serin proteases

Serin Proteases

Alba Bach Faig

Luis Benjumea de Paz

Anna Caballé Ibáñez

Marta Carboneras Girgas

Laura Cutando Ruiz

Serin Proteases

•Introducció

•Plegaments

•Mecanisme d’acció

•Loops funcionals i especificitat

•Estudi evolutiu

Índex

Serin Proteases

•Introducció

•Plegaments

•Mecanisme d’acció

•Loops funcionals i especificitat

•Estudi evolutiu

Índex

Les serin proteases són enzims del tipus peptidases i es

caracteritzen per la presència d’un residu de serina en

el seu centre actiu.

S’agrupen en

SUPERFAMÍLIES

Comparteixen el

centre actiu

FAMÍLIES

Comparteixen homologia

de seqüència i estructura Trypsin-like

Subtilisin-like

Serin ProteasesIntroducció

Serin ProteasesIntroducció

Classificació (SCOP)

CLASSE PLEGAMENT SUPERFAMÍLIA FAMÍLIES

Proteïnes totes β

Barril Beta Greek Key

Trypsin-like serin proteases

Proteases procariotes (15)

Proteases eucariotes (67)

Proteases virals (7)

Cistein proteases virals (7)

Proteïnes α i β(α/β)

Beta Sheet α/ β /αLeft-HandedCrossover

Subtilisin-likeSubtilases (18)

Serin-carboxil proteases (3)

Serin ProteasesIntroducció

Classificació (SCOP)

FAMÍLIA PROTEÏNES

Proteases eucariotes

Tripsina/Tripsinogen,

Quimiotripsina/Quimiotripsinogen,

Trombina, Elastasa, ... (47)

SubtilasesSubtilisines, Peptidases

mesentèriques, ... (13)

PROTEÏNA FITXER PDB ESPÈCIE

Tripsina 1fmg.pdb Sus scrofa (porc)

Tripsinogen 1tgn.pdb Bos taurus (vaca)

Factor de Coagulació Xa 1hcg.pdb Homo sapiens

Quimiotripsina 4cha.pdb Bos taurus

Quimiotripsina 1gmc.pdb Bos taurus

Plasminogen 1a5i.pdb Desmodus rotundus (ratpenat)

Activador Plasminogen 1c5y.pdb Homo sapiens

Elastasa 1c1m.pdb Sus scrofa

Trombina 1a3b.pdb Homo sapiens

Tripsina 1sgt.pdb Streptomyces griseus

Proteïna de la càpside viral 1kxf.pdb Sindbis virus

NS3 proteasa 1bef.pdb Dengue virus serotipus 2

Cistein proteasa tipus 3C 1cqq.pdb Rhinovirus humà

Serin ProteasesIntroducció

Base de dades SCOP

Serin ProteasesIntroducció

PROTEÏNA FITXER PDB ESPÈCIE

Cistein proteïnasa tipus 2A 2hrv.pdb Rhinovirus humà 2

Serin carboxil proteïnasa 1ga6.pdb Pseudomonas sp.

Serin carboxil proteïnasa 1t1g.pdb Bacillus novosp.

Serin carboxil proteïnasa 1sn7.pdbAlicyclobacillus

sendaiensis

Subtilisin 1st3.pdb Bacillus lentus

Sphericase 1ea7.pdb Bacillus sphaericus

Subtilisin 1scj.pdb Bacillus subtilis

Proteinase K 1p7w.pdb Tritirachium album (fong)

Subtilisin 1bh6.pdb Bacillus licheniformis

Subtilisin

1sbt.pdb, 1sup.pdb, 2sbt.pdb, 1spb.pdb, 1ubn.pdb, 2sni.pdb, 1st2.pdb, 2sic.pdb, 3sic.pdb, 2st1.pdb,1vsb.pdb, 1dui.pdb

Bacillus amyloliquefaciens

Base de dades SCOP

ELASTASA QUIMIOTRIPSINA TRIPSINA

ENZIMS PANCREÀTICS

Mateixa estructura

Diferent especificitat de substrat

Serin ProteasesIntroducció: Trypsin-like

- Síntesi: cèl·lules pancreàtiques acinars

- Secreció: budell prim

- Responsables del trencament dels enllaços peptídics

Serin ProteasesIntroducció: Subtilisines

•Produïdes per soques de Bacillus •Actuen com antimicrobians (AMB)

•Indueixen la seva pròpia biosíntesi

•S’afegeixen en els detergents

•Precursors inactius dels enzims proteolítics

- Tripsinogen Tripsina

- Quimiotripsinogen Quimiotripsina

- Proelastasa Elastasa

•Mecanisme de protecció dels teixits productors

Serin ProteasesZimògens

Serin ProteasesActivació dels

Zimògens

Proelastasa

Elastasa

Tripsinògen

Tripsina

Enteropeptidasa (serin proteasa)

Quimiotripsinògen

Quimiotripsina

Arg15 i Ile16

Lys15 i Ile16

Serin Proteases

Tripsina

Activació dels Zimògens

1 122 136 201

S S S S

245

Quimiotripsinògen (inactiu)

1 122 136 201

S S S S

Arg Ile

15 16 245

∏-Quimiotripsina (activa)

1 122 136 201

S S S S

Leu Ile Tyr Ala

1613 146 149 245

α-Quimiotripsina (activa)

QuimiotripsinaArgSer AsnThr

+

Serin Proteases

•Introducció

•Plegaments

•Mecanisme d’acció

•Loops funcionals i especificitat

•Estudi evolutiu

Índex

Serin Proteases

Barril tancat amb motius Greek-Key Duplicació: dos dominis del mateix plegament

Plegament Trypsin-like

Serin Proteases

65123 4

65123 4

HairpinGreek-key

1

2

3

46

5

65

41

2

3

HairpinGreek-key

Plegament Trypsin-like

Serin ProteasesPlegament Trypsin-like

Serin ProteasesPlegament Trypsin-like

Serin ProteasesPlegament Subtisilin-like

•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes α/ß/α formant 3 capes.

•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3

Serin Proteases

•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.

•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3

23

Plegament Subtisilin-like

13 2 1

Serin Proteases

•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.

•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3

1 2

33

Plegament Subtisilin-like

3 2 12

Serin Proteases

•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.

•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3

Plegament Subtisilin-like

Serin Proteases

•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.

•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3

Plegament Subtisilin-like

Serin Proteases

•Introducció

•Plegaments

•Mecanisme d’acció

•Loops funcionals i especificitat

•Estudi evolutiu

Índex

3 residus formen la tríada catalítica

HISTIDINA

SERINA

ASPÀRTIC

Serin ProteasesCentre actiu

Què tenen en comú totes les

serin -proteases

N

Passos de la catàlisi:

1. Unió substrat

2. Meitat N-terminal alliberada

3. Unió d’aigua

4. Meitat C-terminal alliberada

PING PONG CATÀLISI

Serin ProteasesMecanisme d’acció

HISTIDINA

SERINA

ASPÀRTIC

SC

H2O

Grup OH nucleofílic ataca C1 enllaç peptídic substrat

N HIS accepta H del grup OH de la SER

Ser

His

Asp

Grup COOH ponts d’hidrogen amb HIS

Serin ProteasesMecanisme d’acció

H

ON

O

H

-

Asp102

His57

Ser195

R’ RCarboni C1Carbonil de

l’enllaç peptídic

COMPLEX DE MICHAELIS

Substratpolipeptídic

Serin ProteasesMecanisme d’acció - Inici

Asp102

His57

Ser195

R’ RCarboni C1Carbonil de

l’enllaç peptídic

COMPLEX DE MICHAELIS

Substratpolipeptídic

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 1

Asp102

His57

Ser195

+

−

INTERMEDIARI TETRAHÈDRIC

R’ R

OXYANION HOLE

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 1-2

Asp102

His57

R’ R

INTERMEDIARI ACYL-ENZIM

Ser195

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 2-3

TRENCAMENT DE L’ENLLAÇ PEPTÍDIC

Asp102

His57

R’ RNou N-terminal de la cadena polipeptídica

tallada

Ser195

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 2-3

Asp102

His57

R

Ser195

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 3

Asp102

R

Ser195

His57

INTERMEDIARI TETRAHÈDRIC

+

−

OXYANION HOLE

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 3-4

Asp102

His57

Ser195

+

ENZIM ACTIU

Nou C-terminal de la cadena polipeptídica

tallada

Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 4

R

OXYANION HOLE: Trypsin-like

GLY 193

SER 195

Serin ProteasesMecanisme

d’acció

Estabilització dels intermediaris tetraèdrics

Serin ProteasesMecanisme

d’acció

Gly 193 i Ser 195:

Capacitat de formar ponts d’hidrogen amb els tetraedres intermediaris

(passos 1 i 3)

OXYANION HOLE

−Ponts H

R

R’

Enllaç covalent

Serin ProteasesMecanisme

d’acció ESTABILITZACIÓ DE L’OXYANION HOLE

Loop d’estabilització de l’oxyanion hole

184-193

GLY 193

Energia de la reacció catalítica

Sense enzim

Amb enzim

Substrat

Estat transició

Producte

Estabilització de l’estat de transició tetrahèdric

Serin ProteasesMecanisme

d’acció

L’oxyanion hole és el responsable de l’eficiència

catalítica de les serine-proteases

Diferències amb les Subtilisines

Serin ProteasesMecanisme

d’acció

Tríada catalítica:

Ser 221 + His 64 + Asp 32

Passos:

- Asp 32 fa pont d’H protó N anell imidazole His 64

- Altre N His fa pont d’H amb protó O-H de la Ser

- Oxigen de la Ser ataca el substrat amb l’ajuda de la

cadena lateral carboxamida de Asn 155

separació de càrregues

Diferències amb les Trypsin-like

Serin ProteasesMecanisme

d’acció OXYANION HOLE: Subtilisin-like

ASN 155

Serin ProteasesMecanisme

d’acció ESTABILITZACIÓ DE L’OXYANION HOLE

ASN 155

Loop d’estabilització de

l’oxyanion hole156-166

ASN 155

Serin ProteasesMecanisme

d’acció EXEMPLE D’INTERACCIÓ AMB INHIBIDOR BORONAT

ASP102

HIS 57

SER 195

INHIBIDORGLY 193

ASP102

HIS 57

SER 195

GLY 193

INHIBIDOR

Serin Proteases

•Introducció

•Plegaments

•Mecanisme d’acció

•Loops funcionals i especificitat

•Estudi evolutiu

Índex

Serin Proteases

Loop d’activació16-21

Loop d’estabilització de l’oxyanion hole

184-193

Butxaca S1216-223

Loop d’autòlisi142-152

GLU 70

GLN 80

SER 195

HIS 57

ASP 102

Tríada catalítica

Loops funcionals Trypsin-like

Ca2+

Serin ProteasesLoops funcionals

Subtilisin-likeCa2+75

83Loop d’estabilització de l’oxyanion hole

156-166

Loop d’activació154-159

Loop d'autòlisi48-49 / 153-164

Butxaca S1152-156 / 166-167/ 126-127

SER 221

HIS 64

ASP 32

Tríada catalítica

QUIMIOTRIPSINA

•Carboxil de Tyr, Phe, Trp.

•Enllaços amida amb grup carboxils

donadors de Ser

TRIPSINA•Enllaços peptídics per C-terminal de

Lys i Arg excepte quan van seguides de

Pro.

ELASTASA•Enllaços peptídics després de petits

aminoàcids neutres: Ala, Gly, Val

Trypsin-like

Serin ProteasesEspecificitat

Tripsina Quimiotripsina Elastasa

Asp 189

Gly 226Gly 216

Lys

Gly 226

Gly 216

Val 216Val 216

Thr 226

Ser 189

PheAla

Serin ProteasesEspecificitat

TRIPSINA

TRÍADA CATALÍTICA

ASP 189

GLY 216

GLY 226

Asp 189

Gly 226Gly 216

Lys

Serin ProteasesEspecificitat

S

Serin ProteasesEspecificitat

TRIPSINA

QUIMIOTRIPSINA

TRÍADA CATALÍTICA

SER 189

GLY 216

GLY 226

Gly 226

Gly 216

Ser 189

Phe

Serin ProteasesEspecificitat

ELASTASA

TRÍADA CATALÍTICA

VAL 216THR 226Val 216Val 216

Thr 226

Ala

Serin ProteasesEspecificitat

ELASTASA

Serin ProteasesEspecificitat

S

Serin Proteases

•Introducció

•Plegaments

•Mecanisme d’acció

•Loops funcionals i especificitat

•Estudi evolutiu

Índex

•Alineament basat en seqüència

•Alineament basat en estructura

•Tríada catalítica

•Arbre filogenètic

•Comparació entre famílies

Serin ProteasesEstudi Evolutiu

HIS 57

ASP 102

Serin ProteasesAlineament basat en seqüència Trypsin-like

Família proteases eucariotes

Serin ProteasesAlineament basat en seqüència Trypsin-like

SER 195

Família proteases eucariotes

Serin ProteasesAlineament basat en seqüència

Trypsin-like

SER195

ASP102

HIS57

Loop d’estabilització de l’oxyanion hole

Loop d’activació

Butxaca S1

Unió a Ca2+

Serin ProteasesArbre Filogenètic

Elastasa

Alpha Quimiotripsina

Gamma Quimiotripsina

Factor de Coagulació Xa

Plasminogen

Activador del plasminogen

Tripsina

Filogènia basada en seqüència: trypsin-like

Divergència evolutiva

Família proteases eucariotes

Serin ProteasesAlineament basat en estructura Trypsin-like

HIS 57

ASP 102

Família proteases eucariotes

Serin ProteasesAlineament basat en estructura Trypsin-like

Família proteases eucariotes

SER 195

Serin ProteasesSuperposició Trypsin-like

STAMP:Score: 7,47RMS: 1,08

Família proteases eucariotes

Elastasaα – Quimiotripsinaβ – Quimiotripsina

Factor de coagulació XaPlasminogen

Tripsina

Ser195

His57

Asp102

Ser195 His57

Asp102

Serin ProteasesSuperposició Trypsin-like

Família proteases eucariotes

Serin ProteasesSuperposició Trypsin-like

STAMP:Score: 5,71RMS: 2,18

Família Proteases Eucariotes

Família Proteases Procariotes

Cistein Proteases Virals

Serin ProteasesAlineament basat en seqüència

Subtilisin-like

HIS 64

ASP 32

Família Subtilases

Serin ProteasesAlineament basat en seqüència

Subtilisin-like

SER 221

Família Subtilases

Serin Proteases

ASP32

HIS64

SER221

Oxyanion hole Loop d’activació

Loop d'autòlisi

Butxaca S1

Unió a Ca2+

Alineament basat en seqüència Subtilisin-like

Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like

STAMP:Score: 9,42RMS: 0,89

Família Subtilases

Alineament estructural IGUAL a l’alineament de

seqüència

Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like

Ser221

His64

Asp32

Família Subtilases

Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like

Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like

STAMP:Score: 6,38RMS: 1,98

Família Subtilases

Família Serin-carboxil Proteases

Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like

vs Trypsin-like

Convergència evolutiva

Subtilisina 1sbt

Tripsina 1fmg

Serin Proteases

•Tríada Catalítica Trypsin-like

SER195

ASP102

HIS57

Superposició Subtilisin-like vs Trypsin-like

•Tríada Catalítica Subtilisin-like

SER221

HIS64

ASP32

Superposició Subtilisin-like vs Trypsin-like

Serin Proteases

•Tríada Catalítica residu a residu

SER221

HIS64

ASP32

Superposició Subtilisin-like vs Trypsin-like

Serin Proteases

SER195

ASP102

HIS57

Conclusions

•Similitud de seqüència

•Similitud d’estructura

•Conservació de la Tríada Catalítica

•Duplicació gènica + divergència evolutiva

Proteases Eucariotes

Serin Proteases

Conclusions

•Similitud de seqüència

•Similitud d’estructura

•Conservació de la Tríada Catalítica

Subtilases

Serin Proteases

Conclusions

•Cap relació de seqüència

•Cap relació d’estructura

•Conservació de la Tríada Catalítica, però plegaments totalment diferents

•Convergència evolutiva

Trypsin-like vs Subtilisin-like

Serin Proteases

Serin Proteases

1. Quina relació hi ha entre les trypsin-like i les subtilisin-like?

a) La seqüència

b) L’estructura

c) Les dues anteriors

d) La triada catalítica

e) Totes les anteriors són certes

2. Quins són els tres aminoàcids conservats a totes les serin-proteases?

a) Leucina, Glicina i Serina

b) Histidina, Arginina i Serina

c) Glutàmic, Fenilalanina i Serina

d) Histamina, Aspàrtic i Serina

e) Cap de les anteriors

3. Quins dels següents programes faríeu servir per veure la superposició entre una trypsin-like i una subtilisin-like, si tenen plegaments diferents?

a) PSI-BLAST

b) STAMP

c) Els dos anteriors

d) XAM

e) Cap dels anteriors

Preguntes PEM

Serin Proteases

4. Digues quins dels següents plegaments apareixen en les subtilisin-like?

a) Beta-Sheet a/b/a

b) Left-Handed Crossover

c) Les dues anteriors

d) Barril beta

e) Totes les anteriors són certes

5. Quin és el plegament característic de les trypsin-like?

a) Jelly - Roll

b) Barril tancat; Greek Key

c) Open – Sheet α/β

d) TIM Barrel

e) Cap de les anteriors

6. L’exemple de les subtilisin-like i les trypsin-like és un exemple de:

a) Evolució Divergent

b) Duplicació gènica

c) Els dos anteriors

d) Evolució Convergent

e) Cap dels anteriors

Preguntes PEM

Serin Proteases

7. Assenyala l’opció correcta:

a) L’estructura cristal·logràfica de les subtilisin-like i les trypsin-like és molt similar

b) Les tripsin-like tot i que tenen seqüències molt similars, difereixen en el tipus de plegament

c) En la tríada catalítica, l’oxigen de l’Asp forma un pont d’hidrogen amb l’anell imidazole de la His, provocant que la His formi un pont d’hidrogen amb la Ser, augmentant la seva reactivitat

d) Les trypsin-like es caracteritzen per tenir una funció cerebral molt important

e) Les subtilisin-like participen en l’aparell digestiu dels humans

8. Quina és la funció del Oxyanion Hole?

a) Estabilitza la càrrega negativa de l’oxigen dels intermediaris tetraèdrics

b) És un lloc de catàlisi per l’activació del zimogen, que dóna lloc a la forma activa de la proteasa

c) És el lloc d’entrada del substrat

d) Catalitza la tríada catalítica

e) Provoca estrès oxidatiu

9. La superfamília de les trypsin-like és un exemple de:

a) Evolució Divergent

b) Duplicació gènica

c) Els dos anteriors

d) Evolució Convergent

e) Cap dels anteriors

Preguntes PEM

Serin Proteases

10. Senyala les afirmacions correctes:

1) El grup OH de la Serina ataca al carboni de l’enllaç peptídic

2) Durant el procés catalític del trencament de l’enllaç peptídic es generen dos intermediaris tetraèdrics

3) L’aigua reemplaça l’extrem N-Terminal del pèptid

4) Es forma un enllaç covalent entre l’oxigen de la Serina i el carboni de l’enllaç peptídic

a) 1, 2, 3

b) 1, 3

c) 2, 4

d) 4

e) 1, 2, 3, 4

Preguntes PEM

Serin Proteases

1. d

2. e

3. d

4. c

5. b

6. d

7. c

8. a

9. c

10. e

Respostes PEM

Serin ProteasesPreguntes Assaig

1. Fes un esquema de les semblançes i diferències entre les trypsin-like i les subtilisin-like (seqüència, estructura, plegaments, evolució...)

En quant a seqüència i estructura són molt diferents, ja que presenten plegaments totalment diferents; barril-beta amb motius greek-key (plegament tot beta) per les trypsin-like i beta-sheet (α/β/α/) i un left-handed crossover per les sutilisin-like.

A més a més, corresponen (segons SCOP) a proteïnes de dues superfamílies diferents, que han patit un fenomen de convergència evolutiva, ja que presenten una mateixa solució estructural per poder dur a terme la mateixa funció catalítica.

És per aquesta raó, que tenen en comú i, perfectament conservats, els tres residus que formen la tríada catalítica del mecanisme d’acció.

Serin ProteasesPreguntes Assaig

2. Quina importància té l’anomenada “tríada catalítica” per a la funció de les serin-proteases? Per quins residus està formada?

La tríada catalítica, base del mecanisme d’acció de totes les serin-proteases, està formada per 3 residus: Serina, Histidina i Aspàrtic; que s’han conservat al llarg de l’evolució, degut a la seva importància per la funcionalitat proteolítica de les proteases.

Aquests tres residus del centre actiu són els responsables del trencament de l’enllaç peptídic del substrat. Concretament la Serina ataca el carboni de l’enllaç peptídic mentre que l’histidina i l’aspàrtic fan més reactiva la serina, fent el seu oxigen més nucleofílic, per tal de que aquesta pugui atacar el carboni.

Serin ProteasesPreguntes Assaig

3. Quin és el paper de “l’oxyanion hole” en el mecanisme d’acció de les serin-proteases?

Un residu de Glicina (per a les trypsin-like) o un d’Asparagina (per les subtilisin-like), juntament amb la serina de la tríada catalítica conformen l’oxyanion hole. Aquest permet l’estabilització de la càrrega negativa de l’oxigen dels intermediaris tetraèdrics que es formen durant els passos 1 i 3 del procés de proteòlisi del substrat peptídic. Aquesta estabilització es duu a terme gràcies a la formació de dos ponts d’hidrogen entre les amides d’aquests residus i l’oxigen de l’intermediari tetraèdric.

Serin ProteasesPreguntes Assaig

4. Què determina que una proteasa en concret catalitzi el trencament d’un enllaç peptídic entre dos residus del substrat?

L’especificitat de cada serin-protesas ve donada per la seva butxaca d’especificitat.

Partint del coneixement que el centre actiu de la proteasa es troba lleugerament enfonsat dins la proteïna; perquè l’enllaç peptídic que s’ha de trencar entri en contacte amb el centre actiu (serina de la tríada catalítica), cal que el substrat accedeixi pel forat de la butxaca d’especificitat. Les característiques estereoquímiques d'aquesta ve determinada pel volum i les càrregues dels residus que la conformen.

Com que cada proteasa conté residus diferents, duu a terme el trencament d’enllaços peptídics entre residus específics dels substrats peptidics.

Serin ProteasesBibliografia

Fischer D et al. Three-dimensional, sequence order-independent structural comparison of a serine protease against the crystallographic database reveals active site similarities: Potential implications to evolution and to protein folding. Protein Sci, 1994. 3; 769-778.

Devlin, Thomas M. Bioquímica. Editorial Reverté. 4a ed: Barcelona, 2004. 377-387.

Garrett, Reginald H. Grisham, Charles M. Biochemestry. Editorial Thomson Brooks/Cole cop. 3a ed: Belmont, 2005. 454-459.

Branden, Carl. Tooze, John. Introduction to protein structure. Editorial Garland cop. 2a ed: New York, 1999. 208-219.

Finkelstein, Alexei V. Ptitsyn, Oleg B. Protein physics. Editorial Boston Academic Press cop. 1a ed: Amsterdam, 2002. 320-331.