994), pero el periodo de ayuno seguido de realimentación causa un acelerado
crecimiento de los focos preneoplásicos (Hikita y col., 1998; Hikita y col., 1999). En
este análisis planteamos que ratones iniciados con DEN seguidos de ciclos de
privación proteica-realimentación generan focos preneoplásicos, desencadenando a
largo plazo HCC. El suplemento con metionina evitaría la iniciación de las células,
debido a que el medioambiente celular generado con el suplemento de este
aminoácido es más apto para defenderse frente a la acción de la privación proteica
crónica y del DEN.
Para analizar el daño hepático ocasionado y el posible desarrollo de focos
preneoplásicos en ratones sometidos a malnutrición proteica crónica con y sin el
suplemento de metionina e iniciados con DEN se realizaron exámenes
histopatológicos. También se analizó y discutió si la aplicación de ciclos de
malnutrición proteica de manera “restricción/realimentación” puede simular un efecto
promotor de HCC.
El estado de promoción puede ser rápidamente definido en modelos
experimentales en ratones, especialmente en los multiestados del desarrollo de la
hepatocarcinogénesis. Considerando muchos agentes endógenos como hormonas
sexuales, hormonas tróficas entro otros (Pitot 2001), el efecto de estos promotores
endógenos contribuyen al desarrollo de la hepatocarcinogénesis inducidas o
espontáneas (Hikita y col., 1999). La administración de una sola o unas pocas dosis de
carcinógenos necrogénicos que inducen neoplasia ha llevado a algunos a la
conclusión de que, o bien la etapa de promoción tumoral no existe o los agentes
102
promotores tienen efectos relativamente pequeños en estas circunstancias (Bannasch
y Zerban 1986).
En primer lugar se evaluaron los ratones iniciados control, los cuales fueron
alimentados todo el tratamiento con dieta control (CDi). Estos mostraron una
histoarquitectura normal, con una distribución de glucógeno homogénea, sin
hemorragia ni hiperemia (Fig. 11). Este análisis mostró que la inyección de DEN por sí
misma no produjo un daño hepático visible a nivel histológico. A partir de este
resultado podemos concluir que todos los efectos observados en los subsecuentes
tratamientos son ejercidos por un efecto de la malnutrición proteica crónica con y sin
metionina sobre ratones iniciados con DEN.
Los resultados demostraron que el tratamiento SP-CDi afectó la
histoarquitectura hepática normal, detectándose células gigantes con núcleos
pleomórficos. Además se observaron células multinucleadas y áreas de necrosis
temprana con infiltración linfocitaria (Fig. 13-14).
Los focos preneoplásicos son considerados pruebas del desarrollo de HCC
temprana (Khan y col., 2011). Aunque son histoquímicamente identificables mediante
el marcador GSTP1, el estímulo de crecimiento para estas células está ampliamente
debatido. Se presume que ellas podrían crecer de manera “autónoma” o en respuesta
a factores de crecimiento extracelulares. Interesantemente, muchos cambios en
estadios tempranos preneoplásicos exhiben inestables fenotipos y pueden revertirse a
células normales (Khan y col., 2011). Sin embargo, los nódulos preneoplásicos son
persistentes y pueden progresar a carcinomas (Stewart y col., 1980). Cada célula
persistente, aunque con propiedades heterogéneas y la falta de características visibles
para definirla como célula tumoral, puede ofrecer pistas vitales de nuevos cambios
intracelulares que llevan a la transformación (Bannasch y col., 1984). Por lo tanto, en
103
este estudio se evaluaron por histoquímica los cambios en la expresión de GSTP1
como marcador molecular de los nódulos y caspasa 3 como marcador apoptótico.
Los cortes histológicos en los ratones SP-CDi claramente manifiestan los focos
preneoplásico teñidos GSTP1-positivos, mostrando un background del marcador (Fig.
16). Este fondo en la tinción no es observado en los controles de tinción y
experimentales, lo cual podría sugerir un aumento en la expresión de la enzima. Como
los Western blot contra GSTP1 no revelaron diferencias significativas en los niveles
proteicos. Sugerimos una posible relocalización histológica de la enzima para dar lugar
a los focos, sin la necesidad de aumentar su nivel de expresión. Además el aumento
de los focos preneoplásicos en los animales SP-CDi se correlaciona con lo observado
por Hikita y col. (1998) quienes reportaron que 5 días de ayuno seguidos de
realimentación causan un acelerado crecimiento de focos preneoplásicos en ratas
jóvenes iniciadas con DEN.
Complementando este resultado, se observó en los cortes SP-CDi un
incremento significativo en la binucleación, con la presencia de sincitios, indicando una
alta tasa de proliferación, que corrobora la hipótesis planteada por el análisis de AKT.
En los ratones SP+Met-CDi, se observó una histoarquitectura trabecular
conservada, sin hemorragia y con hiperemia moderada. Si bien la distribución de
glucógeno siguió un gradiente periportal, se observaron algunos hepatocitos con
mayor contenido de esta macromolécula que otros (Fig. 17). También se detectaron
algunas zonas eosinófilas pudiendo considerarse posibles centros de necrosis. No se
detectaron focos GSTP1-positivos (Fig. 18). En base a estos resultados, podemos
sugerir que si bien se detectaron algunas alteraciones en el contenido de glucógeno
(Fig. 17) y algunos centros de necrosis, la metionina ejercería un efecto
hepatoprotector, al menos parcial, ya que como se discutió previamente no se reportó
daño según el análisis de enzimas en el suero. Además, se detectó un alto contenido
104
de células binucleadas indicando una gran tasa de proliferación, que daría lugar a la
recuperación celular. Los resultados de este tratamiento en su conjunto indicarían una
competencia constante del órgano frente al daño ocasionado por DEN. Evidentemente
metionina genera un medioambiente propicio para mantener la fisiología normal
hepática.
Por otro lado, nuestros resultados también mostraron que en ninguno de los
tratamientos con DEN se produjo un incremento en las células caspasa-3 positivas,
indicando que no se activa la apoptosis dependiente de caspasa.
En conclusión, este estudio en primer lugar demostró el efecto nocivo de la
malnutrición proteica crónica sobre el hígado de ratón. Además, en ratones iniciados
con DEN, a tiempos donde por sí sólo no genera más que un incremento en el estrés
oxidativo, nos permitió avanzar en el conocimiento de un posible efecto promotor de la
dieta generando focos preneoplásicos. La formación de estos focos, y la disminución
en la actividad apoptótica, impidiendo la eliminación de las células dañadas,
originarían tumores malignos a largo plazo. Además, a partir de este análisis nos
permitimos afirmar que metionina ejerce un efecto hepatoprotector in vivo en modelos
de malnutrición proteica crónica.
Utilizando el presente modelo experimental se podrían realizar futuros estudios
que examinen el estado del hígado en tiempos más largos, y evalúen la acción de
algunos promotores enérgicos como el fenobarbital PB.
105
Conclusiones
106
La malnutrición proteica crónica altera parámetros físicos, bioquímicos y
moleculares en el hígado de ratones hembra BALB/c, en el mismo sentido
al descripto en procesos de desarrollo tumoral.
El suplemento de metionina en ciclos de malnutrición proteica crónica
evita parcialmente el daño ocasionado por la carencia de proteínas y
aminoácidos.
La inyección con DEN por sí sola no altera el hígado de ratones hembra
BALB/c en el período de tiempo analizado.
La malnutrición proteica crónica junto a la inyección con DEN produce
una alteración hepática que favorece el desarrollo de focos
preneoplásicos.
El suplemento con metionina en los ciclos de malnutrición proteica
crónica evita el desarrollo de focos preneoplásicos, generando un
medioambiente favorable para la recuperación hepática.
107
Materiales y Métodos
108
1.- Animales de laboratorio
Ratones hembras BALB/c de dos meses de edad (20-25 kg) fueron criados en
el bioterio del Instituto de Investigaciones Biológicas, UNMDP-CONICET, según lo
preestablecido por la Guía de cuidado y uso de animales de laboratorio (1999). Todos
los animales fueron mantenidos en cuartos a 22°C con ciclos de luz de 07:00 a 19:00
hs, con acceso a comida y agua ad libitum.
2.- Dietas
Las dietas fueron elaboradas en base a la composición de aminoácidos de la β-
caseína bovina (Ribadeau Dumas y col., 1972). Con el objetivo de analizar la
malnutrición crónica y el suplemento de ciertos aminoácidos esenciales, se realizaron
tres tipos de dietas: 1) CD, dieta control, compuesta por 23% de β-caseína bovina,
44.66% de almidón, 5% de aceite de maíz, 5% de sales y 0.5% de vitaminas; 2) SP,
dieta carente de proteínas y aminoácidos; 3) SP+Met, dieta carente de proteínas y
aminoácidos con el suplemento del aminoácido esencial metionina. Las dietas fueron
elaboradas en base a la dieta descripta en USPXV (Pharmacopeia 1955), Tabla 1. El
aminoácido metionina se utilizó en la proporción que se encuentra en la caseína que
compone la dieta completa. Dado que la ausencia de proteínas en SP y SP+Met fue
sustituida por sacarosa: almidón de maíz en una relación 2:1, todas las dietas son
isocalóricas.
3.- Químicos
Dietilnitrosamina (Becker y Shank 1985; Verna y col., 1996; Moennikes y col.,
2004; Naura y Sharma 2009) se obtuvo por reacción entre nitrito de sodio y dietilamina
en medio ácido (Hartman y Roll 1943). Su concentración en 0.15M NaCl, Ph 7 se
determinó mediante el método espectofotométrico de fluorescamina (Udenfriend y col.,
1972), y se administró intraperitonealmente en dosis de 100 mg/kg de peso corporal.
109
4.- Diseño experimental
4.1.- Modelo de malnutrición crónica
Hembras BALB/c de dos meses de edad fueron sujetas a 3 ciclos compuestos
cada uno por 5 días de alimentación con dieta SP ó SP+Met seguidos de 5 días con
dieta CD (Fig. 1). Al finalizar el último ciclo, los animales fueron sometidos a eutanasia
y necropsia según el tipo de muestra a obtener. Los animales control recibieron la
dieta completa CD durante los 3 ciclos. Los pesos corporales se registraron
periódicamente.
Cabe destacar que los ratones ingirieron cerca del doble de dieta SP durante el
periodo de privación que de dieta CD durante el periodo de realimentación en los dos
primeros ciclos. Los animales tratados con el suplemento con metionina ingirieron la
misma cantidad de ambas dietas.
Figura 1. Diseño experimental. Hembras BALB/c de 2 meses de edad fueron sometidas a 3 ciclos de 5 días de dieta carente de proteínas y aminoácidos o suplementado con metionina, seguido de 5 días de alimentación completa repetidos 3 veces, (SP ó SP+Met: □, CD: ■). Los animales fueron adaptados a la dieta 10 días antes de comenzar el tratamiento, finalizados los 3 ciclos fueron sacrificados por dislocación cervical o decapitación según corresponda ↓. Los animales control fueron alimentados con dieta completa durante todo el tratamiento.
110
4.2.- Modelo de iniciación y progresión de hepatocarcinogénesis
Existen varios protocolos establecidos para la iniciación en hígado de ratón con
DEN, uno de ellos es aquel en que los ratones son tratados con una única dosis
necrogénica de DEN (80-90 mg/Kg de peso de ratón) (Shiota y col., 1999; Naura y
Sharma 2009; Watanabe y col., 2009) a las 4-5 semanas de edad (Ward y col., 1983;
Diwan y col., 1986; Lee 2000). En este caso, dado que los ratones son destetados a
los 21 días de edad y la inyección de DEN es aplicada 1 o 2 semanas luego del
destete, el análisis tumoral es realizado a la semana 55 (Lee 2000). Con el objetivo de
incrementar la eficiencia de iniciación en virtud de la regeneración y proliferación de las
células diana, nosotros aplicamos las siguientes modificaciones: los ratones hembras
BALB/c fueron sometidos a dos dosis intraperitoneales de DEN (100 mg/Kg) y el
análisis del desarrollo tumoral se realizó a los 90 días de edad (12.5 semanas) (Fig. 2).
Considerando la iniciación con DEN, nosotros planteamos la promoción por factores
endógenos, como por ejemplo, factores de crecimiento y oncogenes estimulados con
la dieta. El protocolo aplicado fue: 1º inyección (IP) a los 35 días de edad (5 semanas).
Al alcanzar los 60 días (8 semanas) se inició el tratamiento de malnutrición crónica
(descripto en el punto 1.4). A los 80 días de edad (11 semanas), con el comienzo del
último ciclo se aplicó la 2º dosis de DEN. Luego, cumplidos los tres ciclos de
malnutrición crónica se prosiguió con el método de eutanasia y necropsia
correspondiente.
111
Se trabajó con ratones BALB/c ya que esta cepa ha sido utilizada
extensivamente en estudios de carcinogénesis, y en contraste con otras cepas de
ratones, su incidencia a tumores espontáneos de hígado es muy baja, mientras que
son resistentes a la inducción de tumores hepáticos sólo por la aplicación de
carcinógenos químicos (Lipsky y col., 1981; Klaunig y col., 1988).
5.- Eutanasia y necropsia
Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical o guillotina, según el
tipo de muestra a obtener. Ambos métodos se realizaron siguiendo la guía de
Eutanasia AVMA (2007). La necropsia se realizó siguiendo las normas preestablecidas
en la Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (1999). A los
animales sacrificados por dislocación cervical se les extrajo el hígado. Este se pesó y
diseccionó en 3 fragmentos: un fragmento de lóbulo hepático fue almacenado en N2(l),
otro se fijó en formol 10% (v/v) y el tejido restante se perfundió vía vena porta con
buffer A y se almacenó a -80°C. Se recolectó sangre de los animales sacrificados por
guillotina además de extraerles el hígado según lo descripto previamente. Los
protocolos utilizados para este estudio fueron aprobados por el comité de ética local.
Figura 2. Modelo experimental de ratones iniciados con DEN. Hembras BALB/c
iniciadas con doble inyección de DEN (100 mg/Kg) a los 35 y 80 días de edad respectivamente. Ciclos de privación proteica realimentación con y sin suplemento de metionina. □ dieta SPi o SP+Meti; ■ dieta CDi. Tiempo representado en el gráfico:
semanas y días a partir del nacimiento
112
6.- Extracción de ARN
Una porción de lóbulo hepático sin perfundir fue homogenizada con 1ml Trizol/
100 mg tejido (Invitrogen, Gaitherburg, MD, USA). Luego el homogenato se centrifugó
10 min a 12 000 g. Una vez obtenido el sobrenadante se incubó 5 min a 20ºC para
permitir la disociación de los complejos nucleoproteicos. Pasado dicho período se
agregó 0.2 ml cloroformo/ ml Trizol, una vez mezclado se incubó nuevamente 5 min a
20°C y se centrifugó 15 min a 12 000 g. Se recuperó la fase acuosa, se agregó 0.25 ml
2-propanol y 0.25 ml AcNa 2M por ml Trizol y se lo dejó precipitar 1h a -80°C. Luego
se lo volvió a centrifugar 10 min a 12 000 g. Se recuperó el precipitado y lavó mediante
una centrifugación con 70% (v/v) de etanol 5 min a 12 000 g. Para descartar los
contaminantes de polisacáridos como el glucógeno se recolectó el precipitado y se lo
resuspendió en 300 µl de agua DEPC 0.1% (v/v) y se agregó 300 µl de fenol-
cloroformo (1:1; fenol pH 4: cloroformo), se agitó y se dejó separar las fases 5 min a
20°C. Se recuperó la fase acuosa a la cual se le agregó nuevamente 0.5 ml 2-propanol
y se lo dejó reposar 1h a -80°C. Finalmente se lo centrifugó 10 min a 12 000 g, se
recuperó el pellet al cual se le realizó una última centrifugación con 70% (v/v) de etanol
5 min a 12 000 g. Se recuperó el precipitado y se lo resuspendió en 30 µl de agua
DEPC 0.1% (v/v). Se cuantificó la concentración por medio de la relación Abs 260
nm/280 nm. Todos los pasos se realizaron a 4°C. La calidad del ARN se testeó en un
gel de agarosa 1% teñido con 0.5 µg/µl de BrEt.
7.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
7.1.- Síntesis de ADN copia
El ARN total fue tratados RQ1 RNase-Free DNase (Promega, Madison, W1,
USA) e incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos, con el fin de eliminar el
ADN contaminante. La reacción fue detenida por el agregado de EDTA e incubada a
113
65 ºC durante 15 minutos. El ARN se cuantificó finalmente mediante la relación Abs
260 nm/280 nm. La calidad del ARN fue testeada por electroforesis en gel de agarosa
1% teñido con 0.5 µg/µl de BrEt. La síntesis del ADN copia (ADNc) fue generada a
partir de 5 µg de ARN total, el cual se incubó con 0.01 µg/µl de primers oligo dT,
durante 10 min a 70°C. Luego se le realizó un shock térmico en hielo durante 5 min.
Finalmente la mezcla de reacción con 80 U/µl de transcriptasa reversa M-MLV
(Invitrogen, LIFE TECNOLOGIES), de buffer de reacción (Invitrogen) y 0.5 mM de
dNTPs se incubó 90 min a 40°C, terminando con un ciclo de 15 min a 70°C. El ADNc
obtenido se diluyó 3 veces y fue utilizado como templado en cada una de las
amplificaciones.
7.2.- RT-PCR semicuantitativa
Las PCR semicuantitativas se realizaron con 2 µl de ADNc, 0.5 µM de primers
específicos, 1.5 mM Cl2Mg, 0.2 mM dNTPs, 0.02 U/µl de Taq polimerasa “Termoprime
Plus” (Adgene) y buffer de reacción (Adgene). Para cada primer se determinó la
temperatura de annealing adecuada y la fase exponencial en la cinética de la PCR,
esto último se realizó mediante reacciones sucesivas de amplificación con número
creciente de ciclos. Ambas oscilaron entre 55-65°C y 30-35 ciclos respectivamente
(tabla 2). Las reacciones fueron realizadas en un ciclador térmico “PCR Px2 Thermal
Cycler” en los cuales se determinaron los siguientes pasos: 1) temperatura de
desnaturalización: 5 min 94°C, 2) Temperatura de desnaturalización: 30 seg 94°C;
Temperatura de annealing: 50 seg 55-65°C; Temperatura de elongación: 1 min 72°C.
Todo el paso “2” se repitió el número de veces correspondiente a la etapa exponencial
de determinada para cada ARNm. 3) Al finalizar cada reacción se realizó una
elongación final de 5 min a 72°C. Finalmente los productos de amplificación fueron
separados en un gel de agarosa 1.2% teñido con BrEt 0.5 µg/µl. La electroforesis se
realizó durante 60 min a 100V en buffer TBE. Las bandas se cuantificaron por
densitometría. La densidad relativa de todas las bandas fue corregida utilizando actina.
114
Tabla 2: Secuencia de primers específicos utilizados para PCR.
Secuencia
Temperatura de annealing
a
Tamaño de la sonda
amplificada pb
FAS FW 5´-TGC GCC CAG CCT CCT AAG C -3´ 64ºC 230
RV 5´-ATC ACA CGC CGG CAA ACC TAT CC-3´
mGSTM1 FW 5´-GTG ACG CTC CCG ACT TTG ACA G-3´ 62ºC 544
RV 5´-TTA CTC CAG TGG GCC ATC TTT GAA-3´
mGSTA3 FW 5´-GCG GGG AAG CCA GTC CTT CAT T-3´ 64ºC 609
RV 5´-CCT CTG GCT GCC AGG TTG AA-3´
mGSTP1 FW 5´-ATG CCA CCA TAC ACC ATT GT-3´ 55ºC 474
RV 5´-GTC CAG CAA GTT GTA ATC GG-3´
ACTINA FW 5´-AGT ACT TGC GCT CAG GAG GA-3 62ºC 314
RV 5´-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA-3´
GAPDH FW 5´-ACG GCA AAT TCA ACG GCA CAG TCA-3´ 64ºC 561
RV 5´-CAT TGG GGG TAG GAA CAC GGA AGG-3´
AC III FW 5´-TGC CAA AGG GGA CAA CCA GT-3 64ºC 650
RV 5´-GCA CCG GGG GCT CAT TCT C-3´
Los primers fueron diseñados y las Tm fueron calculadas de acuerdo a la formula:
Tm (temperatura de melting) = Fórmula 1= 81.5 - 600/nt + 0.41 x %GC. nt= número de nucleótidos.
Fórmula 2= 2(A+T)+4(G+C)
La Ta* (temperatura de annealing) se calculó en base a un promedio de la Tm obtenidas por ambas fórmulas.
Ta*= Tm – 5. (aTa: aplicada experimentalmente para cada sonda)
8.- Densitometría de bandas
Las bandas obtenidas de geles de electroforesis o membranas de
transferencias, fueron cuantificadas por densitometría mediante el software ImageQ TL
v2005. La densidad relativa se corrigió utilizando actina.
9.- Northern Blot
9.1.- Obtención de la membrana de hibridación
El ARN total fue extraído con el método de Trizol como se explicó en el inciso
1.6, y cuantificado por la relación Abs 260 nm/280 nm. 30 µg de ARN se incubó con
115
buffer desnaturalizante con GLYOXAL durante 1h a 55ºC (Thomas 1980).
Posteriormente el ARN se resolvió por electroforesis en gel de agarosa nativo 1.5% en
buffer BTPE durante 90 min a 100V. Luego, el ARN se transfirió por un sistema de
capilaridad con SSC 20X a una membrana de nylon HybondTM-N+ (Amersham, UK) y
se fijó por exposición a luz ultravioleta en horno Stratalinker (Stratagene).
9.2.- Obtención de las sondas
Todas las sondas utilizadas para Northern blot, se realizaron mediante una
reacción de PCR con primers específicos (Tabla 1) y 40 ciclos de elongación. A partir
del gel de agarosa se cortaron las bandas de ADN correspondientes y se purificaron
mediante el kit Pure Link Quick Gel Extraction System (Invitrogen, LIFE
TECNOLOGIES). El rendimiento y tamaño del ADN purificado se evaluó mediante
electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con 0.5 µg/µl de BrEt y utilizando buffer de
corrida TBE. Se utilizó el marcador de peso molecular de ADN 1Kb Plus DNA Ladder
(GIBCO BRL) cuya banda de 1650 pb contiene 8% de la masa sembrada, esto
permitió estimar la masa del ADN de interés mediante densitometría.
9.3.- Marcado radiactivo de las sondas e hibridación
La marcación de las sondas se llevó a cabo mediante la técnica random
priming, 25 ng de ADN se marcaron por Random Primers DNA Labeling System
(Invitrogen, LIFE TECNOLOGIES) utilizando [α-32P] dCTP (3000 µCi/nmol). La
marcación se realizó durante 30 minutos a 37 ºC en un volumen final de 20 µl y fue
detenida por el agregado de 20 mM de EDTA. Las sondas fueron purificadas por
cromatografía en columna de tamiz molecular Sephadex G-50 en buffer TE. La
radiactividad de las diferentes alícuotas fue estimada y las fracciones elegidas se
desnaturalizaron incubando 5 min a 100ºC. Las membranas se prehibridaron durante 1
hora a 65 ºC en solución de Church. Posteriormente, las sondas marcadas se
116
incubaron con las membranas nylon HybondTM-N+ (Amersham, UK) e hibridaron
durante 20 hs a 65ºC en solución Church. Las membranas se lavaron a 65ºC con 0.1%
SDS y concentraciones decrecientes de SSC 2X, 1X y 0.2X durante 15 minutos.
Finalmente las membranas se expusieron en placas Fuji Imaging plate hasta el
momento de su revelado. Todas las bandas fueron detectadas por el Scanner Storm
(Amersham Biosciences) y cuantificadas por el software ImageQuant TL v2005. La
intensidad de las bandas fue relativizada a actina.
10.- Análisis de proteínas
10.1.- Obtención del citosol
Una fracción de hígado perfundido fue homogenizada con una relación buffer
A: peso hígado de 4:1. El homogenato se centrifugó 20 min a 17 000 g y el
sobrenadante obtenido se ultra centrifugó 105 min a 100 000 g. Finalmente, el
sobrenadante correspondió al extracto citosólico y se almacenó a -80ºC. Todos los
pasos se realizaron a 4ºC (Conde y Scornik 1976). Las proteínas fueron cuantificadas
según el método de Bradford (Bradford 1976).
10.2.- Obtención secuencial de las fracciones mitocondrial y citosólica
La obtención de estas se realizó siguiendo el método descripto por Frezza y
col., (2007) con algunas modificaciones. Una porción de hígado perfundido con buffer
A fue homogenizado con una relación buffer de homogenización: peso hígado de 4:1.
El homogenato se centrifugó 10 min a 1 500 g y el sobrenadante se centrifugó 10 min
a 7 000 g. El precipitado fue resuspendido en 5 ml de buffer de homogenización, luego
se centrifugó 10 min a 7 000 g. En el precipitado se encuentran las mitocondrias las
cuales fueron resuspendidas en 1 ml de buffer de lavado y almacenadas a -80ºC
(fracción mitocondrial). El sobrenadante se centrifugó a 100 000 g y se obtuvo la
fracción citosólica. Todos los pasos se realizaron a 4ºC. La concentración de proteínas
117
en ambas fracciones se determinó utilizando el método del ácido bicinconínico (Smith
y col., 1985).
Para determinar la pureza de las fracciones, se determinaron las siguientes
actividades:
-Lactato deshidrogenasa LDH (marcador citosólico)
La mezcla de reacción se realizó conteniendo 5 µl de la fracción mitocondrial,
0.2 M tris HCl pH 7.3, 0.22 mM NADH y 3mM piruvato. Las muestras se leyeron en un
espectrofotómetro en un rango de Abs340 nm a intervalos de 15 segundos durante 2
minutos. En presencia de LDH el piruvato es reducido a lactato con la oxidación
simultánea de NADH, el NADH consumido es directamente proporcional a la actividad
de LDH. Como control positivo se utilizó la mezcla de reacción con lactato
deshidrogenasa (sigma)
Lactato + NAD+ ↔ piruvato + NADH + H+
-Succinato citocromo c reductasa (marcador mitocondrial)
La mezcla de reacción se realizó conteniendo 10 µl de la fracción mitocondrial,
50 mM buffer fosfato de potasio pH 7.5, 0.04 mM citocromo c, 0.14 mM NADH, 0.5 mM
cianuro de potasio. Se midió el aumento del citocromo c reducido por Abs550 nm.
Citocromo c (oxidado) + NADH ↔ citocromo c (reducido) + NAD
11.- Cuantificación de proteínas
La concentración de proteínas en las diferentes muestras fue determinada
utilizando ácido bicinconínico (Smith y col., 1985), o mediante el método descripto por
Bradford (Bradford 1976). Como estándar se utilizó sero-albumina bovina (BSA).
118
12.- Cuantificación de ácidos nucleicos
La concentración de ácidos nucleicos se determinó siguiendo el método
descripto por Fleck y Munro (1962). Un volumen de 25 µl de homogenato (inciso 1.10
de esta sección) se trató con 1 ml de PCA 0.2 N (HClO4), 60 min a 4ºC.
Posteriormente se centrifugó 10 min a 1 200 g. Al precipitado se le agregaron 0.5 ml
de KOH 0.3 N, y se incubó 60 min a 37ºC. Luego se agregó 1 ml de PCA 0.5 N y se
incubó 60 min a 4ºC. Se centrifugó 10 min a 1 200 g donde se separó el sobrenadante
conteniendo las bases libres de ARN en solución. El precipitado se lavó con 0.5 ml de
PCA 0.2 N y nuevamente se centrifugó 10 min a 1 200 g. Se descartó el sobrenadante
y se agregó 1 ml de PCA 0.5 N, se agitó con vortex y se calentó la muestra 60 min a
70ºC. Para obtener el sobrenadante conteniendo las bases libres de ADN, se
centrifugó la muestra durante 10 min a 1 200 g. Las concentraciones de ARN y ADN
se determinaron a partir de las Abs a 260 nm de las muestras corregidas por su
turbidez estimada por Abs a 320 nm (X) según las siguientes fórmulas:
Abscorregida = Abs260 – X ; donde X = Abs320 x 1.59
mg ARN/ ml homogenato = Abscorregida x 1.86
mg ADN/ ml homogenato = Abscorregida x 1.24
13.- Electroforesis en gel de poliacrilamida
Las fracciones citosólicas o mitocondriales fueron solubilizadas en buffer de
muestra SB y calentadas 3 min a 100ºC para su desnaturalización. Luego fueron
sometidas a electroforesis en gel desnaturalizante SDS-PAGE 12% (30:80% de
acrilamida: bisacrilamida) en condiciones reductoras según Laemmli (Laemmli 1970).
Las condiciones de corrida fueron 20 mA/gel. En cada calle se sembró la misma
cantidad de proteínas (25-60 µg), las cuales fueron reveladas por tinción con
119
Coomassie Blue (Meyer y Lamberts 1965). La intensidad de las bandas se determinó
por densitometría con el software ImageQuant TL v2005. La densidad relativa fue
corregida con la densitometría obtenida del total de la calle y relativizada respecto al
control. La identidad de las bandas teñidas con Coomassie Blue fueron previamente
corroboradas por técnicas de espectrometría de masas, cromatografía HPLC, análisis
de secuencias y examinadas en bases de datos (Ronchi y col., 2004).
14.- Inmunodetección
Las proteínas de las fracciones citosólicas o mitocondriales (60 µg) fueron
separadas en geles desnaturalizantes SDS-PAGE 12% (según lo descripto en el inciso
1.13 de esta sección). Luego fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa
(Amersham, UK) utilizando el equipo de transferencia semiseca (Invitrogen). La
transferencia se realizó durante 25 min, 15V, 200 mA. El ensayo de immunoblot se
realizó de acuerdo a Ey y Ashman (Ey y Ashman 1986) usando anticuerpos
policlonales hechos en conejo anti-: FAS (20140, Santa Cruz Biotechnology), caspasa
3 (7148, Santa Cruz Biotechnology), GST-P (311, MBL), Actina (A2668, Sigma-Aldrich.
Inc), AIF (13116, Santa Cruz Biotechnology), XIAP (M044-3, MBL). Como anticuerpo
secundario se utilizó: A) Inmunoglobulina de conejo conjugada con fosfatasa alcalina
(Sigma-Aldrich. Inc) y se reveló con los sustratos NBT y BCIP según las instrucciones
del manual de Promega, ó B) Inmunoglobulina conjugada a peroxidasa en el cual las
proteínas se detectaron por el método de quimioluminiscencia (Amersham,
Piscataway, NJ).
La cuantificación se realizó igual a lo descripto en el inciso 1.13 de esta
sección.
120
15- Determinación de actividad de caspasa-3
La actividad de caspasa-3 se determinó mediante la medición de la ruptura
proteolítica del sustrato fluorescente Ac(N-acetil)-DEVD-AFC (7–amino-4-
trifluorometilcoumarina) BD PharmingenTM. Brevemente, el extracto citosólico (50 µg)
se agregó a la mezcla de reacción conteniendo 20 mM PIPES, 100 mM NaCl, 10 mM
DTT, 1 mM EDTA , 0.1 % ( w/v) CHAPS, 10% sacarosa, pH 7.2 y 13 µM de sustrato.
La mezcla de reacción se incubó durante 1 h a 37 ºC. Luego de este tiempo, la
actividad enzimática se midió en un fluorómetro Fluoroskan Ascent con un filtro de
excitación de 405 nm y un filtro de emisión de 525 nm.
16.- Determinación de actividad CAT
La actividad catalasa se determinó por medio de la desaparición de H2O2 a 240
nm según el método descripto por Aebi y col., (1984). La mezcla de reacción contiene
50 mM buffer fosfato pH 7.4, 10 mM H2O2 y extracto citosólico. Se definió como unidad
enzimática a una diferencia de 0.05 Abs 240 nm que tiene 1mg/ml de proteína en un
minuto: [∆ 0.05 Abs240 nm: 1U/ml/mg proteína].
17.- Determinación de actividad SOD
La actividad SOD fue medida a partir del extracto citosólico por el método de
inhibición de la reducción del NBT descripto por Beauchamp y col., (Beauchamp y
Fridovich 1971). El medio de reacción contenía 0.4 ml de citosol y 0.6 ml de: 50 mM
HEPES pH 7.6, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCO3H, 13 mM metionina, 0.025% (v/v) Triton
X-100, 75 µM NBT y 2 µM riboflavina. La reacción fue desarrollada 4 min en un baño
de agua a 30º iluminado con una lámpara fluorescente de 22 W (Philips), luego se
midió la Abs 560 nm. Una unidad enzimática se definió como la cantidad de citosol
necesaria para inhibir un 50% la reacción sin enzima.
121
18.- Determinación de actividades de GSTs, GR y CAT
A partir de extractos citosólicos se midió la actividad total de GSTs según lo
descripto por Habing y col., (1974). La actividad GR fue medida según el método
descripto por Tanaka y col., (1994) y la actividad CAT fue medida siguiendo el método
descripto por Claiborne (1985). Todos los resultados fueron expresados en
nanokatales por miligramo de proteína (nkat/ mg prot), donde 1 kat representa la
conversión de 1 mol de sustrato por segundo.
19.- Determinación de grupos carbonilos
El contenido de grupos carbonilos en las proteínas hepáticas se midió según el
método descripto por Oliver y col. (1987). Una porción de lóbulo hepático perfundido
fue homogenizado con 10 ml/g de hígado de buffer conteniendo: 0.15 M NaCl, 1 mM
EDTA, y 20 mM Tris–HCl pH 7.4. Luego, una alícuota de 0.75 ml conteniendo 1 mg de
proteína aproximadamente, fue mezclada con 0.75 ml de TCA 20% (p/v).
Posteriormente se centrifugó 5 min a 6 000 g y se separó el precipitado el cual se
mezcló con 0.75 ml de HCl 2 N (blanco de reacción) o 0.75 ml de HCl 2 N conteniendo
0.2% (p/v) de DNPH, esto se agitó en oscuridad por 60 min a 25ºC. Luego la mezcla
fue re-precipitada con 0.75 ml TCA 20% (p/v), lavada 3 veces con etanol/etilacetato
(1:1, v/v), secada y mezclada con 6 M guanidinio HCl a 25ºC. Finalmente, una vez
removido el precipitado por centrifugación, se midió Abs370 nm de las muestras DNPH.
Luego de restarles el blanco, los valores fueron utilizados para calcular los nanomoles
de DNPH incorporados por miligramo de proteína basados sobre el coeficiente de
absorción de 21 mM-1 cm-1 de hidrazonas alifáticas (Jones y Masters 1975).
20.- Análisis de peroxidación de lípidos
La peroxidación de lípidos se estimó según lo descripto por Oakes y Van Der
Kraak con modificaciones (Oakes y Van Der Kraak 2003). Para evaluar el nivel de
122
peroxidación se cuantificaron las sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico
(TBARS) para lo cual 50 mg de hígado sin perfundir fue homogenizado en 0.15 M KCl
y 35 µM BHT. Luego, alícuotas de 100 µl de homogenato fueron mezcladas con 3.9 ml
de 37.5 mM TBA, 67 µM BHT, 7.5% (p/v) TCA y 0.4% (p/v) SDS. Las muestras fueron
calentadas 30 min a 95ºC, enfriadas a 15ºC y centrifugadas 10 min a 3 000 g.
Finalmente en el sobrenadante se midió la Abs 532 nm y por medio del coeficiente de
extinción molar de 1.56x105 M-1 cm-1, se calculó el contenido de TBARS en
nanomoles/ mg de tejido (Oakes y Van Der Kraak 2003).
21.- Análisis del suero sanguíneo
A partir de ratones sacrificados por decapitación, se recolectó la sangre en
tubos de 1.5 ml. La toma de la muestra fue realizada entre las 08:00 y 10:00 am y
mantenida a 37ºC. Luego de 15 min, una vez formado el coagulo, las muestras fueron
centrifugadas 10 min a 1 000 g, 4ºC, para separar el suero. Este fue mantenido a -
80ºC hasta la determinación de distintos componentes.
Las transaminasas SGOT, SGPT y la enzima fosfatasa alcalina fue
determinada por medio del kit comercial (Wiener lab, Rosario, Argentina) siguiendo el
protocolo establecido. Se determinó la Abs a 505 nm. Para el cálculo de los resultados
se realizó una curva de calibración de acuerdo al kit y los valores se expresaron en U/l.
La determinación de proteínas totales y albúmina se realizó a través de kit
comercial por el método colorimétrico, con el uso de una solución de 2,9 g/dl de
albúmina y 5 g/dl de globulina, como patrón. Se obtuvieron las Abs a 540 y 625 nm,
respectivamente. La concentración de proteínas totales y albúmina se realizó de
acuerdo al Kit. Los valores se expresaron en g/dl.
Determinación de glucosa sanguínea a través de método enzimático glucosa
oxidasa/peroxidasa (GOD/POD), por kit comercial. La lectura se realizó a una Abs de
123
510 nm. La concentración de glucosa queda expresada en mg/dl y se determinó de
acuerdo al Kit.
22.- Análisis histológico
22.1- Toma y procesamiento de la muestra
A partir de los animales sacrificados por dislocación cervical, se extrajo
cuidadosamente el lóbulo hepático mayor. Esta porción de tejido sin perfundir se fijó
durante 72 h en formol 10%. Una vez fijada la muestra se procedió con la
deshidratación para una posterior inclusión en parafina (Biopac). La deshidratación se
realizó por medio de 2 baños de 1h con alcohol 70%, 2 baños de 1h con alcohol 96%,
2 baños de 45 min de Alcohol 100% y 2 baños de 1 h con Xilol. Por último, las
muestras se orientaron adecuadamente en un recipiente metálico donde se incluyeron
en parafina. Para esto se realizó una primer inclusión de 1 h en horno a 57ºC, y luego
un recambio de parafina 1 h a 57ºC. El material incluido se dejó secar al aire y luego
se preparó el bloque para formar el taco. Finalmente se realizaron cortes con
micrótomo (tipo Minot), no mayores a 5 micras. Los cortes se extendieron en un baño
de inmersión y se colocaron en un portaobjeto tratado con adhesivos correspondientes
según el tipo de tinción a utilizar. Los adhesivos utilizados fueron: albúmina de Mayer
para tinciones de rutina, o Silano 2% para inmunohistoquímica. Finalmente, una vez
obtenidos los cortes, se los dejó secar y se desparafinó con baños de Xilol y una serie
decreciente de alcoholes, de100% a 70%. Por último se los sumergió en agua
destilada y quedaron listos para colorear o teñir.
22.2- Tinciones Histológicas
Fueron utilizados diferentes tipos de colorantes para poner en evidencia
distintas estructuras citológicas e histológicas. Los preparados fueron teñidos con
124
Hematoxilina-Eosina (H&E), Tricrómico de Golden Masson y reacción de PAS
(Periodic Acid Schiff: Reactivo de Schiff y ácido Periódico)
22.3- Inmunohistoquímica
Para realizar las inmunohistoquímica, porciones de tejido de 5 micras, se
adhirieron a portaobjetos tratados previamente con silano 2%. Luego se realizó la
desparafinización de los cortes con xilol y una serie decreciente de alcoholes. Una vez
desparafinados los cortes se sumergen en buffer PBS 1X pH 7.6 por 10 min. Dado que
para el revelado se utilizó el método de peroxidasa, fue necesario inhibir la peroxidasa
endógena. Para esto se incubaron los cortes 10 min en una solución conteniendo 3%
(v/v) de H2O2 30V. Luego se continuó con el bloqueo de los antígenos internos
inespecíficos con 5% (p/v) de leche descremada 20 min. Entre el bloqueado de la
peroxidasa endógena y los antígenos internos se realizaron 2 lavados con buffer PBS
1X de 10 min cada uno. Una vez finalizados los bloqueos correspondientes se incubó
over night en cámara húmeda a 4 ºC con los anticuerpos primarios anti-caspasa 3-
activa (C8487, Sigma) ó anti-GST-P (311, MBL). La expresión de ambos se reveló
utilizando el kit de DAKO para la técnica de LSAB (L streptoavidina biotina), utilizando
DAB como cromógeno para revelado y hematoxilina como tinción de contraste.
23.- Análisis estadístico
Para la evaluación de la existencia de diferencias significativas entre los
tratamientos, se realizó el test estadístico análisis de varianza de una vía (ANOVA),
utilizando el test de Tuckey para el análisis entre las medias mediante el programa
GraphPad Prism versión 5. Las diferencias se consideraron significativas con P<0.05.
Los resultados se presentan en gráficos de barras y tablas con el objetivo de
permitir el adecuado seguimiento del análisis.
125
ANEXO
BTPE 1x - 3% (p/v) PIPES
- 6% (p/v) Bis-Tris
- 0.01M EDTA pH 8
Buffer A
- 0.15 M NaCl
- 1 mM EDTA
- 5 mM β-mercaptoetanol
- 20 mM Tris-HCl buffer; pH 7.4
Buffer desnaturalizante con Glyoxal
- 50% DMSO
-1.3 M glyoxal
- 1.3x BTPE
- 5.3% glicerol
- 0.2 mg/ml BrEt
Buffer de homogenización - 450 mM Sacarosa
-1 mM EDTA
- 10 mM Tris-HCl pH 7.5
- 1mM DTT
- 6 g/l PVP 40 (polyvinylpyrrolidone)
- 1mM PMSF
- 2 g/l BSA
Buffer de lavado
- 300 mM Sacarosa
- 1mM EGTA
- 0,2 mM PMSF
- 10 mM Tris-HCl pH 7.5
Buffer fosfato salino (PBS) - 35 mM buffer fosfato
- 0.15 M NaCl
- pH 7.3
Buffer TBE - 0.89 M Tris
- 0.89 M borato
- 2 mM EDTA
126
Buffer TE - 10 mM Tris-HCl pH 7.5
- 1 mM EDTA 7.5
Coomassie blue - 2% Coomassie Blue R-250
- 20% Metanol
- 5% Ácido acético
Church - 0.5 M buffer fosfato pH 7.2 - 7 % (p/v) SDS - 10 mM EDTA pH 7.2 Formol 10%
- Formaldehído 40%: 4 agua SSC 20X - 17.5% (p/v) NaCl - 8.8% (p/v) Citrato de sodio - pH 7.2 Sample buffer SB -160 mM Tris-HCl pH 6.8 - 0.004 % (p/v) azul de bromofenol - 17 % (v/v) glicerol - 3.3 % (p/v) SDS - 8 % (v/v) β-mercaptoetanol
127
ABREVIATURAS
Abs: Absorbancia
ACIII: Anhidrasa carbónica III
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADNc: Ácido desoxirribonucleico copia
ALB: Albúmina
ARN: Ácido ribonucleico
BHT: Butilhidroxitolueno
BrEt: Bromuro de Etidio
BSA: Sero albúmina bovina
CAT: Catalasa
CD: Dieta Control
DAB: 3,3´-diaminobenzidina
DEN: Dietilnitrosamina
DEPC: Dietilpolicarbonato
DNPH: dinitrofenilhidrazona
dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
FA: Fosfatasa alcalina
FAS: Ácido graso sintasa
GAPDH: Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
GR: Glutatión reductasa
GSTs: Glutatión S-transferasas
H&E: Hematoxilina & Eosina
HCC: Hepatocarcinogénesis
LDH: Lactato deshidrogenasa
128
MPM: Marcador de peso molecular
NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido
ON: over night
PAS: Schiff - ácido periódico
PCA: Ácido perclórico
PCR: Reacción en cadena polimerasa
ROS: Especies reactivas de oxígeno
RT-PCR: Transcriptasa reversa de la reacción en cadena polimerasa
SB: Sample Buffer
SDS: Dodecil sulfato de sodio
SGOT: Glutámico-pirúvico transaminasa
SGPT: Glutámico-oxalacético transaminasa
SOD: Superoxidodismutasa
SP+Met-CD: Dieta sin proteínas suplementada con metionina seguida de realimentación completa
SP-CD: Dieta sin proteínas ni aminoácidos seguida de realimentación completa
TBA: Ácido 2-tiobarbitúrico
TBARS: Sustancias reactivas del ácido 2-tiobarbitúrico
TCA: Ácido tricloroacético
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129
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Durante el periodo de formación de postgrado, partes de este trabajo han sido publicadas en:
Publicaciones en revistas internacionales con referato
- Caballero, Veronica J; Mendieta, Julieta R; Giudici, Ana M; Crupkin, Andrea;
Barbeito, Claudio; Ronchi, Virginia P; Chisari, Andrea N; Conde, Ruben D. “Alternancy between protein depletion and normal feeding cause liver damage in mouse”. J Physiol Biochem (2011) 67(1):43-52. DOI 10.1007/s13105-010-0047-1
Manuscritos en preparación
- Caballero Verónica J., Mendieta Julieta R., Lombardo Daniel, Saceda Miguel, Ferragut José Antonio, Chisari Andrea N., Conde Rubén D., Giudici Ana M.. “Liver damage and caspase dependent apoptosis is related to protein malnutrition. Protective effect of methionine”.
Resúmenes publicados en revistas de publicación periódica
1- Caballero, V.J., Ronchi, V.P., Ocampo, E.H., Chisari, A.N., Conde R.D.
(2006). Efecto de la aplicación de ciclos de privación proteica-realimentación sobre la regulación de enzimas hepáticas de ratón. Physiological Mini-Reviews. p 199. ISSN 1669-5402.
2- Caballero VJ, EH Ocampo, VP Ronchi, RD Conde, AN Chisari. (2007).
Estimulación de la expresión de TNFα y GSTP1 en hígado de ratones sometidos a ciclos de privación nutricional de aminoácidos – alimentación normal. Medicina Vol. 67. p 125. ISSN: 0025.7680.
3- Caballero VJ, Mendieta JR, Giudici AM, Conde RD, Chisari AN. (2008).
Malnutrición proteica crónica y su relación con hepatocarcinogenesis química en ratón. Medicina Vol. 68. Suplemento II. p 188. ISSN 00257680.
4- Mendieta JR, Giudici AM, Caballero JV, Conde RD, Chisari AN. (2008).
Efecto de la desnutrición proteica sobre los niveles de especies reactivas de oxígeno y la apoptosis celular en hígado de ratón. Medicina Vol. 68. Suplemento II. p 132. ISSN 00257680.
5- Caballero VJ, Mendieta JR, Conde RD, Giudici AM. (2010). Mouse liver oxidative stress caused by chronic protein malnutrition and DEN. Protection by met. Biocell Vol. 34 (Suppl.) pag 85. ISSN 0327 – 9545.
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Presentaciones a Congresos
1- Caballero, V.J., Ronchi, V.P., Ocampo, E.H., Chisari, A.N., Conde R.D. (2006). Efecto de la aplicación de ciclos de privación proteica-realimentación sobre la regulación de enzimas hepáticas de ratón. XXII Latin-American and First Ibero-American Congress of Physiology Science. Buenos Aires. Argentina. 4-7 de Noviembre.
2- Caballero VJ, EH Ocampo, VP Ronchi, RD Conde, AN Chisari. (2007). Estimulación de la expresión de TNFα y GSTP1 en hígado de ratones sometidos a ciclos de privación nutricional de aminoácidos – alimentación normal. LII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y LV Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología. Mar del Plata, Argentina. 21-24 Noviembre
3- Caballero VJ, Mendieta JR, Giudici AM, Conde RD, Chisari AN. (2008). Malnutrición proteica crónica y su relación con hepatocarcinogenesis química en ratón. LII Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología. Mar de Plata. Buenos Aires. 19-22 de Noviembre
4- Mendieta JR, Giudici AM, Caballero JV, Conde RD, Chisari AN. (2008). Efecto de la desnutrición proteica sobre los niveles de especies reactivas de oxígeno y la apoptosis celular en hígado de ratón. LII Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología. Mar de Plata. Buenos Aires. 19-22 de Noviembre.
5- Caballero VJ, Mendieta JR, Conde RD, Giudici AM. (2010). Mouse liver oxidative stress caused by chronic protein malnutrition and den. Protection by met. XLVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular. Puerto Madryn. Argentina. 30 de noviembre al 3 de diciembre.