sandec aislamiento y determinación de huevos de helmintos y salmonella en lodos cloacales lodos de...

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Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Lodos de plantas de tratamiento de líquidos

sépticos

Bioq. Graciela Sanguinetti

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y Salmonella en lodos cloacales

Generación de los lodos

Red cloacal

PLANTA DE TRATAMIENTO

LODOS

EFLUENTE TRATADO

Líquido cloacal

Pozo absorbente

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BarrosDefiniciones

(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)

Barros crudos: Barros generados como consecuencia de operaciones de tratamiento de efluentes líquidos y que constituyen subproductos de ese proceso.

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y Salmonella en lodos cloacales

BarrosDefiniciones

(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)

Barros tratados: Productos originados en el tratamiento de barros crudos con el propósito de modificar su contenido de humedad y su capacidad de atraer vectores.

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BarrosDefiniciones

(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)

Barros orgánicos: Barros con contenido de materia orgánica total igual o mayor al 20% sobre materia seca.

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y Salmonella en lodos cloacales

BiosólidosDefinición

(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)

Productos originados en la transformación de barros orgánicos a través de tratamientos destinados a reducir su nivel de patogenicidad, su poder de fermentación y su capacidad de atracción de vectores y a otorgarles aptitud para su utilización agrícola y para la recuperación de suelos y sitios degradados.

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Disposición inadecuada de lodos con riesgo sanitario

PLANTA DE TRATAMIENTO

LODOS SIN

TRATAR

EFLUENTE TRATADO

SueloCanales

Cuerpo receptor

Cuerpos de agua

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Alternativas de disposición final de lodos sin riesgo sanitario

PLANTA DE TRATAMIENTO

LODOS

TRATADOS

EFLUENTE TRATADO

Disposición oceánica

“Land farming”

Cuerpo receptor

Uso agrícola Incineración

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Reuso de lodos en agricultura

Factores a considerar:Presencia de metales pesadosMicroorganismos patógenos Bacterias Virus Parásitos

Otros tóxicos

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Guías nacionales para el Uso y Disposición Final de Biosólidos

(Ministerio de Desarrollo Social y Medio Ambiente de la Nación)

ParámetroValor límite

Nivel AValor límite

Nivel B

Escherichia coli (*) < 1000 NMP/g MS< 2.000.000 NMP/g MS

Salmonella (*) < 3 NMP / 4 g MS

Huevos de helmintos viables

< 1 / 4 g MS

Indicadores virales

Reducción del 99,9% de la densidad de bacteriófagos

somáticos de Escherichia coli

(*) Se exige el cumplimiento de uno de los 2 límites

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Indicador apropiado para garantizar la inactivación de

patógenos ¿ Coliformes fecales?

¿Salmonella sp.?

HUEVOS DE HELMINTOS

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Huevo de Trichuris

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y Salmonella en lodos cloacales

Huevos de Hymenolepis

H. diminuta H. nana

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y Salmonella en lodos cloacales

Huevo de Tenia saginata

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y Salmonella en lodos cloacales

Huevos de parásitos resistentes a condiciones ambientales adversas

ASCARIS LUMBRICOIDES

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Huevo de Ascaris

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Ascaris

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y Salmonella en lodos cloacales

AscarisCiclo

biológico

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Bolo de Ascaris

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y Salmonella en lodos cloacales

Proyecto de Investigación Investigación sobre tratamiento de

lodos sépticos: Proyecto colaborativo entre UNR / CIS (Argentina) y EAWAG / SANDEC (Suiza)

Fase B2 del Proyecto: Investigación de la inactivación de

patógenos en lodos sometidos a deshidratación natural

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y Salmonella en lodos cloacales

Investigación en el CIS

Plantas de tratamiento: Alcorta: planta existente.

Tratamiento con ciclos largos de acumulación y deshidratación de barros.

Máximo Paz: planta nueva. Tratamiento con ciclos cortos de acumulación y deshidratación de barros.

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y Salmonella en lodos cloacales

Objetivos de la investigación Huevos de helmintos

Determinar el tiempo de almacena-miento necesario para la inactivación de huevos de helmintos en lodos sometidos a procesos de deshidratación natural dentro de la Planta de Tratamiento

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y Salmonella en lodos cloacales

Objetivos de la investigaciónSalmonella sp.

Establecer una técnica para aislamiento de Salmonella y determinar el die-off.

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y Salmonella en lodos cloacales

Planta de Tratamiento enAlcorta, Santa Fe

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y Salmonella en lodos cloacales

AlcortaEsquema de la Planta de Tratamiento

Líquidos sépticos

Efluente

Líq

uid

o c

loacal

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Alcorta - Descarga de camiones

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Alcorta - Laguna de sedimentación (C1)

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AlcortaDistribución de líquido séptico en la laguna

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Alcorta - Laguna de lodos (C2)

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y Salmonella en lodos cloacales

AlcortaDeshidratación de lodos en pilas

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y Salmonella en lodos cloacales

Caracterización del lodo de la Planta de Tratamiento de

Alcorta

Monitoreo:Muestras: (envases, volumen, extracción, cantidad de muestras)Frecuencia de muestreo: quincenalDuración del Estudio: 2 años

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y Salmonella en lodos cloacales

Caracterización de lodos Parámetros analizados

Humedad Sólidos totales, fijos y volátiles pH Coliformes fecales Huevos de helmintos Salmonella sp.

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y Salmonella en lodos cloacales

Caracterización del lodo de la Planta de Tratamiento de

Alcorta Humedad: 80% Sólidos totales: 200.000 mg/l

Sólidos fijos: 60% Sólidos volátiles: 40%.

Coliformes fecales: se han detectado concentraciones entre 2 y 130.000 NMP /gramo de materia seca.

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y Salmonella en lodos cloacales

AlcortaMonitoreo: Humedad

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400 500 600 700

Time (days)

Hu

mid

ity

(%

)

Piles' samples

Humedad inicial = 87% Humedad final = 32%

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y Salmonella en lodos cloacales

AlcortaMonitoreo: Sólidos fijos y volátiles

Sólidos Fijos y Volátiles en la laguna de sedimentación

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

0 100 200 300 400 500 600 700

T (días)

Fra

cció

n d

e S

óli

do

s (%

)

SANDEC

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y Salmonella en lodos cloacales

AlcortaMonitoreo: Coliformes fecales

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0 100 200 300 400 500 600 700

Tiempo (días)

Co

lifo

rme

s f

ec

ale

s (

NM

P p

or

gra

mo

)

SANDEC

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y Salmonella en lodos cloacales

Caracterización de lodos Parámetros analizados

Humedad Sólidos totales, fijos y volátiles pH Coliformes fecales Huevos de helmintos Salmonella sp.

Investigación de

patógenos

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y Salmonella en lodos cloacales

Etapas de la investigación de patógenos en lodos

Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos

acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en

tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de

la aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.

Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales

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y Salmonella en lodos cloacales

Viabilidad de huevos de helmintos en lodo acumulado en

laguna de sedimentación

Aplicación de técnica de recuperación de huevos (EPA 1992 modificada por J. Schwatzbrod)

Determinación de viabilidad: Incubación a 26 ºC, durante 4 semanas.

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y Salmonella en lodos cloacales

Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Filtración:

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y Salmonella en lodos cloacales

Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Sedimentación:

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Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Flotación con Zn SO4, densidad 1,32 g/cm³:

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y Salmonella en lodos cloacales

Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Centrifugación:

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Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Flotación con Zn SO4, densidad 1,32 g/cm³:

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y Salmonella en lodos cloacales

Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Purificación en solución ácida de alcohol-éter:

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y Salmonella en lodos cloacales

Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Incubación a 26 ºC, 21 días:

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y Salmonella en lodos cloacales

Técnica de aislamiento de huevos de helmintos

Detección de huevos viables:

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Planta de Tratamiento en Alcorta

Resultados de la investigación de patógenos

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Patógenos en laguna de sedimentación

Huevos de helmintos

0,0

4,0

8,0

12,0

16,0

20,0

0 100 200 300 400 500 600 700

Tiempo (días)

Hu

ev

os

de

He

lmin

tos

To

tale

s(N

º h

ue

vo

s p

or

gra

mo

)

SANDEC

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y Salmonella en lodos cloacales

Patógenos en laguna de sedimentación

Huevos viables de Ascaris

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 100 200 300 400 500 600 700

Días de almacenamiento

Hu

ev

os

Via

ble

s d

e A

sc

ari

s (

Nº

po

r g

ram

o)

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y Salmonella en lodos cloacales

Patógenos en laguna de sedimentación

Salmonella: no se detectó en ninguna de las muestras analizadas.

Huevos de helmintos: se han detectado en concentraciones variables entre 0 y 17 huevos totales / gramo. Se detectaron huevos viables en muy pocas muestras.

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y Salmonella en lodos cloacales

Etapas de la investigación de patógenos en lodos

Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos

acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados

en tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de la

aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.

Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales

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y Salmonella en lodos cloacales

Viabilidad de huevos de Ascaris

Experiencias en Tanque Experimental y

“Playa de Secado”Alcorta, Santa Fe

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Viabilidad de huevos de Ascaris suum sembrados en lodos

acumulados

Se estudió en dos etapas: Tanque experimental: 8 meses Playa de secado experimental: 12

meses

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y Salmonella en lodos cloacales

Parámetros adicionales determinados en tanque/playa

de secado

Coliformes fecales

Sólidos totales, fijos y volátiles

Humedad

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y Salmonella en lodos cloacales

Preparación de Suspensión de huevos de Ascaris suum

Se extraen huevos del útero de helmintos hembras

Se prepara suspensión de huevos en solución fisiológica estéril con una concentración aproximada de 3 x 105 huevos/l

Se agrega la suspensión de huevos al lodo del tanque experimental (20 huevos/g materia seca)

Se realizan tests control con la suspensión de huevos incubada a 20ºC, 4 semanas (confirman viabilidad)

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y Salmonella en lodos cloacales

Helmintos Ascaris

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y Salmonella en lodos cloacales

Extracción de huevos de Ascaris

Preparación

SANDEC

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y Salmonella en lodos cloacales

Extracción de huevos de Ascaris

Disección del Ascaris

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y Salmonella en lodos cloacales

Extracción de huevos de Ascaris

Disección del útero

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y Salmonella en lodos cloacales

Extracción de huevos de Ascaris Ruptura del útero y liberación de huevos

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y Salmonella en lodos cloacales

Extracción de huevos de Ascaris Huevos de Ascaris en la suspensión

preparada

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y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimentalDiseño del experimento

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y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimental

Preparación: Siembra de

huevos

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y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimentalUbicación del tanque experimental

SANDEC

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y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimentalComienzo de la experiencia

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y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimentalCuarto mes de deshidratación

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y Salmonella en lodos cloacales

“Playa de secado”

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y Salmonella en lodos cloacales

AlcortaResultados de la experiencia

en tanque experimental y playa de secado

SANDEC

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y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimental / playa de secado

Monitoreo de la humedad

20

30

40

50

60

70

80

0 120 240 360 480 600 720

Tiempo (días)

Hu

me

da

d (

%)

Tanque Experimental Playa de secado

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimental / playa de secado

Viabilidad de Ascaris

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 120 240 360 480 600 720

Tiempo (días)

Hu

evo

s d

e Ascaris

(N

º p

or

gra

mo

)

Huevos totales Huevos viables

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Tanque experimental / playa de secado

Huevos viables de Ascaris vs. humedad

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

20 30 40 50 60

Humedad (%)

Hu

evo

s d

e Ascaris

via

ble

s (N

º p

or

gra

mo

)

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Etapas de la investigación de patógenos en lodos

Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos

acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en

tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través

de la aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.

Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Investigación de un método apropiado para aislamiento de Salmonella sp. en lodo séptico ¿Cuáles son los inconvenientes que se

plantean en el laboratorio para la detección de Salmonella en lodos sépticos?

La presencia de una importante flora indígena puede enmascarar el desarrollo de Salmonella, especialmente cuando se encuentra en bajas concentraciones

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

METODOLOGIA Según Standard Methods (1999)

Se procesaron 9 muestras del lodo de la laguna de sedimentación de la Planta de Tratamiento de Alcorta Medios de enriquecimiento: caldo Selenito - CistinaMedios de aislamiento: agar XLDTests de identificación: TSI, LIS, ureasaConfirmación: Pruebas serológicas (Antígeno grupo “0”)

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacalesSalmonellaen presencia de flora

competidora

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Resultados obtenidos aplicando técnica del “Standard Methods”

Ausencia de Salmonella en todas las muestras de lodo analizadas

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

El resultado < 3 NMP/4g materia seca, ¿significa realmente que Salmonella está por debajo de

dicha concentración?

¿O podría encontrarse en mayor concentración y no detectarse por

quedar enmascarada por la abundante flora competidora presente en el lodo cloacal?

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Objetivos de la investigación Salmonella sp.

Establecer una técnica apropiada para el aislamiento de Salmonella en presencia de flora indígena.

Determinar el die-off (en tanque experimental).

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Selección de la metodología más apropiada para aislamiento

de Salmonella en lodo

1. Se contaminaron 5 muestras de lodo con Salmonella enteritidis. Concentración final: 1,5 x 103 - 1,5 x 105/g materia seca

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Selección de la metodología más apropiada para aislamiento

de Salmonella en lodo (cont.)

2. Se seleccionaron los siguientes medios de cultivo y condiciones de incubación:

a. Caldos de enriquecimiento: Selenito-cistina: 24, 48, 72 horas a 41 ºC Rappaport Vassiliadis: 24, 48, 72 horas a

43ºC

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Selección de la metodología más apropiada para

aislamiento de Salmonella en lodo (cont.)

b. Medios selectivos de aislamiento: Agar XLD: 24 horas a 35 ºC y a 40 ºC Agar SS: 24 horas a 35 ºC y a 40 ªC

c. Pruebas bioquímicas: TSI, LIA, Ureasa

d. Pruebas serológicas: Realizadas en Servicio de Enterobacterias

del Instituto Dr. Carlos Malbrán

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Resultados obtenidos en el estudio de la selección de metodología para

aislamiento de Salmonella

#

Caldo Selenite-Cistina (41ºC) Caldo Rappaport-Vassiliadis (43ºC)

Salmonella Flora indígena Salmonella Flora indígena

24 hs

48 hs

72 hs24 hs

48 hs

72 hs24 hs

48 hs

72 hs

24 hs

48 hs

72 hs

1 ** ** * * ** ** ** *** ** * * **

2 ** * * * ** *** ** *** ** * * *

3 * * * * ** *** * ** ** * * *

4 ** * * * ** ** * ** ** * * **

5 ** ** * * ** ** ** *** ** * ** **

* Desarrollo escaso - ** Desarrollo moderado - *** Desarrollo abundante

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Resultados obtenidos en el estudio de la selección de metodología para

aislamiento de Salmonella

#

Agar Salmonella-Shigella (SS) Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)

Salmonella Flora indígena Salmonella Flora indígena

35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC

1 * ** ** * ** *** ** *

2 ** ** ** * ** *** * *

3 * ** ** ** * ** * *

4 ** ** ** * * ** ** *

5 * ** ** ** ** *** ** *

* Desarrollo escaso - ** Desarrollo moderado - *** Desarrollo abundante

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Aislamiento e identificaciónde Salmonella

Método modificado (Sanguinetti et al) Enriquecimiento

Caldo Rappaport-Vassiliadis

43 ºC – 48 hs.

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Aislamiento e identificaciónde Salmonella

Aislamiento:

Agar XLD40 ºC 24 hs.

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Aislamiento e identificaciónde Salmonella

Aislamiento en Agar XLD:

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Aislamiento e identificaciónde Salmonella

Aislamiento en agar XLD

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Aislamiento e identificación de Salmonella

TSI (alcalino/ácido)

LIA (positivo)

Ureasa (negativo)

Tipificación por pruebas bioquímicas

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Etapas de la investigación de patógenos en lodos

Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos

acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en

tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de la

aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.

Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental

LODOConcentración final:

7,0 x 106 NMP/g ST

Duración experiencia: 4 meses

Salmonella enteritidis

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental

Aplicación de la técnica propuesta para aislamiento

Cuantificación: técnica de tubos múltiples

Expresión de resultados: índice NMP / gramo de materia seca

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental

Parámetros adicionales pH entre 6,5 y 7,5 Humedad entre 30% y 70% Sólidos fijos entre 75% y 80% de ST Sólidos volátiles entre 20% y 25% de ST Coliformes fecales entre 10² y 104 NMP/g ST Temperatura ambiente entre 13ºC y 27ºC Temperatura del lodo entre 14ºC y 30ºC

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Salmonella sp.Die–off en lodos

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

CONCLUSIONES

AB

C

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Los huevos de Ascaris presentes en lodos almacenados

durante 2 años permanecen viables, aún con 35% de humedad

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

Un método apropiado para el aislamiento de Salmonella en lodos, que inhibe el desarrollo de flora indígena es:

Enriquecimiento: caldo Rappaport-Vassiliadis, 48 horas a 43 ºCAislamiento: Agar XLD, 24 horas a 40 ºCTests de identificación: TSI, LIA, ureasa, pruebas serológicas

SANDEC

Aislamiento y determinación de huevos de helmintos

y Salmonella en lodos cloacales

El decaimiento de Salmonella durante 115 días en tanque

experimental con lodos puede expresarse por la ecuación:

Y = log NMP Salmonella/g materia seca = 6,67 x t-

0,086

t: tiempo transcurrido en días