Tecnol. Ciencia Ed. (IMIO) 18(1): 5-9, 2003

L

Escalamiento de la producción de Verticilliumlecanii en cultivos sumergidos

Ana Nelis San-luan-Rodríguez, Rosa María Alvarez-Fontela*,Osmany Pérez-Sánchez, Eulalia Gámez-Santiesteban, Joel Hemández-Barrios

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (lCrnCA) CUBA-lO. Vía Blanca 804 esq. Carretera Central, P.O. Box 4026, Ciudad de La

Habana, Cuba. Te]: (+537) 55 7015, Fax: (+537) 338236,COITeoelectrónico (e-mail):cubaJO@quivican.esihabana.cu

RESUMEN

En esta investigación se realizó el escalamiento de la producción de hongos entomopatógenos, verticillium lecanii, de un biorreactor de 10L hasta uno de 500 L, usando la relación potencia/volumen (P/V) como variable de escalamiento y el número de aireación (Na) como parámetro constante. Las biorreacciones fueron llevadas a cabo empleando un medio de cultivo simple compuesto por miel final de caña de azúcar y fosfato di-básico de amonio. Se utilizó un sistema intermitente con dos adicio nes discontinuas de miel final de caña. Los resultados a escala de 10L demostraron que la agitación variable (300-400 min-I) resulta más efi ciente comparada con la agitación constante (300 min-I), para un 95% de confianza. El ejercicio de escalamiento fue satisfactorio obteniéndose para la escala mayor una agitación variable de 170 min-I y 220 min-I, después del segundo incremento, con un flujo de aire de 0.415 vvm. Bajo estas condiciones, los resultados obtenidos fueron: Biomasa, 21 gJ L, rendimiento con base en esporas. 2.53 x 10" UFCg-1 y una producti vidad de 0.447 g L-1h-l, donde el 96% de las esporas son conidios.

Palabras clave. verücillium lecanii. criterios de escalamiento, cultivo sumergido, reactor intermitente

INTRODUCCIÓN

OS retos fundamentales que enfrenta la biotecnología en la sociedad moderna actual están en

caminados a solucionar los grandes problemas mundiales de alimentación, los cuales están vinculados con la protección de los cultivos frente a las plagas que compiten con el ser humano por los alimentos y el problema ecológico asociado a la lucha por eliminarlas,tratando de preservar el ambiente y la naturaleza.

La mosca blanca (Bemisia tabací) causa anualmen te innumerables daños económicos en países tropica les y sub-tropicales, especialmente en los cultivos de viandas, hortalizas y flores ornamentales (Gerling,1990), siendo el control biológico una de las principa les opciones para el control de esta plaga. en sustitu ción de los plaguicidas químicos. Entre los hongos entomopatógenos reportados como controladores de esta plaga, están Beauveria bassiana, Verticillium lecanii y Paecilomyces fumosoroseus (Cloyd, 1996; Hoffmann y Frodsham, 1993; Jackson, 1997).

Mundialmente, se producen y aplican cientos de productos de origen biológico para el control fitosanitario. La mayoría son a partir de bacterias, principalmente Bacillus thuringiensis, así como de diferentes especies de insectos, pero sólo unas decenas de productos se obtienen a partir de hongos, nematodos, protozoos o virus (Álvarezy col., 1999; Hoffman y Frodsham, 1993; Khachatourians,

Keywords: Yerticillium lecanii, scaiing-up criteria.submerged culture. red-batch reactor 1992; Osaka y Shoda, 1996; Taborsky, 1992). En el caso

particular de los hongos, sólo unos pocos se han logrado producir y aplicar de forma constante y masiva. lo cual

'" Autora a quien debe dirigirse la correspondencia(Recibido: Agosto 3. 2002, Aceptado: Marzo 13,2003)

está dado principalmente por el poco desarrollo tecnológico de los métodos de reproducción y es precisamente la

El problema del paso de una escala a otra (escalamiento) es uno de los aspectos de mayor importancia,

Volumen de diseño del

Volumen detrabajo

Número de impulsores

Diámetro deimpulsor

Diámetro deltanque

biorreactor (L) (cm) (cm)

no sólo en los cultivos bioquímicos sino en la indus (L)

tria, en general. En la práctica, se han escogido varios 10 7 9 21

criterios para efectuar el cambio de escala, todos ellos 25 20 9 2850 40 2 14 35500 200 2 25 75

Más recientemente, se han empleado los métodos de

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superación de estas limitaciones lo que puede hacer posible su empleo a gran escala.

Tabla 1.Características de Los biorreactores utilizados

basados en resultados empíricos (Aiba y col., 1973).

modelación matemática basados en microbalances de momentum, masa y calor (pérez, 2000). Sin embargo, se plantea que en tanques agitados (geométricamente similares), con medio y propiedades físicas constan tes, los criterios más utilizados son: Potencia por uni dad de volumen (PN) y coeficientes volumétricos de transferencia de masa (kLa) (Quintero, 1993).

El presente trabajo tiene como objetivo el escalamien to de la producción de hongos, espedficamente Verticillium lecanii en cultivos sumergidos desde biorreactores de 10 L hasta 500 L, mediante e] empleo del criterio de agitación Potencia/Volumen (PN) del sis tema, manteniendo el número de aireación (Na) cons tante, que permita la obtención de altos volúmenes de esporas viables a partir de este hongo con la calidad de seada para su empleo en el control de la mosca blanca.

MATERIALES y MÉTODOS

Microorganismos

Se utilizó una cepa del hongo VerticiLlium lecanii su ministrada por la micoteca del Instituto de Investiga ciones Fundamentales de Agricultura Tropical (INIFAT) de Cuba, con número de colección 3166. La cepa fue transferida a tubos de cultivo con medio agar-papa-dex trosa e incubadas durante 10 días a 28±2°C, para ase gurar crecimiento y esporulación, manteniéndose a 5°C hasta su posterior utilización.

Características de los biorreactores utilizados

Para el desarrollo de] trabajo experimental se utiliza ron biorreactores de 10, 25, 50 y 500 L, cuyos parámetros geométricos aparecen en la Tabla 1.

Medio de cultivo y condiciones de operación

Se utilizó un medio de cultivo compuesto por miel final de caña clarificada conteniendo 15g/L de azúcares reductores totales (ART) y 18 gIL de fosfato dibásico de amonio. Los experimentos se efectuaron por duplicado empleando un sistema intermitente, realizándose dos adi-

ciones de miel durante la fase exponencial de crecimiento a una concentración de l5gIL de ART (Leal, 2000).

Las condiciones de operación en el biorreactor de10 L fueron: Temperatura 28±2°C, flujo de aire de 1 vvm, inóculo de un 10% de] volumen del trabajo, con una concentración inicial de 107 esporas /rnL y no se tuvo control de pH, salvo cuando estuviera por debajo de 5.0, el cual se ajustó a un valor de pH de 6.0 con adiciones de NaOH 2N (Leal, 2000).

Además, a nivel de] biorreactor de [O L, se estudióel efecto de la agitación sobre la proliferación de los microorganismos, trabajando con agitación constante (300 mín") o variable (velocidad inicial de 300 min" y aumentándola hasta 400 min-I, después de introducir la segunda adición de miel en la fase exponencial). Los~~~oofu~np~es~oom~ante~~taili~~"t student" para un 95% de confianza mediante el programa estadístico STATGRAPIDCS PLUS 2.1.

Escalamiento del proceso

Para el escalamiento se utilizó un método empírico conocido como del "Know-how" o "Regla del pulgar" (Einsele, 1976), el cual se basa en mantener constante, al cambiar de escala, un determinado parámetro rela cionado con la calidad del mezclado del sistema. Entre estos parámetros se encuentra la potencia por unidad de volumen (Potencia/Volumen del sistema o PN), el cual fue seleccionado como criterio de escalamiento considerando la velocidad total de transferencia de oXÍ geno por unidad de volumen (número de aireación, Na), constante, lo que implica que la potencia de aireación por unidad de volumen en el sistema (Pg!V) es cons tante. El procedimiento se desarrolló manteniendo se mejante el diseño geométrico, el mismo medio de cul tivo y una densidad de inóculo constante. El ejercicio de escalamiento se realizó a partir de las ecuaciones descritas por varios autores para requerimientos de potencia en tanques agitados para sistemas aireados (Tabla 2) (Aiba y col., 1973; Quintero, 1993).

Con vistas a corroborar la efectividad del criterio seleccionado, se realizó un estudio en biorreactores de 25 y50 litros utilizando el biorreactor de 10 L como prototipo,

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Biorreactores IIJ 112 n3

min:' min:' min'!n4

min:'

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto de la agitación sobre la producción del hongo V. lecanii en un biorreactor de 10 L

10L 100-150 200-300 300-400 400-50025 L 100-150 200-300 300-400 400-50050L 75-112 150-200 220-300 300-370

En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos enDeterminaciones analíticas el estudio realizado con agitación constante y con agi

tación variable sobre los parámetros estudiados. ElConteo al microscopio: Se prepararon diluciones análisis estadístico de los resultados mediante el

Tabla 2.Ecuaciones involucradas en el ejercicio de escalado

Ecuaciones Donde:

Número de aireación (Na)

Número de Reynolds (Re)

Número de potencia (Np)

QN= -a nDi 3

nDi2pRe=--

¡.t

PN = gp pnJ Di 5

Na = velocidad total de transferencia de oxígeno por unidad de volumenQ = flujo volumétrico de aire (m3/min)n = velocidad rotacional (min")Di = diámetro del impulsor (m)

Re = número de Reynoldsp = densidad (g/crn ')¡I = viscosidad (g/cm s)

Np = número de potenciaPg = potencia con aireación (kg mIs)

con niveles de agitación variables. El estudio consistió en determinar el comportamiento de producción de biomasa en cultivos con 48 horas de reacción y ajustando el grado de agitación de acuerdo con la relación n2=nl(D11D2)2!3 utilizadopara el criterio de escalamiento seleccionado (Pg/ V). En la Tabla 3 se muestran los niveles de agitación empleados. En todos los casos se suministró el aire co rrespondiente al establecido por Na constante.

Tabla 3.Niveles de agitación empleados en los biorreactores de 10, 25 y 50 L

de los azúcares con HCl (1:1) a 65°C y durante 10 minutos de calentamiento en un baño a temperatura constante.pH: Se utilizó un potenciómetro digital,modelo MV 870.Viabilidad: Se determinó haciendo diluciones sucesi vas (1/1 O) en agua destilada estéril. Se sembraron por triplicado en placas Petri con medio PDA (papa Dextro sa Agar) y se contaron las esporas germinadas a las 72 horas de incubadas a una temperatura de 30°e. Se reali zó el conteo en aquellas placas que crecieron entre 30 y300 colonias. El resultado se expresó en UFC/mL.

seriadas de 1: 10 a partir de la muestra hasta una con centración adecuada; el conteo se realizó en una cáma ra de Neubauer con una profundidad de 0.10 mm y un área de 0.0025 mnr'.Masa seca gravimétrica (MSG): Se tomaron 10 mLde la muestra y se centrifugaron a 6000 min' durante20 minutos. El sedimento fue lavado 2 veces con agua destilada, centrifugándose en cada paso. Se trasvasó el mismo en una cápsula previamente tarada y se llevó a peso constante en una estufa a 105°e.Azúcares reductores totales (ART): Se empleó el método de Eynon-Lanemodificado (Beart, 1982), previa inversión

estadígrafo "t student" mostró que, excepto para la productividad, el sistema con agitación variable es significativamente mejor que con agitación constante para un 95% de confianza. Según se aprecia, los ren dimientos obtenidos con base en esporas pueden con siderarse satisfactorios, con titulaciones de 1011 esporas/g. Esto es de especial importancia desde el punto de vista productivo y económico, ya que es necesario obtener la mayor cantidad de producto posible, con una alta titulación de esporas, con el objetivo de lo grar el control de una plaga dada, empleando la me nor dosis del material.

Tabla 4.Resultados obtenidos en los cultivos en el biorreactor de 10 L, utilizando agitación constante y variable

Parámetros Agitación constanteX ±S

Agitación variableX ±S

Biornasa (gIL)Renclimiento(esporas! g de micelio seco) Productividad (gIL/h)

17.50 ± 0.707 a5.68 x IOlo ± 0.45xlOlO

a0.312 ± 0.028 a

20.72 ± 0.509 b1.1 x 10" ± 0.14xl01O b

0.37 ± 0.042 a

Letras iguales: no existen diferencias significativas para un 95% de confianza.

(/

E

=-

iU

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Escalamiento del proceso o 25o --50 Litros

En el estudio realizado se observó que el comportamiento de los reactores de 10,25 Y50 L fue similar, obteniéndose concentraciones de biomasa entre 19 y 22 gil y veloci

:oo

(j) 20"Oe'o

-- 25 Litros--10 Litros

dades de proliferación entre 0.042 y 0.047 h', compro-

bándose que la relación ; oc (N3D2) resulta adecua

'0 Reglón de escalamiento~ 15 efectivo+e-

(j)Üe

da para escalar los sistemas, lo que justifica la utilización del criterio empírico seleccionado.

En la Figura 1se muestran los "títulos" de biomasa pro

o 10

2 3 4Niveles de agitación

ducidos para los tres volúmenes de reacción, donde los ren dimientos máximos se obtienen en el punto 3. Cuando se utilizan niveles de agitación por encima de estos valores se aprecia un decrecimiento en la producción de biomasa, debido fundamentalmente a que los cultivos de hongos pueden ser afectados en su crecimiento por efectos de es fuerzos cortantes producidos por el impulsor. Quintero (1993) planteaque, para biorreaccionesque sigan este com portamiento, es aconsejable seleccionar la concentración máxima del producto, por 10 que se seleccionó el punto 3 como región efectiva para realizar el escalamiento.

Con el f111 de confirmar estos resultados, se llevó a cabo la producción de V. lecanii en el reactor de 500 L, ern-

Figura 1. Hecto de la agitación a escala de banco sobre la

producción de biomasa por el hongo V. lecanii

pleando los niveles de aireación y agitación obtenidos en los experimentos de escalamiento a escala de banco, to mando como prototipo el reactor de 10 L (Figura 2). La relación de escalamiento fue de HL2IHU = 2.25 Ylos cál culos se realizaron de acuerdo a la metodología descrita

en la Tabla 5. Como se aprecia en la Figura 2, se obtiene una producción de biomasa de 21.45 gil, un

rendimiento (con base en esporas) de 2.53 x 1011

esporas/g biomasa y una productividad de 0.447 gL-1h-1.Estos resultados son muy similares a los obtenidos a

nivel de banco y, en partí-

Tabla 5.Resultados obtenidos en el ejercicio de escalamiento para el hongo V. lecanii

JI, = 300 rev/min ni= 400 rev/min

Se calculó el número de aireación. Na para el biorreactor de 10L Y resultó:Na = 3.2E-2

N " nDi 3

Na = 2.4E-2

Re = 4.05x lOS(Régimen turbulento)Re = IIDi2p

11 Re = 5.4xI08(Régimen turbulento)

Régimen turbulento, por lo que Np = 6. según fig. 6.4 del Aiba, para agitador tipo turbina.COIlNa y el número de paletas del agitador se obtuvo en la fig. 6.5 del Aiba la relación Pg!P

Pg/P = 0.45Pg

Según la ecuación N p = 3 D' 5 se calcula la potencia del sistema, resultando:pll I

P = O.451kg rn/sDe acuerdo a la relación obtenida de Pg!P. se obtiene la potencia de aireación del sistema:

Pg = 0.203 kg mIsCalculando PgN se obtiene que:

Pg = 29.018 kglm2~V

Aplicando criterio de escalamiento (PgN)J = (PgNh, se calculó, para el biorreactor de 500 L, la potencia de aireación:

Pg2= 5.802 kg mIs

Manteniendo la misma relación PglP se obtuvo la potencia para el sistema 2.

Pz = 12.89 kg rn/s

A partir del Np obtenido y suponiendo régimen turbulento en la escala mavor, se obtiene nz

"2 = 170 rcv/rnin

Con el valor de n calculado se corrobora el número de Reynolds (Re):

Re¡ = 1.73 X 109

Los valores obtenidos confirman que el régimen es francamente turbulento y, por tanto, que puede usarse Np = 6

PglP = 0.55

P = 1.086 kg mis

Pg = O 597 kg mIs

Pg = 85.34 kg/m2s

V

Pg2 = 17.06 kg mis

Pz = 3 i.03 kg m/~

nz = 220 rev!min

Re] = 2.33 X :09

Para el cálculo de los niveles de aire se mantiene constante el Na y se detennina el flnjo de aire (Q), que, para el biorreactor de 500L da un flujo de aire (Q2) = 0.415 vvrn

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~

25 6,00E+09

20 ·5,OOE+09.....J

n Velocidad de agitación (número de revoluciones por minuto), min"

:..:..J..'. 15

4,OOE+09 ..E.....

Na Velocidad total de transferencia de oxígenor» 'o"'-' 3,OOE+09 '5~ 10

2.00E+09 'c()

5 1,OOE+09

O O,OOE+OO O 8 16 20 29 36 44 48

Tiempo (h)

por unidad de volumen (número de aireación)Np Número de potenciaPg Potencia con aireación, kg m S-I

P/V Potencia por unidad de volumen o relaciónPotencia/Volumen

Pg/V Potencia con aireación por unidad de volu--- MSG (giL) Con/rní, men en el sistema

Figura 2. Cinética de proliferación, como masa seca gravimétrica, MSG, obtenida en el biorreactor de 500L por el hongo V. lecanii

cular, la productividad del sistema es mayor, lo cual co rrobora un ejercicio de escalamiento satisfactorio. Por otro lado es importante destacar que, bajo estas condiciones, el 96% de las esporas producidas son conidios, aspecto de interés debido a su resistencia y estabilidad.

CONCLUSIONES

Puede concluirse que el empleo de la agitación variable (300-400 min') durante la producción del hongo V. lecanii en un reactor de 10 L con alimentación escalona da, resulta más eficiente comparada con la agitación constante (300 min-I), ya que todos los parámetros eva luados excepto la productividad fueron significativamen te mayores para un 95% de confianza. Por otro lado, la biomasa producida con diferentes aportes de energía y tres volúmenes de reactores (10, 25 y 50 L) mostró un comportamiento similar, justificando la utilización de] parámetro de agitación (Pg/V) como criterio empírico para el ejercicio de escalamiento. Los resultados obteni dos en el reactor de 500 L, de acuerdo con esta investi gación, fueron similares a los alcanzados a escala de banco, lo que indica un escalamiento satisfactorio. Las condiciones de operación calculadas fueron de una agi tación de 170-220 rev/min y un flujo de aire de 0.415 vvm. Es importante destacar que, bajo estas condicio

nes, se logra una productividad del sistema de 0.447 gl,. lh-1 Yque el 96% de las esporas producidas son conidios.

NOMENCLATURA

Q Flujo volumétrico de aire, m3 min'Re Número de ReynoldsUFC/rnL Unidades formadoras de colonias por mililitro

LETRAS GRIEGAS

Viscosidad, g cm" S-1

Densidad, g cm'

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ART Di HL kLa MSG

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