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Aspectos de la interacción virus-hospedador a tener en
cuenta en el diagnóstico y control de la Laringotraqueítis
Infecciosa
Ariel VagnozziInstituto de Virología
INTA Castelar.
Bogotá, 17 de abril de 2012
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria.Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias
AMEVEA
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Reseña
• 1925_ Primer reporte de la enfermedad (May & Tittsler. Tracheolaryngitis in
Poultry. J. Am. Vet. Assoc. 67: 229-231).• 1931
_ El comité de enfermedades de las aves de la AVMA adoptó la denominación de Laringotraqueítis Infecciosa (Infectious Laryngotracheitis)
• 1934 _ Primera inmunización contra LT(Brandly & Bushnell (A report of some
investigations of Infectious Laryngotracheitis. Poult. Sci. 13: 212-217).• 1937
_ El agente etiológico de LT fue reconocido como un agente filtrable (virus) (Beudette. Infectious Laryngotracheitis. Poult. Sci. 16: 103-105).
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Infectious Laryngotracheitis Virus (ILTV).También Gallid Herpesvirus 1 (GaHV-1).
• α-Herpesvirus
• Rango de hospedador
– Pollos (Gallus gallus domesticus) y faisanes (Phasianidae) son los
únicos hospedadores naturales reconocidos.
• ILTV replica en la parte alta del tracto respiratorio.
• Inmunología
– El título de anticuerpos neutralizantes no correlaciona bien con
protección (Fahey et al, 1983)
– Respuesta mediada por células parece jugar el rol principal en la
inmunidad (Fahey et al, 1984)
Gransow et al, 2001
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Laringotraqueítis
• Período de incubación
– Infección experimental (intratraqueal): 2 a 4 días
• Signos Clínicos
– Tos, estornudos, expectoración de mucus fibrina y sangre, y marcada disnea.
– Conjuntivitis.
• Lesiones
– Conjuntiva, laringe, y tráquea (ocasionalmente pulmones).
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Entre Ríos, 2010
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Lesiones: Diversos grados de conjuntivitis
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Lesiones: Diversos grados de traqueítis
Imágenes provistas por Dr. G. Zavala
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Epidemiología
• ILTV tiene distribución mundial.
• Mortalidad entre 0 y 70% (dependiendo de la virulencia de la cepa).
• Latencia Luego de la fase aguda
Reactivación generalmente inaparente
• Aves muy jóvenes presentan menor susceptibilidad
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Menores de 30 días Entre 30- 40 días Mayores a 40 días0%
25%
50%
75%
100%
5%13%
68%
Casos (porcentaje) de ILTV según edad de las aves (broilers) afectadas (mayo 2006 - octubre 2011)
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LatenciaGanglio del trigémino
Replicación viralTráquea
Luego de la fase aguda de la
infecciónStress
Reactivación desde latencia es generalmente
inaparenteDiseminación viral
Latencia
Virus de campo y vacunas vivas atenuadas
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Diagnóstico de ILTV
• Signos clínicos y lesiones– Pueden ser muy característicos
• Aislamiento viral– Aves (mayores de 14 días)– Embrión de pollo– Cultivo primario de células
• Histopatología• Inmunofluorescencia • Inmunohistoquímica• PCR• PCR en tiempo real
• Detección de anticuerpos– Virus neutralización
• EP• CEK
– AGID– ELISA
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Muestras para el diagnóstico etiológico
Ave con signos incipientes
– Mucosa de la conjuntiva.
• Hisopado
• Parpado incluyendo conjuntiva
– Tracto respiratorio alto.
• Tráquea
• Raspado de tráquea (con bisturí)
• Hisopado de tráquea
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Hisopado de tráquea
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Control de ILTV: Evitar que el virus contacte al hospedador susceptible
Fuente de
infección
Transmisión Hospedador susceptible
Bioseguridad Bioseguridad Vacunación
Vacunación
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Vacunas
– Vacunas vivas atenuadas:
• CEO: Embrión de pollo (Chicken Embryo Origin).
• TCO: Cultivo celular (Tissue Culture Origin).
– Vacunas vectorizadas en virus (recombinantes):
• FPV-LT: Expresa gB (UL-27) y MAP (UL-34) de ILTV.
• HVT-LT: Expresa gI (US-7) y gD (US-6) de ILTV.
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Evaluación de la protección inducida (bajo
condiciones experimentales) por vacunas
recombinantes y atenuadas.
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Diseño general del estudio
TratamientosVacunación
Desafío (cepa 63140)
vía edad 35 DO
1 NVx-NCh - - -2 CEO Gota en ojo 14 DO +3 TCO Gota en ojo 14 DO +4 HVT-LTio in ovo 18 ED +5 HVT-LTsc subcutánea 1 DO +6 FPV-LTio in ovo 18 ED +7 FPV-LTsc subcutánea 1 DO +8 NVx-Ch - - +
Se evaluó:
• Signos clínicos
• Carga viral en tráquea
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Materiales and métodos
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Materiales and métodos
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Desafío a los 35 días de edad
Resultados
NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io
HVT-LT sc
FPV-LT io FPV-LT sc NVx-Ch0
2.5
5
7.5
a a aa
a
bb
b
Signos clínicos (promedio) 5DPCh
Cli
nica
l sco
re (
aver
age)
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NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io HVT-LT sc FPV-LT io FPV-LT sc NVx-Ch0
2.5
5
7.5
a
a
bc
c
d
c; dc; d
Carga viral 3 DPCh
Ave
rage
log1
0 2-
ΔΔ
Ct
Resultados
Desafío a los 35 días de edad
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Para el desafío a 35 días de edad Signos clínicos:
Carga viral:
NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io HVT-LT sc
< FPV-LT io FPV-LT sc NVh-Ch
(P < 0.05)
NVx-NCh CEO < TCO
HVT-LT io HVT-LT sc
FPV-LT sc FPV-LT io NVx-Ch< <
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Conclusiones del experimento
Vacunas atenuadas mayor protección ante el desafío
Basado en los signos clínicos, la protección inducida por:
HVT-LT fue similar a la conferida por las vacunas atenuadas.
FPV-LT resultó menor que la conferida por las vacunas atenuadas. .
La dificultad de las vacunas vectorizadas para generar el clearence de
virus en la tráquea sugiere que cierta diseminación viral podría estar
ocurriendo en los planteles vacunados con este tipo de vacuna.
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Estudio preliminar de los mecanismos de la vacuna CEO
Pollos SPF vacunados (Vx) Pollos SPF Naïve (NVx)
Vx-Ch Vx-NCh NVx-Ch NVx-NCh
Muestras fueron tomadas a las 6 y 12 horas post-desafío (hpch)
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6 HPCh 12 HPCh 6 HPCh 12 HPCh 6 HPCh 12 HPChNVx-NCh Vx-Ch NVx-Ch
0
200
400
600
2-Δ
ΔC
t (av
erag
e)
Carga viral en tráquea a las 6 y 12 Hs. post desafío con una cepa virulenta de ILTV de aves vacunadas (CEO) y no vacunadas.
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¿Por qué no es conveniente utilizar CEO?
• Virulencia residual
• Latencia
Aves vacunadas pueden convertirse en fuente de virus para aves susceptibles
Posibilidad de reversión
• Caracterización de muestras de campo (Oldomi et al, 2007; 2008).
Mayoría (cerca del 70 %) de las muestras de campo presentaron patrón de RFLP
idénticas o muy cercano a CEO.
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Vacunas atenuadas
VacunaWild-type
VirulenciaVirulencia
AtenuaciónAtenuación
Pasajes en serie
Cultivo celular / embrión
Atenuación
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VacunaWild-typeVirulenciaVirulencia
AtenuaciónAtenuación
Pasajes en serie
Hospedador
Cultivo celular / embrión
Atenuación
Reversión
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Título
(TCID50/ave)
Número de aves
(broilers)
NCh 12
2 x 101 12
2 x 102 12
2 x 103 12
2 x 104 12
Diseño del ensayo
Importancia de la dosis inicial en la infección con ILTV
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3 DPCh 5 DPCh 7DPCh 9DPCh-1
0
1
2
3
4
5
6
7
863140 ILTV load at day 3, 5, 7 and 9 DPCh
1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1.00E+01 Negative Control
Days post-challenge (DPCh)
Vir
al lo
ad (
Log
10 2
-ΔΔ
Ct)
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Carga viral de las aves infectadas con baja dosis (10 TCID50/ave)
3 DPCh 5 DPCh 7 DPCh 9 DPCh-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8913
914
915
916
917
918
919
920
921
922
923
924
Dias post-desafio
Car
ga v
iral
(lo
g10
2-∆
∆C
t)
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Caracterización de aislamientos de ILTV de Argentina (2006-2012).
Genotipo 1 Genotipo 2\4 Genotipo 3 Genotipo 50
10
20
30
40
50
5.36 %
41.07 %
35.71 %
17.86 %
Genotipificacion de aislamientos argentinos
Por
cent
aje
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Caracterización genotípica de aislamientos Argentinos de ILTV (2006-2012)
2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
-5
0
5
10
15
20
25
Distribucion de los genotipos en el tiempo
Genotipo 1Genotipo 2\4Genotipo 3Genotipo 5
Por
cen
taje
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Datos de muestras procesadas en el laboratorio de Sanidad Aviar de INTA EEA Concepción del Uruguay (Entre Ríos)
2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
6 421
85
23
92
Número de brotes por año
Se resolvió prohibir el uso de vacuna CEO en
Argentina
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Cierta replicación viral (en ausencia de manifestaciones clínicas severas), podría estar ocurriendo en el campo en aves vacunadas (TCO o vectorizadas).
No se observan signos de enfermedad
¿Es posible que luego de sucesivos ciclos productivos con animales inmunizados con HVT-LT o con TCO, la carga viral ambiental se reduzca hasta desaparecer?
¿Cuántos ciclos productivos son necesarios para tomar la decisión de suspender la vacunación con cierto grado de seguridad?
¿Qué variables deberían evaluarse antes de decidir la suspensión de la vacunación?
¿Evaluación de anticuerpos séricos por ELISA?
¿Qué tan factible sería dejar de vacunar planteles alojados en zonas donde hubo brotes de ILTV?
Una compañía dejó una granja sin vacunar
ILTV! ¿Uso de aves centinela?
Estos interrogantes abrirán nuevas líneas de investigación
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Agradecimientos
University of Georgia (PDRC)
• Dra. Maricarmen García
• Dr. Guillermo Zavala
• Dr.Andrés Rodríguez Ávila
• Dr. Taylor Barbosa
• Ms. Sylva Riblet
• Dra. Alice Mundt
INTA Instituto de Virología
• Dr. Ariel Pereda
• Dra. María Isabel Craig
INTA EEA Concepción del
Uruguay
• Dr. Federico Vera
• Lic. Florencia Rojas
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Muchas gracias!