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VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
ANALÍTICOS
Q.F MARÍA MERCEDES MEDINA
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¿Por qué validar?
Q.F MARÍA MERCEDES MEDINA
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¿Por qué validar?
• La validación forma parte integral del sistema de
calidad.
• Las BPM exigen que tanto los procesos como
las metodologías analíticas estén validadas.
• Proporciona confianza y seguridad al método
analítico y calidad a los resultados.
• Optimización del método.
• Competitividad.
• Y …
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NORMA 17025
REQUISITOS TÉCNICOS
5.4.2 Selección de los métodos.
.....Preferiblemente, se deben emplear
métodos publicados en normas
internacionales, regionales o
nacionales. El laboratorio debe
garantizar que utiliza la última edición
válida de las normas, a menos que sea
apropiado o imposible de hacerlo así.
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NORMA 17025
REQUISITOS TÉCNICOS
5.4.2 Selección de los métodos.
.... Los métodos desarrollados o
adoptados por el laboratorio también
pueden ser utilizados si resultan
adecuados para los fines propuestos y si
están validados. El cliente debe ser
informado sobre el método elegido
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NORMA 17025
REQUISITOS TÉCNICOS
5.4.3 métodos desarrollados por el
laboratorio.
La introducción de métodos de ensayo y
calibración desarrollados por el
laboratorio para su propio uso debe ser
una actividad planeada y se debe
asignar a personal calificado y equipado
con los recursos adecuados.
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NORMA 17025
¿Qué es validar?
5.4.5 Validación de los Métodos.
5.4.5.1 Validación es la confirmación
por examen y suministro de evidencias
objetivas del cumplimiento de los
requisitos particulares para un uso
específico.
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¿Qué es validar?
USP 31
• Proceso por el cual se establece mediante
estudios de laboratorio que las
características de calidad del método
analítico se adecuan a los requerimientos
y necesidades de la aplicación analítica
propuesta.
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DEFINICIONES
TÉCNICA
Aplicación de un principio
científico del cual se ha
demostrado su utilidad
para proveer información
analítica. Ej.: AA , IR, CG,
HPLC.
Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.
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DEFINICIONES
MÉTODO
Adaptación de una
técnica para una
medición específica con
un fin determinado.
Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.
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DEFINICIONES
PROCEDIMIENTO
Conjunto de instrucciones
detalladas necesarias para llevar a
la práctica un método, presentadas
en forma escrita.
Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.
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FASES DE LA VALIDACIÓN
FASE I : ESTANDARIZACIÓN
OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES Y
VARIABLES
FASE II : DETERMINACIÓN DE LAS
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO DEL
MÉTODO
FASE III : EVALUACIÓN POR RESULTADO
La documentación es parte esencial de la
validación
VALIDACIÓN
PROTOCOLO
DE VALIDACIÓN
REALIZACIÓN DE LA
VALIDACIÓN
EVALUACIÓN
RESULTADOS
ANALÍTICOS
INFORMES
TÉCNICOSCERTIFICADO
DE VALIDACIÓN
ESTANDARIZACIÓN OPTIMIZACIÓN
DE CONDICIONES Y VARIABLES
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PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
Conjunto de instrucciones que garantizan
resultados uniformes de un procedimiento
de validación, constituye la planificación,
ejecución, verificación y control de la
validación.
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PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
• Objetivos
• Alcance
• Responsabilidad
• Referencias
• Factores críticos
• Parámetros a evaluar y C.A.
• Muestras
• Equipos
• Método analítico
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ICHUSP
VALIDACIÓN- Referencias
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VALIDACION
Parámetro I II III IV
Cuan-
titativo
Ensayo
límite
Exactitud Si Si * * No
Precisión Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Límite de detección No No Si * No
Límite de
cuantificación
No Si No * No
Linealidad Si Si No * No
Rango Si Si * * No
* Puede ser requerido, dependiendo del ensayo
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SELECTIVIDAD
Este parámetro se refiere a la propiedad del
método para producir una respuesta
debida solo al analito de interés, libre de
interferencias de otros componentes.
• Metabolitos del analito.
• Productos de degradación.
• Matriz de la muestra.
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SELECTIVIDAD
¿Como se hace?
• Analizar matriz sin activo.
• Analizar por triplicado matriz adicionado
con los productos de degradación,
sustancias relacionadas y sustancias de
interés equivalente al 100%.
• Analizar por triplicado muestras solas,
solo el analito de interés.
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SELECTIVIDAD
¿Como se hace?
Someter al activo a condiciones de
degradación forzada.
• Termólisis (105°C, 8 días)
• Fotolisis (Luz natural o ultravioleta, 8 días)
• Hidrólisis acida (HCl 0.1N, 24 horas)
• Hidrólisis alcalina (NaOH 0.1N, 24 horas)
• Oxidación (H2O2)
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SELECTIVIDAD
• Ensayos separativos
No se puede hacer identificación sólo con eltiempo de retención.
• HPLC/DAD
• HPLC/MS
• HPLC FR / FN
• CG/MS
• CG/FTIR
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Criterios de aceptación.
• Al analizar el placebo no hay respuesta.
• Resolución > 1.5
• Factor de coleo < 2
• Número de platos teóricos > 2000
• Identidad del pico Pureza de pico.
• Ausencia de coelución.
• Recuperación del analito 98-102%
SELECTIVIDAD
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LINEALIDAD Y RANGOSe refiere a la proporcionalidad entre la
concentración del analito y su respuesta.
¿Como se hace?
• Solución patrón
• Muestra problema
• 3 a 5 niveles de concentración, mínimo por triplicado.
mg de activo vs Vol. titulante y = 0.7215x + 0.1719
R2 = 0.9973
0.000
2.000
4.000
6.000
8.000
10.000
12.000
14.000
16.000
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
mg
Vo
lum
en
mg activo vs Vol titulante Lineal (mg activo vs Vol titulante)
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LINEALIDAD Y RANGO
Criterios de aceptación
• Coeficiente de correlación r y de determinación r2.
• r: >= 0.999
• r2: >= 0.990
• Prueba para el intercepto (prueba t)
• Prueba para la pendiente (prueba t)
• Prueba para la regresión (Prueba F)
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EXACTITUD
• Grado de concordancia entre el valor que es
aceptado convencionalmente como valor
verdadero o un valor de referencia y el valor
encontrado.
• Indica que cerca se esta del valor verdadero
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EXACTITUD
¿Como se hace?
• Se recomienda un mínimo de 3 determinaciones por 3 niveles de concentración en todo el rango especificado. (80%-120%)
La exactitud se expresa como:
Porcentaje de recuperación (%R)
%R = xm/U*100
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EXACTITUD
Criterios de aceptación
• Porcentaje de recuperación: 98.0 - 102.0%
• Coeficiente de variación: <= 2.0%
– Test De Cochran
• Si G calculado < G tabulado se acepta Ho
entonces las varianzas entre los niveles de
concentración son equivalentes, es decir el
factor concentración no influye en la variabilidad
de los resultados.
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PRECISIÓN
• Grado de concordancia (grado de dispersión)
entre una serie de medidas obtenidas de
múltiples muestras de una muestra homogénea
bajo condiciones prescritas.
• Se presentan tres niveles de precisión
Repetibilidad
Precisión intermedia
Reproducibilidad
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REPETIBILIDAD
• Expresa la precisión de la técnica analítica bajo
las mismas condiciones de operación en un
intervalo de tiempo corto.
• Es llamada precisión intra-ensayo.
• La repetibilidad esta dividida en dos niveles
Repetibilidad del sistema
Repetibilidad del método
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PRECISIÓN
¿Como se hace?
• Repetibilidad
Mínimo 6 muestras al 100% ó un mínimo de 3
muestras a tres niveles. (80%-120%)
• Precisión intermedia
Se estudiara la variación de los factores día (3
días) y analista (2 analistas) al 100% de la
concentración.
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PRECISIÓN
Criterios de aceptación
• Repetibilidad
Coeficiente de variación: <= 2.0%
• Precisión intermedia
Coeficiente de variación global: <= 2 CV de la repetibilidad.
Coeficiente de grupos: <= 2.0%
• El resultado se presenta con intervalos de confianza para cada nivel de concentración.
X t * s/√n
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REPRODUCIBILIDAD
• El objetivo, es verificar que el método de análisis
proporciona los mismos resultados en diferentes
laboratorios.
• Es llamada precisión inter-laboratorios.
• Se acepta una variación del
10% del valor promedio de los
resultados del laboratorio
primario.
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ROBUSTEZ
• Medida de la capacidad para permanecer
inalterado ante pequeñas pero
deliberadas variaciones en ciertos
parámetros.
• Proporciona idea de fiabilidad durante la
aplicación de rutina.
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ROBUSTEZ
¿Como se hace?
• La evaluación de la robustez se realiza
mediante diseños factoriales:
• Diseño factorial completo y fraccionado
• Diseño de Youden-Steiner
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ROBUSTEZ
Criterio de aceptación
• Cálculo del efecto:
Vd-vd s+t+y+z - u+v+w+z
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• El valor encontrado se compara con la
desviación estándar de la repetibilidad del
método.
US FDA Guidance on method validationhttp://www.fda.gov/cder/guidance/2396dft.htmFor US FDA data submissions
Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods ValidationPublished by employees of the US FDA, February 1987, http://www.fda.gov/cder/guidance/ameth.htm
VALIDACIÓN- Referencias
Validation of chromatographic methods, Reviewer Guidance (FDA)http://www.fda.gov/cder/guidance/cmc3
Policies and Procedures Guide for the Official Methods Program (OMA)
http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/omamanual.htm
VALIDACIÓN- Referencias
USP 32 : <1225> Validation of
Compendial Methods, United States
ICH Q2A: Validation of Analytical
Procedures: Methodology
http://www.fda.gov/cder/guidance/ichqa2.
ICH Publicaciones, Guías:
http://www.ich.org/UrlGrpServer.jser?@_ID=363&
@_TEMPLATE=272
VALIDACIÓN- Referencias
– Programas de Validación de Métodos
http://www.aoac.org/vmeth/page1.htm
http://www.ivthome.com/publications/index.htm
http://www.ivthome.com/free/index.htm
VALIDACIÓN- Referencias
Gracias
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