viii taller de capacitación avícola ponedoras

Taller de

capacitación avícola

PONEDORAS

Marco Cisneros Tamayo DVMZ MSc. Ph.D

Profesor FMVZ - UC

VIIIImpacto y Alternativas para el control de Mycoplasma sinoviae

Características de los micoplasmas aviares

• Bacteria sin pared. (Kleven et al., 1972)

• Muy pequeña talla: 0,2 – 0,5 µm. (Chalquest et Fabricant, 1960)

• Genoma reducido: 799 kpb para MS. (Razin, 1983)

• Fuerte tasa de mutaciones: el sistema de reparación del ADN es defectuoso. (Ferguson, 2013)

• Afecta a muchas especies de aves: pollos, gallinas, pavos (Nascimento et al., 2005)

• MS difunde más rápido que MG

• Carencia de elementos de resistencia y antigenicidad (capsulas, cilias, esporas, plásmidos,

toxinas, etc.)

• “Mejor ejemplo de parasitismo animal”, Artículo de la IOM, (Organización Internacional de Micoplasmología)

• Muy lábiles al medio ambiente y desinfectantes (¿?)

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

“Mejor ejemplo de parasitismo

animal”

Artículo de la IOM

(Organización Internacional de Micoplasmología)

Huespedes

• Reproductores livianos y pesados

• Gallinas de postura comercial

• Pollos de engorde

• Gallos de pelea.

• Pavos

• Faisanes

• Perdices

• Pavos reales

Distribucion Geografica

Cosmopolita

Mycoplasmas Aviaires

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

• Infecciones respiratorias, articulares o genitales (Ferguson, 2013)

Mycoplasma gallisepticum (MG). 1935, enfermedad respiratoria crónica (MRC), aerosaculitis en pollos y pavos.

Mycoplasma synoviae (MS). 1950, articulares, respiratorios en las gallinas y pavos , alteración de los huevos en las ponedoras.

Mycoplasma meleagridis (MM). 1958, aerosaculitis, problemas de la reproducción en los pavos.

Mycoplasma iowae (MI). 1955, disminución de la tasa de eclosión y mortalidad de los embriones de los pavos.

• MS comúnmente se presenta sin signos clínicos y sin lesiones: la disminución de la

performance zootécnica de los lotes muchas veces no son significativos. (Ferguson,

2013)

Infecciones por MS

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

• Difusión muy rápida del MS en las explotaciones. (Christensen et al., 1994)

• MS + stress u otros patógenos = micoplasmosis. (signes cliniques / lésions)

(Feberwee et al., 2008)

• Infecciones agudas frecuentemente asociadas con virus y bacterias : retardos de

crecimiento, edema de las articulaciones, cojeras, ligeros estornudos…

• Infección crónica sigue a la infección aguda. (Nascimento et al., 2005)

• Decomisos en camal (artritis) en ocasiones son muy importantes. (dindes, poulets de

chair)(Landman, 2014)

• Persistencia de MS a pesar de los tratamientos con antibióticos. (Le Carrou et al. 2006

; Kleven et al. 2008)

• Signos clínicos según el tropismo de la cepa…

Transmision/Incubacion

Transmisión

Vertical

Horizontal

Mecanica

Periodo de Incubación

Experimentalmente 6-21 dias

Naturalmente es variable

(Asintomaticos hasta que se estresan)

Sobrevida del Mycoplasma synoviae en el ambiente

ALGODON : 8 HS – 2 DIAS

• VIRUTA : 4 HS

• PLUMAS : 2 – 3 DIAS

• MADERA : 8 – 12 HS

• GOMA : 8 HS

• AGUA : 41 DIAS

• ALIMENTO : 21 DIAS

• POLVO : 51 – 77 DIAS (4 grados)

10 – 21 DIAS (20 grados)

Asociación de factores múltiples

Medio ambiente (humedad, temp.,amoníaco, etc.) - Manejo

Densidad animal (estrés)

La presencia de biofilms

Micotoxinas

Virus inmuodepresores (Gumboro, AI, EM, Reovirus)

Virus respiratorios (EN,BI,IA,LT,NV)

Bacterias (E. coli, Coriza, ORT, Pasteurella)

Micoplasmas (MG, MS)

Signos Clinicos

La information de Mycoplasma synoviae es escasa, y se ha vinculado con muchas

sintomatologias dentro del sindrome respiratorio.

La aereosaculitis se exacerba por vacunación de ND o IB.

Las lesiones se agravan en las épocas frías.

Las parvadas afectadas de sinovitis infecciosa tienen:

Cresta pálida, claudicación y crecimiento retardado, plumas erizadas, la cresta se

encoje,se la pude observar también de color azulado, Se observa hinchazón de

articulaciones y ampollas en el pecho.

Los M.sinoviae aislados de lesiones de sacos aéreos pueden provocar mas

aereosaculitis,mientras que los aislados de sinovia producen sinovitis.

Es frecuente encontrar aves con infección generalizada pero no con hinchazón aparente

de las articulaciones.

M.sinoviae se ha observado en pollos de seis días de edad, que sugiere que el periodo

de incubación es corto en aves infectadas por transmisión del huevo.

Se dice por ahi que:

Respiratorio

Articular

Reproductivo

TROPISMO ARTICULAR

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I. Kempt

Merck Veterinary ManualMerck Veterinary Manual

M. Cisneros

SELARL Vétérinaire de Malestroit, Anilab, Réseau Cristal

TROPISMO RESPIRATORIO

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“SÍNDROME DE HUEVOS CON

EXTREMIDAD DE CRISTAL (EAA)”

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TROPISMO GENITAL

• Sin Síntomas En Las Gallinas

• Afecta Solo Los Huevos

• Aspecto rugoso y/o fragilidad de la punta o del cono superior de los huevos

(huevos sucios). (Feberbee et al., 2009)

• Mayor carga del trabajo clasificando los huevos y lavando las instalaciones.

(Gautier-Bouchardon et al., 2012)

EAA : Eggshell Apex Abnormalities

A.V. Gautier-BouchardonA.V. Gautier-Bouchardon

31/05/2019 Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

• Extremo delgado

• Evidencia de fisuras y rupturas

con la ayuda de: luminosidad

aumentada usando una lámpara.

(Jeon et al.,2014)

The poultrysite

Visualización de huevos con síndrome de EAA

R. Rodas, Guatemala, 2018

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

EAA y la estructura de la cascara del huevo

Huevo normal Huevo EAAA : membranas internas

B : capa mamilar

C : capa palissadica

A : membranas internas

C : capa palissadica

50 µm 100 µm

• Microscopio electrónico (Feberwee et al., 2009) :

• Estructura de la cascara modificada:

o Desaparición de la capa mamilar o de una parte de la capa palisidica.

o Densidad disminuida de las membranas internas.

o Espesor reducido de la cascara de al menos 1/3.

31/05/2019 Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

C

USA

Paraguay

Brésil

Argentine

Chine

Japon

Pakistan

Jordanie

Australie

EPIDEMIOLOGÍA DE MS EAA

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

• Europa :

• Holanda (GD Deventer, 2008)

• Italia (IZSV, 2010)

• Reino Unidoi (AHVLA, 2011)

• Portugal (CECAV, 2012)

• Francia (Anses, 2009 - 2010)

Diagnóstico de micoplasmosis

Muestreo para el diagnostico en lotes

de aves

Tamaño del lote

Numero de muestras

10 10*

20 19

30 26

40 31

50 35

60 38

70 40

80 42

90 43

100 45

200 51

500 56

1000 57

2000 58

5000 59

>5000 59

Numero de muestras a tomar en función del

tamaño del lote, para tener 95% de probabilidad de

identificar al menos una muestra positiva si la

enfermedad esta presente en el 5% del lote (inicio

de la infeccion).

60 muestras (hisopos o muestras de sangre)

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Diagnostico bacteriológico

• Método de referencia para la diagnostico de Micoplasmas

• Muestreo :

• Animales vivos :

• Animales muertos :

• Muestreos medio ambientales

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS

M.

• Transporte : rápido, en temperatura de refrigeracion (4C)

•Ideal en agua peptonada tamponada con glicerol + inhibidores

• Hisopos traqueales (o fosas palatinas) o cloacales (genitales) para el

pavo (MM y MI)

• Huevos embrionados o no

• Semen

• Órganos del aparato respiratorio (tráquea, senos, sacos

aéreos…) o del aparato genital (oviducto) y articulaciones

PROTOCOLO: CULTIVO DE MYCOPLASMAS

hisopos

(traquea, cloaca, huevos)

Universitdad Central del Ecuador - FMVZ - CISNEROS M. 31/05/2019

M.Cisneros, 2017

M.Cisneros, 2016

cultivo

(medio FM4)

Con antibioticos

virage

37 oC

virage

PCR MS+

multiplicacion

37 oC

Conservacion cultivo

MS+ (20% de glycérol,

-70 oC)

Anses, 2017

M.Cisneros, 2016

M.Cisneros, 2016

Conservacion (-70

oC)

Aslamiento

1 colonia

Multiplicacion

Diagnostico bacteriológico

Cultivo :

• Laboratorios especializados.

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

• Medios específicos y complejos (líquidos y gelosa) :

Base PPLO, suero de cerdo, extracto de levadura.

Rojo de fenol (detección de la actividad metabólica antes que

una turbidez como en las bacterias clásicas).

Diferentes substratos : glucosa (M. gallisepticum, M. synoviae,

M. iowae) o arginina (M. meleagridis).

Inhibidores (para limitar la contaminación).

• Incubación à 37°C (al menos un mes), diluciones de muestras,

control + y -.

• Identificación : determinación de las características bioquímicas,

antigénicas y genéticas (PCR).

• Ventajas :

• diagnóstico definitivo,

• precocidad, sensibilidad.

• Otros análisis posibles para la cepa aislada (CMI, poder patógeno…).

Diagnostico bacteriológico

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

• Inconvenientes/dificultades :

• Difícil cultivo (laboratorios especializados, largos periodos de cultivo).

• Difícil re-aislamiento después de un tratamiento con antibióticos (efecto inhibidor del

antibiótico en las muestras, persistencia de los mycoplasmas en bajas concentraciones).

• Para lograr el cultivo del mycoplasma es importante la vigilancia diaria de los cultivos

durante la incubación.

• Hay cepas de mycoplasmas más sensibles que otras a las variaciones de pH (M. synoviae

mucho más sensible que M. gallisepticum).

Diagnostico bacteriológico

• Re-aislamiento de M. gallisepticum 8 días post tratamiento de tilmicosina.

IT4 (300 mg/l)

IT3 (200 mg/l)

IT2 (100 mg/l)

IT1 (50 mg/l)

INT

NI

Lotes

0 /60

1 /60

19/60

40/60

60/60

0/60

Numero

de aves

positivas

0 /600 /600 /60

1 /600 /600 /60

15 /606 /602 /60

40 /6018 /608 /60

60/6060/6060/60

0/600/600/60

10-210-1Sin diluido

Diluciones de las muestras

NI : no infectados ; INT : infectados no tratados; IT : infectados y tratados

Importancia de las diluciones de la muestra original

(similar para las contaminaciones) 31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS

M.

Anses, 2017

Diagnostico bacteriológico

Dias post

inoculación

• Re-aislamiento de MG post tratamientos por enrofloxacina.

Coronavirus

TD/2 TD TD

Pmetaneumovirus

desaparición de mycoplasmas post tratamiento

re-aparacimiento después de una infección viral (o stress)

Persistencia de los mycoplasmas : falsos negativos en cultivo31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS

M.

Anses, 2017

Diagnostico por PCR

• PCR

– simple, multiplex y tiempo real

• Ventajas / inconvenientes comparado al cultivo

– Condiciones menos críticas para los Muestreos y el transporte

– Rapidez (algunas horas vs muchos días)

– Detección de bacterias no viables o viables no cultivables (estabilidad del ADN): los

mycoplasmas pueden ser detectadas pero pueden ya no estar presentes en la granja

– Reacciones específicas : Se detecta lo que se busca

– PCR normalmente más sensible que el cultivo

– Costo : más barato que el cultivo

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

Diagnostico por PCR

• PCR para las 4 especies patógenas

– PCR clásicos o cuantitativos (tiempo real)

– PCR simples o multiplex (una o muchas especies)

• PCR para mollicutes (van Kuppelveld et al., 1992)

Resultados de un PCR de M. synoviae (Lauerman et al., 1993) : fragmento de 207 pb

- Pocillo 1 : marcador de peso molecular- Pocillo 2 à 4 : muestra negativa- Pocillo 5 à 11 : muestra positiva (muestra 8 bajamente positiva)- Pocillo 12 : control positivo (cepa de referencia M. synoviae)- Pocillo 13 : control negativo (agua)

207 pb

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M. Anses, 2017

Diagnostico serológico de mycoplasmas

• Principio del diagnóstico serológico : evidencia anticuerpos

específicos

• Naturaleza de anticuerpos detectados :

Ac post-infección, maternales o vacunales

• Muestreos : sangre

• Lectura de resultados :

PositivoNegativo 31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Diagnostico serológico de mycoplasmas

Diferentes técnicas :

• Aglutinación rápida en placa (ARP) : técnica la más utilizada

• Ventajas : rápida, poco costosa, precoz (IgM), relativamente sensible

• Inconvenientes : falta de especificidad (reacciones cruzadas MG/MS,

vacunas...) anamnesis es importante.

• ELISA indirectos o de competición : costo relativamente elevado,

sensibilidad, especificidad.

• Inhibición de la hemoaglutinación : poco utilizado.

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS

M.

Comparación de métodos de diagnostico

Detección más rápida por cultivo (o PCR) que por serología.

ARP más rápida que ELISA.

Efecto memoria de la serología (el lote continua positivo).31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Anses, 2016

ARP clásico - ARP modificado y ELISA

Diferencias importantes entre estas técnicas serológicas :

• ARP modificada (dilución y des-complementación) permite detectar más

aves positivas que el ARP clásico.

• Los resultados ELISA de manera general equivalen a los resultados ARP

modificado.

• No se puede diferenciar lotes vacunados o no por métodos serológicos.

• Explicacion de esta diferencia de lectura en ARP?

Effeto « prozona »

La reacción se hace positivasi se diluye el suero muestra

Resultado negativoSin la presencia de Anticuerpos

Resultado positivo(aglutinación)

Ac + Ag

Resultado negativoSi hay demasiados Ac

Comparado con la cantidad de Ag(la reacción de

aglutinaciónno se produce)

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA

• 1ra granja

– Muestra de sangre : ARP MG et MS

– Hisopos de tráquea y cloaca :

– Cultivo (medio líquido y agar FM4 + ATB)

– PCR para mollicutes, MG et MS

– Huevos : separación de albumen y yema

– Cultivo (FM4 + ATB)

– PCR para mollicutes, MG et MS

• 2da granja

– Hisopos traqueales y cloacales :

– Cultivo (medio FM4 + ATB)

– PCR mollicutes, MG et MS

Si el medio vira durante el cultivo : multiplicación, PCR, clones

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA

Resultados :

• 1era granja :

• 2da granja: 12/14 HT (83%) y 1/14 HC (4%) positivos

P1

P2

P3

P4

8/30

4/30

3/30

0/30

22/30

25/30

22/30

27/30

26/30

27/30

21/30

26/30

1/30

0/30

2/30

1/30

1/30

1/30

2/30

0/30

ARP MS HT HCPCR MS cult. PCR MS cult.

Baja proporción de sueros positivos (0 à 3%) 73 à 90% de los HT positivos en cultivo o PCR

3 à 7% des HC positivos en cultivo o PCR (contaminaciones, inhibition del PCR)

un huevo positivo en PCR MS (albumina)

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Anses, 2017

Comparación de métodos de diagnostico

36

Resultados :

PCR

Cultivo

PCR + cultivo

ARL

ELISA

(MS+/EAA-)%

49/60 (81,7)45/60 (75)

53/60 (88,3)

8/60 (13,3)60/60 (100)

galpón 1

(MS+/EAA-)/%

28/30 (93,3)

18/30 (60)

30/30 (100)

2/30 (6,7)

29/29 (100)

galpón 2 (MS+/EAA+)%

29/30 (96,7)

19/30 (63,3)

30/30 (100)

1/30 (3,3)

29/30 (96,7)

Resultados de los muestreos

88 à 100 % de aves positivas a nivel de la tráquea

Mas muestras positivas por PCR que por cultivo

Ciertas muestras son PCR-/culture+ y viceversa no hay hisopos cloacales positivos

HT

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Anses, 2017

Granja 3

Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA

Comparación de métodos de diagnostico

Granja 4

37

Resultados :

PCR

Cultivo

PCR + cultivo

ARP

ELISA

Granja 3

49/60 (81,7)

45/60 (75)

53/60 (88,3)

8/60 (13,3)

60/60 (100)

Galpón 1(MS+/EAA-)%

28/30 (93,3)

18/30 (60)30/30 (100)

2/30 (6,7)

29/29 (100)

Galpón 2

(MS+/EAA+)%

29/30 (96,7)

19/30 (63,3)

30/30 (100)

1/30 (3,3)

29/30 (96,7)

Resultados de la serología

3 à 13 % de las aves son positivas por ARP : confirmación de los

resultados de aves positivas por ARP.

96 à 100 % de aves positives en ELISA.

diferencia entre las dos técnicas serológicas.

31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Anses, 2017

(MS+/EAA-)%

Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA

Comparación de métodos de diagnostico

Granja 4

Seguimiento de un lote de ponedoras a diferentes semanas : resultados de ARP

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

27/04 16/05 29/05 13/06 26/06 16/07 10/09

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

27/04 16/05 29/05 13/06 26/06 16/07 10/09

Dil./descomplementación. si positivo (normal) Dil./descomplementacion. sistemática

La técnica ARP modificada permite detectar más aves positivas

(equivalente à la técnica ELISA)31/05/2019

Universidad Central del Ecuador - FMVZ-

CISNEROS M.

Anses,2017

Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA

Comparación de métodos de diagnostico

n

fecha

5-7 d 10-15 d

Ig M (ARP)

Ig G (ELISA-HI)

Tít

ulo

de

Inm

un

oglo

bu

lin

a

2-3 meses 8-10 meses

Curvas de ig producidas postinfeccion de mg o ms

Sem 18 22 26 30 34 464238

Ig M

Ig GARP +

ELISA-HI +

Perfil serológico más común en

reproductoras infectadas con MG/MS

IgG (Elisa/HI)

IgM (ARP)

15 d 25 d 40 d20 d1-3 d

Situación más común en progenie de reproductoras

infectadas con MG/MS

¿Cuando hay sintomas y cuando no hay sintomas ?

1. La Serologia nos da la primera informacion

2. El Cultivo del mycoplasma es el ideal para:

Estudios de la cepa de Ms:

Cmi para antibioterapia (dosis y frecuencia)

Caracterizacion genetica

Estudios de patogenicidad

Estudios epidemiologicos

ST 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

nb 2 2 1 2 8 2 1 1 1 1 1 1 6 1 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1

Reparticion de las 44 cepas de MS :

Misma granja

diferentes ST

Misma gallina

diferentes STUBP17-365

gallina 1

3 ST

UBP17-365

gallina 2

2 ST

UBP17-218

gallina 13

4 ST

Resultados de la genotipificacion por MLST de 13 Sitios de comparacion

Universitdad Central del Ecuador - FMVZ - CISNEROS M. 31/05/2019

Impacto del Mycoplasma synoviae

• En la producción:

• Pérdidas directas (cuando hay signos clínicos):

• Retardo en crecimiento

• Enfermedad respiratoria crónica

• Disminución y deterioro en la producción de pollos y huevos

• Programas de erradicación difíciles de llevar a cabo.

• Perdidas indirectas (sin signos clínicos):

• Predisposición a enfermedades secundarias (post-vacunales)

• Resistencia a los antimycoplasmicos (Salud pública)

• Costos de antimycoplasmicos

• Es una de las enfermedades más costosas de la industria31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

Estrategias de Control

Empleo de vacunas:

Bacterinas (MG-MS)

Vacunas vivas (cepa F, 6/85, ts-11 y MS-H)

Vacunas recombinantes para MG

Antibióticoterapias:

Preventivas

Curativas

Macrólidos (tilosina, tilvalosina, josamicina), pleuromutilinas (tiamulina, valnemulina), lincosamidas (lincomicina), fluoroquinolonas(enrofloxacina), tetraciclinas (clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina)

Vacunas Vivas Comerciales Contra Mg y Ms

Caracteristicas

Ventajas

Desventajas

Cepa MS-H

(Marham Et Al, 1998)

Características:

Buena protección de lesiones (87.5%)

Rápida seroconversión en el 100% de las aves (5ta semana PV)

A mayor dosis mayor protección

Asociación directa entre grado de aglutinación y grado de protección

Se requieren entre 2-3 semanas para obtener adecuada inmunidad

Alta seguridad (dosis 10 veces superiores)

Cepa MS-H

(Marham Et Al, 1998)

Seguridad en la combinación con otras vacunas (ts-11, IB, ILT)

Transmisión horizontal 2 sem PV

No se transmite verticalmente

Se observó un retraso en seroconversión por SAR de 16 a 20 semanas PV para el 100%

Observación de reversión en fenotipo de termosensibilidad en 9 de 50 cepas reaisladas

Factores que dificultan su control y erradicación

Concentración de granjas en regiones

Granjas de edades múltiples

Deficiencias de manejo

Fallas de bioseguridad

Transmisión vertical y horizontal

Fallas en técnicas de diagnóstico

31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.

Estudiar y determinar la presencia de MS y de EAA en el Ecuador?.

Considerar el efecto “Prozona en las pruebas de ARP.

Realizar encuesta nacional epidemiológica sobre los factores de riesgo en todos los sistemas

de producción avícola y la encuesta nacional bacteriológica de prevalencia de MG y MS.

Sugerir el uso del PCR para el diagnóstico temprano de MS en pollitos y las pollitas,

considerar el efecto “Prozona en las pruebas de ARP.

Mezcla de dos o más especies de mycoplasmas en las muestras de MS (MS+MP).

Gran diversidad genética de las cepas de Mycoplasmas de las aves.

El uso de antibióticos disminuye la sintomatología pero no elimina al MS.

Conclusion: