aportes de la biología molecular en el estudio de los ... trastornos... · eje somatotropo (gh /...

APORTES de la BIOLOGÍA MOLECULAR

en el ESTUDIO de los NIÑOS con TALLA BAJA

Bq. Paula A. Scaglia [email protected]

Centro de Investigaciones Endocrinológicas “Dr. César Bergadá”

(CEDIE) CONICET –FEI – División de Endocrinología

Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez.

CRECIMIENTO

Constituye uno de los mejores indicadores del estado de salud de un niño.

Proceso complejo en el que participan múltiples factores

Genéticos

Étnicos

Hormonales

Nutritivos

Afectivos 95,4%

99,6%

Talla

Talla Objetivo Genética (TOG, cm):

Varón: (talla del padre + talla de la madre) + 6,5

Mujer: (talla del padre + talla de la madre) - 6,5

Lejarraga H. y Orfila J. Arch. Arg. Pediatr. 1987, 85:209-222

CRECIMIENTO NORMAL Estatura (Talla)

CRECIMIENTO: EJE SOMATOTROPO

Sanderson, I. R. (2014) Growth problems in children with IBD Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol.

CARTILAGO de CRECIMIENTO

Baron, J. et al. Nat Rev Endocrinol. 2015 Dec;11(12):735-46.

Andrade a. et al. Horm Res Paediatr. 2017;88(1):22-37.

TALLA BAJA

Uno de los motivos de consulta más frecuentes en Pediatría,

especialmente para el endocrinólogo pediatra.

Aquella que se encuentra por debajo de –2 DE para edad y sexo en

relación a la media de la población de referencia.

A mayor desvío de talla con respecto a la

media de la población y/o al potencial genético

de crecimiento de la familia, mayor

probabilidad de encontrar una

patología subyacente.

Talla Baja

Patológica Idiopática Variantes de la normalidad

Desproporcionada Proporcionada

Displasias

esqueléticas

Cromosomopatías

Raquitismo

RCIU

Cromosomopatías

Smes. dismórficos

Desnutrición

Deprivación psicoafectiva

Enfermedades crónicas

Iatrogenia

Enfermedades Endocrinas

Retraso

constitucional

del crecimiento

y desarrollo

Talla Baja

Familiar Prenatal Postnatal

TALLA BAJA

CURVAS DE CRECIMIENTO: VARIANTES DE LA NORMALIDAD

TALLA BAJA FAMILIAR

Edad ósea dentro de 2 DS de la EC

Pronóstico de talla final acorde a la

talla parental

RETARDO CONSTITUCIONAL DE CRECIMIENTO

Edad ósea atrasada más de 2 DS de la EC

Pronóstico de talla final, en general, acorde a la talla parental

Retardo puberal en algunos casos

Talla Baja



Displasias

esqueléticas

Cromosomopatías

Raquitismo

RCIU

Cromosomopatías

Smes. dismórficos

Desnutrición



Iatrogenia


Retraso

constitucional

del crecimiento

y desarrollo

Talla Baja


Renales

Gastrointestinales

Hematológicas

Cardiopulmonares

Hepáticas

Inmunodeficiencias

Metabolopatías

Alteraciones

del eje GH-IGFs

Causa genética

no identificada?

TALLA BAJA

Hipotiroidismo

Hipo/Hipercortisolismo

Diabetes

Alteraciones del eje GH-IGFs

ESTRATEGIAS para el ESTUDIO MOLECULAR

GEN CANDIDATO ENFOQUE GENOMICO

Variaciones en el

número de copias

(CNV)

Mutaciones puntuales

o pequeñas

Gen candidato

(más probable)

Gen candidato

Gen candidato

Negativo

Negativo

Secuenciación de genes

“en serie” Mutación

(Variante

patogénica)

Hallazgos

bioquímicos

Hallazgos

clínicos Imágenes,

otros estudios

Diagnóstico

molecular

Diagnóstico molecular

GEN CANDIDATO: requiere conocer la secuencia a investigar



Variaciones en el

número de copias

(CNV)


o pequeñas

FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification)



Variaciones en el

número de copias

(CNV)


o pequeñas

Secuenciación

(Sanger)

G90 E91

N92 S93 C94 Y95 F96 N97

F92 I93 V94 Y95 L96 H97



http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/

lectures/techniques.htm

www.ucm.es/.../practicas/secuencia/Automat1.jpg

Gen IGFALS:

c.103delG

(Glu35Lysfs*87)

(Homocigoto)

N Engl J Med 2004;350:570-7. Domené et al.

SECUENCIACIÓN: MÉTODO de SANGER (PRIMERA GENERACIÓN)



Variaciones en el

número de copias

(CNV)


o pequeñas

Secuenciación

(Sanger)

Microarreglos:

CGH-array (Comparative Genomic Hybridization)

SNP-array (Single Nucleotide Polymorphism)



Karampetsou E1et al. J Clin Med. 2014 Jun 20;3(2):663-78.



CNV: ENFOQUE GENOMICO



Variaciones en el

número de copias

(CNV)


o pequeñas



Secuenciación

(Sanger)

Microarreglos:



Canton et al. Eur J Endocrinol2014;171(2):253-62



Variaciones en el

número de copias

(CNV)


o pequeñas



Secuenciación

(Sanger)

Microarreglos:



Secuenciación masiva en

paralelo (NGS)

Genoma (WGS)

Exoma (WES)

Paneles de genes

M.J. Bamshad et al. Nat. Rev. Genet. 12 (2011) 745–55

SECUENCIACIÓN: Next Generation Sequencing (NGS)

Determinado grupo de

genes (pocos a miles).

Puede incluir regiones

regulatorias o intrónicas

Tamaño variable

Comerciales o diseñados

Costo y cantidad de

muestras/corrida depende

del tamaño del panel

Secuencias exónicas de

todos los genes que codifican

proteínas (180000 exones)

1-2% del genoma

~30 Mb (~30.000.000 pb)

~30000-50000

variantes/individuo

Todo el material genético

contenido en cada célula

(incluye ADNmt)

~3,1 Gb (haploide)

~20000-25000 genes

~2-4 millones

variantes/individuo

Genoma (WGS) Exoma (WES) Panel de genes

Targeted sequencing (Captura de las regiones de interés)

Whole Genome Sequencing Whole Exome Sequencing

SECUENCIACIÓN: Next Generation Sequencing (NGS)

Variante(s)

candidata(s)

Variantes

gen candidato???

o

múltiples genes

candidatos

Hallazgos

bioquímicos

Hallazgos

clínicos Imágenes,

otros estudios

Validación

Secuenciación

de genes

“en paralelo”

Diagnóstico

molecular

NGS

INFO

(Paciente,

herencia, BD,

fenotipo, etc) Bioinformática

(Priorización,

filtrado)

In silico

In vitro

In vivo

ENFOQUE GENÓMICO: no requiere hipótesis previa acerca del gen potencialmente afectado

Dr. Muin Khoury on Twitter

Variantes / individuo

WGS ~2-4 millones

WES ~30000-50000

El desafío es interpretar los resultados…

CRECIMIENTO – GENES INVOLUCRADOS



SOX9

SHOX

LARP7

BRF1

CREBBP

PTPN11

SPRED1

PRKAR1A

PIK3R1

ATR

DNA2

TRAIP

SMARCAL1

LIG4

XRCC4

MCM9

RECQL4

ERCC6

NIPBL

LMNA

TRIM37

CDH7

SCARP

DHCR7

PCNT

CRIPT

POC1

CUL7

OBSL1

ORC1

CDKN1C

GNAS1 locus

Ejes

Somatorotpo

Tiroideo, otros

Col2a1

Col9a

Col10a1

Col11a

ACAN

COMP

MATN3

FBN1

FGFR3

PTHLP

PTH1R

IHH

BMPR1B

GDF5

NPR2

WNT3

ROR2

WNT5A

DVL1

IGF2

Displasias

esqueléticas

Talla Baja

Sindrómica

CRECIMIENTO – GENES INVOLUCRADOS

GH1 GHRHR GHSR SOX3 BTK

ALMS1 RNPC3 IFT172 PROP1

POU1F1 LHX3 LHX4 HESX1

OTX2 PITX SOX2 SPR GLI2 IGSF1

SPINK5 GLI3 FGF8 FGFR1

PROKR2 HMGA2 GRP161

SHH GHR

STAT5B STAT3 IGFALS IGF1 IGF2 IL2RG IKBKB PAPPA2 IGF1R Eje

GH-IGFs

Ejes

Somatorotpo

Tiroideo, otros

FGFR3

PTHLP

PTH1R

IHH

BMPR1B

GDF5

NPR2

WNT3

ROR2

WNT5A

DVL1

IGF2 Col2a1

Col9a

Col10a1

Col11a

ACAN

COMP

MATN3

FBN1

SOX9

SHOX

LARP7

BRF1

CREBBP

PTPN11

SPRED1

PRKAR1A

PIK3R1

ATR

DNA2

TRAIP

SMARCAL1

LIG4

XRCC4

MCM9

RECQL4

ERCC6

NIPBL

LMNA

TRIM37

CDH7

SCARP

DHCR7

PCNT

CRIPT

POC1

CUL7

OBSL1

ORC1

CDKN1C

GNAS1 locus



Sanderson, I. R. (2014) Growth problems in children with IBD Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol.

EJE SOMATOTROPO (GH / IGFs / IGFBPs)

Adaptado a partir de Rory Curtis et al. Nature Reviews Drug Discovery 4, 569 (2005)

GHRH Grelina

Somatostatina

GH

IGF-I IGFBP-3/-5

ALS

GHR

GHSR

GHRHR

IGF-IR

Deficiencia

de GH

TALLA BAJA: ALTERACIONES GENÉTICAS del EJE SOMATOTROPO

Insensibilidad

a la GH

Insensibilidad

al IGF-I

GHRH Grelina Somatostatina

GH

IGF-I IGFBP-3/-5

ALS

GHR

GHSR

GHRHR

IGF-IR

GH IGF-I

Deficiencia primaria

de IGF-I

TALLA BAJA: ALTERACIONES GENÉTICAS


GH

IGF-I IGFBP-3/-5

ALS

GHR

GHSR

GHRHR

IGF-IR

Combinada

o múltiple

PROP1

POU1F1

LHX3

LHX4

HESX1

OTX2

PITX

SOX2

SPR

GLI2

IGSF1

SPINK5

GLI3

FGF8

FGFR1

PROKR2

HMGA2

GRP161

SHH

Deficiencia

de GH GH IGF-I

Aislada

GH1 (AD/AR)

GHRHR (AR)

GHSR (AR)

SOX3

BTK

ALMS1

RNPC3

IFT172

~27 genes

Deficienci

a de GH GH IGF-I

Aislada GH1

(AD/AR)

GHRHR

(AR)

GHSR (AR)

SOX3

BTK

ALMS1

RNPC3

IFT172

Romero CJ1, Pine-Twaddell E, Radovick S. J Mol Endocrinol. 2011 Jun 9;46(3):R93-R102.

TSH

Prl

GH

LH / FSH

ACTH


Insensibilidad a la GH GHRH Grelina Somatostatina

GH

IGF-I IGFBP-3/-5

ALS

GHR

GHSR

GHRHR

IGF-IR

GHR ~300 pacientes, ~70 mutaciones

Dominio extracelular (Insensibilidad clásica a la GH, GHBP -):

Sme de Laron. AR.

Dominio transmembrana o intracelular (Insensibilidad no clásica a la

GH, GHBP +). AR (AD).

STAT5B: autoinmunidad e inmunodeficiencia. AR. ~10 pacientes

STAT3 (activante): autoinmunidad e inmunodeficiencia. AD. ~25 pacientes

IGFALS: AR.~37 pacientes

PAPPA2: AR.

IGF1: PEG, microcefalia, sordera neurosensorial. AR (AD) ~5 pacientes

IGF2: PEG. Herencia paterna.

IKBKB: Inmunodeficiencia. AR, AD.

IL2RG: Inmunodeficiencia Combinada Severa ligada al X

GH IGF-I

J Clin Invest. 2009;119(11):3189-3202. Ke Shuai & Bin Liu. Nat Rev Immunol 3, 900 (2003)

IGF1, IGBP3, ALS

GH



GH

IGF-I IGFBP-3/-5

ALS

GHR

GHSR

GHRHR

IGF-IR

Insensibilidad al IGF-I IGF1R IGF-I GH

Jiping Zha, and Mark R. Lackner Clin Cancer Res 2010;16:2512-2517

Hormona de crecimiento (rhGH)

Deficiencia de GH (aislada o combinada)

Sme. de Turner

Sme. de Prader Willi

RCIU

Talla Baja Idiopática: aprobado en EEUU

(talla < -2,25 SDS), no en nuestro país

TALLA BAJA: TRATAMIENTO

rhIGF-1 (no disponible en nuestro país)

Insensibilidad a GH

Además…

Reemplazo de otras

hormonas según los

ejes afectados

Inhibición de la

pubertad

Tratamiento específico

según comorbilidades

Talla Baja



Displasias

esqueléticas

Cromosomopatías

Raquitismo

RCIU

Cromosomopatías

Smes. dismórficos

Desnutrición



Iatrogenia


Retraso

constitucional

del crecimiento

y desarrollo

Talla Baja


Causa genética

no identificada?

TALLA BAJA

TALLA BAJA IDIOPATICA

Talla < -2 SDS para edad, sexo y grupo poblacional

No son PEG

Sin evidencias de enfermedades sistémicas, nutricionales o cromosómicas

Sin alteraciones endocrinas

Sin deficiencia de GH ni insensibilidad a la GH

Grupo muy heterogéneo de pacientes

Respuesta al tratamiento con rhGH muy variable debido a los diversos mecanismos

fisiopatológicos subyacentes

TALLA BAJA IDIOPATICA

Displasias

esqueléticas

Talla Baja

Sindrómica

GH1 GHRHR GHSR SOX3 BTK

ALMS1 RNPC3 IFT172 PROP1

POU1F1 LHX3 LHX4 HESX1

OTX2 PITX SOX2 SPR GLI2 IGSF1

SPINK5 GLI3 FGF8 FGFR1

PROKR2 HMGA2 GRP161

SHH GHR

STAT5B STAT3

IGFALS IGF1 IGF2 IL2RG IKBKB PAPPA2 IGF1R Eje

GH-IGFs

FGFR3

PTHLP

PTH1R

IHH

BMPR1B

GDF5

NPR2

WNT3

ROR2

WNT5A

DVL1

IGF2 Col2a1

Col9a

Col10a1

Col11a

ACAN

COMP

MATN3

FBN1

SOX9

SHOX

LARP7

BRF1

CREBBP

PTPN11

SPRED1

PRKAR1A

PIK3R1

ATR

DNA2

TRAIP

SMARCAL1

LIG4

XRCC4

MCM9

RECQL4

ERCC6

NIPBL

LMNA

TRIM37

CDH7

SCARP

DHCR7

PCNT

CRIPT

POC1

CUL7

OBSL1

ORC1

CDKN1C

GNAS1 locus



GH baja pero detectable

Mutaciones puntuales en GH1

Buena respuesta al

tratamiento con rhGH

M

P

rhGH Inicia

pubertad

5 años

93,9 cm

-3,4 SDS

G

207Q 209R/H 208C 210S 211V

GH1: c.626G>A, p.R209H (p.R183H)

Tipo IB (AR) o II (AD) Deficiencia aislada de GH

TALLA BAJA por DEFICIENCIA de GH

Tipo II (dominantes negativas):

Pueden evolucionar desarrollando

deficiencia de otras hormonas

hipofisarias

Reemplazo de otras hormonas

según los ejes afectados

TALLA BAJA por DEFICIENCIA de GH

Deleciones del gen GH1 completo

GH no detectable

Tipo IA (AR)

rhGH

2.4 años

67.5 cm

-6.3 SDS

Desarrollo de Ac anti-GH bajo

tratamiento con rhGH

Deficiencia aislada de GH

Si el tto con rhGH deja

de ser efectivo

2700bp

MK

(Chernausek SD, et al. JCEM 92:902-10, 2007)

wt / p.G223G wt / p.N92Ffs*16

p. N92Ffs*16;G223G

c.328_344del;723C>T

M

F

rhIGF-I

Triptorelina

X

X

X

X

X

X

X

X

X

TH

1 año

60.9 cm

-4.91 SDS

TALLA BAJA por INSENSIBILIDAD a la GH

GHR

Tratamiento con

rhIGF-I

+

Inhibición de la

pubertad

TALLA BAJA por INSENSIBILIDAD a la GH

Sindrome de Laron: GHR

ESTUDIO del NIÑO con TALLA BAJA

Anamnesis detallada: antecedentes familiares (talla padres) y personales (EG, peso y

longitud al nacimiento, curva de talla, velocidad de crecimiento)

Examen físico: talla, peso, BMI, proporciones corporales

Estudios bioquímicos

Análisis de rutina: descartar anemias, parasitosis, malabsorción, desnutrición, patología renal y hepática,

Determinaciones hormonales: descartar hipotiroidismo, hipercortisolismo, etc

Pruebas bioquímicas para evaluar el eje somatotropo (Prueba de estímulo de GH, Prueba de

generación de IGF-I)

Estudios de Imágenes: edad ósea, descartar displasias óseas

Cariotipo: Descartar Sme. de Turner

Estudio molecular

ESTUDIO MOLECULAR del NIÑO con TALLA BAJA

Permite arribar a un diagnóstico etiológico.

Ayuda a comprender los mecanismos fisiopatológicos subyacentes.

Ayuda a predecir la evolución de la enfermedad, permitiendo realizar un seguimiento más adecuado.

Contribuye en la elección de un tratamiento individualizado.

Brinda la posibilidad de realizar el asesoramiento genético apropiado a las familias afectadas.

Investigación

Práctica clínica (paciente individual)

Enfoque genómico

Identificar nuevos genes y vías implicados en el crecimiento

Contribuye a mejorar la comprensión de la variabilidad fenotípica

Definir nuevos diagnósticos y estrategias terapéuticas

Genetic Evaluation of Short Stature

Andrew Dauber, Ron G. Rosenfeld, Joel N.

Hirschhorn.

aportes de la biología molecular en el estudio de los ... trastornos... · eje somatotropo (gh /...

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