transferencia de métodos de hplc a uhplc: …2.1mm x 50mm 1.8µm 1.00ml/min, 40 c grad.: 35-95% en...
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1
Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: Estrategias y Criterios de Selección de Columnas.
Álvaro Arnau
Responsable de
Ventas
Agenda1. Introducción y Fundamentos UHPLC
2. ¿Cómo transferir métodos entre
HPLC y UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
- Isocrático y Gradientes Concentración
• ¿Cómo reducir tiempos sin sacrificar resolución?.
• ¿Cómo ganar resolución manteniendo tiempos de
análisis?.
• Criterios de Selección de Columna
- Longitud y Tamaño Partícula
- Fase estacionaria y tipo de columnas
- Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 22-58m 11:00-12:00
UHPLC “versus” HPLC: Definiciones
1. La columna (tamaño de partícula y tipo) es quien define la
modalidad de trabajo (UHPLC/HPLC), NO el cromatógrafo.
• HPLC: partículas de 3.5 y 5µm.
• UHPLC:
– partículas totalmente porosas <2 µm.
– partículas superficialmente porosas 2.7 µm
2. El cromatógrafo debe estar adaptado al VOLUMEN
y PRESIÓN de la columna utilizada.
• El volumen muerto (por donde circula la muestra) debe ser:
Conexiones+ Celda detector ~≤ 0.02 x V0 columna <0.1x V pico
– Se deben utilizar capilares y celda adecuados.
• El volumen de retardo del gradiente se recomienda no sea muy superior al Vo de la columna (el retardo definirá el d.i, de la columna a utilizar).
• La presión máxima del cromatógrafo deberá ser adecuada a la LONGITUD y TAMAÑO DE PARTICULA de las columnas utilizadas.
¿Porqué la Tendencia de pasar de HPLC UHPLC?
UHPLC responde a la cada vez mayor presión para:
1. Analizar un mayor nº de muestras.
2. Reducir los tiempos de análisis.
3. Reducir costes: mayor nº muestras/instrumento, menor
consumo disolvente
4. Aumentar Resolución para analizar muestras más
complejas: con un mayor nº de analitos a controlar.
5. Combinando UHPLC con Espectrometría de Masas mejorar
los límites de cuantificación y especificidad: UHPLC/MS (o
LC/MS).
Página: 4
5
INCISO:
Resolución en HPLC
Eficacia Selectividad Retención
2.1mm x 50mm 1.8µm
1.00ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 0.9 min
Analysis Time= 1.1min
UHPLC, 40°C
10x faster
PW = 0.5 sec
min0.2 0.4 0.6 0.8 10
Aportaciones Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLC Agilent
1200-RRLC (UHPLC-600bars)
HPLC, 40°C
PW = 3.4sec
4.6 x 150mm, 5µm
1.20ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 10.8 min
Analysis Time = 11minmin0 2 4 6 8 10
0.2 0.60 0.4 min
2.1mm x 50mm 1.8µm
2.40ml/min, 95°C
Grad.: 35-95% en 0.38 min
Analysis Time: 0.4min
Presión < 600bars
UHPLC, 95°C
27x faster
PW = 197msec
150mm > 50mm: 3x
1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x
Hasta +20x más rápido que un HPLC. manteniendo la resolución
Página: 6
F xTg /
V0
1.2 x10.8
/1.5 =
8.6
1.0 x 0.9
/0.1 =
9.0
2.4x0.38
/0.1=
9.1
4.6 x 150, 1.8um
490 bar
N = 28669
RS = 1.80 (+ 57%)
S/N = 44
7 Impurezas
Las 7 Separadas
a línea de base
4.6 x 150, 5um
93 bar
N = 7259
RS = 1.15
S/N = 42
Ejemplo de un cliente
Método Impurezas Isocr.
Zoom zona critica
rango tiempo @ 7min
4.6 x 150, 3.5um
165 bar
N = 14862
RS = 1.37 (+19%)
S/N = 50
7 Impurezas
6 No Separadas
a línea de base
Aportaciones Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µmEjemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución Manteniendo Tiempo de Análisis
4 Impurezas
2 No Separadas
a línea de base
HPLC UHPLC
Página: 7
Fundamentos de la UHPLC:
1. Ecuación de Van Deemter:
• Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas:
- De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm).
- Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm).
- Éstas además proporcionan más eficacia.
2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes.
Página: 8
k α F x Tg k = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)
1.-Fundamentos UHPLC: Ecuación de Van Deemter Partículas pequeñas proporcionan Mayor Eficacia y ésta NO se reduce a flujos elevados
Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18
Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)
Eluyente: 85:15 ACN: Agua
Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min
Temp: 20°C
Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente
1/ 2.5
+ EFI
CA
CIA
-
HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS:
EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS
Partícula H_min
5 μm 9,1 μm
3,5 μm 5,8 μm
1,8 μm 3,7 μm
N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)
1.6 x Rs(5µm)
0.0000
S.T.M.: Sub Two Microns
Ultra Fast LC
Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia
N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)
* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.
HPLC
GC: Diám. col. cap.
Espesor film f.estac. N
Página: 9
o Poroshell 120
+ info en Anexo final
H (HEPT) = A + B/u + C x uA: Difusión de Eddy
B: Difusión Longitudinal
C: Resistencia a la transferencia de materia
2.- Fundamentos UHPLC: Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes
• S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.
• Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula
2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)
• Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.
k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Parámetro dependiente de:
• Analito
• Modificador Orgánico
Volumen muerto de la columna
% de incremento de Modificador OrgánicoTiempo del gradiente (min)
Flujo (ml/min)
“Factor de Retención o Capacidad” en Gradientes
Página: 10
• La Capacidad de Separación de picos en Gradientes es DIRECTAMENTE
proporcional al FLUJO.
• Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradiente por
unidad de tiempo: Doblar el flujo produce la misma mejora en resolución que
doblar el tiempo del gradiente!!!
• P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, 2346-2357
• D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 3232–3243
k α F x Tg (sin cambiar de columna)
HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar de Columna para Reducir Tiempos SIN perder ResoluciónIncluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm
• Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá
mejorar la resolución/capacidad de separación.
• El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de
eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.
k = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)
• La capacidad de separación no cambiará si: F1xTg1 = F2xTg2
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µm
Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F1 = 2.0 mL/min
Tg1 = 3 min
3min
1
23
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F2 = 3.0 mL/min
Tg2 = 2 min
2min
Con Tg=3 y F=3 se obtendría:
+Resolución y un tiempo análisis < 3min
Página: 11
Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
3mL/min
1mL/min
5mL/min 1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en 10 min
Flujo: 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando
Pmáx columna: 400bars) 40ºC.
Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-
terfenilo en metanol)
8min
4.5min
3.3min
Al subir flujo se reduce el tiempo
y el ancho de los picos
Página: 12
FxTg= 10
FxTg= 30
FxTg= 50
Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
3mL/min
1mL/min
5mL/minAl subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el
ancho de los picos y en especial de los del principio
mejora la capacidad de separación de picos
8min
4.5min
3.3min
Peak width:
0.0546
Peak width:
0.0242
Peak width:
0.0171
Peak width:
0.0496
Peak width:
0.0542
Peak width:
0.0696
Página: 13
Peak width:
0.0696
Peak width:
0.0446
Peak width:
0.0371
Flujo
mL/
min
Capacidad
Separación
Nº picos(ref.1º)
Capacidad
Separación
Nº picos(ref.3º)
1 35 30
3 45 35
5 55 40
• Nº de picos que se pueden
separar con resolución
hasta línea de base en
función del ancho en línea de
base del 1er (zona inicial) y
3er pico (zona central) del
cromatograma a distintos
flujos con la columna de 5µm
totalmente porosa.
• Eficacia (N) 5µm a 5mL/min =
½ de la N a 1mL/min
Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una
columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis.
FxTg= 10
FxTg= 30
FxTg= 50
¿Porqué se reduce el ancho del pico ?
Ejemplo
INCREMENTANDO
FxTg de 10 a 50
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo transferir métodos entre
HPLC y UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
- Isocrático y Gradientes Concentración
• ¿Cómo reducir tiempos sin sacrificar resolución?.
• ¿Cómo ganar resolución manteniendo tiempos de
análisis?.
• Criterios de Selección de Columna
- Longitud y Tamaño Partícula
- Fase estacionaria y tipo de columnas
- Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 1429-41m
Estrategias Transferencia Métodos HPLC UHPLC
OBJETIVOS / Estrategias:
• Reducir Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.
• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.
HPLC UHPLC:
• Columnas HPLC 5 y 3.5µm UHPLC: 1.8µm (TP) o 2.7µm (SP).
Página: 15
* Trabajando con gradientes de concentración
Estrategias en el Traspaso de Métodos de
HPLC a UHPLC
Reducción de Tiempo*:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolución**:
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)
• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
Página: 16
* Manteniendo Resolución
** Manteniendo Tiempos
Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Métodos
Reducción de Tiempo*:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolución**:
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)
• Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5μm.
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
Página: 17
* Manteniendo Resolución
** Manteniendo Tiempos
22-38m
min5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
5
10
15
20
25
30
Gradiente = 67min
Capacidad picos = 694 (10/min)
“Resolución GC”
Mapa péptidico de BSA digerida con tripsina con Agilent 1200-RRLC (SL)
Zorbax SB-C18, 2.1x150mm, 1.8µm
Página 18
min2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Gradiente = 30min
Capacidad picos = 540 (18/min)
Cromatografía de Alta Resolución con el Agilent
1200 RRLC (SL) + Columnas 1.8µm y 150mm
Capacidad de Separación de Picos: 700
Eficacia : 36.000 platos/columna 15cm x 1.8µm
(típica de columna GC de 10metros x 0.32mm)
8 Columnas x 5µm 200.000 platos/ 2 metros
Cromatografía de Alta Resolución por Acoplamiento en Serie de Columnas de 5μm
Página 19
0.4ml/min H2O/CH3CN 60/40 80ºC
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5μm
8 Columnas en serie 8 x 25cm x 4.6mm - 5μm
1 Columna 25cm x 4.6mm - 5μm
70bars
177bars
360bars
20.000 platos
100.000 platos
200.000 platos
105min
14min
80ºc
Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
Estrategias en el Traspaso de Métodos
Reducción de Tiempo*:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).
Mejora de Resolución**:
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo
• Acoplar varias columnas en serie de 5μm.
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
Página: 20
* Manteniendo Resolución
** Manteniendo Tiempos
24-36m
Traspaso de Métodos Isocráticos a UFLC.
Columna referente: 5µm x 150mm (12.500 platos)
Long. Col. equivalentes Reducción del Tiempo de Análisis*
1.8µm 1/3 // 3.5µm 3/5 Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3
1.8µm x 50mm
(12.000 platos)
1/3
30min10min
1/6
30min5min
1/9
30min3.3 min
3.5µm x 75mm
(10.500 platos)
1/2
30min15min
1/4
30min7.5min
1/6
30min5 min
3.5µm x 100mm
(14.000 platos)
2/3
30min20min
1/3
30min10min
2/9
30min6.7 min
La resolución será semejante a la original. La misma proporción aplica a D.I. 2.1 y 3mm*Nota: Reducción del tiempo de análisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5µm
**Incremento presión: +2% para 7.5cm x 3.5µm +35% para 10cm x 3.5µm +150% para 5cm y 1.8µm (∆P = f (η.u.L/ dp2))
1.- Reducir volumen inyección (proporcionalmente a reducción volumen columna).
2.- Subir Flujo (hasta p.e. 75% presión máxima columna/ instrumento).
3.- Mantener: composición y nº puntos muestreo pico (↑ Hz).
Página: 21
Ajuste de la Frecuencia de Adquisición de Datos: Compromiso entre Resolución Cromatográfica y Sensibilidad.
• Aumentar la frecuencia de adquisición de datos proporcionalmente a la reducción del tiempo de análisis.
- Ajustar “Peak width” adquisición al “width” de integración de los resultados del pico más fino de interés.
- Proporcionará unos 35-40 puntos de medición por pico para máxima resolución cromatográfica.
• Para óptima repetibilidad cuantitativa adquirir >15 puntos (15-20) (RSD< 1%).
• Para máxima sensibilidad ajustar a 8-10 puntos(RSD% ≈ 10-15%).
• El ruido se reduce con el aumento del nº puntos promediados:
• Ruido α ~ 1 / √ nº promedios
Página: 22
Parámetros Optimización Resolución Cromatográfica
Página 23
Rs= 2 (T1-T2) /( Wb1+Wb2) N= 5.54 ( Tr / w50%)1/2
α = (T2 – T0)/(T1 – T0) k = (Tr – T0) / T0
* Para picos de tamaños muy distintos se recomienda Rs > 2
Parámetro
Modificado
% Mejora
ResoluciónIncremento
Tiempo Análisis
Long. x 2 40% x 2
k: 0.5 2 100% x 2
k: 5 10 10% x 2 El incrementar la retención por encima de K’=5
apenas mejorará la resolución.
OBJETIVO Rs > 1.5 (2)*
1 < k< 10Rs= 0.25 N1/2 ((α- 1)/ α ) (k/(k+1))
RETENCIÓNPoder Eluotrópico Eluyente
% modificador OrgánicoSELECTIVIDADFase Estacionaria y Soporte
pH Fase Móvil (si pH próximo a pK)
Modificador Orgánico y su %
Aditivos Fase Móvil
Temperatura
EFICACIA√
Tamaño Partícula del RellenoLongitud de la ColumnaExcesivos Volúmenes Muertos (-)Flujo
ISOCRÁTICO:
k' k'/k'+1 T. análisis
0,2 0,17 1.2 x T0
0,5 0,33 1.5 x T0
1 0,50 2 x T0
2 0,67 3 x T0
3 0,75 4 x T0
4 0,80 5 x T0
5 0,83 6 x T0
10 0,91 11 x T0
20 0,95 21 x T0
La mejora de Resolución
es muy importante al
incrementar la retención
hasta K’= 5
Rs = f ( k/[k+1] )
0,2
0,5
1
2
34
510
20
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
k
k/(
k+
1)
k'/k'+1
La mejora de Resolución
es muy importante al
incrementar la retención
hasta k = 5
N= f(L/ 2dp)
Para mejorar resolución de picos con k > 5 (2) mejor
aumentar long. columna. Para k <2 reducir “poder
eluotropico” del eluyente
DISMINUCION 10% ORGANICO ===> k2 = (2 ó 3) x k1
Log k =aprox flineal(%orgánico)
Traspaso de Métodos con Gradientes
Página 24
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µmGradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F1 = 2.0 mL/min
Tg1 = 3 min
3min
1
23
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F2 = 3.0 mL/min
Tg2 = 2 min
2min
Si k se mantiene constante el poder de separación no variará
Página: 24
Se mantendrá constante el factor de retención en cada punto (%) del gradiente
FxTg = 6 FxTg = 6
k = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)
• La capacidad de separación no cambiará si: F1xTg1/V0 col.1 = F2xTg2/V0 col.2
Comparación Estrategias Mejora de la Resoluciónk = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Columna: ZORBAX SB-C8
Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min
Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2
B: Acetonitrilo
Flujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°C
Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine
5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor
Tg = 10 min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
15min
1,2
34 5
6
7
8
0 5 10 15Time (min)
• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )1
Tg = 60 min a 1mL/min 4
2
0 25 50Time (min)
3
5
8
6
7 40min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
Tradicional
• Reducir V0 y Subir Flujo4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml
N = 10,000
Tg = 15 min a 2mL/min
“Moderna”:
Si k se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.
Página: 25
Time (min)0 5 10
2
3
45
67
8
1
7min
1x10/1.5= 6,7
2x15/0.75= 40
1x60/1.5= 40
¡¡¡Se reduce Tiempo análisis
a 1/6 pero se mantiene la
Separación !!!
¿Cómo mejorar?
Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC
www.agilent.com/chemInstruments
Liquid Chromatography
Buscar: Method translator
Página: 26
http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe
para descargárselo (6Mb – requiere Flash Player).
¿Criterios Selección Columna UHPLC?
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos entre
HPLC y UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
- Isocrático y Gradientes Concentración
• ¿Cómo reducir tiempos sin sacrificar resolución?.
• ¿Cómo ganar resolución manteniendo tiempos de
análisis?.
• Criterios de Selección de Columna
- Longitud y Tamaño Partícula
- Fase estacionaria y tipo de columnas
- Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 2740-20m
Selección de la Longitud Columna y Tamaño de Partícula del Relleno“versus” Eficacia
• Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo el nº platos proporcionados
por la columna, se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder
Resolución.
• La eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula ( N= f(L / 2dp) )
• El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) ).
Recomendación Columna UHPLC: 5cm gradiente ≤ 5min, 10cm para 5-30min, 15cm para > 30min
Página: 28
% Ahorro
Tiempo/
Disolvente
Longitud
(mm)
Eficacia
N (5 µm)
Eficacia
N (3.5 µm)
Eficacia N(1.8
µm) ( 2.7 µm
SP)
- 0% 150 12.500 21.000 36.000
- 33% 100 8.500 14.000 24.000
- 50% 75 6.000 10.500 18.000
- 67% 50 4.200 7.000 12.000
- 80% 30 2.500 4.200 6.500
- 90% 15 1.250 2.100 2.500
Selección Longitud y Tamaño Partícula:
Tipo Cromatógrafo
(Presión Máxima)
“Máxima” Longitud Columna*
1.8µm (TP)** Poroshell-120
2.7µm (SP)**
400 (“HPLC”) 5 (10) cm 10 (15) cm
600 (“UHPLC”) 10 (15) cm 15 (20) cm
1200 (“UHPLC”) 25 (30) cm 35 (40) cm
* En UHPLC suele utilizarse acetonitrilo (eluyente contemplado en esta tabla); el utilizar metanol reducirá los flujos máximos de
trabajo (especialmente con contenidos de agua alrededor del 60%).
** TP: Totalmente Porosa *** SP: Superficialmente Porosa; las columnas SP permiten utilizar columnas entre un 40 y 60% más largas
que las TP (o trabajar a flujos mayores). *** L(3.5µm) 3/5 L(5µm)
.
Equivalencia Eficacia columnas UHPLC1.8µm TP (total. porosas) ó 2.7µm SP (superf. porosas)
Columnas HPLC3.5 µm 5 µm
5 cm 10 cm 15 cm
10 cm 20 cm 30 cm
15 cm 30 cm 45 cm
L (1.8µm TP o 2.7µmSP) 1/2 L(3.5µm) 1/3 L(5µm) ***
+ info en Anexo finalPágina: 29
TPTotalmente
Porosas SPSuperficialmente
Porosas
Poroshell 120: 2.7µm
NO es imprescindible un cromatógrafo de Alta Presión (600-1200bars) para trabajar en UHPLC
Agilent LC calculator- version web:
http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-Preparation/LC-LC-MS-Columns/Pages/lccalcweb.aspx
Viscosidad “versus” Composición Orgánico/Agua.En UHPLC se suele utilizar Acetonitrilo
Tener en cuenta:
La alta viscosidad de las mezclas metanol/agua (máximo a 40/60)
Perfiles de Presión con Gradientes Concentración.
Perfil de Concentración
Presión CH3-CN / H2O
Presión CH3OH / H2O
3 3
η
0 20 40 60 80
1
2
1
2
Vis
cosid
ad
[cP]
a 20º C
100%
n-Propanol
Etanol
Metanol
Acetonitrilo
Este gráfico es útil para poder calcular relaciones
aproximadas de viscosidad entre distintas
composiciones de eluyentes y poder calcular
presiones equivalentes: p.e. 100 bars con CH3-CN/H20 70/30 equivalen a
100 x (1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30
η ~ 0.6
η ~ 1.3
70/30 org. /agua
CH3OH
CH3CN
% Orgánico[w/w]
Gradiente 10100%
Metanol
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
Bar25 o C (355b)
80ºC (140bars)
50ºC (220bars)
ºCPosible Δ flujo con
respecto a 25ºC
50ºC x 1.6
80ºC x 2.5
Página: 30 + info en Anexo final
Traspaso de Métodos de H20/CH30H a H20/CH3CN. Composiciones Fase Móvilcon Fuerza Eluotrópica Equivalente
Acetonitrilo / Agua (da menor presión)
Metanol / Agua
Tetrahidrofurano* / Agua
%MeOH %ACN %THF
20 15 10
40 30 25
60 50 38
80 72 53
100 98 72
%ACN %MeOH %THF
20 30 18
40 50 30
60 72 45
80 85 58
100 >100 72
%THF %MeOH %ACN
20 35 28
40 65 55
60 88 82
80 >100 >100
100 >100 >100
72%
53%
80%
En UHPLC se recomienda trabajar con fases poco viscosas
* Con THF, solventes clorados y acetato etilo, la vida de las juntas de equipos de +1000bars se reduce.
Página: 31
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Ecuación de Van Deemter
2. ¿Cómo convertir métodos entre
HPLC y UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
• Criterios de Selección de Columna
- Longitud y Tamaño Partícula
- Fase estacionaria y tipo de
columnas.
- Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 3245-15m
Selección Fase Estacionaria (Relleno)
• Si es posible, mantener el mismo relleno que en HPLC
simplemente cambiando tamaño partícula (p.e. Zorbax XX).
Muchas fases de HPLC NO están disponibles en formato
UHPLC.
• Si NO se quiere revalidar de nuevo los métodos al transferir
HPLCUHPLC, la limitación en la reducción de tamaño de
partícula en métodos validados obliga a pasar de rellenos
5µm (TP) a 2.7µm (SP)*.
• Con HPLC convencionales (400 bars) es mejor utilizar
rellenos SP de 2.7µm.
* EUP sólo admite reducir tamaño partícula en isocrático.Página: 33
Núcleo
Sólido
1.7um
} 0.5µm
2.7
µm
¿Tipo de Columna: Superficial o Totalmente Porosas?
Superficial Totalmente Porosa
Poroshell-120 reduce 40-50% de presión con similar resolución
2.7µm (capa porosa: 0,5µm)
1.8µm
Ventajas Poroshell 120:
• Reducir la presión para aumentar el flujo.
Importante con HPLC de 400 bars
• Mejorar la resolución en Métodos USP con 5µm
(2.7µm <50% en disminución del tamaño de partícula).
• Robustez: fritas 2µm (en lugar de 0.5µm de las de 1.8µm)
Ventajas 1.8µm Totalmente Porosas:
• Mayor surtido de fases.
• Zorbax 1.8-3.5-5µm con idéntica
selectividad.
• 10-20% más eficacia/cm.
Página: 34
Poroshell -120
+ info en Anexo final
Muestra de tranquilizantes
Columna: Porosa superficial
Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um
Flujo 3.5ml/min, ~ 700 barGradiente 2-92% ACN en 0.4min
T= 80 °C
0.095sec PW
0.140secPW
Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de
separación con todo tipo y marcas de columnas
Columnas Superficialmente Porosas:
permiten muy elevadas velocidades lineales
con elevada resolución y menor presión
0.5 s
Núcleo
Sólido
1.7um
} 0.5µm
2.7µm
Página: 35 + info en Anexo final
Selección del Tipo de Fase Estacionaria con Columnas ZORBAX 1.8µm
• Utilice el mismo tipo de Zorbax: muy fácil escalabilidad debido a la
idéntica selectividad de Zorbax - independiente del tamaño de
partícula (5, 3.5,1.8µm) y dimensiones de la columna.
• Zorbax Eclipse Plus / XDB para separaciones a
pH’s intermedios y traspaso de columnas de otros fabricantes (excepto a pH’s extremos).
• Zorbax Stablebond (SB) para separaciones a pH muy ácidos (hasta pH 0.8) y/o a Alta
Temperatura hasta 90° C (100ºC).
• Zorbax Extended para separaciones a pH básicos (hasta pH 11.5 y 40ºC),
HPH para pH’s básicos y temperaturas elevadas (hasta pH 11.0 y 60ºC).
• Excelente tiempo de vida y resistentes a las más altas presiones gracias a la alta
resistencia mecánica de las partículas ZORBAX (+1300 b) .
• En equipos 400-600bars utilice Zorbax 1.8μm de 600bars*. Reducen la presión de trabajo en >20%,
gracias a su distribución asimétrica del tamaño de partícula ingeniada por Agilent.. Las de 400bars (año
2003 distribución simétrica tamaño partícula) generan más presión que las de 600bars.
Página: 36 + info en Anexo final
* alternativa: Poroshell
Agenda
1. Fundamentos de la UHPLC:
• Ecuación de Van Deemter
2. ¿Cómo convertir métodos entre
HPLC y UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
• Criterios de Selección de Columna
- Longitud y Tamaño Partícula
- Nuevos tipos de columnas para
poder hacer UHPLC en HPLC's
convencionales (Poroshell).
- Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 3749-11m
Selección Diámetro Columna según Tipo Instrumento
• Mantener d.i. en métodos validados (o reducirlo en un máx.25% EUP).
• La selección del d.i. de la columna (2.1 a 4.6mm) dependerá de:
• 1.- Flujo Máximo del sistema de bombeo:
- Flujos “elevados”: 0,6mL/min (2.1mm d.i.) 1.2 mL/min (3mm d.i.) 3mL/min (d.i. 4.6mm).
Tipos Instrumentos UHPLC
- Presión máx.≈ 1000-1300 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min. (Fluj. elev. todo tipo columnas)
- Presión máx.≈ 1000-1300 bars y Flujo máx. 1 -2 mL/min (Fluj. elev. sólo columnas 2-3mm d.i.)
- Presión máx.≈ 600 bars y Flujo máx. 5 – 10 mL/min (Fluj. elev. columnas SP)
- UHPLC’s que permitan llegar a 5 mL/min permitirán obtener todo el rendimiento de las columnas Superficialmente Porosas y de columnas con 4.6mm d.i.
• 2.- Tipo de sistema de Bombeo/ Generación del Gradiente:
• Con 2.1mm d.i. se recomiendan sistemas de mezclado en alta presión.
• Con 4.6mm d.i. se puede utilizar cualquier sistema de mezcla (alta o baja presión).
Página: 38
Con columnas UHPLC el trabajar a flujos elevados
permitirá mejorar la capacidad de separación en gradientes
El flujo máximo es un parámetro clave en un UHPLC
Tipos de Sistemas de Generación de Gradientes Distinto volumen de retardo del Gradiente de concentración
El volumen de retardo se recomienda no sea superior al Vo de la columna
V0 (col. 4.6mm d.i.) 1mL /10cm – V0 (col. 2.1mm d.i.) 0.2mL /10cm V0 (col. 3mm d.i.) 0.43mL /10cm
Gradientes con Mezclado a Baja Presión
(en válvula proporcional)
Válvula proporcional
Mayor volumen de retardo – NO configurable600-900µL / (<350 1290 cuaternario)
Bombas cuaternarias 1100,1200, 1220, 1260 y 1290
Página: 39
sólo 1220/1260*
Gradientes con Mezclado a Alta
Presión
Menor volumen de retardo – Configurable
120-800µL (1100,1200,1260) // 10-45µL (1290)
Bombas binarias 1100, 1200, 1260 y 1290
Amortiguador /Damper (no en los 1290)*
+ info en Anexo final
*Los modelos 1290 NO llevan “Damper”
Mixer
Ejemplo Distintos Volúmenes Retardo del Gradiente
Pág.:
Programa de gradiente teórico
1290 gradiente real
1200 gradiente real
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0
50
100
150
200
250
300
350
400
min
mAU
Inyección
ISET: Las mismas condiciones de gradiente
pero desplazando el gradiente y emulando el
perfil del gradiente a clonar.
ISET-1290: Tecnología de Emulación Inteligente de otras bombas
Fruto de la mayor precisión del 1290 y su menor volumen de retardo del gradiente.
¿Cómo trabaja un 1290 emulando un 1200?:
1290 binarioMezcla alta
presión
1200 cuaternario: mezcla en baja presión mayor duración
de la etapa isocrática al principio de todo gradiente
teórico
Equipos Emulados ISET-3:
• Agilent: 1100,1120,1200,1220,1260 binarios y cuatern., 1290 cuat.
• Waters: Alliance, Acquity UPLC, Acquity H-class.
• Shimadzu: LC-20AT, LC-20AB.
• Emulación “genérica”: para “emular” cualquier instrumento
especificando su volumen de retardo.
Emula Volumen de Retardo
Emula Pendiente Grad.
+ Comportamiento Mezcla
+ info en Anexo final
Ejemplo Impacto de Distintos Volúmenes de Retardo: Reproducción de Analisis en
Gradiente con diferentes HPLC´s: Columna: 3 x 50 mm, 2.7 µm Poroshell
min1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Rs= 1.90 1100 Series Binario LC(configurado con mixermayor vol.)
1290 Infinity LC- El gradiente llega antes
Rs= 1.15
Me
tam
itro
n
Chlo
rid
azo
ne
Sim
azin
e
Chlo
rto
luro
n
Diu
ron
Pro
pa
zin
eTe
rbu
tyla
zin
e
Pro
me
tryn
Cya
niz
ine
1290 Infinity LC
with iSET
Rs= 1.87
Página: 41
Influencia del Volumen Muerto en la Eficacia
Página: 42+ info en Anexo final
V0 500µL
V0 500µL
V0 100µL
Flujos ajustados al d.i. de la columna:
4.6 mm columna 1 mL/min
3 mm columna 0.43 mL/min
2.1 mm columna 0.21 mL/min
Ejemplo para compuesto con K’=4
Columna:
50 mm long.
1.8 µm tam. part.
*
* Volumen dispersivo: el que recorre la muestra fuera de la columna ** 0.12mm recomendado para columnas de 2-3mm d.i.
Típico 60 cm capilar 0.12mm = 7µL + X µL celda + Y µL vol. Inyectado total > 10µL
20uL/500uL = 4% del V0 columna
6uL/100uL = 6% del V0 columna
Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 x V0 columna <0.1x V pico
d.i. mm capilar V0 µL/cm.
0.17 mm 0.227 µL/cm
0.12 mm ** 0.113 µL/cm
0.075 mm (ss) 0.044 µL/cm
0.025 (sílice fundida) 0.0047 µL/cm
Columnas de menor d.i. exigen utilizar capilares más finos y cortos, también reducir el volumen de inyección proporcionalmente
Agenda
1. Introducción
2. ¿Cómo convertir métodos entre
HPLC y UHPLC?:
• Estrategias de Traspaso de Métodos
- Isocrático y Gradientes Concentración
• Criterios de Selección de Columna
- Longitud y Tamaño Partícula
- Fase estacionaria y tipo de
columnas
- Diámetro
3. Conclusiones.
Página: 4354-6m 11:00-12:00
44
Transferencia de Métodos de HPLC a UHPLC: Estrategias y Criterios de Selección de Columnas.
Resumen
• Reducir Tiempo Análisis sin perder Resolución:
• Reducir tamaño de partícula y longitud de la columna pero manteniendo constante nº platos columna . (15cm x 5µm = 10cm x 3.5µm = 5cm x 1.8µm).
• Maximizar Resolución Manteniendo los Tiempos:
• Reducir tamaño de partícula y mantener la longitud de la columna (p.e. 150mm x 1.8µm). Requiere un equipo de alta presión.
Alternativa; aumentado tiempo de análisis: acoplar varias columnas en serie de 5µm.
• Columnas Superficialmente Porosas (Poroshell 120):
• Permiten trabajar en UHPLC con HPLC’s convencionales.
• Poder trabajar a mayores flujos (que las de 1.8µm) para reducir sus tiempos de análisis e incrementar la capacidad de separación y resolución en gradientes.
Capacidad de separación en gradientes proporcional a F x Tg / V0 Trabajar a flujos elevados permite mejorar la capacidad de separación en gradientes de concentración.
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