serin proteases
DESCRIPTION
Serin Proteases. Alba Bach Faig Luis Benjumea de Paz Anna Caballé Ibáñez Marta Carboneras Girgas Laura Cutando Ruiz. Serin Proteases. Índex. Introducció Plegaments Mecanisme d’acció Loops funcionals i especificitat Estudi evolutiu. Serin Proteases. Índex. Introducció Plegaments - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Serin Proteases
Alba Bach Faig
Luis Benjumea de Paz
Anna Caballé Ibáñez
Marta Carboneras Girgas
Laura Cutando Ruiz
Serin Proteases
•Introducció
•Plegaments
•Mecanisme d’acció
•Loops funcionals i especificitat
•Estudi evolutiu
Índex
Serin Proteases
•Introducció
•Plegaments
•Mecanisme d’acció
•Loops funcionals i especificitat
•Estudi evolutiu
Índex
Les serin proteases són enzims del tipus peptidases i es
caracteritzen per la presència d’un residu de serina en
el seu centre actiu.
S’agrupen en
SUPERFAMÍLIES
Comparteixen el
centre actiu
FAMÍLIES
Comparteixen homologia
de seqüència i estructura Trypsin-like
Subtilisin-like
Serin ProteasesIntroducció
Serin ProteasesIntroducció
Classificació (SCOP)
CLASSE PLEGAMENT SUPERFAMÍLIA FAMÍLIES
Proteïnes totes β
Barril Beta Greek Key
Trypsin-like serin proteases
Proteases procariotes (15)
Proteases eucariotes (67)
Proteases virals (7)
Cistein proteases virals (7)
Proteïnes α i β(α/β)
Beta Sheet α/ β /αLeft-HandedCrossover
Subtilisin-likeSubtilases (18)
Serin-carboxil proteases (3)
Serin ProteasesIntroducció
Classificació (SCOP)
FAMÍLIA PROTEÏNES
Proteases eucariotes
Tripsina/Tripsinogen,
Quimiotripsina/Quimiotripsinogen,
Trombina, Elastasa, ... (47)
SubtilasesSubtilisines, Peptidases
mesentèriques, ... (13)
PROTEÏNA FITXER PDB ESPÈCIE
Tripsina 1fmg.pdb Sus scrofa (porc)
Tripsinogen 1tgn.pdb Bos taurus (vaca)
Factor de Coagulació Xa 1hcg.pdb Homo sapiens
Quimiotripsina 4cha.pdb Bos taurus
Quimiotripsina 1gmc.pdb Bos taurus
Plasminogen 1a5i.pdb Desmodus rotundus (ratpenat)
Activador Plasminogen 1c5y.pdb Homo sapiens
Elastasa 1c1m.pdb Sus scrofa
Trombina 1a3b.pdb Homo sapiens
Tripsina 1sgt.pdb Streptomyces griseus
Proteïna de la càpside viral 1kxf.pdb Sindbis virus
NS3 proteasa 1bef.pdb Dengue virus serotipus 2
Cistein proteasa tipus 3C 1cqq.pdb Rhinovirus humà
Serin ProteasesIntroducció
Base de dades SCOP
Serin ProteasesIntroducció
PROTEÏNA FITXER PDB ESPÈCIE
Cistein proteïnasa tipus 2A 2hrv.pdb Rhinovirus humà 2
Serin carboxil proteïnasa 1ga6.pdb Pseudomonas sp.
Serin carboxil proteïnasa 1t1g.pdb Bacillus novosp.
Serin carboxil proteïnasa 1sn7.pdbAlicyclobacillus
sendaiensis
Subtilisin 1st3.pdb Bacillus lentus
Sphericase 1ea7.pdb Bacillus sphaericus
Subtilisin 1scj.pdb Bacillus subtilis
Proteinase K 1p7w.pdb Tritirachium album (fong)
Subtilisin 1bh6.pdb Bacillus licheniformis
Subtilisin
1sbt.pdb, 1sup.pdb, 2sbt.pdb, 1spb.pdb, 1ubn.pdb, 2sni.pdb, 1st2.pdb, 2sic.pdb, 3sic.pdb, 2st1.pdb,1vsb.pdb, 1dui.pdb
Bacillus amyloliquefaciens
Base de dades SCOP
ELASTASA QUIMIOTRIPSINA TRIPSINA
ENZIMS PANCREÀTICS
Mateixa estructura
Diferent especificitat de substrat
Serin ProteasesIntroducció: Trypsin-like
- Síntesi: cèl·lules pancreàtiques acinars
- Secreció: budell prim
- Responsables del trencament dels enllaços peptídics
Serin ProteasesIntroducció: Subtilisines
•Produïdes per soques de Bacillus •Actuen com antimicrobians (AMB)
•Indueixen la seva pròpia biosíntesi
•S’afegeixen en els detergents
•Precursors inactius dels enzims proteolítics
- Tripsinogen Tripsina
- Quimiotripsinogen Quimiotripsina
- Proelastasa Elastasa
•Mecanisme de protecció dels teixits productors
Serin ProteasesZimògens
Serin ProteasesActivació dels
Zimògens
Proelastasa
Elastasa
Tripsinògen
Tripsina
Enteropeptidasa (serin proteasa)
Quimiotripsinògen
Quimiotripsina
Arg15 i Ile16
Lys15 i Ile16
Serin Proteases
Tripsina
Activació dels Zimògens
1 122 136 201
S S S S
245
Quimiotripsinògen (inactiu)
1 122 136 201
S S S S
Arg Ile
15 16 245
∏-Quimiotripsina (activa)
1 122 136 201
S S S S
Leu Ile Tyr Ala
1613 146 149 245
α-Quimiotripsina (activa)
QuimiotripsinaArgSer AsnThr
+
Serin Proteases
•Introducció
•Plegaments
•Mecanisme d’acció
•Loops funcionals i especificitat
•Estudi evolutiu
Índex
Serin Proteases
Barril tancat amb motius Greek-Key Duplicació: dos dominis del mateix plegament
Plegament Trypsin-like
Serin Proteases
65123 4
65123 4
HairpinGreek-key
1
2
3
46
5
65
41
2
3
HairpinGreek-key
Plegament Trypsin-like
Serin ProteasesPlegament Trypsin-like
Serin ProteasesPlegament Trypsin-like
Serin ProteasesPlegament Subtisilin-like
•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes α/ß/α formant 3 capes.
•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3
Serin Proteases
•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.
•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3
23
Plegament Subtisilin-like
13 2 1
Serin Proteases
•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.
•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3
1 2
33
Plegament Subtisilin-like
3 2 12
Serin Proteases
•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.
•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3
Plegament Subtisilin-like
Serin Proteases
•Beta-Sheet paral·lel de 7 cadenes a/b/a formant 3 capes.
•Conexió Left-Handed Crossover entre les cadenes 2 i 3
Plegament Subtisilin-like
Serin Proteases
•Introducció
•Plegaments
•Mecanisme d’acció
•Loops funcionals i especificitat
•Estudi evolutiu
Índex
3 residus formen la tríada catalítica
HISTIDINA
SERINA
ASPÀRTIC
Serin ProteasesCentre actiu
Què tenen en comú totes les
serin -proteases
N
Passos de la catàlisi:
1. Unió substrat
2. Meitat N-terminal alliberada
3. Unió d’aigua
4. Meitat C-terminal alliberada
PING PONG CATÀLISI
Serin ProteasesMecanisme d’acció
HISTIDINA
SERINA
ASPÀRTIC
SC
H2O
Grup OH nucleofílic ataca C1 enllaç peptídic substrat
N HIS accepta H del grup OH de la SER
Ser
His
Asp
Grup COOH ponts d’hidrogen amb HIS
Serin ProteasesMecanisme d’acció
H
ON
O
H
-
Asp102
His57
Ser195
R’ RCarboni C1Carbonil de
l’enllaç peptídic
COMPLEX DE MICHAELIS
Substratpolipeptídic
Serin ProteasesMecanisme d’acció - Inici
Asp102
His57
Ser195
R’ RCarboni C1Carbonil de
l’enllaç peptídic
COMPLEX DE MICHAELIS
Substratpolipeptídic
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 1
Asp102
His57
Ser195
+
−
INTERMEDIARI TETRAHÈDRIC
R’ R
OXYANION HOLE
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 1-2
Asp102
His57
R’ R
INTERMEDIARI ACYL-ENZIM
Ser195
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 2-3
TRENCAMENT DE L’ENLLAÇ PEPTÍDIC
Asp102
His57
R’ RNou N-terminal de la cadena polipeptídica
tallada
Ser195
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 2-3
Asp102
His57
R
Ser195
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 3
Asp102
R
Ser195
His57
INTERMEDIARI TETRAHÈDRIC
+
−
OXYANION HOLE
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 3-4
Asp102
His57
Ser195
+
ENZIM ACTIU
Nou C-terminal de la cadena polipeptídica
tallada
Serin ProteasesMecanisme d’acció – Pas 4
R
OXYANION HOLE: Trypsin-like
GLY 193
SER 195
Serin ProteasesMecanisme
d’acció
Estabilització dels intermediaris tetraèdrics
Serin ProteasesMecanisme
d’acció
Gly 193 i Ser 195:
Capacitat de formar ponts d’hidrogen amb els tetraedres intermediaris
(passos 1 i 3)
OXYANION HOLE
−Ponts H
R
R’
Enllaç covalent
Serin ProteasesMecanisme
d’acció ESTABILITZACIÓ DE L’OXYANION HOLE
Loop d’estabilització de l’oxyanion hole
184-193
GLY 193
Energia de la reacció catalítica
Sense enzim
Amb enzim
Substrat
Estat transició
Producte
Estabilització de l’estat de transició tetrahèdric
Serin ProteasesMecanisme
d’acció
L’oxyanion hole és el responsable de l’eficiència
catalítica de les serine-proteases
Diferències amb les Subtilisines
Serin ProteasesMecanisme
d’acció
Tríada catalítica:
Ser 221 + His 64 + Asp 32
Passos:
- Asp 32 fa pont d’H protó N anell imidazole His 64
- Altre N His fa pont d’H amb protó O-H de la Ser
- Oxigen de la Ser ataca el substrat amb l’ajuda de la
cadena lateral carboxamida de Asn 155
separació de càrregues
Diferències amb les Trypsin-like
Serin ProteasesMecanisme
d’acció OXYANION HOLE: Subtilisin-like
ASN 155
Serin ProteasesMecanisme
d’acció ESTABILITZACIÓ DE L’OXYANION HOLE
ASN 155
Loop d’estabilització de
l’oxyanion hole156-166
ASN 155
Serin ProteasesMecanisme
d’acció EXEMPLE D’INTERACCIÓ AMB INHIBIDOR BORONAT
ASP102
HIS 57
SER 195
INHIBIDORGLY 193
ASP102
HIS 57
SER 195
GLY 193
INHIBIDOR
Serin Proteases
•Introducció
•Plegaments
•Mecanisme d’acció
•Loops funcionals i especificitat
•Estudi evolutiu
Índex
Serin Proteases
Loop d’activació16-21
Loop d’estabilització de l’oxyanion hole
184-193
Butxaca S1216-223
Loop d’autòlisi142-152
GLU 70
GLN 80
SER 195
HIS 57
ASP 102
Tríada catalítica
Loops funcionals Trypsin-like
Ca2+
Serin ProteasesLoops funcionals
Subtilisin-likeCa2+75
83Loop d’estabilització de l’oxyanion hole
156-166
Loop d’activació154-159
Loop d'autòlisi48-49 / 153-164
Butxaca S1152-156 / 166-167/ 126-127
SER 221
HIS 64
ASP 32
Tríada catalítica
QUIMIOTRIPSINA
•Carboxil de Tyr, Phe, Trp.
•Enllaços amida amb grup carboxils
donadors de Ser
TRIPSINA•Enllaços peptídics per C-terminal de
Lys i Arg excepte quan van seguides de
Pro.
ELASTASA•Enllaços peptídics després de petits
aminoàcids neutres: Ala, Gly, Val
Trypsin-like
Serin ProteasesEspecificitat
Tripsina Quimiotripsina Elastasa
Asp 189
Gly 226Gly 216
Lys
Gly 226
Gly 216
Val 216Val 216
Thr 226
Ser 189
PheAla
Serin ProteasesEspecificitat
TRIPSINA
TRÍADA CATALÍTICA
ASP 189
GLY 216
GLY 226
Asp 189
Gly 226Gly 216
Lys
Serin ProteasesEspecificitat
S
Serin ProteasesEspecificitat
TRIPSINA
QUIMIOTRIPSINA
TRÍADA CATALÍTICA
SER 189
GLY 216
GLY 226
Gly 226
Gly 216
Ser 189
Phe
Serin ProteasesEspecificitat
ELASTASA
TRÍADA CATALÍTICA
VAL 216THR 226Val 216Val 216
Thr 226
Ala
Serin ProteasesEspecificitat
ELASTASA
Serin ProteasesEspecificitat
S
Serin Proteases
•Introducció
•Plegaments
•Mecanisme d’acció
•Loops funcionals i especificitat
•Estudi evolutiu
Índex
•Alineament basat en seqüència
•Alineament basat en estructura
•Tríada catalítica
•Arbre filogenètic
•Comparació entre famílies
Serin ProteasesEstudi Evolutiu
HIS 57
ASP 102
Serin ProteasesAlineament basat en seqüència Trypsin-like
Família proteases eucariotes
Serin ProteasesAlineament basat en seqüència Trypsin-like
SER 195
Família proteases eucariotes
Serin ProteasesAlineament basat en seqüència
Trypsin-like
SER195
ASP102
HIS57
Loop d’estabilització de l’oxyanion hole
Loop d’activació
Butxaca S1
Unió a Ca2+
Serin ProteasesArbre Filogenètic
Elastasa
Alpha Quimiotripsina
Gamma Quimiotripsina
Factor de Coagulació Xa
Plasminogen
Activador del plasminogen
Tripsina
Filogènia basada en seqüència: trypsin-like
Divergència evolutiva
Família proteases eucariotes
Serin ProteasesAlineament basat en estructura Trypsin-like
HIS 57
ASP 102
Família proteases eucariotes
Serin ProteasesAlineament basat en estructura Trypsin-like
Família proteases eucariotes
SER 195
Serin ProteasesSuperposició Trypsin-like
STAMP:Score: 7,47RMS: 1,08
Família proteases eucariotes
Elastasaα – Quimiotripsinaβ – Quimiotripsina
Factor de coagulació XaPlasminogen
Tripsina
Ser195
His57
Asp102
Ser195 His57
Asp102
Serin ProteasesSuperposició Trypsin-like
Família proteases eucariotes
Serin ProteasesSuperposició Trypsin-like
STAMP:Score: 5,71RMS: 2,18
Família Proteases Eucariotes
Família Proteases Procariotes
Cistein Proteases Virals
Serin ProteasesAlineament basat en seqüència
Subtilisin-like
HIS 64
ASP 32
Família Subtilases
Serin ProteasesAlineament basat en seqüència
Subtilisin-like
SER 221
Família Subtilases
Serin Proteases
ASP32
HIS64
SER221
Oxyanion hole Loop d’activació
Loop d'autòlisi
Butxaca S1
Unió a Ca2+
Alineament basat en seqüència Subtilisin-like
Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like
STAMP:Score: 9,42RMS: 0,89
Família Subtilases
Alineament estructural IGUAL a l’alineament de
seqüència
Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like
Ser221
His64
Asp32
Família Subtilases
Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like
Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like
STAMP:Score: 6,38RMS: 1,98
Família Subtilases
Família Serin-carboxil Proteases
Serin ProteasesSuperposició Subtilisin-like
vs Trypsin-like
Convergència evolutiva
Subtilisina 1sbt
Tripsina 1fmg
Serin Proteases
•Tríada Catalítica Trypsin-like
SER195
ASP102
HIS57
Superposició Subtilisin-like vs Trypsin-like
•Tríada Catalítica Subtilisin-like
SER221
HIS64
ASP32
Superposició Subtilisin-like vs Trypsin-like
Serin Proteases
•Tríada Catalítica residu a residu
SER221
HIS64
ASP32
Superposició Subtilisin-like vs Trypsin-like
Serin Proteases
SER195
ASP102
HIS57
Conclusions
•Similitud de seqüència
•Similitud d’estructura
•Conservació de la Tríada Catalítica
•Duplicació gènica + divergència evolutiva
Proteases Eucariotes
Serin Proteases
Conclusions
•Similitud de seqüència
•Similitud d’estructura
•Conservació de la Tríada Catalítica
Subtilases
Serin Proteases
Conclusions
•Cap relació de seqüència
•Cap relació d’estructura
•Conservació de la Tríada Catalítica, però plegaments totalment diferents
•Convergència evolutiva
Trypsin-like vs Subtilisin-like
Serin Proteases
Serin Proteases
1. Quina relació hi ha entre les trypsin-like i les subtilisin-like?
a) La seqüència
b) L’estructura
c) Les dues anteriors
d) La triada catalítica
e) Totes les anteriors són certes
2. Quins són els tres aminoàcids conservats a totes les serin-proteases?
a) Leucina, Glicina i Serina
b) Histidina, Arginina i Serina
c) Glutàmic, Fenilalanina i Serina
d) Histamina, Aspàrtic i Serina
e) Cap de les anteriors
3. Quins dels següents programes faríeu servir per veure la superposició entre una trypsin-like i una subtilisin-like, si tenen plegaments diferents?
a) PSI-BLAST
b) STAMP
c) Els dos anteriors
d) XAM
e) Cap dels anteriors
Preguntes PEM
Serin Proteases
4. Digues quins dels següents plegaments apareixen en les subtilisin-like?
a) Beta-Sheet a/b/a
b) Left-Handed Crossover
c) Les dues anteriors
d) Barril beta
e) Totes les anteriors són certes
5. Quin és el plegament característic de les trypsin-like?
a) Jelly - Roll
b) Barril tancat; Greek Key
c) Open – Sheet α/β
d) TIM Barrel
e) Cap de les anteriors
6. L’exemple de les subtilisin-like i les trypsin-like és un exemple de:
a) Evolució Divergent
b) Duplicació gènica
c) Els dos anteriors
d) Evolució Convergent
e) Cap dels anteriors
Preguntes PEM
Serin Proteases
7. Assenyala l’opció correcta:
a) L’estructura cristal·logràfica de les subtilisin-like i les trypsin-like és molt similar
b) Les tripsin-like tot i que tenen seqüències molt similars, difereixen en el tipus de plegament
c) En la tríada catalítica, l’oxigen de l’Asp forma un pont d’hidrogen amb l’anell imidazole de la His, provocant que la His formi un pont d’hidrogen amb la Ser, augmentant la seva reactivitat
d) Les trypsin-like es caracteritzen per tenir una funció cerebral molt important
e) Les subtilisin-like participen en l’aparell digestiu dels humans
8. Quina és la funció del Oxyanion Hole?
a) Estabilitza la càrrega negativa de l’oxigen dels intermediaris tetraèdrics
b) És un lloc de catàlisi per l’activació del zimogen, que dóna lloc a la forma activa de la proteasa
c) És el lloc d’entrada del substrat
d) Catalitza la tríada catalítica
e) Provoca estrès oxidatiu
9. La superfamília de les trypsin-like és un exemple de:
a) Evolució Divergent
b) Duplicació gènica
c) Els dos anteriors
d) Evolució Convergent
e) Cap dels anteriors
Preguntes PEM
Serin Proteases
10. Senyala les afirmacions correctes:
1) El grup OH de la Serina ataca al carboni de l’enllaç peptídic
2) Durant el procés catalític del trencament de l’enllaç peptídic es generen dos intermediaris tetraèdrics
3) L’aigua reemplaça l’extrem N-Terminal del pèptid
4) Es forma un enllaç covalent entre l’oxigen de la Serina i el carboni de l’enllaç peptídic
a) 1, 2, 3
b) 1, 3
c) 2, 4
d) 4
e) 1, 2, 3, 4
Preguntes PEM
Serin Proteases
1. d
2. e
3. d
4. c
5. b
6. d
7. c
8. a
9. c
10. e
Respostes PEM
Serin ProteasesPreguntes Assaig
1. Fes un esquema de les semblançes i diferències entre les trypsin-like i les subtilisin-like (seqüència, estructura, plegaments, evolució...)
En quant a seqüència i estructura són molt diferents, ja que presenten plegaments totalment diferents; barril-beta amb motius greek-key (plegament tot beta) per les trypsin-like i beta-sheet (α/β/α/) i un left-handed crossover per les sutilisin-like.
A més a més, corresponen (segons SCOP) a proteïnes de dues superfamílies diferents, que han patit un fenomen de convergència evolutiva, ja que presenten una mateixa solució estructural per poder dur a terme la mateixa funció catalítica.
És per aquesta raó, que tenen en comú i, perfectament conservats, els tres residus que formen la tríada catalítica del mecanisme d’acció.
Serin ProteasesPreguntes Assaig
2. Quina importància té l’anomenada “tríada catalítica” per a la funció de les serin-proteases? Per quins residus està formada?
La tríada catalítica, base del mecanisme d’acció de totes les serin-proteases, està formada per 3 residus: Serina, Histidina i Aspàrtic; que s’han conservat al llarg de l’evolució, degut a la seva importància per la funcionalitat proteolítica de les proteases.
Aquests tres residus del centre actiu són els responsables del trencament de l’enllaç peptídic del substrat. Concretament la Serina ataca el carboni de l’enllaç peptídic mentre que l’histidina i l’aspàrtic fan més reactiva la serina, fent el seu oxigen més nucleofílic, per tal de que aquesta pugui atacar el carboni.
Serin ProteasesPreguntes Assaig
3. Quin és el paper de “l’oxyanion hole” en el mecanisme d’acció de les serin-proteases?
Un residu de Glicina (per a les trypsin-like) o un d’Asparagina (per les subtilisin-like), juntament amb la serina de la tríada catalítica conformen l’oxyanion hole. Aquest permet l’estabilització de la càrrega negativa de l’oxigen dels intermediaris tetraèdrics que es formen durant els passos 1 i 3 del procés de proteòlisi del substrat peptídic. Aquesta estabilització es duu a terme gràcies a la formació de dos ponts d’hidrogen entre les amides d’aquests residus i l’oxigen de l’intermediari tetraèdric.
Serin ProteasesPreguntes Assaig
4. Què determina que una proteasa en concret catalitzi el trencament d’un enllaç peptídic entre dos residus del substrat?
L’especificitat de cada serin-protesas ve donada per la seva butxaca d’especificitat.
Partint del coneixement que el centre actiu de la proteasa es troba lleugerament enfonsat dins la proteïna; perquè l’enllaç peptídic que s’ha de trencar entri en contacte amb el centre actiu (serina de la tríada catalítica), cal que el substrat accedeixi pel forat de la butxaca d’especificitat. Les característiques estereoquímiques d'aquesta ve determinada pel volum i les càrregues dels residus que la conformen.
Com que cada proteasa conté residus diferents, duu a terme el trencament d’enllaços peptídics entre residus específics dels substrats peptidics.
Serin ProteasesBibliografia
Fischer D et al. Three-dimensional, sequence order-independent structural comparison of a serine protease against the crystallographic database reveals active site similarities: Potential implications to evolution and to protein folding. Protein Sci, 1994. 3; 769-778.
Devlin, Thomas M. Bioquímica. Editorial Reverté. 4a ed: Barcelona, 2004. 377-387.
Garrett, Reginald H. Grisham, Charles M. Biochemestry. Editorial Thomson Brooks/Cole cop. 3a ed: Belmont, 2005. 454-459.
Branden, Carl. Tooze, John. Introduction to protein structure. Editorial Garland cop. 2a ed: New York, 1999. 208-219.
Finkelstein, Alexei V. Ptitsyn, Oleg B. Protein physics. Editorial Boston Academic Press cop. 1a ed: Amsterdam, 2002. 320-331.