MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTAMINACIONFECAL (coliformes, colifecales, y E. coli)

I. INTRODUCCION:Los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, principalmente son: Coliformes, Colifecales, Escherichia coli, y Streptococus del grupo D de Lancefield; por cuanto normalmente se le encuentra en el tracto digestivo del hombre y de animales de sangre caliente.

A) COLIFORMES: El termino coniforme , comprende los géneros: Escherichia , Enterobacter , Klebsiella , y Citrobacter , y se caracteriza por utilizar la lactosa como fuente de carbono. Los Coliformes distintos a la E. coli, persisten en el suelo o sobre las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos de campo.

B) COLIFECALES: Son un grupos de microorganismos procedentes de la incubación del inóculo a la temperatura de 44 a 45.5°C, que contiene por lo general un alto porcentaje de E. coli tipo I y II, por lo que son muy indicativos de la contaminación fecal.

C) ESCHERICHIA COLI: Este microorganismo habita naturalmente en el tracto digestivo del hombre y de otros animales de sangre caliente. La presencia de este microorganismo en un alimento dado se interpreta como contaminación directa o indirecta de origen fecal, por lo que se considera a la E. coli como el indicador clásico de la presencia simultanea de bacterias patógenas, entéricas, entre ellas, salmonella tiply, otras salmonellas, shigella, vibrios, parásitos diversos, y virus entéricos.Sin embargo la presentencia de la E. coli en un alimento no indica que exista también necesariamente gérmenes patógenos, si no simplemente advierte el riesgo de que pudieran estar presentes.En conclusión, podemos considerar los siguientes: La E. coli, en un buen indicador de la contaminación fecal para la mayoría de los alimentos. Los demás coliformes, son buenos indicadores de una limpieza y de infecciones no adecuadas o de una industrialización o procesamiento no correcto de los alimentos. Los coliformes fecales, tiene una mayor probabilidad de contener gérmenes de origen fecal, por lo que son organismos indicadores mucho mas seguro de la contaminación fecal que los coliformes totales.

MEDIO DE CULTIVO: Los medios de cultivo en la presente práctica son los siguientes:

A) Para coliformes : método de recuentro en placas : Se utiliza el agar rojo violeta con sales biliares (VRBA), que tiene la siguiente composición:

Cristal violeta 2.0mg Rojo neutro 30.0mg Extracto de levadura en polvo 3.0mg Sal biliar N° 3 1.5mg Lactosa 10.0mg Cloruro de sodio(Na Cl) 5.0gr Peptona 7.0gr

Agar Agar 15.0gr Agua destilada 1.0lt

Después de la disolución llevar el pH del medio 7.3. El calentamiento se realiza a mas o menos 100°C para la disolución de los ingredientes, el afeminar bacterias vivas que pueden dificultad la numeración de coniforme, hace q no haya necesidad de esterilizar el medio, solo se conserva a 50-60°C después de lograrse la disolución. Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram.(-) que fermentan la lactosa (denominada bacteria coniforme o coli-aerógenes), como la E. coli, Citrobacter, freundii, Enterobacter aerógenes, etc., si no también la bacteria intestinales lactosa (+) conocida como colifecales, patógena indeterminados como la salmonella, Arizona Shingella, y las especies denominadas “Paracolobactrun”. El medio se caracteriza por que lleva consigo un colorante apropiado y sales biliales que van a inhibir el desarrollo de las bacterias que no son coliformes.

1. Pruebas Presuntiva, para determinar coliformes totales: para esta prueba se utiliza el Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a doble y simple concentración cuya composición es la siguiente:

Verde brillante 15.0 mg Peptona 10.0 gr Lactosa 10.0 gr Bilis deshidratada 20.0 gr Agua destilada 1.0 Lt

Esta formula es a simple concentración, para obtener doble concentración, se adiciona el doble de cada componente en un litro de agua destilada. Después de la disolución llevar al pH a 7.0–7.2 y repartir en tubos de ensayo a razón de 9.0 ml. Provisto de una campana Durham y esterilizar a 121°C x 15minutos.

2. Prueba Confirmativa o Test de Eijkam, para determinar Colifecales: Se utiliza los siguientes medios de cultivo: Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a simple concentración; y Caldo Pectonado cuya composición es la siguiente:

Peptona o tristona 10.0gr Cloruro de Sodio 5.0gr Agua Destilada 1.0Lt

Después de la disolución llevar el pH a7.0 y repartir a razón de 5.0ml por tubo de ensayo y esterilizar a 121°C por 20minutos.

II. OBJETIVO:

Adiestrar al estudiante con las técnicas e interpretación de los microorganismos indicadores en los alimentos.

III. REVISIÓN LITERARIA:

Escherichia coli es una de las bacterias más abundantes en el tubo digestivo de los mamíferos. En condiciones normales, constituye una parte esencial de la flora bacteriana humana, a la que se atribuyen efectos beneficiosos para la salud. Existen, sin embargo, cepas capaces de provocar alteraciones graves en forma de enteritis.

Principios. Las investigaciones ecológicas han puesto de manifiesto que E. Coli, procede del intestino de hombre y de los intestinos de los animales de sangre caliente, si bien puede sobrevivir y aun multiplicarse en determinados substratos. Del origen fecal de E. Coli, se concluye que si esta bacteria se encuentra en algún alimento ello indica que han tenido lugar una contaminación de origen fecal y que, consiguientemente, existe el riesgo de que hayan llegado al alimento en cuestión microorganismos patógenos de procedencia entérica.En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienización eficaz, que asegura su inocuidad para el Consumidor, por lo general, la determinación de coliformes o gérmenes del grupo coliaerógenes: gérmenes que, incubados a 37° C, fermentan la lactosa con producción de gas en un medio, con verde brillante y 2 % de bilis. Ya hemos señalado antes que esta determinación no tiene necesariamente relación con una contaminación de origen fecal y consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos de procedencia entérica, sino que es sólo una indicación de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial de los alimentos.Se utiliza a veces también la denominación "coliformes fecales" refiriéndose a los microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contiene sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5 °C.

Bacterias coliformes:

Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre sí en características pequeñas; se diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad solamente se reconocen seis. Se sabe que dos aparecen con frecuencia suficiente como para mencionarse: E. Coli y Aerobacter aerogenes.

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.

Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. Las colonias de A. Aerogenes en el mismo medio son mayores, muy mucoides, y de color Rosado; con frecuencia tienen un centro parduzco pequeño.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS:

3.1 Materiales: Placas petri. Tubos de ensayo. Pipetas. Frascos erlenmeyer. Estufa de incubación Baño maría. Agar rojo violeta con

sales biliales. Caldo Lauryls sulfato.

Muestra (Leche).

3.2. Procedimiento:

Para Coliformes: Recuento en Placas:

La siembra se realizo por incorporación y para ello la forma de proceder es como sigue: Primero se preparo las siguientes diluciones:

mezclar en placas petri estériles 1ml de la serie de diluciones con mas o menos 15ml del medio de cultivo y mezclar, mover cinco veces en sentido horario, cinco en sentido anti horario y cinco a los costados, dejar solidificar a temperatura ambiente.

Seguidamente adicionamos una capa fina de Agar aproximadamente 5ml para luego llevar a incubar a 37°C por un tiempo de 24 - 48 horas.

Finalmente luego del tiempo mencionado contar las colonias de las placas que contienen entre 30 – 300 colonias, el número de colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo violeta, y reducir el número de coliformes por gramo o mililitro de muestra.

Para Coliformes, Colifecales y E. Coli: Método de Número Más Probable (NMP).

1. Para Colifomes Totales:

Pipetear 10ml del homogenizado del alimento, en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2%de doble concentracion.

Pipetear 1ml de homogenizado en tres tubos de ensayo con caldo lactosadoverde brillante bilis(CLVBB) al 2%.

Agitar cada tubo de ensayo e incubar a 36 – 37°C x 24horas. Así mismo pasado el tiempo anotar los tubos de ensayo que muestren producción de gas más del 1/3 del volumen de la campana de Durham.

Elegir la dilución más alta (la más diluida), en que sean positivos de formación de gas los tres tubos y las dos diluciones superiores (más diluidas) más próximas. Si esto no es posible, ya que ninguna de las diluciones trabajadas presentan tres tubos positivos, seleccionar las tres últimas diluciones y anotar el número de tubos positivos en cada una.

Para determinar el número de colifecales: Se sigue el test de Eijkman, compuesto por dos tubos de ensayo conteniendo CLVBB al 2% a simple concentración, uno y caldo peptonado (CP) el otro, en los que siembran por azadas el inoculo de cada tubo positivo de la prueba anterior, luego se incuba en baño maría a 44°C por 24 horas. Para el calculo se anotan los tubos de CLVBB al 2% con formación de gas (aquí no interesa ya la condición de mas de un tercio del volumen de la campana, suficiente con que haya igual o cercano a un tercio de gas) y su respectivo CP con formación de indol (formación de anillo rojo grosella con tres gotas del reactivo de kovacs). Cualquier variación contraria se considera prueba negativa. Luego del triple numero obtenido, se logra el valor respectivo de la tabla de NMP y se procede igual que para el anterior caso visto.

V. RESULTADOS:

Número de coliformes:

Lecturas

Placa 2A: --- fd = 102 N = 26 x fdPlaca 3A: --- fd = 103 N = 26 x104

Placa 4A: 26 fd = 104 N = 2.6 x105 ufc/ml.Diluciones: -1: 10 = 3

-2: 100 = 1-3: 1000 = 0

Lectura: 3 – 1 – 0.Valor de la tabla del NMP: 43.Dilución intermedia: fd = 100.Formula:

Población/ml = NMP x fd(i) 100

N° = 43 x 100 100N° = 4.3 x 101 col/ml.

VI. DISCUCIONES:

Se obtuvo en la práctica realizada resultados negativos a la prueba de colifecales, por ello se descarta la presencia de colifecales en el alimento usado como muestra, por ende descartamos la presencia de E.coli. Esto nos indica que el alimento ha sido manipulado en condiciones asépticas, sin descartar la presencia de otros microorganismos, pero con un nivel de carga aceptable para el consumo humano. A todo esto según bibliografía revisada una carga baja de presencia de microorganismos hace que el alimento se apto para el consumo y no pueda ser perjudicial para la salud

VII. CONCLUSIONES:

Concluimos con respecto a los objetivos antes relacionados que la determinación de bacterias coliformes fecales y totales, pueden estar presentes tanto en los alimentos como en los sistemas de agua potable, ya que estos microorganismos se pueden transmitir a través de las heces fecales.La mayoría de los enterococos, estreptococos y demás grupos o géneros microbianos son algunos patógenos y no patógenos, de estos se pueden preparar fermentaciones, que mediante un largo proceso, llegan a ser elaboradas en productos comestibles, garantizando al consumidor la mayor seguridad al consumir ese producto fermentado.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

García, Monses. Microbiología de los Alimentos J.M. J.A.Y. Microbiología Moderna de los Alimentos

CUESTIONARIO

1) Diga las razones por las que la prueba de kliger es importante para la determinación de la E. coli.Por que mediante la observación de las características de la muestra