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ANALISYC II
ANTECEDENTES
R.D. 2001/1995
Directiva 94/36/CE Colorantes alimentarios
Naturales Sintéticos
Azoicos No azoicos
Sólo están autorizados aquellos
colorantes azoicos que tienen
TODOS sus grupos
aromáticos sulfonados
La legislación europea impide
desde 2004 la comercialización
de productos que contengan Sudán I-IV
Sudán I-IV
ANTECEDENTES LOS SUDANES I-IV
Sudán III
Sudán IV
Sudán I
Sudán II
Intensos colores por
resonancias electrónicas
Grupo azo conjugado con anillos aromáticos por ambos extremos
(−N=N−)
ANTECEDENTES LOS SUDANES I-IV
400,0 420 440 460 480 500 520 550,0
0,003
0,02
0,04
0,06
0,08
0,092
nm
A
sudan IV
sudan III
sudan II
sudan I
Absorciones máximas en la región visible del espectro comprendidas entre 450-540 nm
Disolvente: acetonitrilo, concentración: 1 mg/mL
ANTECEDENTES LOS SUDANES I-IV
Sudán III
Sudán IV
Sudán I
Sudán II
Muy solubles en disolventes orgánicos apolares
Poco polares y básicos (pKa = 11-12)
Baratos (5-6 euros/kg)
Toxicología: clasificados como “carcinogénico clase 3” por la IARC
Intensos colores por
resonancias electrónicas
Grupo azo conjugado con anillos aromáticos por ambos extremos
(−N=N−)
Muy utilizados en el sector industrial
LA CRISIS ALIMENTARIA DE LOS SUDANES
Importación de especias
Europa : 2003-2006
“Crisis alimentaria de los sudanes”
Francia, 2003, alertó por vez la presencia
de Sudan I en partidas de chile en polvo
procedentes de India
2003 -…. , episodios semejantes en toda Europa
Reino Unido, Italia, Austria, Alemania, España,
Países Bajos, Hungría
- Necesidad de colorear artificialmente especias (chile y otras especias en
polvo), que aparecen a menudo con colores poco intensos
¿Origen de la aparición de los sudanes y de otros colorantes ilegales en alimentación?
-El consumidor o el productor exigen un efecto picante muy alto y un color
rojizo intenso
Adulteraciones en salsas y condimentos
SALSAS Y CONDIMENTOS: PROBLEMÁTICA ANALÍTICA
Procedimientos largos y laboriosos
Recuperaciones de analitos bajas
Interferencias
Espectrofotometría DAD
Espectrometría MS
Interferencias de
carotenoides
Matrices variadas
y complejas
HPLC-DAD: LOD
Insuficientes en
ocasiones
HPLC- DAD:
Interferencias de
carotenoides
HPLC-MS:
Interferencia de la
capsaicina
Licopeno y -caroteno en tomate
Capsantina y capsorrubina en pimiento
Fitoeno, caroteno acíclico presente en el tomate
MSPD
HPLC-DAD
Separación cromatográfica por
HPLC
Preparación de la muestra Detección
OPTIMIZACIÓN DE LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Condiciones finales
• Columna:
Phenomenex Synergy Polar RP
• Elución isocrática a 1.0 mL/min
• Temperatura: 30ºC
• Longitud de onda DAD
- sudán I y sudán II a 484 nm
- sudán III y sudán IV a 510 nm
Separación cromatográfica de los colorantes
azoicos (Sudán I-IV y Para Red)
2.
• Fase móvil ternaria:
MetOH 65% / ACN 20% / agua 15%
ttotal= 10 minutos
- disolvente de extracción
- t. de preparación de la muestra
- Presencia de interferencias
Muestra +
Sorbente
Extractos
PROCEDIMIENTO B
PROCEDIMIENTO A
Sorbente para la purificación
Lana de vidrio
Extractos
Muestra +
Sorbente
Lana de
vidrio
Lana de
vidrio
Sorbente
para la
purificación
OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD, DISPERSIÓN DE LA MATRIZ EN FASE SÓLIDA
- Dispersión de la muestra en un soporte sólido
MSPD
- Generación de una mezcla sólida
- Completa disgregación de la muestra
Carácter cromatográfico suficiente
para la extracción selectiva
de los componentes y analitos
- Empaquetamiento en columna SPE
- Elución secuencial mediante el empleo de
disolventes de polaridad creciente o decreciente
Ventajas
OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD
Carotenoides (apolares)
ESTRATEGIA DE ELUCIÓN DE LOS ANALITOS
Carga de
la muestra Lavado
Elución
Frita
Materia
grasa
Hexano 1+3 mL
Sudan I-IV
Carotenoides
apolares
Acetonitrilo 1+3 mL
Azúcares
Sales
….
H2O
Carotenoides
polares y
apolares
Metanol 2 mL
Analitos: Sudan I-IV
OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD
C18
Sílic
e
Sílic
e a
cti
vad
a
Alú
min
a N
Alú
min
a N
act.
Flo
risil
Celite
sudán I
sudán III
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
rec
up
era
ció
n,
%
Recuperaciones en función del tipo de sorbente
sudán I
sudán II
sudán III
sudán IV
Realizada con salsa de
chile nº 1
- Sílice
- Alúmina
- Florisil
- Celite (tierra de diatomeas)
- C18
1. Optimización del sorbente
Sólo con Florisil se consiguen
recuperaciones aceptables
OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD
2. Optimización cantidad de sorbente
Recuperaciones en función de la cantidad de sorbente
50
60
70
80
90
100
0,25 0,50 0,75 1,00
Florisil, g
re
cu
pe
ra
ció
n,
%
sudan I
sudan II
sudan III
sudan IV
Recuperaciones en función del volumen de eluyente
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6
volumen de acetonitrilo, mL
re
cu
pe
ra
ció
n %
sudan I
sudan II
sudan III
sudan IV
4. Optimización del Vol. eluyente
3. Optimización del eluyente
Tetrahidrofurano, acetona, acetato de etilo,
acetonitrilo, mezcla acetonitrilo/agua, metanol
0,50 g
3 mL
acetonitrilo
OPTIMIZACIÓN DE LA MSPD
Sudán I
Extracto
Sudán IV Carotenoides Patrón
Sudán II Sudán III
Extracto de una muestra de salsa de chile dopada con Sudán I-IV (0,5μg/g)
Patrón Sudán I-IV (1 ppm)
CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS
Rectas de calibrado en salsa de chile
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 0,5 1 1,5 2 2,5
dosis, mg/g
área m
ed
ia, m
Au
.s
Lineal (sudan I)
Lineal (sudan II)
Lineal (sudan IV)
Lineal (sudan III)
Analito
Intervalo
de
linealidad
mg/g
R2 LOD*,
mg/g
LOQ,
mg/g
sudán I 0-2 0.9964 0.09 0.15
sudán II 0-2 0.9957 0.07 0.17
sudán III 0-2 0.9959 0.08 0.12
sudán IV 0-2 0.9989 0.05 0.10
Analito Repetibilidad
% RSD
Reproducibilidad
% RSD
sudán I 3-5 3
sudán II 3-4 5
sudán III 1-8 4
sudán IV 2-8 3
* El LOD establecido en la
UE es de 0.5 mg/g
Calibrado
Precisión
APLICACIÓN DEL MÉTODO MSPD A DIVERSAS SALSAS Y CONDIMENTOS PICANTES
Nº
No
mb
re
Marc
a
Orig
en
Base
Ch
ile
Azú
care
s
Pim
en
tón
Sal
Alm
ido
ne
s,
esp
esan
tes
Aceite
s
Vin
ag
re
Esp
ecia
s,
hie
rbas
Ajo
, ceb
olla
Co
nserv
an
t.
su
dán
I
su
dán
II
su
dán
III
su
dán
IV
1 Chili picante
molto Heinz España
Tomate
48%
0.5
% 81 75 75 69
2 Sweet chili
sauce Vitasia Alemania Tomate
0.7%
68 86 57 93
3 Salsa
Picante
Louisiana
Chovi España Pimiento 66 67 61 48
4
Salsa Brava Orlando España Tomate 72 71 61 49
5
Curry Sauce Vitasia Alemania Tomate 68 99 70 85
6 Picante para
Botana
La
Costeña México Zanahoria 89 98 81 59
7 Salsa de Ají
picante Oriental Ecuador Pimiento - - 62 66
8
Chimichurri JR España - 89 73 52 58
9 Chiles
adobados
San
Marcos México Pimiento - - 71 69
Muestras adicionadas con Sudán I-IV (0,25μg/g)
Síntesis, caracterización y evaluación analítica de MIPs
selectivos para la determinación de colorantes
4.
MIP para Sudán I MIP para amaranto
DIFUSIÓN DE RESULTADOS
PUBLICACIONES
- “Two rapid and sensitive automated methods for the determination of nitrite and nitrate in soil samples”. C.
E. López Pasquali, A. Gallego-Picó, P. Fernández-Hernando, M. Velasco, J.S.Durand Alegría.
Microchemical Journal, 2010, 94, 79-82
-“Rapid and interference-free determination of illegal dyes in sauces and condiments by matrix solid phase
dispersion (MSPD) and liquid chromatography (HPLC-DAD)”, L. Enríquez, A. Gallego-Picó, R.M. Garcinuño,
P.Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría (Enviado febrero 2011)
- “An HPLC-DAD method for the simultaneous determination of nine β-lactam antibiotics in ewe milk". M.
Cámara, A. Gallego-Picó, R.M. Garcinuño, P. Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, P.J. Sánchez .
Food Chemistry (Enviado marzo 2011)
- “Methacrylyc acid-ethyleneglycol dimethacrylate polymeric sorbent for the removal of estrogens from
water samples”, J.C. Bravo, A. Gallego-Picó, R. M. Garcinuño, P. Fernández, J.S. Durand (enviado).
DIFUSIÓN DE RESULTADOS
CONGRESOS
- “4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2009)” (INTERNACIONAL),
“HPLC-DAD method for simultaneous determination of nine β-lactam antibiotics in Manchega sheep milk”,
M. Cámara, A. Gallego, R.M. Garcinuño, P.Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, P.J. Sánchez, Praga,
República Checa, noviembre 2009
- “4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2009)” (INTERNACIONAL)
“Optimization of a matrix solid-phase dispersion method for the determination of sudans I-IV in tomato an
chilli sauce samples”, Enríquez L., R.M. Garcinuño, P.Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, Praga,
República Checa, noviembre 2009
- 28th International Symposium on Chromatography (ISC 2010)” (INTERNACIONAL) “Application of
methacrylyc acid-ethyleneglycol dimethacrylate polymeric sorbent for the removal of estrogens from water
samples”, A. Gallego, J.C. Bravo, R.M. Garcinuño, P. Fernández and J.S. Durand, Valencia, España,
septiembre 2010
COLABORACIÓN ENTRE GRUPOS
Con UAH: preparación de MIPs para antibióticos y validación por EC-MS
Con CISC-AA: preparación de MIPs para acrilamida
Con Laboratorio URJ: preparación de MIPs para nuevos estrógenos
FORMACIÓN Y MOVILIDAD
Dra. Gema Paniagua González – Universidad de Alcalá de Henares Dra. Alejandrina Gallego Picó – CSIC-IQOG Lda. Judith Gañán Aceituno (Universidad Rey Juan Carlos) – UNED María Cámara Díaz (CERSYRA)-UNED
GRACIAS POR SU ATENCIÓN